Summary
HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.
Abstract
Hücre dıĢı uyaranlar tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum (Ca2 + ) geçicileri canlılarda çok sayıda biyolojik proses başlatır. Hücre içi kalsiyum salınımının merkezinde, kas hücrelerinde büyük hücreiçi kalsiyum depolama organelleri, endoplazmik retikulum (ER) ve daha özelleşmiş sarkoplazmik retikulum (SR) bulunur. Bu organellerden kalsiyumun dinamik olarak salınması, sarko / endoplasmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası vasıtasıyla yeniden doldurma ile birlikte riyano-nodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R) aracılığı ile sağlanır. ER / SR'den hızlı kalsiyum salımını izlemek için, Catcher adı verilen, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum sensörü (GECI) oluşturuldu. Burada, HEK293 ve C2C12 hücrelerinde gelişmiş ER / SR hedef GECI Catcher + 'ın transfeksiyonu ve ekspresyonu için ayrıntılı protokoller ve IP 3 R, RyR ve SERCA pompa aracılıklı kalsiyum geçiciHEK293 hücrelerinde floresan mikroskobu kullanılarak özetlenmiştir. Seçilen reseptör agonisti veya inhibitörü oda çözeltisine dağıtılır ve yoğunluk değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu yöntemle, ER kalsiyumunda bir azalma, 4-kloro-m-kresol (4-cmc), adenosin trifosfat (ATP) ile dolaylı olarak IP 3 R'yi aktive eden RyR aktivasyonu ve siklopiazonik SERCA pompasının inhibisyonu ile görülür Asit (CPA). Ayrıca in situ K d' yi belirlemek ve C2C12 hücrelerinde bazal [Ca 2+ ] miktarını belirlemek için protokolleri tartışıyoruz. Özetle, Catcher + ile birlikte kullanılan bu protokoller ER / SR kalsiyum ile ilgili patolojilerin incelenmesinde gelecekte uygulanacak olan ER'den reseptör aracılı kalsiyum salımını ortaya çıkarabilir.
Introduction
Hücre içi kalsiyum (Ca 2+ ) geçici maddelerinin uzay-zamansal özellikleri, çeşitli biyolojik fonksiyonları aktive eder 1 . Bu Ca 2+ sinyal olayları hücre dışı olarak farklı uyarılarla tetiklenir ve hücre içi olarak büyük Ca 2+ depolama organelleri ve sayısız Ca 2+ pompalar, kanallar ve Ca 2+ bağlayıcı proteinler tarafından kontrol edilir. Ca 2+ transientleri, sinyal modülasyonlu kusurların bir sonucu olarak farklı hastalıklara yol açarak önemli ölçüde değişebilir 2 . Merkezde endo (ER) ve sarkoplazmik retikül (SR) bulunan Ca 2+ sinyal sisteminin hızı ve karmaşıklığı nedeniyle, hızlı kinetik ile memelilerin ekspresyonu için optimize edilmiş genetik olarak kodlanmış Ca 2+ probları gereklidir Farklı hücrelerdeki küresel ve yerel Ca 2+ değişimlerini gözlemlemek 3 .
ER ve SR, Kas hücrelerindeki muadili, büyük intraselüler Ca 2+ depolama organelleri olup Ca 2+ sinyallerinin amplifiye edilmesine yardımcı olan Ca 2+ lavabo gibi hareket eder. ER / SR, Ca 2+ sinyallerinin ayrılmaz bir parçasıdır ve sinyaller 5 vericisi ve alıcısı olarak ikili rolleri vardır. Riyanodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R), Ca 2+ 6 ile regüle edilen ER / SR membranlarında bulunan Ca 2+ serbest reseptörleridir. Diğer ajanlar doğrudan veya dolaylı olarak bu reseptörlerin işlevini uyarır. 4-kloro-m-kresol (4-cmc), her ikisi de düzenli olarak RyR aracılı Ca 2+ salınımını incelemek için kullanıldığında, SR Ca 2+ salınımını tetiklemek için kafeinden 10 kat daha yüksek bir hassasiyete sahip olan, RyR'nin güçlü bir agonistidir Sağlıklı ve hastalıklı hücreler 7 . ATP, IP 3 aracılı Ca 2+ reIP 3 R 8 üzerinden kiralayın . ATP, bir G-proteine bağlı reseptör (GPCR) olan purinergik reseptör P2YR'ye bağlanır ve IP 3 R'ye bağlanan IP 3 üretimini tetikleyerek Ca 2+ 'yı ER 9 , 10'dan salınır. Sarkoz endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası, aynı zamanda ER / SR zarında bulunan ve sitosolik Ca 2+ miktarını azaltan ve iyonu ER / SR lümenine aktif olarak pompalayarak ER / SR'yi tekrar dolduran bir P tipi ATPaz pompasıdır 11 . SERCA pompasının spesifik önleyicileri, Thapsia garganica'ndan thapsigargin ve Aspergillus ve Penicillium'dan siklopiazonik asit (CPA) içerir . CPA, pompa için düşük afiniteye sahiptir ve Ca 2+ erişim noktasını 12 tersine çevrilebilir şekilde bloke eder. Thapsigargin, diğer yandan, nanomol ile M3 helezonunda F256 kalıntısında Ca 2+ serbest pompaya geri döndürülemez şekilde bağlanırAf affinity 11 . Ca 2+ uyarılmış olaylarla ilgili değişiklikleri analiz etmek ve nicelleştirmek bir sorun olmuştur ve halen bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. ER / SR, Ca 2+ sinyalinin yayılımında merkez işlevli ana hücre içi Ca 2+ ihtiva eden kompartıman olduğundan, ER / SR Ca 2+ sinyalizasyonunu anlama konusunda çok çalışılmıştır.
