Summary
Vi presenterar protokoll för tillämpningen av vår målmedicinsk kodade kalciumindikator (GECI) CatchER + för övervakning av snabba kalciumtransienter i endoplasmatisk / sarkoplasmisk retikulum (ER / SR) hos HEK293 och skelettmuskel C2C12-celler med användning av realtids fluorescensmikroskopi. Ett protokoll för mätningen och kalibreringen in situ K d diskuteras också.
Abstract
Intracellulära kalcium (Ca 2+ ) transienter framkallade av extracellulära stimuli initierar en mängd biologiska processer i levande organismer. I centrum för intracellulärt kalciumfrigörande är de huvudsakliga intracellulära kalciumlagringsorganellerna, endoplasmatisk retikulum (ER) och mer specialiserad sarkoplasmisk retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiska frisättningen av kalcium från dessa organeller medieras av ryanodinreceptorn (RyR) och inositol 1,4,5-trifosfatreceptorn (IP 3 R) med påfyllning som sker genom sarco / endoplasmatisk retikulumkalcium ATPas (SERCA) -pumpen. En genkodad kalciumsensor (GECI) kallad CatchER skapades för att övervaka det snabba kalciumfrigörandet från ER / SR. Här beskrivs de detaljerade protokollen för transfektion och uttryck av den förbättrade, ER / SR-riktade GECI CatchER + i HEK293- och C2C12-celler och dess tillämpning vid övervakning av IP 3 R-, RyR- och SERCA-pumpmedierad kalciumtransientS i HEK293-celler med användning av fluorescensmikroskopi skisseras. Den föredragna receptoragonisten eller hämmaren dispergeras i kammarlösningen och intensitetsförändringarna registreras i realtid. Med denna metod ses en minskning av ER-kalcium med RyR-aktivering med 4-klor-m-kresol (4-cmc), indirekt aktivering av IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) och inhibition av SERCA-pumpen med cyklopiazon Syra (CPA). Vi diskuterar också protokoll för att bestämma in situ K d och kvantifiera basal [Ca 2+ ] i C2C12-celler. Sammanfattningsvis kan dessa protokoll, som används i samband med CatchER + , framkalla receptormedierat kalciumfrigörande från ER med framtida tillämpning vid studier av ER / SR-kalciumrelaterade patologier.
Introduction
De rumsliga egenskaperna hos intracellulära kalcium (Ca 2+ ) transienter aktiverar olika biologiska funktioner 1 . Dessa Ca 2+ -signaleringshändelser utlöses extracellulärt genom olika stimuli och regleras intracellulärt av den stora Ca 2+ -lagringsorganellen och av många Ca 2+ -pumpar, kanaler och Ca 2+ -bindande proteiner. Ca 2+ transienter kan förändras signifikant som ett resultat av defekter med signalmodulation, vilket leder till olika sjukdomar 2 . På grund av hastigheten och invecklingen av Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) och sarkoplasmisk retikulum (SR) i mitten behövs genetiskt kodade Ca 2+ -prober som har optimerats för däggdjursuttryck med snabb kinetik Att observera globala och lokala Ca 2+ förändringar i olika celler 3 .
ER och SR, Dess motsvarighet i muskelceller, är de huvudsakliga intracellulära Ca 2+ lagringsorganellerna och fungerar som Ca 2+ sänkor som hjälper till att förstärka Ca 2+ -signalen 4 . ER / SR är en integrerad del i Ca2 + -signalering med dubbla roller som en sändare och mottagare av signaler 5 . Ryanodinreceptorn (RyR) och inositol-1,4,5-trifosfatreceptorn (IP3R) är Ca2 + -frisättningsreceptorer belägna på membranen i ER / SR som regleras av Ca2 + 6 . Andra medel stimulerar direkt eller indirekt funktionen hos dessa receptorer. 4-klor-m-kresol (4-cmc) är en potent agonist av RyR som har en 10-faldig högre känslighet än koffein för att inducera SR Ca 2+ -frisättning där båda regelbundet används för att studera RyR-medierad Ca 2+ -frisättning i Friska och sjuka celler 7 . ATP ökar IP3-medierad Ca2 + reHyra via IP 3 R 8 . ATP binder till den purinerga receptorn P2YR, en G-proteinkopplad receptor (GPCR), som utlöser produktionen av IP3 som binder till IP3R för att frigöra Ca2 + från ER 9 , 10 . Sarko-endoplasmatisk retikulumkalcium ATPas (SERCA) -pumpen är en P-typ ATPaspump, som också är lokaliserad på ER / SR-membranet som reducerar cytosolisk Ca2 + och fyller ER / SR genom att aktivt pumma jonen i ER / SR-lumenet 11 . Specifika inhibitorer av SERCA-pumpen inkluderar thapsigargin, från Thapsia garganica och cyklopiazonsyra (CPA), från Aspergillus och Penicillium . CPA har en låg affinitet för pumpen och blockerar reversibelt Ca 2+ åtkomstpunkten 12 . Thapsigargin binder däremot irreversibelt till Ca 2+ fri pump vid rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analysera och kvantifiera förändringarna i Ca 2+ stimulerade händelser har varit och förblir en utmaning. Eftersom ER / SR är det huvudsakliga subcellulära Ca 2+ innehållande facket med en central funktion vid propagationen av Ca 2+ -signalen har mycket arbete fokuserats på att förstå ER / SR Ca 2+ -signalering 5 .
