Summary
L'esame ecocardiografico è frequente nei topi. Sono stati sviluppati dispositivi costosi ultrasuono ad alta definizione per questo scopo. Questo protocollo descrive una procedura ecocardiografica conveniente combinata con analisi morfometriche istologico per determinare la morfologia cardiaca.
Abstract
Un numero crescente di modelli murini geneticamente modificati è diventato disponibile negli ultimi anni. Inoltre, il numero di studi farmacologici effettuati nei topi è alto. Caratterizzazione fenotipica di questi modelli del mouse richiede anche l'esame della morfologia e funzione cardiaca. L'ecocardiografia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) sono comunemente utilizzati approcci per caratterizzare la funzione cardiaca e morfologia nei topi. Apparecchiatura ecocardiografica e MRI specializzati per l'uso in piccoli roditori è costoso e richiede uno spazio dedicato. Questo protocollo descrive misure cardiache nei topi usando un sistema ecocardiografico clinico con una sonda vascolare umano 15 MHz. Misurazioni eseguite su topi adulti anestetizzati. Almeno tre sequenze di immagini sono registrati e analizzati per ogni animale in M-mode nella visualizzazione parasternale asse corto. In seguito, viene eseguito l'esame istologico cardiaco e del cardiomyocyte diametri sono determinati su ematossilina-eosina - o germe di grano dell'agglutinina (WGA)-paraffina sezioni macchiate. La densità del vaso è determinato morfometrico dopo Pecam-1 immunostaining. Il protocollo è stati applicati con successo agli studi farmacologici e diversi modelli animali genetici sotto condizioni di base, così come dopo infarto miocardico sperimentale di legatura permanente del (dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra LAD). Nella nostra esperienza, indagine ecocardiografica è limitata agli animali anestetizzati ed è fattibile in topi adulti peso corporeo di almeno 25 g.
Introduction
Una grande varietà di modelli murini geneticamente modificati sono disponibili e il numero di studi farmacologici nei topi è alta1,2. Ecocardiografia e MRI sono gli approcci comunemente utilizzati per la caratterizzazione fenotipica della funzione cardiaca e la morfologia in questi modelli del mouse3. L'obiettivo del protocollo presentato è quello di analizzare la funzione cardiaca e morfologia in topi adulti. Combina ecocardiografica, istologiche e immunohistochemical misurazioni. L'esame ecocardiografico è ampiamente usato in topi4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 identificato 205 studi pubblicati in circolazione, Circulation Research, American Journal of Physiology - cuore e fisiologia circolatoriae Ricerca cardiovascolare tra il 2012 e il 2015 che utilizzato l'esame ecocardiografico in animali.
L'ecocardiografia è utilizzato per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, anche per analizzare la funzione cardiaca in ipertrofia indotta da sovraccarico cronico, l'ischemia del miocardio e modelli di cardiomiopatia in topi (rivisto in12). Migliorata l'ecocardiografia apparecchiature permettono la misura standard di sinistra-ventricolare dimensioni di sistolica e diastoliche (LV), formazione immagine di Doppler del tessuto, ecografia di contrasto del miocardio e la valutazione della funzione regionale di LV e riserva coronarica 12. idealmente, esame ecocardiografico dovrebbe essere effettuato nei topi coscienti per evitare gli effetti negativi dell'anestesia sulla funzione contrattile, controllo riflesso autonomo, e frequenza cardiaca11. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'esigenza di addestrare gli animali; Difficoltà nel mantenere la temperatura corporea stabile; artefatti di movimento; stress; frequenze cardiache molto alte; e il requisito di almeno due investigatori eseguire l'esperimento, soprattutto se un gran numero di animali è sotto inchiesta. Interessante, uno studio recente ha non segnalato nessuna differenza nei parametri ecocardiografici in animali addestrati e inesperto19. Eseguiamo misurazioni ecocardiografiche nei topi anestetizzati. Protocolli di anestesia diversi saranno discusso di seguito.
Anche se l'ecocardiografia risoluzione standard (> 10 MHz) è sufficiente per misurare LV sistolica e diastoliche dimensioni e funzione cardiaca nei topi adulti, il metodo è limitato nella sua descrizione di fenomeni strutturali sottostanti. Quindi, uniamo le misurazioni in vivo con istologici e immunohistological analisi per misurare, ad esempio, densità di diametro e la nave dei cardiomiociti. Altre indagini istologiche ed immunoistochimiche, quali la determinazione di proliferazione, esame di apoptosi, misure di dimensione di infarto, determinazione di fibrosi e di espressione di marcatori specifici, possono essere eseguite anche sullo stesso tipo di elaborati del tessuto, ma non sono oggetto del presente protocollo. La combinazione di esame ecocardiografico in vivo con analisi istologiche fornisce ulteriori approfondimenti alterazioni strutturali sottostanti. In un ulteriore passaggio, possiamo completare queste misure con le indagini ultrastrutturali e molecolari. Le analisi istologiche non solo completano l'esame ecocardiografico ma anche diventano indispensabile quando la risoluzione dell'ecocardiografia non è sufficiente. Questo è specialmente il caso in modelli di topi geneticamente modificati che sono letale embrionale23,24.
