Summary
Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.
Abstract
유전자 변형된 마우스 모델의 증가 최근 몇 년 동안에서 가능한 되고있다. 또한, 약리 연구에서 쥐의 수는 높다. 이 마우스 모델의 phenotypic 특성에는 심장 기능과 형태학의 검사를 필요합니다. 심장 초음파 및 자기 공명 영상 (MRI)은 심장 기능과 마우스 형태학 특성을 일반적으로 사용 되 접근법입니다. Echocardiographic 및 MRI 장비 전문 사용 작은 설치류에 비싼 하 고 전용된 공간이 필요 합니다. 이 프로토콜 15 MHz 인간의 혈관 프로브 임상 echocardiographic 시스템을 사용 하 여 마우스에 심장 측정을 설명 합니다. 측정은 마 취 성인 쥐에 수행 됩니다. 적어도 3 개의 이미지 시퀀스는 기록 하 고 parasternal 짧은 축 보기에서 M 모드에서 각 동물에 대 한 분석. 나중에, 심장 조직학 검사 수행 및 cardiomyocyte 직경 hematoxylin에 결정 됩니다-오신-또는 밀 세균 agglutinin (WGA)-파라핀 섹션 스테인드. 배 밀도 Pecam-1 immunostaining 후 결정된 morphometrically입니다. 프로토콜 약리 연구에 성공적으로 적용 하 고 다른 유전 동물 모델의 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (영구 결 찰 하 여 실험적인 심근 경색 후에 뿐만 아니라 초기 조건 되었습니다. 젊은이)입니다. 우리의 경험에서는, echocardiographic 조사 마 취 동물에 제한 되 고 적어도 무게 성인 쥐에 가능 25 g.
Introduction
유전자 변형된 마우스 모델의 큰 다양 한 사용할 수 있습니다, 하 고 약리 연구에서 쥐의 수는 높은1,2. 심장 초음파 및 MRI은 심장 기능과 형태학이 마우스 모델3의 phenotypic 특성 일반적으로 사용 되 접근법입니다. 제시 프로토콜의 목적은 심장 기능과 성인 쥐에 형태 분석입니다. 그것은 echocardiographic, 조직학, 결합 및 immunohistochemical 측정. Echocardiographic 시험 쥐4,5,6,7,,89,10,11에서 널리 이용 된다 12. Pachon 외. 11 식별 205 연구 2012과 2015 사이의 순환, 순환 연구, 미국의 저널의 생리-심 혼과 순환 상 생리학, 및 심장 혈관 연구 에 게시 동물에 echocardiographic 검사를 사용합니다.
심장 초음파는 심장 고기 유전자 변형된 쥐5,6,13,,1415,16, 를 식별 하는 데 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, 또한 만성 과부하 유발 비 대, 심근 허 혈, 및 쥐 (12에서 검토) 심장 근육 병 증 모델에서 심장 기능 분석으로. 향상 된 심장 초음파 장비에 대 한 수는 왼쪽 심 실 (LV) 수축 기 및 diastolic 차원, 조직 도플러 영상, 심근 대비 진단법, 그리고 라스베가스 지역 기능과 관상 예비 의 평가의 표준 측정 12. 이상적으로, echocardiographic 시험 수축 기능, 자율 반사 제어에 마 취의 부정적인 영향을 피하기 위해 의식 쥐에서 수행 해야 하 고 심장 속도11. 그럼에도 불구 하 고,이 방법은 동물; 훈련 요구에 의해 제한 됩니다. 안정적인; 체온 유지에 어려움 운동 유물; 스트레스; 매우 높은 심장 주파수; 그리고 동물의 많은 수는 조사 하는 경우에 특히 실험을 수행 하기 위해 두 개 이상의 조사에 대 한 요구 사항. 흥미롭게도, 최근 연구 보고 훈련 하 고 훈련 되지 않는 동물19에 echocardiographic 매개 변수에서 차이가. 우리는 마 취 쥐에 echocardiographic 측정을 수행합니다. 다른 마 취 프로토콜 아래에 설명 될 것 이다.
비록 표준 해상도 심장 초음파 (> 10 MHz)은 측정 LV 수축 기 및 diastolic 크기와 성인 쥐에 심장 기능에 충분 한, 메서드를 기본 구조 현상의 설명에 제한 됩니다. 따라서, 우리가 결합 조직학을 vivo에서 측정 및 측정, 예를 들어 cardiomyocyte 직경 및 배 밀도를 immunohistological 분석. 동일한 유형의 다른 조직학 및 immunohistological 조사, 확산의 결정, apoptosis, 경색 크기 측정, 섬유 증, 및 특정 마커 식의 검사를 수행할 수 있습니다. 조직 처리 하지만이 프로토콜의 대상이 되지 않습니다. 조직학 분석 비보에 echocardiographic 시험의 기본 구조 변경에 대 한 추가적인 통찰력을 제공합니다. 추가 단계에서 우리는 분자와 울트라 구조 조사와이 측정을 완료할 수 있습니다. 조직학 분석 echocardiographic 시험 완료 뿐만 아니라 또한 불가결 될 때 심장 초음파의 해상도 충분 하지 않습니다. 이것은 유전자 변형된 생쥐 배아 치명적인23,24의 모델의 경우 특히.