Skapandet av syntetiska Ca 2+ färgämnen bidrog till att utveckla fältet och övningen av Ca 2+ bildbehandling. Även om färgämnen, såsom Mag-Fura-2, har använts i stor utsträckning för att mäta uppdelad Ca 2+ i olika celler, har de 13 , 14 , 15 begränsningar såsom ojämn färgning, fotobildning och oförmågan att riktas mot specifika organeller . Upptäckten av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) och framsteg av fluorescerande protein-Baserade Ca 2+ -prober har drivit fältet Ca 2+ avbildning framåt 16 . Några av de befintliga GECI: erna är Förster resonans energiöverföring (FRET) -par som involverar gult fluorescerande protein (YFP), cyan-fluorescerande protein (CFP), kalmodulin och M13-bindande peptid 17 , 18 . Troponin C-baserade GECIs finns också som FRET-par CFP och Citrin och som enskilda fluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andra, såsom GCaMP2 och R-GECO, är enskilda fluorofor-sensorer som involverar kalmodulin 22 , 23 . För att övervinna begränsningarna för smal inställning av Kd 's och kooperativ bindning associerad med flera Ca2 + bindningsställen som finns i deras Ca2 + bindningsdomäner 24 , en ny klass av kalcium senSors skapades genom att designa en Ca 2+ bindningsplats på ytan av beta-tunneln i en kromoforkänslig plats för förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) 25 , 26 . Den här högstartade sensorn, kallad CatchER, har en Kd av ~ 0,18 mM, ak nära diffusionsgränsen och ak off av 700 s -1 . CatchER har använts för att övervaka receptormedierat ER / SR-kalciumfrigöring i olika däggdjurscellinjer, såsom HeLa, HEK293 och C2C12 25 . På grund av sin snabba kinetik användes CatchER i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibrer hos unga och gamla Friend Virus B NIH Jackson (FVB) möss för att avslöja att mer Ca 2+ förblir i SR efter 2 s av depolarisering i FDB Fibrer av gamla möss jämfört med hos unga möss 27 . För att övervinna dess låga fluorescens vid 37 ° C, vilket hindrar dess tillämpningar vid kalciumbildning av däggdjurCeller har vi utvecklat en förbättrad version av CatchER som heter CatchER + . CatchER + uppvisar förbättrad fluorescens vid 37 ° C för bättre applicering i däggdjursceller. Ytterligare mutationer inkorporerades i CatchER för att förbättra termostabiliteten och fluorescensen vid 37 ° C 28 , 29 , för att skapa CatchER + . CatchER + uppvisar en sexfaldig ökning av dess signal-brusförhållande (SNR) över CatchER 30 .
Här presenteras protokollen för kulturen och transfektionen av HEK293- och C2C12-celler med CatchER + och dess tillämpning för övervakning av ER / SR-receptormedierade kalciumtransienter. Representativa resultat visas för CatchER + uttryckt i HEK293-celler behandlade med 4-cmc, CPA och ATP. Vi tillhandahåller också ett protokoll för att bestämma in situ K d av CatchER + i C2C12 myoblastceller och quaNtifiering av basal [Ca2 + ].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slide Preparation
- Placera 22 mm x 40 mm glasmikroskopskivor i 6 cm cellodlingsdiskar, 1 bildskiva per skål.