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Protocol
gli esperimenti descritti qui sono stati effettuati in conformità con le leggi pertinenti istituzionale e francese sul benessere degli animali, linee guida e criteri. Essi sono stati approvati dal comitato etico francese (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour il ' animale de Laboratoire; numero NCE/2012-106).
1. ecocardiografia
- determinare il peso del corpo del mouse usando una bilancia di laboratorio standard, tenendola leggermente dalla coda per assicurare il posizionamento corretto.
- Anestetizzare l'animale tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
Nota: Qualsiasi altro tipo di anestesia può essere utilizzato se viene utilizzato lo stesso protocollo in tutto lo studio. Vantaggi e svantaggi saranno discusso di seguito. - Mettere il mouse indietro nella propria gabbia e aspettare fino a quando esso non risponde, si vede il respiro regolare, e i riflessi del piede posteriore sono assenti. Per eseguire questo test, spremere un piede leggermente e osservare se la gamba si ritrae ancora.
- Radere il lato sinistro del torace e l'ascella sinistra utilizzando un rasoio roditore commerciale.
Nota: L'uso di un rasoio roditore dedicato consente la completa rimozione dei capelli del mouse bene per evitare interferenze nella misurazione ecocardiografica. Creme depilazione commerciali o soluzioni dovrebbero essere evitati, come di solito sono profumati, che disturbano l'animale dopo che si risveglia. Evitare eccessiva rasatura, in quanto aumenta la perdita di calore. - Mettere l'animale dorme su un pad caldo impostato su 40-42 ° C in una posizione di sinistra-parteggiato poco profonda, con la testa alle 12 o ' dell'orologio e la coda alle 6 o ' orologio. Fissare il braccio sinistro, la gamba sinistra e la coda con del nastro.
- Applica l'ecocardiografia gel sul petto rasato e la testa del trasduttore preriscaldato.
- Posizionare il trasduttore parasternale sinistra, orientandolo verso il lato destro del collo per ottenere una visione di lungo-asse bidimensionale (2D) parasternal al livello del muscolo papillare. Girare il trasduttore di 90° in senso orario per ottenere una vista corta-asse a livello del muscolo papilary. È possibile utilizzare un'impostazione di profondità minima e uno zoom per ingrandire immagine qualità e frame rate. Impostare la velocità di spazzata al massimo.
- Per ottenere queste impostazioni, zoom diversi e opzioni di regolazione della profondità può essere utilizzato, a seconda della macchina e software. Registrare immagini 2D-Guida M-mode in breve-asse Vedi 27. Fare riferimento alla Figura 1A e B 27.
Nota: fare attenzione a evitare una eccessiva pressione al petto, poiché ciò può causare bradicardia.
- Per ottenere queste impostazioni, zoom diversi e opzioni di regolazione della profondità può essere utilizzato, a seconda della macchina e software. Registrare immagini 2D-Guida M-mode in breve-asse Vedi 27. Fare riferimento alla Figura 1A e B 27.
- Registra almeno 3 serie di 3 cuore battere cine loop per ciascun animale.
Nota: Per il software di ecocardiografo utilizzato in questo studio, premere il " Acquire/Salva " solo una volta il pulsante. Questa metodologia è specifica per l'ecocardiografo con questo software particolare. Altri pacchetti software possono essere utilizzati con macchine diverse. - Dopo successo registrazioni, pulire l'ecocardiografia gel dal torace del mouse, rilievo di riscaldamento e trasduttore. Rimuovere il nastro dalle arti e la coda.
- Lascia il mouse sotto osservazione il termocuscino, coperto di tessuto per evitare inutili perdite esposizione e calore luce, fino a quando si sveglia up.
- Mettere l'animale torna nella sua gabbia.
- Analizza registrato immagini M-mode da vista breve-asse parasternal per determinare la funzione e dimensioni di (LV) ventricolare sinistra. Misurare lo spessore della parete anteriore LV in sistole e diastole (LVAWs e LVAWd), i LV telesistolico e fine diastole diametri interni (LVIDs e LVIDd) e lo spessore di parete posteriore di LV (LVPW) in sistole e diastole (LVPWs e LVPWd) utilizzando la identificazione dell'interfaccia tessuto-sangue su immagini memorizzate.