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Protocol
여기에 설명 된 실험 관련 기관 및 프랑스 동물 복지 법률, 지침 및 정책에 따라 실시 했다. 그들은 프랑스 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 (위원회 회의 Institutionnel d ' Ethique 부 l ' 동물 드 응용; 번호 후부 터/2012-106).
1. 심장 초음파
- 꼬리 가볍게 잡고 적절 한 위치를 표준 실험실 균형을 사용 하 여 마우스의 몸 무게를 확인.
- 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26의 복 (i.p.) 주입에 의해 동물 anesthetize.
참고: 연구를 통해 동일한 프로토콜을 사용 하는 경우 마 취의 다른 종류를 사용할 수 있습니다. 장단점은 아래에 설명 될 것 이다. - 마우스 응답 하지 않는 때까지 그것의 자신의 감 금 소 및 대기에 다시, 그것은 보여줍니다 지속적인 호흡, 그리고 후방 발 반사는 결 석. 이 테스트 하려면 약간 발을 짜 내 고 다리는 여전히 리트랙트 여부 관찰.
- 왼쪽 흉부와 상업 설치류 면도기를 사용 하 여 왼쪽된 겨드랑이 면도.
참고: 전용된 설치류 면도기를 사용 하 여 정밀한 마우스 머리의 완전 한 제거를 위한 echocardiographic 측정에 간섭을 유발 하지 않도록 허용 됩니다. 상업적인 머리 제거 크림 또는 솔루션 피해 야 한다로 그들은 일반적으로 향수, 그것은 일어나 야 후 동물을 방해 합니다. 열 손실을 증가, 과도 한 면도 하지 마십시오. - 따뜻한 패드 12 머리 얕은 왼쪽 양면 위치, 40-42 ° C로 설정 자 고 동물을 넣어 o ' 시계와 6 꼬리 o ' 시계. 테이프로 왼쪽된 팔, 왼쪽된 다리, 그리고 꼬리 수정.
- 적용 사전 예 열 변환기의 머리 면도 가슴에 심장 초음파 젤.
- 배치 변환기 parasternal-왼쪽, 젖꼭지 근육의 수준에 2 차원 (2D) parasternal 긴 축 보기를 목의 오른쪽으로 그것을 지시 합니다. Papilary 근육 수준에서 짧은 축 보기를 시계 방향으로 90 ° 변환기를 설정 합니다. 최소 깊이 설정과 확대/축소를 사용 하 여 이미지 품질 및 프레임 속도 최대화 하기 위해. 스윕 속도 최대로 설정.
이러한 설정, 다른 확대/축소 및 깊이 옵션 설정
- 컴퓨터와 소프트웨어에 따라 사용할 수 있습니다. 2D 기반 M 모드 이미지를 기록 짧은 축에 27 볼. 그림 1A와 B 27을 참조 하십시오.
참고: 주의 가슴에 과도 한 압력을 적용 하지 않도록이 bradycardia을 발생할 수 있습니다.
- 컴퓨터와 소프트웨어에 따라 사용할 수 있습니다. 2D 기반 M 모드 이미지를 기록 짧은 축에 27 볼. 그림 1A와 B 27을 참조 하십시오.
- 각 동물에 대 한 3 마음 이길 시 네 루프의 기록 이상 3 시리즈.
참고:이 연구에 사용 된 echocardiograph 소프트웨어에 대 한 누르십시오는 " 취득/저장 " 버튼을 한 번만. 이 방법론은이 특정 소프트웨어와 함께 echocardiograph에 적용 됩니다. 다른 컴퓨터와 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. - 성공적인 기록, 닦아는 심장 초음파 젤 마우스 흉부, 생리대, 및 변환기에서 후. 사지 및 꼬리에서 테이프를 제거.
- 관찰 하 난방 패드, 손실을 방지 하기 위해 불필요 한 빛 노출 및 열, 최대 절전 모드 해제 될 때까지 조직으로 덮여에 마우스를 두고
- 동물의 장에 다시.