- Utsätt varje sida av varje bild och 6 cm-skålen till ultraviolett (UV) ljus i 15-20 minuter för att sterilisera i en steril huva.
- Täck disken med diabilder inuti med parafilm och lagra vid 4 ° C tills det är klart att använda.
2. Framställning av media, buffertar, lösningar och reagenser
- Förbered 1 liter av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i avjoniserat vatten och tillsätt 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 och 1 mM EGTA. Justera till pH 7,2-7,3 med NaOH. Filtrera buffert med ett 0,22 μm filter i en autoklaverad flaska.
- Förbered 900 ml hög glukos Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h i avjoniserat vatten. Tillsätt 44 mM NaHCO3 och justera pH till 7,2-7,3 med HCl. Filtrera media med ett 0,22 μm filter i en autoklaverad flaska. Tillsätt 100 ml fetalt boviNe-serum (FBS) till media för att göra FBS-koncentrationen 10%. Förvara vid 4 ° C.
- Förbered 1 liter intracellulär buffert (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) i avjoniserat vatten och justera pH till 7,25. Den slutliga [Ca2 + ] kommer att vara ~ 100 nM. Före användning tillsätt 0,5 mM ATP. Förvara vid rumstemperatur.
- Bered 1 liter Ringer buffert (121 mM NaCl, 2,4 mM K2 HPO4, 0,4 mM KH2 PO4, 10 mM HEPES och 1,2 mM MgCl2) i avjoniserat vatten och justera pH till 7.2. Förvara vid rumstemperatur. För användning, alikvot 50 ml i ett 50 ml rör och tillsätt 1,8 mM Ca 2+ och 10 mM glukos.
- Förbered 1 liter KCl sköljlösning (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) i avjoniserat vatten och justera pH till 7,25.
- Lös 5 mg jonomycin i 1 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Aliquot 30 μL i mikrotubes och lagra vid -206; C.
- Förbered cyklopiazonsyra (CPA) -materialet genom att lösa CPA i DMSO. Se till att den slutliga procenten av DMSO är ≤ 1% för att CPA läggs till cellerna för att förhindra apoptos. Förbered 20 mM 4-klor-m-kresol (4 cm) genom upplösning i filtrerad H2O och låt den lösa upp över natten genom att skaka vid 37 ° C. Förbered ATP-stammen genom att lösa upp i filtrerad H2O till 100 mM.
- För att bestämma in situ Kd bereda 15 ml vardera 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM och 100 mM Ca 2+ i KCl-buffert med användning av en 100 MM EGTA-lager och en 1 M CaCl2-stam löst i avjoniserat vatten.
3. Cellkultur
- Kultur C2C12-myoblast- och HEK293-celler enligt ATCC-protokoll för vardera användande 10 cm cellodlingsdiskar i en steril UV-huva.
OBS: C2C12-celler får inte tillåtas växa högre än ~ 70% konfluens eftersom myoblasterna kommer att börja differentieraTe i myotubes. Både HEK293- och C2C12-celler växer lätt och bör inte tillåtas växa över 100% konfluens för att upprätthålla cellintegriteten. Dessutom bör celler inte passeras mer än 10 gånger innan de används för ett försök för att bevara cellhälsan.
4. Transfektion av HEK293-celler
- Frö HEK293-celler på steriliserade 22 mm x 40 mm glasmikroskopskivor i 6 cm rätter så att de är ~ 70% konfluenta dagen för transfektion.
- Nästa dag följer tillverkarens protokoll för transfektionsreagenset att transfektera celler med 2 μg CatchER + cDNA och ett 1: 3 (vikt / volym) DNA: transfektionsreagensförhållande i det reducerade serummediet ( t.ex. Opti-MEM).
- Töm DMEM-media från disken och tillsätt 3 ml reducerat serummedium. Tillsätt DNA: transfektionsreagensblandning i skålen och inkubera i 4-6 h vid 37 ° C.
- Efter inkubation tvätta cellerna med 5-6 ml HBSS. Kassera HBSS fSkålen och ersätt med 3 ml färsk DMEM och inkubera dem vid 37 ° C under 48 timmar för att tillåta expression av GECI.
- Transfektion av C2C12 myoblastceller
- För C2C12 myoblastceller trypsiniserar celler genom att tillsätta tillräckligt med trypsin för att täcka botten av skålen (1-2 ml). Placera disken i en 37 ° C inkubator i 2-6 minuter för att tillåta trypsin att lossa cellerna från botten av skålen.
