Summary
La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.
Abstract
Un creciente número de modelos de ratón modificados genéticamente se ha convertido en disponible en los últimos años. Por otra parte, el número de los estudios farmacológicos realizados en ratones es alta. Caracterización fenotípica de estos modelos de ratón también requiere el examen de la morfología y la función cardiaca. La ecocardiografía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) son métodos utilizados para caracterizar la función cardiaca y morfología en ratones. Equipo ecocardiográfico y MRI especializado para uso en pequeños roedores es costoso y requiere un espacio dedicado. Este protocolo describe mediciones cardiacas en ratones usando un sistema ecocardiográfico clínico con una sonda vascular humano 15 MHz. Las mediciones se realizan en ratones adultos anestesiados. Al menos tres secuencias de imágenes se registran y se analizan para cada animal en modo M en la vista de eje corto paraesternal. Luego, la examinación histológica cardíaca se lleva a cabo, y cardiomiocitos diámetros se determinan con hematoxilina-aglutinina eosina o germen de trigo (WGA)-tinción de secciones de la parafina. Densidad del barco es determinada morfométricamente immunostaining de Pecam-1. El protocolo ha sido aplicados con éxito a los estudios farmacológicos y diferentes genética los modelos animales bajo las condiciones iniciales, así como después de infarto experimental por la ligadura permanente de la izquierda (anterior) de la arteria coronaria descendente CHAVAL). En nuestra experiencia, investigación ecocardiográfica se limita a los animales anestesiados y es factible en ratones adultos pesa por lo menos 25 g.
Introduction
Una gran variedad de modelos de ratón modificados genéticamente están disponibles, y el número de los estudios farmacológicos en ratones es alta1,2. Ecocardiografía y MRI son métodos utilizados para la caracterización fenotípica de la función cardiaca y la morfología de estos modelos de mouse3. El protocolo presentado pretende analizar la función cardiaca y morfología en ratones adultos. Combina ecocardiográfica, histológicos, immunohistochemical y. La examinación ecocardiográfica es ampliamente utilizada en ratones4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachón et al. 11 identificó 205 estudios publicados en circulación, la Investigación de circulación, Revista americana de fisiología - fisiología circulatoria y corazóne Investigación Cardiovascular entre 2012 y 2015 utilizan la examinación ecocardiográfica en animales.
La ecocardiografía se utiliza para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, así como para analizar la función cardiaca en hipertrofia inducida por sobrecarga crónica, isquemia miocárdica y cardiomiopatía modelos en ratones (revisados en12). Equipo de ecocardiografía mejorada permite la medida estándar de ventricular izquierda (LV) sistólicas y diastólicas dimensiones, Doppler tisular, ecografía de contraste miocárdico y la evaluación de la función regional del VI y reserva coronaria 12. idealmente, la examinación ecocardiográfica debe realizarse en ratones conscientes para evitar los efectos negativos de la anestesia sobre la función contráctil, control reflejo autonómico, y ritmo cardíaco11. Sin embargo, este enfoque está limitado por la necesidad de entrenar a los animales; dificultades para mantener la temperatura corporal estable; artefactos de movimiento; estrés; frecuencias cardíacas muy altas; y el requisito de al menos dos investigadores para llevar a cabo el experimento, especialmente si un gran número de animales está bajo investigación. Curiosamente, un estudio reciente divulgó ningunas diferencias en parámetros ecocardiográficos en animales entrenados y no entrenados19. Realizamos las mediciones ecocardiográficas en ratones anestesiados. Protocolos de anestesia diferentes se discutirá a continuación.