- 분석 parasternal 짧은 축 보기 왼쪽된 심 실 (LV) 치수 및 기능 결정에서 M 모드 이미지 기록. Systole와 심장 (LVAWs 및 LVAWd), LV 내부 끝 심장 수축 및 끝 확장기 직경 (LVIDs 및 LVIDd), 및 systole와 심장 (LVPWs 및 LVPWd)를 사용 하 여 LV 후부 벽 두께 (LVPW)에서 LV 앞쪽 벽의 두께 측정 합니다 저장 된 이미지에 조직 혈액 인터페이스의 식별.
- 명백한 최대한 LV 확장기 차원 시 확장기 치수를 측정 하 고 끝 심장 수축 차원 LV 후부 벽의 가장 앞쪽 수축 여행 시 LV. 터치 스크린에 꼭지는 " 분석 " 아이콘 다음에 " LVAWd " 아이콘. 오른쪽 심 실 구멍 및 심장에 LV 앞쪽 벽 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스 위치.
- 전자 캘리퍼스 LV 앞쪽 벽와 LV 확장기 앞쪽 벽 두께를 LV 구멍 사이의 인터페이스에 위치, 소프트웨어 직접 LV 내부 끝 확장기 측정으로 전환 됩니다.
- LV 구멍 및 LV 직경 내부 끝 확장기를 LV 후부 벽 사이의 인터페이스에는 캘리퍼스를 위치, 소프트웨어 LV 후부 벽 두께 측정으로 전환 됩니다.
- LV 후부 벽과 LV 확장기 후부 벽 두께를 심장 막 간의 인터페이스에는 캘리퍼스를 배치 합니다. LV 수축 차원에 대 한 스크린에 터치에는 " LVAWs " 아이콘 및 위치 오른쪽 심 실 구멍 및 LV 앞쪽 벽 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스 systole.
- LV 앞쪽 벽와 LV 수축 앞쪽 벽 두께를 LV 구멍 사이의 인터페이스에 전자 캘리퍼스를 배치 합니다. LV 내부 끝 수축 기 직경 및 LV 수축 후부 벽 두께 대 한 위에서 설명한 대로 프로세스를 반복 합니다. 심장 초음파 검사의 미국 사회에 의해 채택-첨단 규칙을 사용 하 여 추적 endocardial epicardial 테두리 13 , 27.
참고: LV 수축 함수 매개 변수 자동으로 계산 됩니다 이전 측정을 사용 하 여. 분수 (FS) 단축 LV FS (%)로 정의 됩니다 [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd =] x 100. LV 방출 분수 (EF) 수정된 Teicholz 수식으로 계산 됩니다 어디 EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. 그림 1A와 B를 참조 하십시오. - USB 메모리 스틱 또는 콤팩트 디스크에 데이터를 저장 하 고 백업 복사본.
- 가져오기, 분석, 그리고 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 내보냅니다.
참고: 이러한 기준선 측정 후 실험 수 일시 정지 됩니다. 녹아웃 동물 및 야생-타입 littermates 사이 직접적인 비교를 수행 하는 경우 진행 조직학 분석 6. Cre-ERT2;에 대 한 lox/lox 마우스 라인 설명된 5 , 24로 i.p. 주입 tamoxifen 유도 함께 다음 날 계속. Echocardiographic 측정 후 직접 수술을 수행할 수 왼쪽된 관상 동맥 5 , 28의 결 찰 하 여 실험적인 심근 경색을 유도 하는 경우 때 쥐 마 취를 받고 있다입니다. 그렇지 않으면, 1 주일 사이 마 취의 두 라운드의 최소 지연 수술 치의 속도 제한에 유지 되어야 합니다.
2. 조직학 평가 위한 심장 샘플의 준비
- 경부 전위에 의해 동물 희생. 그들의 몸 무게를 측정 합니다. 가슴 및 복 부를 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 소독.
- 게 가로 절 개 피부 1cm에에서 원심 흉 골. 무딘 집게를 사용 하 여, 가슴, 머리의 방향으로 이동에서 피부를 제거 합니다. 좋은 집게와 흉 골을 가볍게 잡고 하 고 좋은 위의 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 여 횡 경 막 엽니다.
- 흉 골에 평행 하 게 양쪽에 흉 곽을 잘라. 흉 골의 머리 방향으로 이동 합니다. 가슴에서 마음을 찾습니다. 좋은 집게와 심장의 혈관 트렁크를 누른 좋은 위를 사용 하 여 아래 컷.
- 가슴을 열고 삭제할 흉부에서 전체 심장, 심장 무게를 측정 고 설정 마음-몸 무게 비율 4 , , 5 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- 수정 2 ml 15 mL 튜브에 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 솔루션의 심장 4에서 하룻밤 ° C.