- När inkubationen är fullständig, ta bort trypsinet och aspirera cellerna i 8 ml DMEM. Pipettera cellerna noggrant med DMEM för att jämnt fördela och re-suspendera te-cellerna och frö dem på sterila täckglas i 6 cm-cellkulturskålar innehållande 3 ml DMEM så att den slutliga sammanflödet är 60%.
- Transfektera cellerna samma dag som beskrivs i steg 4.2-4.3. Inkubera i 24 timmar vid 37 ° C.
- Upprepa steg 4.4.
5. Framställning av glid- och fluorescensmikroskop
- Slå på mMikroskop och ljuskälla, öppna sedan Simple PCI-programmet. Låt mikroskopet värmas upp i 15-20 minuter eller tills laddningsenheten (CCD) kyls till -65 ° C. Förbered kammaren och glida med celler medan du väntar.
- Skydda botten av den lågprofilade öppna diamantbadkammaren med ett tunt skikt av tätningsmedel, med en bomullspinne.
- Ta gliden som innehåller transfekterade celler ur inkubatorn och skölj försiktigt tre gånger med 1 ml Ringer buffert med 10 mM glukos och 1,8 mM Ca 2+ förvärmd till 37 ° C.
- Lämna 1 ml Ringer buffert i disken, för att förhindra att celler torkar och använd tång för att ta gliden ur disken. Låt överskottslösningen absorberas på en laboratorievävnad genom att vidröra glidkanten till en laboratorievävnad. Placera sedan på sidan av kammaren som innehåller fettet med cellerna vända upp mot fett och säkra kammaren på scenmonteringen med en skruvmejsel.
- Lägg till 1ML Ringer buffert till kammaren för att förhindra att celler torkar samtidigt som kammaren monteras på scenen och fullbordar resten av mikroskopuppsättningen. När vakuumsugslangen är fäst vid kammaren är den slutliga volymen kammaren rymmer ~ 450 μl.
- Växla mikroskopets mål till 40X oljedjupsmålet.
- Använd linspapper och linsrengöringslösning för att rengöra och torka målet. Gnugga inte målet. Doppa försiktigt tills ytan är ren.
- Tillsätt en droppe av nedsänkningsoljan till målet.
- Placera berget på mikroskopsteget och lägg vakuumspetsen i kammaren. När vakuumsugslangen är fäst vid kammaren och påslagen är den slutliga volymen kammaren rymmer ~ 450 μL. Denna slutliga volym är nivå med kammarens sidor. Det är absolut nödvändigt att kammarlösningen är jämn under experimentet för att förhindra att lösningen slår ner i målet på grund av överfyllning.
- Använd ljusfältläget, justera förstärkningen till 175 och exponeringstiden till 0,03 s för att fokusera cellerna.
- När cellerna är fokuserade, byt till fluorescensläge med hjälp av 488 nm excitation. Ändra exponeringstiden till 0,07 s. Hitta ett synfält som har tillräckligt med celler som är friska med tillräcklig fluorescens till bilden.
- När ett visningsfält har valts, ta bilder i fluorescens och ljusfältläge.
- Ringa en region av intresse (ROI) i cellerna eller cirkla hela cellen för att spela in intensiteten från det valda området.
6. Imaging Drug inducerad Ca 2+ transienter och i situ K d Kalibrering
- Börja intensitetsmätning med bildhastighet inställd vid en var 5: e sekund.
- Låt baslinjen intensitet stabilisera för 20-30 bilder (100-150 s). Om så behövs, minska frAmes / s under detta steg för att förhindra photobleaching.
- Beräkna mängden 4 cmc som behövs från en 20 mM stam, baserad på slutkammarmängden på ~ 450 μl för att göra en slutlig koncentration av 200 | im. Gör utspädningar av beståndet vid behov.
- Ta försiktigt 60 μL Ringer buffert från kammaren och placera i ett mikrocentrifugrör. Torka den beräknade mängden 4 cmc med denna lösning och sätt tillbaka till kammaren för att framkalla det avsedda svaret från cellerna som avbildas.
- Tillsätt den beräknade mängden 4 cmc till mikrocentrifugröret och blanda genom pipettering.
- Lägg försiktigt lösningen över synfältet samtidigt som händelsemarkören läggs till i intensitetsmätningen.