- Misurare le dimensioni diastoliche al tempo delle dimensioni diastoliche LV massimale apparente e LV dimensioni telesistolico al momento dell'escursione sistolica più anteriore della parete posteriore LV. Tocca il touchscreen sul " Analyze " icona e quindi sulla " LVAWd " icona. Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV nel diastole.
- Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore diastolica di LV; il software passerà direttamente alla misura telediastolica interna LV.
- Posizionare la pinza sull'interfaccia fra la cavità di LV e la parete posteriore di LV per ottenere il diametro interno fine-diastolica di LV; il software passerà per la misura di spessore di parete posteriore LV.
- Posizionare la pinza sull'interfaccia tra la parete posteriore di LV e il pericardio per ottenere lo spessore di parete posteriore diastolica di LV. Per le dimensioni sistolica LV, toccare il touch screen il " LVAWs " icona e posizione il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV in sistole.
- Posizione il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore sistolico di LV. Ripetere la procedura come descritto sopra per il diametro telesistolico interno LV e lo spessore di parete posteriore sistolica di LV. Utilizzare la convenzione di avanguardia adottata dalla American Society of Echocardiography per tracciare i confini endocardial e dell'epicardio 13 , 27.
Nota: I parametri di funzione contrattile di LV verranno calcolati automaticamente utilizzando le misurazioni precedenti. Il LV (FS) di riduzione frazionario è definito come FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La frazione di eiezione (EF) di LV è calcolata con la formula di Teicholz modificata, dove EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Fare riferimento alla Figura 1A e B. - Memorizzare i dati su compact disc o USB memory stick e fare copie di backup.
- Importazione, analizzare ed esportare i dati utilizzando il software appropriato.
Nota: Dopo queste misurazioni di base, l'esperimento può essere sospeso. Se si esegue un confronto diretto tra gli animali knockout e selvaggio-tipo littermates, procedere con l' analisi istologiche 6. Per Cre-ERT2; lox/lox mouse linee, continuare il giorno seguente con tamoxifene induzione da i.p. l'iniezione, come descritto 5 , 24. Se indurre infarto miocardico sperimentale tramite la legatura dell'arteria coronaria sinistra 5 , 28, la chirurgia può essere eseguita direttamente dopo le misurazioni ecocardiografiche, quando i topi sono sotto anestesia. In caso contrario, un ritardo minimo di una settimana tra due turni di anestesia dovrebbe essere mantenuto per limitare il tasso di mortalità post-operatoria.
2. Preparazione di campioni di cuore per la valutazione istologica
- sacrificare gli animali dalla dislocazione cervicale. Misurare il loro peso corporeo. Disinfettare il petto e l'addome utilizzando un tampone di alcool al 70%.
- Fare un'incisione trasversale nella pelle 1 cm distale allo sterno. Usando il forcipe smussato, togliere la pelle dal torace, si muove in direzione della testa. Tenere lo sterno leggermente con una pinzetta e aprire il diaframma inserendo l'estremità smussata di forbici bene.
- Tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati paralleli allo sterno. Spostare lo sterno in direzione della testa. Individuare il cuore nel torace. Tenere il tronco vascolare del cuore con una pinzetta e taglio qui sotto utilizzando forbici bene.
- Aprire il torace e asportare l'intero cuore fuori del torace, misurare il peso del cuore e stabilire un cuore-a-corpo peso rapporto 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- Fix il cuore in 2 mL di soluzione di formalina neutra tamponata 10% in provette da 15 mL durante la notte a 4 ° C.
Attenzione: pericolo! Lavoro con soluzioni di formalina deve essere fatto in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza.
Nota: Come la composizione di buffer per le soluzioni di formalina varia con diversi fornitori, utilizzare lo stesso fornitore in tutto lo studio. - Il giorno successivo, tagliare i cuori sul piano trasversale, in mezzo e trasferirli in cassette per inclusione in paraffina, che viene eseguita nel laboratorio di patologia utilizzando un apparato di incorporamento automatizzato.
- Eseguire sezionamento.
- Paraffina sezione blocca ad uno spessore di 3 µm utilizzando un microtomo e galleggiare in acqua a 40 ° C vasca contenente l'acqua distillata.
- Trasferire le sezioni sui vetrini. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte in un incubatore a 37 ° C e conservarli a 4 ° C fino a che pronto per l'uso.
Nota: Il protocollo può essere sospesa qui fino a quando l'utente è pronto per la colorazione (passaggio 3).
- Deparaffinize e reidratare il tessuto scivola.
- Porre i vetrini in vaschette con inserti di vetro nel forno a 55 ° C per 10 min sciogliere la paraffina per colorazione.