Sentetik Ca 2 + boyalarının oluşturulması, Ca 2+ görüntülemenin tarla ve uygulamasına yardımcı olmuştur. Mag-Fura-2 gibi boyalar, farklı hücrelerdeki bölümlü Ca 2+ miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 13 , 14 , 15 düzensiz boya yüklemesi, foto-ağartma ve belirli organelleri hedef alamama gibi sınırlamaları vardır . Yeşil floresan protein (GFP) keşfi ve floresan protein-Tabanlı Ca 2+ sondaları Ca 2+ görüntüleme alanını ilerletti 16 . Mevcut GECI'lerin bazıları sarı floresan protein (YFP), camgöbeği flüoresan proteini (CFP), kalmodulin ve M13 bağlayıcı peptid 17 , 18 içeren Förster rezonans enerji transferi (FRET) çiftleri. Troponin C tabanlı GECI'ler, FRET'in CFP ve Sitrin çiftleri olarak ve tekli florofor probları 19 , 20 , 21 olarak da mevcuttur. GCaMP2 ve R-GECO gibi diğerleri, kalmodulin 22 , 23 içeren tekli florofor sensörleridir. Ca2 + bağlanma alanlarında 24 bulunan çoklu Ca2 + bağlanma yerleri ile ilişkili Kd ve kooperatif bağlamanın dar ayarlamanın sınırlamalarını aşmak için yeni bir kalsiyum sınıfı sınıfıSors, gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) 25 , 26'nın kromofor duyarlı bir konumunda beta varilin yüzeyinde Ca2 + bağlama sitesi tasarlanarak oluşturuldu. CatchER olarak adlandırılan bu yüksek duyarlıklı sensör, ~ 0,18 mM'lik bir Kd'ye, difüzyon sınırının yakınında ak'a ve 700 s'lik bir ak'a sahiptir. Catcher, HeLa, HEK293 ve C2C12 25 gibi farklı memeli hücre dizilerinde reseptör aracılı ER / SR kalsiyum salımını izlemek için kullanılmıştır. Hızlı kinetiklerinden dolayı Catcher, genç ve yaşlı Friend Virüs B NIH Jackson (FVB) farelerinin flexor digitorum brevis (FDB) kas liflerinde FDB'de 2 s depolarizasyon sonrasında SR'de daha fazla Ca 2+ kalmış olduğunu göstermek için kullanıldı Eski farelerin elyafları genç farelerinkine kıyasla 27 . Memelinin kalsiyum görüntülemedeki uygulamalarını engelleyen, 37 ° C'de düşük flüoresansının üstesinden gelmek içinCatcher + denilen Catcher'ın geliştirilmiş bir versiyonunu geliştirdik. Catcher + , memeli hücrelerinde daha iyi uygulama için 37 ° C'de gelişmiş floresan sergilemektedir. 37 ° C'de 28 , 29 ° C'de termostabilite ve flüoresanı iyileştirmek için Catcher + ' e ek mutasyon eklendi. Catcher + , Sinyal-gürültü oranına (SNR) Catcher 30'a göre altı kat arttı.
Burada, Catcher + ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürlenmesi ve transfeksiyonu için protokoller ve ER / SR reseptör aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulanması sunulmuştur. Temsilci sonuçlar, 4 cmc, CPA ve ATP ile muamele edilmiş HEK293 hücrelerinde ifade edilen Catcher + için gösterilmiştir. C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d' sini belirlemek için bir protokol de sunuyoruzBazal [Ca 2+ ] ntifikasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slayt Hazırlama
- 6 cm'lik hücre kültürü kaplarında 22 mm x 40 mm'lik cam mikroskop lamı koyun, tabağa 1 slayt yerleştirin.
- Steril bir kaputta sterilize etmek için her slaydın her yanını ve 6 cm çanağı ultraviyole (UV) ışığa 15-20 dakika maruz bırakın.