주의: 위험! 화학 증기 두건;에 말린 솔루션 작업을 수행 해야 합니다. 착용 장갑 및 안전 안경.
참고: 말린 솔루션에 대 한 버퍼 구성 다른 공급 업체에 따라 다릅니다, 연구를 통해 동일한 공급 업체 사용. - 다음 날, 마음, 중간에서 가로 평면에서 잘라내어 파라핀 포함, 카세트에 그들을 전송는 자동된 삽입 장치를 사용 하 여 병 리 실험실에서 수행 됩니다.
- 단면 수행.
- 섹션 파라핀 톰와 40 ° C 물에 포함 된 증류수 목욕 float를 사용 하 여 3 µ m의 두께에서 차단.
- 이전 슬라이드에 섹션. 37 ° C 배양 기에서 건조 하룻밤 슬라이드를 허용 하 고 사용을 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 저장.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 사용자 얼룩 (3 단계)에 대 한 준비가 될 때까지.
- Deparaffinize 및 리하이드레이션 조직 슬라이드.
- 얼룩이 지는 파라핀을 녹여 10 분 55 ° C 오븐에 유리 삽입과 함께 항아리에 슬라이드를 놓습니다.
- Deparaffinize 크 실 렌 또는 크 실 렌 대신 5 분의 200 mL의 두 변경에서 슬라이드.
주의: 매우 가연성 및 독성! 화학 증기 두건;에서 일 착용 장갑 및 안전 안경. - 는 100% 알코올 200ml에 슬라이드를 전송합니다. 3 분 동안 두 변경 하 고 3 분에 대 한 95% 알콜 200 mL를 통해 한 번 전송
주의: 가연성! 멀리 점화;의 소스 금연. - 린스 200 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 5 분에 두 번 3, 4, 또는 5 단계를 계속 하 고.
3. 되며 고 오신 얼룩
- 증류수에 그들의 단면도 가진 슬라이드 린스.
- 8 분에 대 한 되며 솔루션 핵 얼룩
- 실행 하는 10 분에 대 한 수돗물에 씻어
- 2 분에 오신 솔루션 얼룩
- Dehydrate 100% 에탄올 (EtOH)에 2 분 동안 세 번. 크 실 렌 또는 크 실 렌 대신에 2 분 동안 세 번을 선택을 취소 합니다. 크 실 렌 기반 설치 매체에 마운트.
- 는 슬라이드 사진 하 고 interventricular 심장의 경도 섹션에서 핵의 수준에서 cardiomyocyte 직경을 측정 한다. 심장 당 세 섹션 및 섹션 당 적어도 100 셀 측정.
4. WGA 얼룩
- tetramethylrhodamine (또는 다른 형광 성 염료) 2.7 단계에서 가져온 슬라이드를 품 어-습 한 챔버에 실 온에서 60 분에 대 한 WGA (PBS에 1: 100)를 활용.
- PBS를 가진 5 분 세 번 세척.
- 마운트 형광 DAPI 포함 된 미디어를 탑재와 함께입니다. 분석 하기 전에 어둠 속에서 4 ° C에서 저장소.
주의: 눈 보호와 호환 화학 내성 장갑 착용. - 슬라이드 사진.
- 사용 현미경 epi 조명 형광 및 필터 DAPI와 tetramethylrhodamine (테이블의 자료를 참조)를 설정 합니다. 최대 밝기를 자동 노출 조리개 설정.
- 취득 파란색과 빨간색 채널에 대 한 400 x 배율에서 이미지를 구분합니다. ImageJ에서 이미지를 엽니다. 밝기를 조정 하 고 필요한 경우를 대비 (이미지 > 조정 > 밝기/대비).
- 8 비트 각 이미지 설정 (이미지 > 유형 > 8-비트). DAPI WGA 이미지 오버레이. DAPI를 빨강 채널 파랑 채널을 사용 하 여 WGA;에 대 한 없음으로 녹색과 회색 채널 설정 (이미지 > 색상 > 채널 병합) 31.
- Cardiomyocyte 직경 interventricular 심장의 횡 근 섹션에서 핵의 수준에서 결정.
- 정의 ImageJ에 이미지의 규모. 이 목적을 위해 (예를 들어, 심장 섹션으로 같은 확대 hemocytometer 챔버; 단계 4.4) 알려진된 크기의 사진.
- 처음부터 끝까지 선을 그리는 직선 도구를 사용 하 여 알려진 구조 (분석 > 규모 설정).
참고: 픽셀에서 거리 표시 됩니다 자동으로; 알려진된 거리와 길이 단위 입력 해야 합니다. 핵의 수준에서 cardiomyocyte 측정 진행. - WGA-긍정적인 세포 막의 반대 사이트에 DAPI 긍정적인 핵 통해 WGA 긍정적인 막에서 직선을 그릴 (분석 > 측정). 결과 창에서 길이 값 소수 자릿수의 의미 있는 수 있는지 확인 (분석 > 측정을 설정 > 소수 자릿수).