- Deparaffinizzare le diapositive in due modifiche di 200 mL di xilene o sostituto di xilene per 5 minuti ciascuno.
Attenzione: Altamente infiammabile e tossico! Lavorare in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza. - Trasferire i vetrini a 200 mL di alcole a 100%. Fare due modifiche per 3 minuti ciascuno e trasferire una volta attraverso 200 mL di alcol al 95% per un minimo di 3
Attenzione: Altamente infiammabile! Tenere lontano da fonti di ignizione; non fumare. - Sciacquare due volte in 200 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuno e continuare con il passaggio 3, 4 o 5.
3. Ematossilina ed eosina
- sciacquare i vetrini con le sezioni in acqua distillata.
- Macchia i nuclei con soluzione di ematossilina per 8 min.
- Sciacquare in acqua corrente per 10 min.
- Macchia con la soluzione di eosina per 2 min.
- Disidratare tre volte per 2 min in 100% di etanolo (EtOH). Deselezionare tre volte per 2 min in xilene o sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.
- Fotografare le diapositive e misurare il diametro dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni longitudinali del setto interventricular. Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni per cuore.
4. Macchiatura di WGA
- Incubare i vetrini ottenuti dal passaggio 2.7 con tetrametilrodamina (o altri coloranti fluorescenti)-coniugato WGA (1: 100 in PBS) per 60 min a temperatura ambiente in una camera umida.
- Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Mount con fluorescenza montaggio supporti contenenti DAPI. Conservare a 4 ° C al buio prima dell'analisi.
Attenzione: Indossare occhiali protettivi e guanti resistenti alle sostanze chimiche compatibili. - Fotografare le diapositive.
- Uso un microscopio dotato di fluorescenza epi-illuminazione e filtro imposta per DAPI e tetrametilrodamina (fare riferimento alla Tabella materiali). Impostare il diaframma al massimo e la luminosità di esposizione automatica.
- Acquire separare immagini a 400 ingrandimenti per i canali rossi e il blu. Aprire le immagini in ImageJ. Regolare la luminosità e il contrasto se necessario (immagine > regolare > luminosità/contrasto).
- Impostare ogni immagine a 8 bit (immagine > tipo > 8-bit). Sovrapporre le immagini DAPI e WGA. Utilizzare il canale blu per DAPI e il canale rosso per WGA; impostare i canali verdi e grigi su nessuno (immagine > colore > unire i canali) 31.
- Determinare i diametri dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni trasversali del setto interventricular.
- Definire la scala delle immagini in ImageJ. Per questo scopo, fotografare un oggetto di dimensioni note (ad es., un'emocitometro camera allo stesso ingrandimento come le sezioni di cuore; punto 4.4).
- Utilizzare lo strumento linea retta per disegnare una linea dall'inizio alla fine della struttura conosciuta (Analyze > impostare scala).
Nota: La distanza in pixel verrà visualizzata automaticamente; l'unità di lunghezza e distanza nota dovrà essere inserito. Procedere con le misurazioni dei cardiomiociti a livello del nucleo. - Disegnare una linea retta dalla membrana WGA-positivi attraverso il nucleo di DAPI-positivo al lato opposto della membrana cellulare WGA-positivi (Analyze > misura). Nella finestra dei risultati, assicurarsi che i valori di lunghezza hanno un significativo numero di posizioni decimali (Analyze > impostare misure > decimali).
- Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni al cuore. Esportare i risultati in Excel (fare clic su risultati > File > salvare come >. csv) 6 , 31.
5. Immunostaining PECAM-1
- eseguire antigene smascheramento.
Buffer di
- aggiungere 1.600 mL di sodio citrato (citrato di sodio di 10 mM, 0,05% di Tween 20, pH 6.0) per una pentola a pressione. Posizionate la pentola a pressione sulla piastra e ruotare a piena potenza. Non fissare il coperchio della pentola a pressione a questo punto; Basta appoggiarla sulla parte superiore.
Attenzione: Caldo! - Una volta che il buffer di citrato di sodio è bollente, trasferire le diapositive da passo 2.5 per la pentola a pressione. Fissare il coperchio della pentola a pressione. Non appena la pentola ha raggiunto piena pressione, attendere 7 min. Quando siano trascorsi 7 min, spegnere il fornello e mettere la pentola a pressione in un lavandino vuoto. Attivare la valvola di rilascio pressione e correre acqua fredda sopra il fornello. Una volta che esso è depressurizzato, aprire il coperchio ed eseguire acqua fredda nella pentola per 5 min posto le diapositive in 200 mL di PBS.
Nota: In alternativa, forno a microonde antigene smascheramento poteva essere utilizzato, anche se il rischio di surriscaldamento.