- Parafilm ile içinde slaytlar bulunan bulguları kapatın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.
2. Medyanın Hazırlanması, Tamponlar, Çözümler ve Reaktifler
- Deiyonize suda 1 L Hank dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın ve 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 ve 1 mM EGTA ekleyin. NaOH ile pH 7.2-7.3'e ayarlayın. Otoklavlanmış bir şişeye 0.22 μm'lik bir filtre ile tampon filtre edin.
- Deiyonize suda 900 mL yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hazırlayın. 44 mM NaHC03 ilave edin ve pH'ı HC1 ile 7.2-7.3'e ayarlayın. Medyayı 0,22 μm'lik bir filtre ile otoklavlanmış bir şişeye süzün. 100 mL fetal boviNe serum (FBS) ortamına% 10 FBS konsantrasyonu yapmak için. 4 ° C'de saklayın.
- Deiyonize suda 1 L intraselüler tampon (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM EGTA, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.25'e ayarlayın. Son [Ca 2+ ] ~ 100 nM olacaktır. Kullanmadan önce 0.5 mM ATP ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
- Deiyonize suda 1 L Ringer tamponu (121 mM NaCl, 2.4 mM K2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 10 mM HEPES ve 1.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanmak için, 50 mL'lik bir alikot 50 mL tüp içine yerleştirin ve 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ekleyin.
- Deiyonize suda 1 L KCl durulama solüsyonu (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.25'e ayarlayın.
- 5 mg iyonomisin 1 mL dimetil sülfoksid (DMSO) içinde eritilir. Mikrotüpler içine 30 uL'lik kısım ayırın ve -20'de saklayın6 ° C.
- CPA'yı DMSO'ya eriterek siklopiazonik asit (CPA) stokunu hazırlayın. Apoptozu önlemek için hücrelere eklenen CPA için DMSO'nun son yüzdesinin ≤% 1 olduğundan emin olun. Filtrelenmiş H20 içine eritilerek ve bir gece boyunca 37 ° C'de çalkalanarak bırakılarak 20 mM 4-kloro-m-kresol (4 cmc) hazırlayın. Filtrelenmiş H20 içerisinde 100 mM'ye eriterek ATP stokunu hazırlayın.
- İn situ Kd'yi belirlemek için , 100 uL'lik bir KCl tamponu içinde 15 mM'lik 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM ve 100 mM Ca2 + MM EGTA stok ve deiyonize su içerisinde çözündürülmüş bir 1 M CaCl 2 stokunu içermektedir.
3. Hücre Kültürü
- Kültür C2C12 miyoblast ve HEK293 hücreleri, steril bir UV kaputunda her biri 10 cm'lik hücre kültürü kapları kullanan ATCC protokollerine göre.
NOT: C2C12 hücrelerinin ~ 70% konfluansa oranla daha fazla büyümesine izin verilmemelidir, çünkü miyoblastlar farklılaşmaya başlarMiyotüpler içine te. Hem HEK293 hem de C2C12 hücreleri kolayca büyür ve hücre bütünlüğünü korumak için% 100 konfluenasyondan sonra büyümesine izin verilmemelidir. Buna ek olarak, hücrelerin sağlığını korumak için bir denemede kullanmadan önce hücreler, 10 kereden fazla pasajlanmamalıdır.
4. HEK293 Hücrelerinin Transfeksiyon Edilmesi
- Tohumlanmış HEK293 hücreleri 6 cm'lik tabaklardaki sterilize edilmiş 22 mm x 40 mm cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilir, böylece transfeksiyon gününde ~% 70 konfluent olurlar.
- Ertesi gün, indirgenmiş serum ortamında ( örn. Opti-MEM) 2 μg Catcher + cDNA ve 1: 3 (ağırlık / hacim) DNA: transfeksiyon reaktif oranı kullanarak transfekte reaktifinin üreticinin protokolünü takip edin.
- DMEM ortamını çanaktan boşaltın ve 3 mL düşürülmüş serum ortamı ekleyin. DNA ekleyin: transfeksiyon reaktif karışımı çanak ve 4-6 saat 37 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra hücreleri 5-6 mL HBSS ile yıkayın. HBSS'yi atın fÇanak ve yerine 3 ml taze DMEM ile değiştirin ve GECI ekspresyonuna izin vermek için 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- C2C12 miyoblast hücrelerinin transfeksiyonu
- C2C12 miyoblast hücreleri için, çanak (1-2 mL) altını örtecek kadar tripsin ekleyerek hücreleri tripsinleştirin. Tripsinin tabağın altındaki hücrelerin gevşetilmesine izin vermek için 2-6 dakika 37 ° C inkübatörde çanağı yerleştirin.