- Tillåt tid för läkemedlet att binda till receptorn och efterföljande signalminskning, tvätta sedan med 3-6 ml Ringer buffert med 1,8 mM Ca 2+ och 10 mM glukos samtidigt som man tillsätter händelsemarkören. Eftersom kammarens volym är 450 &# 181; L och är ansluten till ett vakuum, varvid tillsats av 3-6 ml buffert säkerställer att den tidigare lösningen innehållande läkemedlet har tvättats bort och ersatt med den nyligen tillsatta lösningen.
- Upprepa 6,1-6,7 för 100 μM ATP och 15 μM CPA, med användning av en ny glida av transfekterade celler för varje analys.
- När mätningen är klar avslutar du datainsamlingen i intensitetsmätningsfönstret i Simple PCI-programmet.
- Ta fluorescens och brightfield bilder av cellerna.
- Öppna datafilen för experimentet. Här, omcirkulera de celler eller regioner som är av intresse för att beräkna intensitetsvärdena om så behövs.
- För att bestämma in situ Kd i C2C12 myoblastceller, följ protokollet som beskrivs i avsnitt 4.2 och avsnitt 5 och sätt 1 ml 0 mM Ca2 + Ringer buffert i kammaren.
- Permeabilisera cellerna med 0,002-0,005% saponin i intracellulär buffert under 15-30 s för att tömma cellerna i någonCatchER + som kan vara i cytosolen. Tvätta cellerna med 3-6 ml 1 ml EGTA i KCl-buffert med 10 μM jonomycin. Låt intensiteten minska tills en platå är uppnådd.
- Skölj med 3-6 ml KCl-buffert med 10 μM ionomycin och låt intensiteten stabilisera, tillsätt sedan varje Ca 2+ -lösning detaljerad i steg 2.7. Låt intensiteten nå en platå mellan varje tillsats.
- För att kalibrera sensorn för basal [Ca 2+ ] kvantifiering, följ steg 6.12. Använd EGTA och 100 mM Ca 2+ -bufferten från steg 2.7 för att få minsta och maximala fluorescensintensiteten.
7. Databehandling
- Ladda ner kalkylarkfilen för intensitetsmätdata.
- Normalisera data för varje cell till baslinjen intensitet (F / F 0 ). Plot den normaliserade data kontra tiden i något grafprogram.
- För att beräkna% förändringen, subtrahera den normaliserade toppvalenUe från 1 och multiplicera med 100. Beräkna medel- och standardavvikelsen om flera celler avbildades.
- För att beräkna signalförhållandet SNR öppnar du den bildfil som sparats från experimentet i en bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ, och mäter sedan signalen, transfekterade celler och brus, bakgrund. Beräkna SNR med hjälp av ekvationen SNR = signal / brus.
- För att beräkna in situ Kd från den uppsamlade fluorescensbildningsdatan, genomsnittlig intensitetsdata, innefattande platåerna, efter tillsatsen av varje Ca2 + -koncentration och EGTA (0 mM Ca2 + ). Beräkna fraktionell mättnad (relativ intensitet) med θ = (F - F min ) / ( Fmax - F min ), där θ är den relativa intensiteten, F är fluorescensen vid vilken som helst punkt, F min är den minsta fluorescensintensiteten, och F max är den maximala fluorescensintensiteten för att se förändringen i intensiteten av tHan sondar med tillsatsen av Ca2 + jämfört med minsta intensiteten. Plot relativ intensitetsdata mot [Ca 2+ ] i vilket grafik- och kurvanpassningsprogram som helst. Använd 1: 1 bindningsekvationen θ = [M T ] / (K d + [M T ]) översatt för vilket grafiskt och kurvanpassningsprogram som ska beräkna K d . M T är den totala metalkoncentrationen.
- För att kvantifiera det basala kalciumet från kalibreringen som skisseras i 6.13, genomsnittlig intensitetsdata, innefattande platåerna, efter tillsatsen av 1 mM EGTA (Fmin) och 100 mM Ca 2+ ( Fmax ). Använd kalibreringsekvationen [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] för att beräkna basalkalcium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt kommer att illustrera resultaten som uppnåddes med användning av de tidigare beskrivna metoderna med användning av den optimerade ER / SR-riktade GECI CatchER + för att övervaka förändringar i ER / SR Ca 2+ genom olika receptormedierade vägar.