- aggiungere 1.600 mL di sodio citrato (citrato di sodio di 10 mM, 0,05% di Tween 20, pH 6.0) per una pentola a pressione. Posizionate la pentola a pressione sulla piastra e ruotare a piena potenza. Non fissare il coperchio della pentola a pressione a questo punto; Basta appoggiarla sulla parte superiore.
- Uso 0,3% perossido di idrogeno in metanolo al blocco attività perossidasica endogena per 5 min, sciacquare i vetrini per tre volte per 2 min ogni in 200 mL di PBS.
Attenzione: Infiammabile e tossico! - Incubare i vetrini per 15 min in siero blocco normale diluito (siero di capra normale di 5% in PBS) che contiene anche un blocco di avidina (4 gocce in 1 mL).
- Attentamente toccare il liquido dalle sezioni e li incubare con l'anticorpo Pecam-1 da coniglio, diluito 01:50 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% e 4 gocce di blocco della biotina / mL. Incubare le diapositive durante la notte in una camera umida a 4 ° C.
- Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS. Incubare le sezioni con biotinilati goat anti-rabbit IgG Anticorpo diluito 1: 200 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% per 1 h a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.
- Incubare tsezioni di lui con un sistema basato su avidina/biotina perossidasi per 20 min (Reagente A e reagente B devono essere combinati 30 minuti prima di utilizzare). Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.
- Sciogliere 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 1 urea tablet in 5 mL di acqua bidistillata. Incubare le sezioni con DAB soluzione per circa 3 min., monitoraggio attentamente lo sviluppo del colore. Arrestare la reazione di colore lavando delicatamente le diapositive in 200 mL di PBS.
Attenzione: Cancerogeni; indossare guanti resistenti alle sostanze chimiche! - Colorante di contrasto i nuclei per 6 min con ematossilina. Sciacquare in acqua corrente per 2 min disidratare tre volte per 2 minuti ciascuno, in 200 mL di alcole a 100%. Deselezionare tre volte per 2 min ogni in 200 mL di xilene o un sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.
- Fotografare le diapositive (almeno dieci campi all'ingrandimento di 40x dal setto interventricular di ogni cuore) e misurare la densità di zona Pecam-1 utilizzando il liberamente disponibile di software ImageJ 31. Utilizzare il colore deconvoluzione 32 plugin per DAB ed ematossilina e regolare il contrasto dell'immagine allo stesso livello.
Nota: nel caso in cui il colore marrone e viola/blu hanno significativa sovrapposizione spettrale, che potrebbe causare difficoltà con deconvoluzione di colore, uno potrebbe provare diverse marche di soluzione di ematossilina di ottenere chiaro, azzurro di macchiatura nucleare. In alternativa, potrebbe essere eseguita immunofluorescenza o il conteggio manuale dei capillari.
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Representative Results
Nella Figura 1, rappresentante registrazioni ecocardiografiche dimostrano l'utilità di ecocardiografia per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati. La differenza tra un mouse con la normale funzione cardiaca (Figura 1A) e un animale con un ventricolo di sinistra dilatato e ridotta funzione di LV (Figura 1B) possa essere facilmente identificata. Figura 2 Mostra il confronto del cardiomyocyte misure di diametro in animali senza (Figura 2A) e con l'ipertrofia cardiaca (Figura 2B) utilizzando le sezioni hematoxylin-eosina-macchiate paraffina cuore e misure di sezioni longitudinali del tessuto del cuore. La figura 3 illustra la misurazione dei diametri trasversali del cardiomyocyte utilizzando sezioni di paraffina WGA-macchiato dai cuori di controllo topi (Figura 3A) e gli animali con l'ipertrofia cardiaca (Figura 3B). Figura 4 descrive l'utilità di immunohistochemistry Pecam-1 (substrato, marrone di colorazione DAB) delle sezioni cardiache per determinare la densità della nave del tessuto cardiaco normale (Figura 4A) e cuori con aumentata angiogenesi (Figura 4B ).
Figura 1: L'ecocardiografia Standard-risoluzione (> 10 MHz) per dimensioni di misura LV sistolica e diastolica e funzione cardiaca nei topi con cardiomiopatia ipertrofia cardiaca dopo infarto miocardico contro animali di controllo.