- Kuluçka tamamlandıktan sonra tripsin çıkarın ve hücreleri 8 mL DMEM içinde aspire edin. DMEM ile hücreleri iyice pipetleyin ve te hücrelerini tekrar süspanse edin ve yeniden süspanse edin ve 3 cm'lik DMEM içeren 6 cm'lik hücre kültürü kaplarında steril lamellerin üzerine tohumlayın böylece böylece nihai konfluenasyon% 60 olacaktır.
- Adım 4.2-4.3'te özetlendiği gibi hücreleri aynı güne nakledin. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Adım 4.4'ü tekrarlayın.
5. Slayt ve Floresan Mikroskop Hazırlama
- M açınMikroskop ve ışık kaynağına bağlayın, ardından Basit PCI programını açın. Mikroskopun 15-20 dakika boyunca veya şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamerası -65 ° C'ye soğuyana kadar ısınmasına izin verin. Odayı hazırlayın ve beklerken hücrelerle birlikte sürün.
- Düşük profilli açık elmas banyosu görüntüleme bölmesinin tabanını, pamuklu çubukla ince bir tabaka yapıştırın.
- İnkübatörden transfekte edilmiş hücreler içeren slayt alın ve 1 mL Ringer tamponu ile 10 mM glikoz ve 1.8 mM Ca 2+ 37 ° C'de önceden ısıtılmış üç kez yavaşça durulayın.
- Hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL Ringer tamponunu çanakta bırakın ve çanağın dışına çıkarmak için forseps kullanın. Aşırı solüsyonun bir laboratuar dokusunda slaytun kenarına dokunarak bir laboratuar dokusunda emilmesine izin verin. Ardından, gres içeren bölmenin yanındaki hücrelerin yağa doğru bakmasını sağlayın ve bir tornavida kullanarak sahne montajına sabitleyin.
- 1 ekleML Ringer tamponu hücrenin sahne üzerine monte edilmesi ve mikroskop kurulumunun geri kalan kısmının tamamlanması sırasında kurutulmasını önlemek için hazneye gelmektedir. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan sonra hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL'dir.
- 40X yağ daldırma objektif mikroskop objektif geçin.
- Amacı temizlemek ve kurutmak için lens kağıdı ve lens temizleme solüsyonunu kullanın. Amacı ovmayın. Yüzey temiz olana kadar yavaşça dikkatle dokundurun.
- Amaçya daldırma yağının bir damla ekleyin.
- Mount mikroskop sahneye yerleştirin ve odasına vakum ucu ekleyin. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan ve açıldığında, hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL'dir. Bu nihai hacim, odanın kenarlarıyla aynı seviyededir. Deney sırasında, aşırı doldurma nedeniyle çözeltinin objektifin içine dökülmesini önlemek için oda çözeltisinin düz olması zorunludur.
- Parlak alan modunu kullanarak kazançları 175'e, pozlama süresini hücreleri odaklamak için 0,03 saniyeye ayarlayın.
- Hücreler odaklandığında, 488 nm uyarılmayı kullanarak floresans moduna geçin. Pozlama süresini 0,07 saniyeye değiştirin. Görüntü için yeterli flüoresan ile sağlıklı olan yeterli hücrelere sahip bir görüş alanını bulun.
- Bir görüş alanı seçildikten sonra, flüoresan ve parlak alan modunda fotoğraf çekin.
- Hücrelerde bir ilgi alanını (ROI) daire içine yerleştirin veya seçilen bölgedeki yoğunluğu kaydetmek için tüm hücrenin etrafını sarın.
6. İlaca bağlı Ca 2+ Geçici ve Yerinde K d Kalibrasyonunun Görüntülenmesi
- Her 5 saniyede bir ayarlanan kare hızıyla yoğunluk ölçümünü başlatın.
- Baz yoğunluğunun 20-30 çerçeve (100-150 s) boyunca sabit kalmasına izin verin. Gerekirse fr azaltınAmes / s, bu aşamada fotokopelliğin önlenmesi için.
- 200 uM'lik bir nihai konsantrasyon sağlamak için ~ 450 mcL'lik son bölme hacmine dayanan 20 mM'lik bir stoktan gerekli 4 cmc'lik miktarı hesaplayın. Stokların dilüsyonlarını gerektiği gibi yapın.
- Dikkatle bölmeden 60 μL Ringer tamponunu alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hesaplanan miktarı 4 cmc'ye bu çözeltiyle seyreltin ve görüntülenecek hücrelerden istenen tepkiyi uyandırmak için bölmeye geri ekleyin.
- Hesaplanan miktarı 4 cmc'lik mikrosantrifüj tüpüne ilave edin ve pipetleme ile karıştırın.
- Eşzamanlı olarak yoğunluk ölçüsünde etkinlik işaretleyicisini eklerken, görüş alanına solüsyonu hafifçe ekleyin.