- 심장 당 세 섹션 및 섹션 당 적어도 100 셀을 측정합니다. 결과 Excel로 내보내기 (결과 클릭 > 파일 >로 저장 >.csv) 6 , 31.
5. Pecam-1 Immunostaining
- 항 unmasking 수행.
- 나트륨 시트르산의 추가 1, 600 mL
- 버퍼 (10 m m 나트륨 구 연산 염, 0.05% 트윈 20, pH 6.0) 압력 밥 솥입니다. 열판에 압력 밥 솥을 놓고 전체 전력에 그것을 설정 합니다. 이 시점에서; 압력 밥 솥의 뚜껑을 확보 하지 마십시오 단순히 위에 휴식.
주의: 핫! - 나트륨 구 연산 염 버퍼 끓는 일단 단계 2.5에서에서 압력 밥 솥 슬라이드를 전송. 압력 밥 솥 뚜껑을 보호 합니다. 밥 솥 전체 압력에는, 7 분을 기다립니다. 7 분 경과 열판을 해제 하 고 빈 싱크대에 압력 밥 솥을 배치. 압력 방출 벨 브를 활성화 하 고 밥 솥을 통해 냉 수를 실행. 그것은 드 가압, 일단 뚜껑 열고 냉 수 5 분 장소에 대 한 솥에 슬라이드에서에서 실행 200 mL PBS의.
참고: 또는, 마이크로웨이브 항 unmasking 사용할 수, 과열 위험 증가.
주의: 가연성 및 독성!
주의: 발암 성; 화학 방지 장갑 착용!
참고: 갈색과 보라색/파란색 색상 색상 deconvolution 어려움이 발생할 수 있습니다, 중요 한 스펙트럼 중복 경우에 하나를 명확 하 고, 밝은 파란색 핵 얼룩 되며 솔루션의 다른 브랜드를 시도할 수 있습니다. 면역 형광 검사 또는 모 세관의 수동 계산을 수행할 수 또는.
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Representative Results
그림 1, 대표 echocardiographic 녹음 유전자 변형 쥐에서 심장 고기를 식별 하기 위해 심장 초음파의 유용성을 보여 줍니다. 정상적인 심장 기능 (그림 1A)와 마우스 및 넓혀 진된 좌 심 실 및 감소 된 LV 기능 (그림 1B)와 동물의 차이 쉽게 확인 될 수 있다. 그림 2 에서는 cardiomyocyte 비교 직경 측정 (그림 2A) 없이 동물 및 심장 비 대 (그림 2B) 되며 오신 스테인드 파라핀 심장 섹션의 측정을 사용 하 여 심 혼 직물의 경도 섹션입니다. 그림 3 에서는 cardiomyocyte 가로 직경 제어의 마음에서 WGA 스테인드 파라핀 섹션을 사용 하 여 측정 생쥐 (그림 3A)와 심장 비 대 (그림 3B)와 동물. 그림 4 는 정상적인 심 혼 직물 (그림 4A)와 증가 된 신생 (그림 4B 마음 배 밀도 결정 하기 위해 심장 섹션의 Pecam-1 immunohistochemistry (DAB 기판, 갈색 얼룩)의 유틸리티를 묘사 ).
그림 1: 표준 해상도 심장 초음파 (> 10 MHz) 측정 LV 수축 기 및 diastolic 치수와 제어 동물 대 심근 경색 후 동 공이 확장 되어 심장 비 대와 쥐에 심장 기능을.
정상적이 고 건강 한 쥐 (A)와 LV 팽창과 심근 경색 (Tie2-CreERT2; 후 감소 된 LV 기능을 가진 동물에서 대표 echocardiographic 녹음 PPARβ/δ + 타 목 시 펜 마우스)5 (B). LVAW, LVID, 및 LVPW가 표시 됩니다. 흰색 막대 수축 기 및 diastolic 포인트 측정을 나타냅니다. 그들은 포인트 측정에 대 한 설정 하 고 프로토콜 단계 1.12에서에서 설명 하는 커서에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:와 쥐의 경도 sectioned 셀에 cardiomyocyte 직경 측정 되며 오신 스테인드 섹션 크기 심장 비 대 및 제어 동물. 일반 cardiomyocyte 크기 (A)와 쥐에 증가 cardiomyocyte 크기 (Tie2-CreERT2; 동물 cardiomyocyte 직경의 대표 이미지 PPARβ/δ + 타 목 시 펜 마우스)5 (B). 블랙 라인 측정된 직경을 나타냅니다. 각 측정에 대 한 값이 표시 됩니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 심장 조직의 동 공이 확장 되어 심장 비 대와 쥐에서의 섹션에 cardiomyocyte 가로 직경을 측정 하기 위해 WGA 스테인드 섹션 제어 동물. 정상 cardiomyocyte 크기 (A)와 쥐과 동물 증가 cardiomyocyte 크기 (Tie2-CreERT2; cardiomyocyte 직경에 대 한 대표 이미지 PPARβ/δ + 타 목 시 펜 마우스)5 (B). 핵은 DAPI와 counterstained 했다. 흰색 라인 (파란색) 핵의 수준에서 측정 된 직경을 나타냅니다. 각 측정에 대 한 값이 표시 됩니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 제어 마우스 및 증가 신생 동물에서 심장 혈관 밀도 분석 Pecam-1 immunolabeled 섹션입니다.