Rappresentante registrazioni ecocardiografiche da topi normali, sani (A) e gli animali con la dilatazione di LV e ridotta funzione di LV dopo infarto miocardico (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen topi)5 (B). Il LVAW, LVID e LVPW sono indicati. Le barre bianche rappresentano sistolica e diastolica punti di misura. Essi corrispondono al cursore punti regolato per misurazioni e sono spiegati nel passaggio di protocollo 1.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sezioni Hematoxylin-eosina-macchiate per misurare diametri del cardiomyocyte in sezionato longitudinalmente cellule dei topi con dilatato cardiaco ipertrofia e controllo animali. Immagini rappresentative dei diametri dei cardiomiociti in topi con le dimensioni normali del cardiomyocyte (A) e gli animali con aumento del cardiomyocyte dimensioni (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen topi)5 (B). Le linee nere indicano i diametri misurati. Sono rappresentati i valori per ciascuna misura. Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sezioni WGA-macchiate per misurare diametri trasversali del cardiomyocyte in sezioni di tessuto cardiaco da topi con ipertrofia cardiaca dilatato rispetto a controllano gli animali. Immagini rappresentative per diametri del cardiomyocyte in topi con dimensione del cardiomyocyte normale (A) e gli animali con aumento del cardiomyocyte dimensioni (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen topi)5 (B). I nuclei erano controcolorati con DAPI. Le linee bianche indicano i diametri misurati a livello dei nuclei (blu). Sono rappresentati i valori per ciascuna misura. Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Pecam-1 immunolabeled sezioni per analizzare la densità del vaso cardiaco in topi di controllo e gli animali con aumentata angiogenesi.
Immagini rappresentative per l'etichettatura di nave in topi con densità vascolare normale (A) e gli animali con una maggiore vascolarizzazione (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen topi)5 (B). I nuclei erano controcolorati con ematossilina. Le frecce puntano ai vasi Pecam-1-positive. Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la struttura cardiaca e funzione in topi, tra cui l'ecocardiografia, MRI contrapporre-aumentato, micro CT e scansione PET. Grazie alla sua economicità e semplicità, l'ecocardiografia è la tecnica più ampiamente usata per l'analisi funzionale in topi11. In generale, a causa delle piccole dimensioni del cuore e l'alta frequenza della frequenza cardiaca nei topi, trasduttori con una frequenza > MHz 10 dovrebbe essere usato, anche se misure di successo sono state segnalate con 8 o 9 MHz trasduttori4,7 . Funzione cardiaca è strettamente correlata alla temperatura corporea e la frequenza cardiaca, è importante controllare questi parametri in tutto lo studio. Posizionando il cursore del mouse su un rilievo di riscaldamento è essenziale per mantenere costante la temperatura corporea dell'animale anestetizzato. Idealmente, dovrebbe essere utilizzato un rilievo di riscaldamento controllato con una sonda rettale per impostare la temperatura corporea di 38 ° C. Se questo non è disponibile, il rilievo di riscaldamento dovrebbe essere impostato a due-tre gradi superiore a questo valore. Lampade riscaldanti dovrebbe essere evitato, in quanto essi complicare il compito per lo sperimentatore e il rischio di surriscaldamento degli animali.
Per controllare la frequenza cardiaca e funzione cardiaca, il tipo di anestesia è altamente importante. Maggior parte degli studi utilizzare isoflurano, come anestesia è facile indurre per inalazione in un'aula di induzione (3% isoflurano), può essere mantenuta tramite una maschera di inalazione (1-2% isoflurano) ed è solo di breve durata. Altre sostanze comunemente usate sono 2,2,2-tribromoethanol, pentobarbital e ketamina + xilazina mescola11,12. Sorprendentemente, isoflurane è stata segnalata per compromettere la funzione cardiaca in misurazioni ecocardiografiche, e questo effetto è stato ancora più pronunciato in ketamina + xilazina gruppo11. Ketamina da solo ha lavorato meglio in questo studio11. Gao et al. ha riferito i risultati più riproducibili con 2,2,2-tribromoethanol12. I risultati erano nel medesimo intervallo per isoflurano, 2,2,2-tribromoethanol e pentobarbital12. Inoltre, tassi di cuore non erano differenti in 2,2,2-tribromoethanol e pentobarbital gruppi12. Cuore et al ha segnalato tassi più bassi di cuore nella ketamina + xilazina gruppo rispetto al gruppo di 2,2,2-tribromoethanol16. Nei nostri esperimenti usando diversi ceppi di topi transgenici differenti e l'anestesia di pentobarbital, alla frequenza cardiaca media variata tra 350 e 450 bpm. Tuttavia, le frazioni di espulsione sono stati > 80%, che corrisponde ai valori in animali coscienti11. Misurazioni ecocardiografiche in linea di base sono nella stessa gamma come condizioni da nostro laboratorio4,5,6 segnalati altrove11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . In contrasto con pentobarbital, ketamina, isoflurano e 2,2,2-tribromoethanol sono caratterizzati da recupero e rapida insorgenza. Così, i tempi tra l'anestesia e le misurazioni ecocardiografiche dovrebbero essere lo stesso per tutti gli animali nello studio per evitare diversi gradi di recupero dall'anestesia. Pentobarbital agisce più, ma ha lo svantaggio di una piccola finestra terapeutica, rendendo necessario aggiustare la dose strettamente rispetto al peso corporeo. L'anestesia di lunga durata utilizzando pentobarbital ha il vantaggio che, dopo misurazioni ecocardiografiche di base, le procedure chirurgiche possa essere eseguito senza la necessità di re-iniezione5. Ripetitiva anestesia utilizzando pentobarbital dovrebbe essere evitato come, nella nostra esperienza, iniezioni con un intervallo di meno di una settimana ha provocato un aumento della mortalità postoperatoria.