Aunque la ecocardiografía de resolución estándar (> 10 MHz) es suficiente para medir LV sistólico y diastólicas dimensiones y función cardiaca en ratones adultos, el método es limitado en su descripción de los fenómenos estructurales subyacentes. Por lo tanto, combinamos las mediciones en vivo con histológicos y análisis immunohistological para medir, por ejemplo, la densidad diámetro y buque de cardiomiocitos. Otras investigaciones histológicas e immunohistological, tales como la determinación de la proliferación, la examinación de apoptosis, medidas del tamaño del infarto, la determinación de la fibrosis y la expresión del marcador específico, también se pueden realizar en el mismo tipo de procesado del tejido, pero no son objeto del presente Protocolo. La combinación de en vivo la examinación ecocardiográfica con análisis histológicos ofrece ideas adicionales sobre alteraciones estructurales subyacentes. En un paso adicional, podemos completar estas medidas con investigaciones moleculares y ultraestructurales. Análisis histológicos no sólo completan la examinación ecocardiográfica pero también se convierten en indispensables cuando la resolución de la ecocardiografía no es suficiente. Esto es especialmente el caso en modelos de ratones modificados genéticamente que son letales embrionarios23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo en cumplimiento de las leyes de bienestar animal francés e institucionales pertinentes, directrices y políticas. Que hayan sido aprobados por el Comité de ética francés (Comité Institutionnel d ' l Ethique Pour ' animales de laboratorio; número NCE/2012-106).
1. ecocardiografía
- determinar el peso del cuerpo del ratón con una balanza de laboratorio estándar mientras sujeta suavemente por la cola para asegurar la colocación apropiada.
- Anestesiar el animal por la inyección intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
Nota: Puede utilizarse cualquier otro tipo de anestesia si se utiliza el mismo protocolo durante todo el estudio. Ventajas y desventajas serán discutidos abajo. - Poner el ratón de nuevo en su jaula y esperar hasta que sea insensible, muestra respiración constante y pie posterior reflejos están ausentes. Para probar esto, apriete ligeramente un pie y observe si la pierna todavía se retrae.
- Afeitar el lado izquierdo del tórax y la axila izquierda con una afeitadora roedor comercial.
Nota: El uso de una máquina de afeitar roedor dedicado permite la eliminación completa del pelo del ratón fino para evitar interferencias en la medición ecocardiográfica. Soluciones o cremas de eliminación de pelo comerciales deben evitarse, ya que son generalmente perfumadas, que perturbarán el animal después que despierta. Evite afeitar excesivo, ya que aumenta la pérdida de calor. - Poner el animal para dormir en una almohadilla caliente situada a 40-42 ° C en una posición superficial de lado izquierdo, con la cabeza a las 12 o ' reloj y la cola en 6 o ' reloj. Fijar el brazo izquierdo, pierna izquierda y la cola con cinta de.
- Aplicar previamente calentado ecocardiografía gel en el pecho depilado y la cabeza del transductor de.
- Coloque el transductor paraesternal izquierda, encaminándolo hacia el lado derecho del cuello para obtener una vista de dos dimensiones (2D) paraesternal eje largo a nivel del músculo papilar. Gire el transductor 90° para obtener una vista de eje corto a nivel de músculo papilar. Utilice un ajuste de la profundidad mínima y un zoom para maximizar la imagen calidad y velocidad de fotogramas. Ajustar la velocidad de barrido al máximo.
- Para obtener estos ajustes, diferentes zoom y configuración de opciones de profundidad puede usarse, dependiendo de la máquina y el software. Grabar imágenes de modo M guiado por 2D en eje corto ven el 27. Consulte la figura 1A y B 27.
Nota: tenga cuidado de no aplicar demasiada presión en el pecho, ya que puede causar bradicardia.
- Para obtener estos ajustes, diferentes zoom y configuración de opciones de profundidad puede usarse, dependiendo de la máquina y el software. Grabar imágenes de modo M guiado por 2D en eje corto ven el 27. Consulte la figura 1A y B 27.
- Serie de registro por lo menos 3 de 3 corazón cine beat bucles para cada animal.