정상적인 혈관 밀도 (A)와 향상 된 vascularization (Tie2-CreERT2;와 동물 쥐에 용기 라벨에 대 한 대표 이미지 PPARβ/δ + 타 목 시 펜 마우스)5 (B). 핵은 hematoxylin와 counterstained 했다. 화살표는 Pecam-1-긍정적인 용기를 가리킵니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다른 방법은 심장 구조와 쥐, 심장 초음파, 등 대비 강화 된 MRI, 마이크로 CT, PET 스캔 기능을 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 비용 효율성과 단순함, 심장 초음파는 마우스11기능 분석에 대 한 가장 널리 사용 되 기술입니다. 마음과 쥐에서 심장 박동, 주파수 변환기의 높은 주파수의 작은 크기 때문에 일반적으로, > 10 MHz 해야 사용할 수 있지만 성공적인 측정 8 또는 9 MHz 변환기4,7 보고 되었습니다 . 심장 기능은 체온과 심장 주파수에 밀접 하 게 관련 된다, 그것은 연구를 통해 이러한 매개 변수를 제어 하는 것이 중요입니다. 생리대에 마우스를 배치 마 취 동물의 체온 일정 유지 필수적 이다. 이상적으로, 몸 온도 38 ° C를 설정 하는 직장 프로브 제어 난방 패드를 사용 해야 합니다. 이 사용할 수 없는 경우에가 열 패드 2이 값 보다 3도 설정 해야 합니다. 램프를 난방 해야 피해 야, 그들은 조사자와 위험 동물을 과열에 대 한 작업을 복잡 하 게.
심장 박동수 및 심장 기능을 제어 하기 위해 마 취의 형식은 매우 중요 합니다. 마 취 유도 실 (3 %isoflurane)에서 흡입에 의해 유발 하기 쉽습니다, 흡입 마스크 (1-2 %isoflurane)를 통해 유지할 수 있으며 짧은 기간만은 대부분 연구 isoflurane, 사용 합니다. 다른 일반적으로 사용 되 물질은 2,2,2-tribromoethanol, pentobarbital, 케 타 민 + xylazine 믹스11,12. 놀랍게도, isoflurane echocardiographic 측정, 심장 기능의 손상 보고 되었습니다 그리고이 효과 더욱 케 타 민 + xylazine 발음11그룹. 케 타 민 혼자이 연구11에서 잘 일했다. 가 오 외. 2,2,2-tribromoethanol12가장 재현성 결과 보고. 결과는 isoflurane, 2,2,2-tribromoethanol, 및 pentobarbital12에 대 한 동일한 범위에 있었다. 또한, 심장 박동수는 2,2,2 tribromoethanol에서 다른 되었고 pentobarbital 그룹12. 심장 외. 보고는 케 타 민에 낮은 심장 박동수 + xylazine 그룹에 비해 2,2,2 tribromoethanol 그룹16. 우리의 실험에서 서로 다른 유전자 변형 마우스 긴장과 pentobarbital 마 취, 350와 450 bpm 사이 원거리 평균 심장 박동수를 사용 하 여. 그럼에도 불구 하 고, 방출 분수 했다 > 의식 동물11값에 해당 하는 80%. Echocardiographic 측정 조건은 우리의 실험실4,5,6 에서 동일한 범위에 기준선에서 보고 다른11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,,2122,26 . 달리 pentobarbital, 케 타 민, isoflurane, 및 2,2,2 tribromoethanol 급속 한 발병 및 복구에 의해 특징. 따라서, 마 취 및 echocardiographic 측정 사이의 타이밍을 마 취에서 회복의 다른 정도 피하기 위해 연구에서 모든 동물에 대 한 동일 해야 합니다. Pentobarbital 역할을 더 이상, 그러나 몸 무게에 대해 긴밀 하 게 복용량을 조정 해야 하는 작은 치료 창의 단점이 있다. Pentobarbital을 사용 하 여 오랫동안 마 취는 기준선 echocardiographic 측정, 수술 후 다시 주입5에 대 한 필요 없이 수행할 수 있는 이점이 있다. 으로, 우리의 경험, 미만 1 주일 간격으로 주사 수술 후 사망률 증가 귀착되 pentobarbital을 사용 하 여 반복적인 마 취를 피해 야 한다.