- İlaç reseptöre bağlanma ve ardından sinyal azalması için zaman tanıyın, ardından etkinlik işaretleyicisini eklerken 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ile 3-6 mL Ringer tamponu ile yıkayın. Oda hacmi 450 &# 181; L ve bir vakuma bağlı, 3-6 mL tampon eklenerek ilacın bulunduğu eski solüsyonun yıkanması ve yerine yeni eklenen solüsyon ile değiştirilmesi sağlanır.
- Her tahlil için transfekte edilmiş hücrelerin yeni bir slaydı kullanılarak 100 uM ATP ve 15 uM CPA için 6.1-6.7 tekrarlayın.
- Ölçüm tamamlandıktan sonra yoğunluk ölçüm penceresindeki Veri toplama işlemini Basit PCI programında sonlandırın.
- Hücrelerin floresan ve parlak görüntülerini alın.
- Deney için veri dosyasını açın. Burada, gerekirse yoğunluk değerlerini yeniden hesaplamak için ilgili hücreleri veya bölgeleri tekrar daire haline getirin.
- C2C12 miyoblast hücrelerinde in situ K d' yi belirlemek için, bölüm 4.2 ve bölüm 5'de özetlendiği gibi protokolü uygulayın ve bölmede 1 mL, 0 mM Ca 2+ Ringer tamponu koyun.
- Hücreleri, hücre içi tamponda 0.002-0.005% saponin ile 15-30 saniye boyunca Permeabilize ederek herhangi birinin hücrelerini boşaltın.Catcher + sitosolda olabilir. Hücreleri, 10 uM ionomisin ile KCl tamponu içinde 3-6 mL 1 mL EGTA ile yıkayın. Bir platoya erişinceye kadar yoğunluğun düşmesine izin verin.
- 10 uM ionomisin ile 3-6 mL KCl tamponu ile durulayın ve yoğunluğun dengelenmesine izin verin, ardından adım 2.7'de detaylandırılan her Ca 2+ solüsyonunu ekleyin. Her ilavenin yoğunluğunun bir platoya erişmesine izin verin.
- Algılayıcıyı bazal [Ca 2+ ] ölçümü için kalibre etmek için adım 6.12'yi izleyin. Minimum ve maksimum floresans yoğunluğunu elde etmek için adım 2.7'deki EGTA ve 100 mM Ca 2+ tamponunu kullanın.
7. Veri İşleme
- Yoğunluk ölçüm verilerinin elektronik tablo dosyasını indirin.
- Her bir hücre için verileri taban çizgisi yoğunluğuna (F / F 0 ) göre normalleştirin. Herhangi bir grafik programında zamana karşı normalleştirilmiş verileri çizin.
- % Değişimini hesaplamak için, normalleştirilmiş tepe değerini çıkarınUe'dan 1'e çarpın ve 100 ile çarpın. Birden fazla hücre görüntülendiğinde ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
- SNR sinyalini hesaplamak için, deneyden kaydedilen görüntü dosyasını ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında açın ve sinyali, transfekte hücreleri ve gürültüyü, arka planı ölçün. SNR = sinyal / gürültü denklemini kullanarak SNR'yi hesaplayın.
- Toplanan floresans görüntüleme verilerinden in situ Kd'yi hesaplamak için, her Ca2 + konsantrasyonunun ve EGTA'nın (0 mM Ca2 + ) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verisinin ortalamasını alın. Θ, göreli yoğunluk, F, herhangi bir noktadaki flüoresan, F min minimum floresan yoğunluğu olduğu durumda, θ = (F - F min ) / (F max - F min ) kullanılarak kesirli doygunluğun (göreli yoğunluk) hesaplanması ve Fmax, t yoğunluğundaki değişimi görmek için maksimum floresans yoğunluğudurMinimum yoğunluğa kıyasla Ca 2+ ilavesi ile sondaj yapar. Herhangi bir grafik ve eğri uydurma programında [Ca 2+ ] karşı göreli yoğunluk verilerini çizin. K d hesaplamak için herhangi bir grafikleme ve eğri uydurma programı için tercüme edilmiş 1: 1 bağlanma denklemi θ = [M T ] / (K d + [M T ]) kullanın. M T toplam metal konsantrasyonudur.
- 6.13'te özetlenen kalibrasyondan alınan bazal kalsiyumun miktarını belirlemek için, 1 mM EGTA (Fmin) ve 100 mM Ca2 + (Fmaks) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verilerini ortalaması alın. Bazal kalsiyum hesaplamak için kalibrasyon denklemi [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm, ER / SR Ca 2+ değişikliklerini farklı reseptör aracılı yollarla izlemek için optimize edilmiş ER / SR hedef GECI Catcher + kullanılarak önceden açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen sonuçları gösterecektir.