Nota: Para el software de la ecocardiografía transesofágica utilizado en este estudio, presione el " adquirir/Save " el botón sólo una vez. Esta metodología es específica a la ecocardiografía transesofágica con este software en particular. Otros paquetes de software se pueden utilizar con máquinas diferentes. - Después de exitosas grabaciones, limpie la ecocardiografía del gel del tórax de ratón, cojín de calentamiento y transductor. Retire la cinta de las extremidades y la cola.
- Deja el ratón bajo observación en la almohada, cubierta con papel para evitar la innecesaria exposición y calor pérdida de luz, hasta que despierta arriba
- Puso el animal de nuevo en su caja.
- Analizar registró imágenes modo M paraesternal eje corto para determinar dimensiones de (LV) ventriculares izquierdas y función. Medir el espesor de la pared anterior de la LV en sístole y diástole (LVAWs y LVAWd), el LV telesistólico y telediastólico diámetros internos (LVIDs y LVIDd) y el espesor de la pared posterior del LV (LVPW) en sístole y diástole (LVPWs y LVPWd) utilizando el identificación de la interfaz de tejido sanguíneo en las imágenes almacenadas.
- Medir las dimensiones de la diastólicas en el momento de las aparente dimensiones diastólicas máximas LV y LV telesistólico dimensiones en el momento de la excursión sistólica más anterior de la pared posterior del LV. Toque la pantalla táctil en el " analizar " icono y luego en el " LVAWd " icono. Coloque la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior de la LV en diástole.
- Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior diastólico LV; el software cambiará directamente a la medición diastólica final interna LV.
- Coloque la pinza en la interfaz entre la cavidad del LV y la pared posterior del LV para obtener el diámetro telediastólico interno LV; cambiará el software a la medida de espesor de pared posterior de LV.
- Coloque la pinza en la interfase entre la pared posterior de la LV y el pericardio para obtener el espesor de la pared posterior diastólica de LV. Dimensiones sistólica del LV, toque la pantalla táctil en el " LVAWs " icono y posición de la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior del LV en sístole.
- Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior sistólica del LV. Repita el proceso como se describe anteriormente para el diámetro telesistólico interno de LV y el espesor de pared posterior sistólica del LV. Utilizar la Convención de punta aprobada por la sociedad americana de ecocardiografía para trazar los bordes endocárdico y epicárdico 13 , 27.
Nota: Los parámetros de la función contráctil del LV se calculan automáticamente usando las medidas anteriores. LV (FS) del acortamiento fraccional se define como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fracción de eyección del LV (EF) se calcula con la fórmula de Teicholz modificada, donde EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Consulte la figura 1A y B. - Almacenar los datos en discos compactos o sticks de memoria USB y hacer copias de seguridad.
- Importación, analizar y exportar los datos utilizando el software correspondiente.
Nota: Después de estas mediciones iniciales, el experimento puede hacer una pausa. Si se realiza una comparación directa entre animales knockout y hermanos de camada de tipo salvaje, proceder con el análisis histológico 6. Para Cre-ERT2; líneas de ratón de LOX/lox, continúe al día siguiente con la inducción de tamoxifeno por inyección i.p., como se describe 5 , 24. Si la inducción experimental de infarto de miocardio por ligadura de la arteria coronaria izquierda 5 , 28, podría realizar la cirugía inmediatamente después de las mediciones ecocardiográficas, cuando los ratones están bajo anestesia. De lo contrario, un retardo mínimo de una semana entre las dos rondas de la anestesia debe mantenerse para limitar la tasa de letalidad postoperatoria.
2. Preparación de muestras de corazón para la evaluación histológica
- sacrificar a los animales por dislocación cervical. Medir su peso corporal. Desinfectar el pecho y el abdomen mediante una torunda de alcohol al 70%.
- Hacer una incisión transversal en la piel 1 cm distal del esternón. Con unas pinzas embotadas, retirar la piel del tórax, en la dirección de la cabeza. Sostener el esternón ligeramente con unas pinzas finas y abra el diafragma insertando el extremo despuntado de tijeras finas.