Figur 1 illustrerar ER tömning genom RyR stimulerad med 200 | iM 4 cmc. 4 cmc är en agonist för RyR. Tillsats av läkemedlet inducerar en minskning av ER-kalcium, mätt genom minskningen av CatchER + fluorescensintensiteten. Såsom markerat tillåter det protokoll som beskrivs här visualisering och mätning av receptormedierade Ca 2+ -transienter med användning av CatchER + som ger information om förändringarna i ER Ca 2+ .
Såsom avbildas i figur 2 , tillsatsen av 15 μM CPA, för att reversibelt blockera SERCA-pumpen, ger en stor minskning av fluorescensintensiteten som bildar en platå. Eftersom SERCA-pumpens funktion hämmas, frigörs ER Ca 2+ -frigöringskanalerna aktivt Ca 2+ i cytosolen vilket förorsakar att fluorescensintensiteten minskar. Cellerna återvinns efter tvättning av CPA iväg med Ringers buffert innehållande 1,8 mM Ca 2+ och 10 mM glukos. Dessa resultat bekräftar förmågan hos CatchER + att övervaka Ca 2+ transienter specifika för SERCA-pumpen.
Figur 3 visar representativa data för den indirekta aktiveringen av IP3R med 200 | iM ATP i HEK293-celler transfekterade med CatchER + . ATP binder till P2Y-receptorn, en G-proteinkopplad receptor, vilken alstrar IP3 som aktiverar Ca2 + -frisättning genom IP 3 R. Även om förändringenÄr liten, ger tillägget av 200 | xM ATP en synlig minskning av signalintensiteten. Tvätta cellerna med Ringers buffert innehållande 1,8 mM Ca 2+ och 10 mM glukos låter ER fylla på och signalen återgår till baslinjen. Dessa resultat belyser förmågan hos CatchER + att övervaka IP 3 R-medierad kalciumfrisättning genom indirekt stimulering.
I figur 4 transfekterades CatchER + i C2C12 myoblastceller för att bestämma in situ Kd. Uppgifterna samlades in enligt beskrivningen i protokollet. C2C12-myoblastceller permeabiliserades med 0,005% saponin i 15-30 s, tvättades sedan med 1 mM EGTA i KCl-buffert innehållande 10 | j, m ionomycin. De olika Ca2 + -koncentrationerna framställdes i KCl-buffert innehållande 10 | jM jonomycin och tillsattes på ett stegvis sätt. Data normaliserades och monterades med användning av 1: 1 bindningenIng ekvationen. Medelvärdet Kd var 3,1 ± 1,4 mM för 7 celler. Den svaga affiniteten hos CatchER + gör det möjligt att känna av Ca 2+ i höga Ca 2+ organeller som ER eller SR. För att bestämma den basala [Ca2 + ] i SR-cellerna permeabiliserades C2C12-celler med 0,005% saponin i 15-30 s, tvättades med KCl-buffert och tvättades sedan med 1 mM EGTA i KCl-buffert innehållande 10 | jM jonomycin för att erhålla F min . Efter tvättning av EGTA iväg med KCl-buffert tillsattes en maximal Fmax , av 100 mM Ca 2+ med 10 | im Jonomycin. Den basala Ca2 + beräknades vara 0,4 ± 0,2 mM.
Figur 1: Stimulering av RyR med användning av 4 cmc i HEK293-celler. ( A ) Avbildning av aktiveringen av RyR med 4 cmc. ( B ) Intensitetsregistrering av HEK293-cellerTransfekterad med CatchER + , lokaliserad i ER, behandlad med 200 | iM 4 cmc. Stimulering av RyR med 4 cmc ger en minskning av normaliserad fluorescensintensitet som direkt korrelerar till en minskning av [Ca 2+ ] ER . N avser antalet celler som avbildats. Den genomsnittliga signalminskningen var 12,0 ± 2,2%. Närvaron av 1,8 mM Ca 2+ i Ringers buffert underlättade återfyllning av ER reflekterad i intensitetsåtervinningen till baslinjen. Insetbilder visar cellerna före och efter behandling med 4 cm. SNR beräknades vara 4,3 ± 0,8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Minskning i [Ca 2+ ] ER med användning av den reversibla SERCA pUmp-hämmare CPA i HEK293-celler. ( A ) Inhiberingen av SERCA-pumpen med CPA. ( B ) Levande avbildning av HEK293-celler transfekterade med CatchER + , lokaliserad i ER, behandlad med 15 / xM CPA. Eftersom Ca 2+ fortfarande kan flöda genom IP 3 R och RyR orsakar blockering av SERCA-pumpen med CPA en minskning av den normaliserade fluorescensintensiteten som direkt korrelerar till en minskning av [Ca 2+ ] ER . N avser antalet celler som avbildats. Insetbilder är HEK293-celler transfekterade med CatchER + före och efter behandling. Den genomsnittliga signalminskningen var 21,0 ± 0,3%. Närvaron av 1,8 mM Ca 2+ i Ringers buffert underlättade återfyllning av ER reflekterad i intensitetsåtervinningen till baslinjen. SNR beräknades vara 5,5 ± 0,8. Vänligen klicka här för att se en större version avden här figuren.