Şekil 1 , 200 uM 4 cmc ile uyarılan RyR boyunca boşaltılmayı göstermektedir. 4 cmc, RyR'nin bir agonistidir. İlacın ilavesi, Catcher + floresan yoğunluğundaki azalma ile ölçülen ER kalsiyumunda bir düşüşe neden olur. İşaretlendiği gibi, burada özetlenen protokol, ER Ca 2+ ' daki değişiklikler hakkında bilgi sağlayan Catcher + ' ı kullanarak reseptör aracılı Ca 2+ transientlerin görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar.
Şekil 2'de gösterildiği gibi, 1SERCA pompasını tersine bloke etmek için 5 uM CPA, bir plato oluşturan floresan yoğunluğunda büyük bir azalma meydana getirir. SERCA pompasının fonksiyonu engellendiğinde, ER Ca 2+ serbest bırakma kanalları hala Ca 2+ 'yı sitoplazmaya aktif olarak salmaktadır ve floresan yoğunluğunun azalmasına neden olmaktadır. Hücreler CPA'yı 1.8 mM Ca2 + ve 10 mM glukoz içeren Ringer tamponuyla yıkadıktan sonra iyileşirler. Bu sonuçlar, Catcher + 'nın SERCA pompasına özgü Ca2 + geçişlerini izleyebilme kabiliyetini teyit eder.
Şekil 3 , Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde IP 3 R'nin 200 uM ATP ile dolaylı olarak aktive edilmesi için temsili verileri göstermektedir. ATP, IP 3 R yoluyla Ca 2+ salınımını aktive eden IP 3 üreten bir G-proteini eşlenmiş reseptör olan P2Y reseptörüne bağlanır.Küçük olsa da, 200 μM ATP ilavesi, sinyal yoğunluğunda görünür bir azalma meydana getirir. Hücrelerin 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz içeren Ringer tamponu ile yıkanması, ER'ye yeniden doldurulmasını ve sinyalin taban çizgisine dönmesini sağlar. Bu sonuçlar, Catcher + 'nın dolaylı uyarılma yoluyla IP 3 R aracılı kalsiyum salınımını izleyebilme yeteneğini vurgulamaktadır.
Şekil 4'te , Catcher + , in situ Kd'yi belirlemek için C2C12 miyoblast hücrelerine nakledildi. Veriler protokolde belirtildiği gibi toplandı. C2C12 miyoblast hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, sonra 10 uM ionomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı. Çeşitli Ca2 + konsantrasyonları 10 uM iyonomisin ihtiva eden KCl tamponu içinde hazırlandı ve kademeli olarak ilave edildi. Veriler normalleştirildi ve 1: 1 bağlama kullanılarak takıldıIng denklemi. 7 hücre için ortalama Kd, 3.1 ± 1.4 mM idi. Catcher + 'un zayıf afinitesi, ER veya SR gibi yüksek Ca 2+ organellerinde Ca 2+' yu hissetmesini sağlar. SR'de bazal [Ca 2+ ] 'yi belirlemek için, C2C12 hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, KCl tamponu ile yıkandı ve daha sonra F mıkanasını elde etmek için 10 uM iyonomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı . EGTA'yı KCl tamponu ile yıkadıktan sonra, 10 uM iyonomisin ile 100 mM Ca 2+ maksimum bir Fmax ilave edildi. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı.
Şekil 1: HEK293 hücrelerinde 4 cmc kullanılarak RyR'nin uyarılması. ( A ) RyR'nin 4 cmc ile aktivasyonunun tasvir edilmesi. ( B ) HEK293 hücrelerinin yoğunluk kaydıER'de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş, 200 uM 4 cmc ile muamele edilmiştir. RyR'nin 4 cmc ile stimüle edilmesi, normalize flüoresan yoğunluğunda, [Ca 2+ ] ER'deki bir azalmayla direkt olarak korelasyona neden olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 12.0 ± 2.2 idi. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER'yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. Çizilmiş resimler, hücreleri 4-cmc ile tedavi öncesi ve sonrası göstermektedir. SNR, 4.3 ± 0.8 olarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Tersinir SERCA p'yi kullanarak [Ca 2+ ] ER'de azalmaHEK293 hücrelerinde ump inhibitörü CPA. ( A ) CPA ile SERCA pompasının inhibisyonu. ( B ) 15 μM CPA ile tedavi edilen ER'de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin canlı görüntülemesi. Ca 2+ hala IP 3 R ve RyR'den akabildiğinden, SERCA pompasını CPA ile bloke etmek, normalize floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olur ve bu da doğrudan [Ca 2+ ] ER'de bir azalmaya karşılık gelir. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Çizilmiş resimler, tedavi öncesi ve sonrası Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleridir. Ortalama sinyal azalması% 21.0 ± 0.3'tü. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER'yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. SNR, 5.5 ± 0.8 olarak hesaplandı. Daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.bu figür.