- Cortar las costillas en ambos lados paralelo al esternón. Mover el esternón en dirección a la cabeza. Coloque el corazón en el tórax. Mantenga el tronco vascular del corazón con las pinzas finas y cortar por debajo con unas tijeras finas.
- Abre el cofre y suprimir el entero corazón fuera del tórax, medir el peso del corazón y establecer un corazón peso proporción 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- Fijar el corazón en 2 mL de solución de formalina tamponada neutra 10% en tubos de 15 mL durante la noche a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: peligro! Trabajo con soluciones de formalina debe realizarse en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad.
Nota: Como la composición del tampón para soluciones de formalina varía con los diferentes proveedores, utilizar el mismo proveedor durante todo el estudio. - Al día siguiente, cortar los corazones en el plano transversal, en el centro y transferirlas en cassettes para inclusión en parafina, que se realiza en el laboratorio de patología, utilizando un aparato automatizado empotrar.
- Realizar seccionamiento.
- Bloques de parafina de sección en un grosor de 3 μm utilizando un micrótomo y flotar en un agua de 40 ° C baño que contiene agua destilada.
- La transferencia de las secciones en diapositivas. Deje que los portaobjetos se seque durante la noche en una incubadora de 37 ° C y almacenarlos a 4 ° C hasta que esté listo para uso.
Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí hasta que el usuario esté listo para la tinción (paso 3).
- Deparaffinize y rehidratar el tejido correderas.
- Coloque los portaobjetos en tinción frascos con insertos de vidrio en un horno de 55 ° C durante 10 minutos derretir la parafina.
- Desparafinizar el portaobjetos en dos cambios de 200 mL de xileno o sustituto de xileno durante 5 minutos.
PRECAUCIÓN: Altamente inflamable y tóxico. Trabajar en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad. - Transfiera los portaobjetos a 200 mL de alcohol al 100%. Hacer dos cambios de 3 minutos cada uno y una vez la transferencia a través de 200 mL de alcohol 95% por 3 minutos
PRECAUCIÓN: Altamente inflamable! Mantener alejado de fuentes de ignición; no fumar. - Enjuague dos veces en 200 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos y continúe con el paso 3, 4 o 5.
3. Hematoxilina y eosina
- enjuague los portaobjetos con las secciones en agua destilada.
- Teñir los núcleos con solución de hematoxilina durante 8 min.
- Enjuague en agua corriente durante 10 minutos
- Tinción con solución de eosina durante 2 min.
- Deshidratar tres veces por 2 min en 100% de etanol (EtOH). Claro tres veces por 2 minutos xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.
- Fotografía las diapositivas y mida el diámetro del cardiomiocito a nivel del núcleo en secciones longitudinales del tabique interventricular. Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por corazón.
4. Tinción de WGA
- incubar los portaobjetos de paso 2.7 con tetramethylrhodamine (u otros tintes fluorescentes)-conjugado WGA (1: 100 en PBS) durante 60 min a temperatura ambiente en cámara húmeda.
- Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.
- Monte con fluorescencia media con DAPI de montaje. Almacenar a 4 ° C en la oscuridad antes del análisis.
PRECAUCIÓN: Use protección ocular y guantes resistentes a productos químicos compatibles. - Fotografiar las diapositivas.
- Uso un microscopio equipado con fluorescencia epi-iluminación y filtro establece para DAPI y tetramethylrhodamine (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la abertura al máximo y el brillo a la exposición.
- Acquire separado imágenes con 400 aumentos para el azul y el rojo canales. Abra las imágenes en ImageJ. Ajustar el brillo y contraste si fuera necesario (imagen > ajuste > brillo/contraste).
- Set cada imagen a 8 bits (imagen de > tipo > 8 bits). Superposición de las imágenes de DAPI y WGA. Utilizar el canal azul para DAPI y el canal rojo para WGA; Establezca los canales verdes y gris en ninguno (imagen > Color > combinar canales) 31.