와 쥐에서 심장 초음파 검사를 수행할 때 한 > 10 Mhz 변환기, 그림의 질 글로벌 LV 기능을 확인 하기에 충분 해야한다. 여러 사진은 이길-이길 변화와 운동 아티팩트를 줄이기 위해 각 동물에 대 한 촬영 해야 합니다. 훈련된 심장 또는 쥐 심장 초음파에 경험을 가진 과학자에서 전문가 조언은 처음 이미지의 품질을 평가 하 게 한다. 대부분의 심장 초음파 기계 LV 내부 직경 Teicholz 수식11,12를 사용 하 여에서 EF를 계산 합니다. LV의 크기는 측정 하기 쉽게, 경우에 때문에 라스베가스 어떤 이상적인, 단순화 된 기하학적 모양에 맞지 않는 LV 볼륨 및 분야의 불완전 한 평가 제공 합니다. Teicholz 수식으로 얻은 소수 단축도 방출 분수 LV 수축 기능, 그들은 모두 기하학적 가정에 기반 하 고 두 개의 벽의 수축 설명 확인 완벽 한 매개 변수입니다. 복 엽 비행기 심슨의 방법으로 평가 하는 방출 분수 더 정확한 것 하지만이 모든 동물에 여기에서 사용 하는 장비를 얻을 수 없었습니다.
심근 경색 후 우리 echocardiographic 이미징에 관련 된 몇 가지 문제에 직면. 첫째, 이미지 품질은 크게 thoracotomy 흉터에 의해 방해 됩니다. 둘째, 동물 반복 된 마 취에 훨씬 더 민감 했다. 마지막으로, M 모드-기반 LV 볼륨 및 기능 측정 LV 기하학 균질는 가정. 결과적으로, 이러한 인덱스를 사용 하 여 심근 경색 후 LV 벽 모션 이상이 면 전에 서 더 논란이 된다.
우리의 손에서 15 MHz 프로브를 사용 하 여 도플러 이미지의 가끔, 하지만 하지 체계적인 기록에 대 한 허용. 훨씬 더 높은 주파수는 LV 지역 함수를 확인 또는 심근 콘트라스트 심장 초음파, 설치류12전용 장비로 얻어질 수 있는 필요 합니다.
추가 가능성과 그 설치류 전용 시스템의 높은 해상도 감안할 때, 하나는 미래에 그들을 사용 하 여 고려해 야 합니다. 불리는 더 높은 비용 및 전용된 공간의 필요 이다. 충분 한 동물 조사를 받고 있으며 과학자 들의 중요 한 숫자는 장비를 사용 하는 경우에이 높은-엔드, 설치류 전용 echocardiographs 수익성이 있을 것입니다. 제공 하는이 기계에 대 한 특별 한 훈련, 그들은 심장에 안 전문가 과학자 들에 의해 사용할 수 있습니다. 임상 심장 초음파 장비 위에서 언급 한 대로 제한 된 해상도를 제공 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 아직 성공적으로 다른 경험이 l에 사용aboratories11,12; 숙련 된 과학자와 심장;에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 더 많은 모바일 및 전용된 공간;에 덜 요구 그리고, 컴퓨터의 높은 숫자 때문에 (예를 들어, 임대, 임상 사용 하는 장비를 취득 하거나 간접 구매) 비용을 줄이기 위해 다양 한 옵션의 고려에 대 한 수 있습니다.
조직학 분석에 대 한 첫 번째 중요 한 포인트는 기관 격리와 조직의 고정 사이 시간을 최소화 하기 위해입니다. 이 프로토콜에서 대부분 얼룩 및 조직학 분석 기반 전송된 가벼운 현미경 검사 법; formol에서 심 혼 직물의 침수 고정은 충분 합니다. 프로젝트의 초점은 형광 현미경 얼룩에 더 하나 마 취 동물의 조직에서 적혈구를 제거 밝은 자동 형광 표시 관류 고정을 고려해 야 합니다.