Şekil 3: ATP, HEK293 hücrelerinde [Ca 2+ ] ER'yi azaltır. ( A ) IP 3 R'nin ATP ile P2YR purinerjik reseptörü aracılığıyla dolaylı olarak aktivasyonunun şeması. P2YR, ATP'ye bağlandığında IP 3 üreten bir GPCR'dir. IP 3 , ER'den kalsiyum salınmasını uyaran IP 3 R'yi aktive eder. ( B ) 200 uM ATP ile tedavi edilen ER'de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin gerçek zamanlı görüntülemesi. ATP ile P2Y reseptörü aracılığıyla IP 3 R'nin dolaylı uyarımı, normalize edilmiş floresan yoğunluğunda, doğrudan [Ca 2+ ] ER'de bir düşüşle bağlantılı olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 6.0 ± 3.0'dır. SNR c6,7 ± 2,7 olarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d' si. Catcher + ile transfekte edilmiş permeabilize edilmiş C2C12 miyoblast hücrelerinden toplanan normalize yoğunluğun temsili izi. Hücreler, hücre içi tamponda% 0,005'lik saponin ile 15-30 s süreyle permeabilize edildi. EGTA ve Ca 2+ solüsyonları KCl tamponu içerisinde hazırlanmış, n, görüntülemiş hücre sayısını belirtir. ( A ) Gelen floresan görüntüleri, tedaviden önce ve sonra hücrelerin temsilcisidir. 10 uM varlığında permeabilize C2C12 miyoblast hücrelerine 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 ve 100 mM Ca2 +3.1 ± 1.4 mM bir Kd elde etmek için İyonomisin kullanılmıştır. ( B ) Inzet flüoresans görüntüleri sırasıyla 10 uM ionomisin ile 1 mM EGTA ve 100 mM Ca 2+ eklendikten sonra, minimum ve maksimum değerlerde hücrelerin temsilcisidir. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Catcher + gibi flüoresan probların canlı tek hücreli görüntülemesi, reseptör agonistlerine veya antagonistlerine yanıt olarak her bir hücredeki karmaşık ER / SR Ca 2+ sinyalleme süreçlerini analiz etmek için etkili bir tekniktir. Bu teknik, sırasıyla hem ER hem de sitozolik kalsiyum değişikliklerini izlemek için birlikte Fura-2 için veya Catcher + ve Rhod-2 görüntüsü için gerekli olan gibi, aynı anda birden çok dalga boyunu kullanan görüntüleme için de yararlıdır. Bu protokolde birkaç kritik adım vardır; Hücre transfeksiyonunun görüntüleme canlılığı üzerinde büyük etkisi olabilir. Düşük transfeksiyon oranları, kalsiyum yanıtlarını izlemek için GECI'nin yetersiz ekspresyonuna neden olabilir. Öte yandan, Catcher + 'yı aşırı ifade etmek, sentetik kalsiyum boyaları ile ilgili bir sorun olan ER / ER Ca 2+ üzerinde bir tamponlama etkisi oluşturmaz. Ca 2+ sondalarının tamponlayıcı etkileri, organelle'deki [Ca 2+ ], p'nin K d' inden etkilenirElbise ve ölçüm için gerekli olan prob konsantrasyonu. Sitosolik [Ca 2+ ], tipik olarak düşük nanomolar aralıktadır, ancak gerekli prob konsantrasyonu karşılaştırılabilir bir aralıktadır. Bu durumda, sitosolik kalsiyumu tamponlamada boya konsantrasyonunun ve bunun kabiliyetinin miktarı hücresel görüntüleme için büyük bir endişe kaynağıydı ve bu da büyük bir endişe kaynağıydı. Aksine, farklı memeli hücre soyları 25 için belirlendiği üzere, ER / SR [Ca 2+ ] 100 mikromolar ila milimolar aralığı 31'dedir. Catcher + 'ın 0.1-1 μM ekspresyonu, ER kalsiyumunun tespit edilmesini sağlamak için yeterlidir, Catcher'in tamponlama etkisi önemsizdir. Böylece Catcher + , Ca 2+ akığını yüksek [Ca 2+ ] ortamlarda luminal ER / SR Ca 2+ 32 üzerinde tamponlama etkisi olmadan izleyebilir.