Figur 3: ATP minskar [Ca2 + ] ER i HEK293-celler. ( A ) Schematisk av indirekt aktivering av IP3R med ATP genom den purinerga receptorn P2YR. P2YR är en GPCR som genererar IP 3 vid ATP-bindning. IP 3 aktiverar IP 3 R, stimulerande kalciumfrigöring från ER. ( B ) Realtid avbildning av HEK293-celler transfekterade med CatchER + , lokaliserad i ER, behandlad med 200 | xM ATP. Indirekt stimulering av IP 3 R via P2Y-receptorn med ATP orsakar en minskning av den normaliserade fluorescensintensiteten som direkt korrelerar till en minskning av [Ca 2+ ] ER . N avser antalet celler som avbildats. Den genomsnittliga signalminskningen var 6,0 ± 3,0%. SNR var cBeräknad till 6,7 ± 2,7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: In situ Kd av CatchER + i C2C12 myoblastceller. Representativt spår för normaliserad intensitet uppsamlad från permeabiliserade C2C12 myoblastceller transfekterade med CatchER + . Celler permeabiliserades med 0,005% saponin i intracellulär buffert under 15-30 s. EGTA- och Ca2 + -lösningar framställdes i KCl-buffert, n avser antalet celler som avbildades. ( A ) Insetfluorescensbilder är representativa för celler före och efter behandling. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 och 100 mM Ca2 + sattes till permeabiliserade C2C12-myoblastceller i närvaro av 10 ^ MJonomycin för att få en Kd på 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Insetfluorescensbilder är representativa för celler vid minimala och maximala värden efter tillsats av 1 mM EGTA och 100 mM Ca 2+ med 10 | jM jonomycin vardera. Den basala Ca2 + beräknades vara 0,4 ± 0,2 mM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levande enkelcellsavbildning av fluorescerande sonder, såsom CatchER + , är en effektiv teknik för att analysera invecklade ER / SR Ca 2+ -signaleringsprocesser i varje cell som svar på receptoragonister eller antagonister. Denna teknik är också användbar för avbildning med användning av flera våglängder samtidigt, såsom behövs för Fura-2 eller till bild CatchER + och Rhod-2 tillsammans för att övervaka både ER och cytosolisk kalciumförändringar. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll; Celltransfektion kan ha en stor effekt på bildbarhetens livskraft. Lågtransfektionshastighet kan resultera i otillräckligt uttryck av GECI för övervakning av kalciumsvar. Å andra sidan kommer överuttryck av CatchER + inte att ha en buffrande effekt på ER / ER Ca 2+ , ett problem associerat med syntetiska kalciumfärger. Bufferteffekter av Ca2 + -prober påverkas av [Ca2 + ] i organellen, Kd av pMantel och koncentrationen av sonden som krävs för mätning. Cytosolisk [Ca2 + ] är typiskt i det låga nanomolära området, men den erforderliga sondkoncentrationen ligger i ett jämförbart intervall. I detta fall var mängden färgämskoncentration och dess förmåga att buffra cytosolisk kalcium, och är ett stort problem för cellulär bildbehandling. I kontrast är ER / SR [Ca2 + ] i 100'erna av mikromolära till millimolära intervall 31 när vi bestämde för olika däggdjurscellinjer 25 . Eftersom 0,1-1 uM-uttryck av CatchER + är tillräckligt för att möjliggöra detektering av ER-kalcium, är buffert-effekten hos CatchER försumbar. Således kan CatchER + övervaka Ca 2+ -flöde i höga [Ca 2+ ] miljöer utan någon buffrande effekt på luminal ER / SR Ca 2+ 32 .