파라핀 포함에 있는 변이 피하기 위해, 우리는 자동된 삽입 장치를 사용 합니다. 융해 점 및 경도 파라핀의 브랜드 사이 다, 연구를 통해 동일한 공급자를 사용 하는 것이 좋습니다. 파라핀 단면 회전 톰을 사용 하 여 미리 냉장된 블록에 실행 되어야 한다. 섹션 두께 일정 유지 되어야 한다. 3 µ m 섹션 두께 cardiomyocyte 직경의 정확한 측정에 필요한 되며 오신 얼룩진 마음 단원의 막 테두리의 명확한 시각화 수 있습니다. Cardiomyocytes의 모양 일반으로, 핵의 수준에 측정을 수행 합니다. WGA 얼룩 얼룩 세포 막 하는 대체 방법을 제공 하 고 hematoxylin에 오신 얼룩이와 동일한 값에서 발생 합니다. 형태학 분석 전에 하나 명확 하 게 측정 됩니다 (즉, 왼쪽 또는 오른쪽 심 실 무료 벽 또는 심장) 심장의 어느 부분이 고 cardiomyocyte 횡단면 길거나 짧은 축에 결정 여부를 정의 해야 합니다. 가로, 나선, 및에 cardiomyocytes의 경도 방향, cardiomyocytes의 동일한 가로 섹션 경도 통과 섹션에 가능 하다. 세포 핵의 수준에서 분석으로 세로 또는 가로 지름 측정 여부 규칙의 문제입니다.
우리의 연구에서 우리는 echocardiographic 크기와 마음-몸 무게 비율 cardiomyocyte 크기4,,56, 사이 계약을 관찰 하지만 cardiomyocyte 크기의 조직학 측정 하지 않습니다. 항상 방출 분수의 값에 해당 합니다. 예를 들어 운동 훈련 보존된 방출 분수와 증가 cardiomyocyte 직경 증가 심장 크기 결과. 그러나, decompensated 심장 마비 감소 방출 분수와 증가 cardiomyocyte 직경33증가 심장 크기 특징 이다. 또한, 우리가 최근에 보여주었다는 PPARβ의 내 피 특정 overexpression 인해 증가 심장 혈관 밀도 되지는지 않습니다 초기 조건 하에서 향상 된 심장 기능에도 향상 된 복구에서 후 심근 경색5 .
Immunohistochemistry에 대 한 부정적인 컨트롤을 포함 하 고 단계에 따라 다른 차단 프로토콜에 제공에 중요 하다. 프로토콜에서 항 원 unmasking 단계는 사용 하는 1 차 항 체에 대 한 특정 이다. 다른 1 차 항 체에 대 한 그것은 낮은 또는 높은 pH unmasking 버퍼는 더 나은 신호 발생 여부를 결정 하는 데 필요한. 특정 항 원을 검출 하기 위하여 다른 고정 기법을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 Pecam-1 라벨 보고 되었습니다 같은 고정 배경 thrombomodulin 항 체34를 줄이기 위해 추가 조치를 요구 하는 동안 아연 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직에 가장 잘 작동 하도록. 따라서, 우리는 다른 항 원의 다양 한 연구를 확장 하기 위한 허용 되는 일반 포 르 말린 고정을 사용 합니다. Pecam-1 immunostaining, isolectin b 4 대체 자주 혈관을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 내 피 세포35의 비율, 게다가 isolectin B4 라벨 명과36 대37도. 또한, 다양 한 항 동맥 및 정 맥 내 피 세포38사이의 구분을 사용할 수 있습니다. 기능을 시각화 하는 우아한 방법 끼얹는다 선박 또는 선박 결정 하 돋 아 또는 회귀 cryosections24의 분석을 선행 하는 형광 결합 lectin의 정 맥 주입. 그러나,이 이렇게 크게 추가 항 원을 검출 하 고 형태학은 cryosections의 다른 품질 분석을 수행 하는 가능성을 제한 합니다.
신호 DAB와 시각 이다 immunostained 섹션에 영역 밀도 수 양적 정한다 ImageJ 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여. 그러나, 신호 선형으로, 갈색 얼룩의 정도 정확 하 게 단백질 표정 수준에 해당 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
작품 "미래 위한 투자" LABEX SIGNALIFE 프로그램 (참조 ANR-11-LABX-0028-01) (국립 연구 기관, ANR) 프랑스 정부에 의해 지원 되었다 하 고 공화국을 교부 금에 의해 협회에서 D. W. 부 la Recherche 쉬르 르 암, Fondation 드 프랑스, 고 암 Inserm 계획입니다. D. B.와 A. V. 받은 장학 Fondation 부 라 검색 Médicale에서에서와 니스의 도시에서 각각. 필립스에 의해 제공 되는 echocardiograph와 변환기를 친절 하 게 했다. 우리가 그들의 숙련 된 기술 지원에 대 한 A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini, 및 S. M. 바그너 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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