GECI'nin transfeksiyon verimliliğini etkileyebilecek birkaç faktör, inkübasyon süresi,E transfeksiyon reaktifi, kuluçka sıcaklığı ve hücre konfluansı. Hücreleri slaytta tohumlarken hücre konflueni görüntüleme kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Düşük konfluyon düşük hücre sayısına (n) ve daha az istatistiksel doğruluka neden olurken yüksek konfluen seviyeler görüntülemede büyük değişkenler üreten hücrelerin üst üste binmesine yol açar. Transfeksiyon için zaman ve sıcaklık, hücre türüne göre optimize edilmelidir. Buna ek olarak, azaltılmış serum ortamı ile DMEM eklenmesi, apoptozu önlemek için daha uzun transfeksiyon süreleri için optimaldir. Memeli hücrelerde orijinal GECI Catcher floresansı, kültürlendiğinde ve transfekte edildiğinde sadece 30 ° C idi. Catcher'in flüoresansı, 37 ° C'de ekspresyon için başarıyla optimize edildi ve geliştirildi, sonuçta yeni geliştirilmiş Catcher + geliştirmesi sağlandı. EGFP'ye karşı bir antikor kullanan bir batı leke, Ca2 + sondasının ekspresyonunu teyit etmek için gerçekleştirilebilir.
Üstelik beniReaktif teslimatının tutarlılığı ve önemi kritiktir. Reaktifler odaya perfüzyon, küçük hacimli difüzyon veya mekanik pompalar ile eklenebilir, bunların hepsi farklı tepkiler verebilir. Çözüm haznesinin, haznenin dibinde, slaydın üzerine yerleştirilecek bir sızdırmazlık macunu gres örtüsü uygulayarak düzgün şekilde kapatılmış olması zorunludur. Prob için doğru dalga boyları seçilmelidir. Catcher + için uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 395/488 nm ve 510 nm'dir. Hücre görüntüleme için, UV ışığının hücreler üzerindeki zararlı etkisini önlemek için uyarılma için sadece 488 nm kullanılır. Bu nedenle, 488 nm'de uyaran ve 510 nm'de emisyonu toplamayan herhangi bir optik filtreyi kullanmak, Catcher + ile görüntü oluşturmak için kabul edilebilir olacaktır. Fotobirik oluşumunu önlemek için ışık yoğunluğunu ve çerçeve / s 33 gibi ışık hassasiyetini optimize etmek için yoğun çaba sarf edilebilir.
Bu protokol, etkinliği analiz etmek için ideal olsa daER / SR değişiklikleri, Catcher + Ca 2+ ER / SR floresan probu kullanılarak değiştirildiğinde, herhangi bir deneyde beklendiği gibi sınırlamalar vardır. Tek hücreli canlı görüntüleme yalnızca küçük bir hücre kümesini analiz ettiğinden, hücrelerin sayısı (n) ortalama 1-100 hücre arasında değişebilir, ancak daha büyük hücre hatları için daha düşük olabilir. Bu, hücre sayısının azalmasına ve birden fazla denemeden istatistiksel olarak farklı sonuçlara yol açar. İstatistiksel doğruluk için bir n> 6 gereklidir. Daha büyük bir n elde etmek için, birçok yemekler görüntülenecek veya diğer teknikler aynı anda kullanılmalıdır. Ayrıca, Catcher + , tek bir dalga boyu ER / SR Ca 2+ probudur, bu sinyali nicelemek mümkün olmayan diğer tek dalga boyundaki sondalar ve boyalar ile ilgili sorunlara yol açar, hücrenin bozulmasına karşı sinyalin doğru olup olmadığını bilmemektedir Artifaktı ve ratiyometrik sistemlere nazaran daha büyük gürültüye sahip 34 .
Bu çalışma, bu optimize Ca 2+ sondaların,Reseptör aracılı ER / SR Ca 2+ salınımını izlemek için farklı hücre tiplerinde veya doku tiplerinde uygulanabilir. Catcher + , tek bir dalga boyundaki ER / SR Ca 2+ probudur. Bu nedenle, deneysel parametrelerin ve ayarların niceliksel ölçüm için tutarlı olması önemlidir. Kalsiyum konsantrasyonunun ve K d kalsiyum sensörünün hücre çizgilerinde ayrıntılı bir kalibrasyonu niceliksel analiz için ek önemli ölçümlerdir.
Bu gelişmiş kalsiyum sensörleri, çeşitli biyolojik ve patolojik koşullardaki küresel Ca 2+ değişimlerine kıyasla var olan, büyük ölçüde farklı Ca 2+ geçişlerini izlemek için ER / SR'deki belirli lokasyonlara da hedef olabilir. Bu bulgular, Ca 2+ ile ilişkili hastalıkların teşhisinde gelecek araçları sağlamak için Ca 2+ görüntüleme ve sonda tarama alanlarını ilerletmeye devam edecektir. Bildirilen protokoller ve gelişmiş sensör ilaç d için de uyarlanabilirKalsiyum sinyaliyle ilişkili hastalıklara karşı korunma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant tarafından finanse edildi ve NI, FR, BB bursundan CM, CDT bursuna RG'ye bir Yardım Masası ek yardımı ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