Flera faktorer kan påverka transfektionseffektiviteten hos GECI, såsom inkubationstiden, thE-transfektionsreagens, inkubationstemperaturen och cellkonfluensen. Cellkonfluensen kan, vid sådd av cellerna på objektglaset, väsentligt påverka bildkvaliteten. Låg konfluens kan resultera i ett lågt antal celler (n) och mindre statistisk noggrannhet, medan höga nivåer av sammanflöde leder till överlappande lager av celler som producerar stora variabler vid bildbehandling. Tiden och temperaturen för transfektion bör optimeras baserat på celltypen. Dessutom är tillsats av DMEM med reducerat serummedium optimalt för längre transfektionstider för att förhindra apoptos. Den ursprungliga GECI CatchER-fluorescensen i däggdjursceller, när den odlades och transfekterades, var endast 30 ° C. Fluorescensen hos CatchER optimerades framgångsrikt och förbättras för uttryck vid 37 ° C vilket resulterade i den nya, förbättrade varianten CatchER + . En western blot med användning av en antikropp mot EGFP kan utföras för att bekräfta uttrycket av Ca2 + -proben.
Dessutom, migThod och konsistens av reagensavgivning är kritisk. Reagenser kan sättas till kammaren genom perfusion, liten volymdiffusion eller med mekaniska pumpar, vilka alla kan framkalla olika svar. Det är absolut nödvändigt att lösningskammaren är ordentligt förseglad genom att applicera ett skikt av tätningsmedel fett på kammarens botten som placeras på gliden. De rätta våglängderna måste väljas för sonden. Excitations- och emissionsvåglängder för CatchER + är 395/488 nm respektive 510 nm. För cellbildning används endast 488 nm för excitation för att undvika skadlig effekt av UV-ljus på celler. Användning av några optiska filter som exciterar vid 488 nm och samlar upp emissionen vid 510 nm skulle därför vara acceptabelt att använda för att bilda med CatchER + . För att förhindra fotobildning kan insatser vara inriktade på att optimera ljusintensitet och ljusexponering, såsom ramar / s 33 .
Medan detta protokoll är idealiskt för att analysera effEct av ER / SR förändringar med användning av CatchER + Ca 2+ ER / SR fluorescerande sond, det finns begränsningar som förväntas i något experiment. Eftersom encells levande bildbehandling bara analyserar en liten cellram, kan antalet celler (n) variera från 1-100 celler, men kan vara lägre för större cellinjer. Detta leder till lägre cellnummer och statistiskt varierade resultat utan flera försök. En n> 6 krävs för statistisk noggrannhet. För att få en större n måste många rätter avbildas eller andra tekniker måste användas samtidigt. Dessutom är CatchER + en enkelvåglängd ER / SR Ca 2+ -prob, vilket leder till problem med andra enskilda våglängdsprober och färgämnen med att inte kunna kvantifiera signalen utan att veta om signalen är sann i motsats till cellerna Artefakt och har större brus jämfört med ratiometriska system 34 .
Detta arbete visar att dessa optimerade Ca 2+ -prober kanAppliceras i olika celltyper eller vävnadstyper för att övervaka receptormedierad ER / SR Ca 2+ -frisättning. CatchER + är en enkelvåglängd ER / SR Ca 2+ sond. Därför är det viktigt att de experimentella parametrarna och inställningarna är konsekventa för kvantitativ mätning. En detaljerad kalibrering av kalciumkoncentrationen och Kd av kalciumsensorn i cellinjerna är ytterligare viktiga mätningar för kvantitativ analys.
Dessa utvecklade kalciumsensorer kan också riktas mot specifika platser inom ER / SR för att övervaka de väldigt olika Ca 2+ -transienterna som existerar jämfört med globala Ca 2+ förändringar i olika biologiska och patologiska tillstånd. Dessa resultat kommer fortsätta att driva områdena Ca 2+ bildbehandling och sonddesign framåt för att tillhandahålla framtida verktyg för att diagnostisera Ca 2+ -relaterade sjukdomar. De rapporterade protokollen och den utvecklade sensorn kan också anpassas för läkemedel dTäckningar mot sjukdomar som är förknippade med kalciumsignalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant och ett NIH Supplementary Grant till FR, BB-fellesskap till CM, CDT-fellesskap till RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