Quando si esegue l'ecocardiografia in topi con un > 10 Mhz trasduttore, la qualità delle immagini dovrebbe essere sufficiente per determinare la funzione globale di LV. Diverse immagini devono essere presi per ogni animale per ridurre le variazioni di beat-to-beat e artefatti di movimento. Consulenza di esperti da un cardiologo qualificato o uno scienziato con esperienza in ecocardiografia in topi dovrebbe essere chiesto all'inizio per valutare la qualità delle immagini. La maggior parte delle macchine di ecocardiografia calcolano EF da diametri interni LV utilizzando la formula11,Teicholz12. Anche quando le dimensioni di LV sono facili da misurare, che forniscono un'imperfetta valutazione di aree e volumi di LV perché il LV non è conforme a qualsiasi forma geometrica ideale, semplificata. Né frazionaria frazione di accorciamento né espulsione ottenuta con la formula di Teicholz è un perfetto parametro per determinare la funzione contrattile del ventricolo, come essi sono entrambi basati su un presupposto geometrico e descrivere la contrattilità di solo due pareti. Frazione di eiezione, valutata con metodo di Simpson Biplano sarebbe più accurata, ma questo era impossibile da ottenere in ogni animale con l'attrezzatura utilizzata qui.
Dopo infarto miocardico, abbiamo affrontato diversi problemi legati al imaging ecocardiografico. In primo luogo, la qualità dell'immagine è stato notevolmente ostacolata dalla cicatrice di thoracotomy. In secondo luogo, gli animali erano molto più sensibili all'anestesia ripetuta. Infine, misure di volume e la funzione basate su M-modalità LV supporre che geometria LV è omogeneo. Di conseguenza, l'uso di questi indici diventa più controverso in presenza di anomalie di movimento della parete di LV dopo infarto miocardico.
Nelle nostre mani, l'uso di una sonda di 15 MHz consentita per la registrazione occasionale, ma non sistematica, di immagini Doppler. Frequenze molto più alte sono necessarie per determinare la funzione regionale di LV o per eseguire l'ecocardiografia di contrasto del miocardio, che può essere ottenuto soltanto con apparecchiature dedicate a roditori12.
Data la possibilità aggiuntive e maggiore risoluzione di quei sistemi di roditore-specifico, si dovrebbe considerare con loro in futuro. Gli svantaggi sono i costi più elevati e la necessità di uno spazio dedicato. Questi echocardiographs High-end, roditore-dedicato sarà redditizio solo se abbastanza animali sono sotto inchiesta e un numero critico di scienziati utilizza l'apparecchiatura. Con l'addestramento speciale offerto per queste macchine, sono utilizzabili dagli scienziati non esperti in cardiologia. L'apparecchiatura di ecocardiografia clinica fornisce una risoluzione limitata, come accennato in precedenza. Tuttavia, viene usato ancora con successo a diversi esperti lartners11,12; può essere facilmente utilizzato da ricercatori qualificati e cardiologi; è più mobile e meno esigenti su uno spazio dedicato; e, dato l'elevato numero di macchine, consente la considerazione di diverse opzioni per ridurre i costi (ad es., affittare, ottenimento di attrezzature che non sono in uso clinico o fare acquisti di seconda mano).
Per le analisi istologiche, il primo punto critico è di minimizzare il tempo tra isolamento dell'organo e la fissazione del tessuto. Come in questo protocollo, la maggior parte delle analisi colorazione ed istologici si basano su microscopia chiara trasmessa; fissazione di immersione del tessuto del cuore in formolo è sufficiente. Se l'obiettivo di un progetto è più sulla macchiatura al microscopio di fluorescenza, uno dovrebbe prendere in considerazione la fissazione di aspersione di animali anestetizzati per rimuovere i globuli rossi dal tessuto, che mostrano brillante auto-fluorescenza.
Per evitare variazioni l'inclusione in paraffina, utilizziamo un apparato di incorporamento automatizzato. Come il punto di fusione e la durezza differiscono tra le marche di paraffina, si consiglia di utilizzare lo stesso fornitore in tutto lo studio. Paraffina di sezionamento deve essere eseguita su blocchi pre-refrigerati usando un microtomo rotativo. Spessore della sezione deve essere mantenuto costante. Uno spessore della sezione 3-µm permette la visualizzazione chiara delle frontiere di membrana nelle sezioni hematoxylin-eosina-macchiate di cuore, che è richiesto per la misura esatta del cardiomyocyte diametri. Come la forma dei cardiomyocytes è irregolare, misurazioni devono essere effettuate a livello del nucleo. WGA colorazione fornisce un modo alternativo per macchiare la membrana cellulare e si tradurrà negli stessi valori come l'ematossilina-eosina. Prima analisi morfometriche, uno dovrebbe definire chiaramente quale parte del cuore (cioè, ventricolo destro o sinistro della parete libera o setto) sarà misurati e se le sezioni trasversali dei cardiomiociti sono determinate nell'asse brevi o lunghi periodi. A causa della trasversale, a spirale e orientamento longitudinale dei cardiomyocytes nel cuore, è possibile ottenere sulle stesse sezioni longitudinali e trasversali sezione trasversale dei cardiomiociti. Se si misurano diametri longitudinali o trasversali è una questione di convenzione, fino a quando le cellule sono analizzate a livello del nucleo.
Nei nostri studi, abbiamo osservato un accordo tra le dimensioni ecocardiografiche e i rapporti di peso cuore-a-corpo e del cardiomyocyte taglie4,5,6, ma istologici misurazioni delle dimensioni del cardiomyocyte di non sempre corrispondono ai valori di frazione di eiezione. Ad esempio, l'allenamento fisico provoca aumentati dimensioni cardiache, con una frazione conservata di espulsione e aumentato del cardiomyocyte diametri. Tuttavia, insufficienza cardiaca scompensata è caratterizzata da dimensioni cardiache aumentate, con una frazione di eiezione ridotta e aumento del cardiomyocyte diametri33. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che densità aumentata del vaso cardiaco dovuto sovraespressione endoteliali specifici di PPARβ non si traduca nel miglioramento della funzione cardiaca in condizioni basali, né in maggiore recupero dopo infarto miocardico5 .
Per immunoistochimica, è importante includere controlli negativi e per eseguire le diverse fasi di bloccare previste nel protocollo. Il passo lo smascheramento dell'antigene nel protocollo è specifico per l'anticorpo primario utilizzato. Per gli anticorpi primari differenti, è necessario determinare se basso o alto pH buffer che smaschera generano un segnale migliore. Tecniche di fissazione diversi potrebbero essere utilizzati per rilevare un antigene specifico. Ad esempio, Pecam-1 etichettatura è stata segnalata per funzionare al meglio su zinco-fisse, paraffina-incastonato del tessuto, mentre la stessa fissazione necessari ulteriori passaggi per ridurre lo sfondo per un anticorpo di thrombomodulin34. Così, usiamo la fissazione formalina regolari, che ha permesso di estendere lo studio ad una varietà di antigeni differenti. Alternativa a Pecam-1 immunostaining, isolectin B4 viene spesso utilizzato per visualizzare i vasi. Oltre ad una proporzione di cellule endoteliali35, isolectin B4 etichette anche glia macrofagi e36 37. Inoltre, una varietà di antigeni potrebbe essere utilizzata per distinguere tra cellule endoteliali arteriose e venose38. Un modo elegante per visualizzare funzionale irrorato di vasi o per determinare la nave germinazione o regressione è l'iniezione endovenosa di lectin accoppiati a fluorescenza seguito dall'analisi di cryosections24. Tuttavia, questo approccio limita in gran parte le possibilità di rilevare ulteriori antigeni ed effettuare le analisi morfometriche dovuto la qualità differente della cryosections.
Sulle sezioni immunostained dove il segnale è visualizzato con DAB, la densità di zona può essere quantitativamente determinata utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile. Tuttavia, poiché il segnale non è lineare, il grado di colorazione marrone non esattamente corrispondono al livello di espressione della proteina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dal governo francese (National Research Agency, ANR) attraverso il programma "Investimenti per il futuro" LABEX SIGNALIFE (riferimento ANR-11-LABX-0028-01) e da sovvenzioni a K. d. W. dalla Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France e pianificare l'Inserm di cancro. D. B. e V. a. ricevuto borse di studio dalla Fondation pour la Recherche Médicale e dalla città di Nizza, rispettivamente. L'ecocardiografo e il trasduttore sono state gentilmente fornite da Philips. Ringraziamo la Borderie r., S. Destree, M. Cutajar-Bossert, r. Landouar, r. Martres, r. Biancardini e S. M. Wagner per la loro assistenza di tecnico qualificato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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