- Determinar los diámetros de cardiomiocitos en el nivel del núcleo en secciones transversales del septo interventricular.
- Definir la escala de las imágenes en ImageJ. Para ello, fotografiar un objeto de tamaño conocido (por ejemplo, una cámara del hemocitómetro en el mismo aumento como las secciones de corazón; paso 4.4).
- Utilice la herramienta de línea recta a trazar una línea desde el principio hasta el final de la estructura conocida (analizar > ajustar escala).
Nota: La distancia en píxeles se mostrará automáticamente; la unidad de longitud y distancia conocida debe introducirse. Proceder con las mediciones de cardiomiocitos en el nivel del núcleo. - Trazar una línea recta de la membrana positivo WGA por el núcleo positivo DAPI para el sitio opuesto de la membrana celular de WGA-positivo (analizar > medida). En la ventana resultados, asegúrese de que los valores de longitud tienen un significativo número de lugares decimales (analizar > establecer medidas > lugares decimales).
- Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por el corazón. Exportar los resultados a Excel (haga clic en resultados > archivo > guardar como > .csv) 6 , 31.
5. Inmunotinción de PECAM-1
- realizar antígeno desenmascaramiento.
Buffer
- añadir 1.600 mL de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0) en una olla a presión. Coloque la olla a presión sobre la placa y convertirlo en potencia. No fije la tapa de la olla a presión en este punto; simplemente apoyarlo en la parte superior.
PRECAUCIÓN: Caliente! - Una vez que este hirviendo el buffer de citrato de sodio, transfiera los portaobjetos de paso 2.5 a la olla a presión. Asegure la tapa de la olla a presión. En cuanto la olla ha alcanzado la presión, espere 7 minutos. Cuando han transcurrido 7 minutos, apagar la placa y coloque la olla a presión en un tanque vacío. Activar la válvula de liberación de presión y deje correr agua fría sobre la olla. Una vez que se ha presurizado, abra la tapa y deje correr agua fría en la olla por 5 min lugar las diapositivas en 200 mL de PBS.
Nota: Como alternativa, microondas desenmascaramiento del antígeno podría utilizarse, aunque aumenta el riesgo de sobrecalentamiento.
- añadir 1.600 mL de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0) en una olla a presión. Coloque la olla a presión sobre la placa y convertirlo en potencia. No fije la tapa de la olla a presión en este punto; simplemente apoyarlo en la parte superior.
- Uso 0.3% peróxido de hidrógeno en metanol a bloque actividad de peroxidasa endógena por 5 min enjuague los portaobjetos tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
PRECAUCIÓN: Inflamable y tóxico! - Incube los portaobjetos durante 15 min en suero bloqueo normal diluido (5% de suero normal de cabra en PBS) que también contiene un bloque de avidina (4 gotas en 1 mL).
- Cuidadosamente el líquido de las secciones de toque e incubar con el anticuerpo de Pecam-1 de conejo, diluido 1:50 en PBS con suero normal de cabra de 2,5% y 4 gotas de bloque de biotina por mL. Incube los portaobjetos durante la noche en cámara húmeda a 4 ° C.
- Lave los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS. Incubar las secciones con biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo diluido 1: 200 en PBS con suero de cabra normal 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
- Incubar a tsecciones de con un sistema basado en avidina/biotina peroxidasa durante 20 min (reactivo A y reactivo B necesidad combinadas 30 minutos antes de usar). Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
- Disolver 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) y peróxido de hidrógeno de 1 urea tableta en 5 mL de agua destilada doble. Incubar las secciones con solución de DAB por aproximadamente 3 minutos, cuidadosamente monitoreo desarrollo de color. Detener la reacción de color lavando suavemente el portaobjetos en 200 mL de PBS.
PRECAUCIÓN: Cancerígeno; guantes resistentes a químicos! - Contratinción los núcleos de 6 minutos con hematoxilina. Lavar en el chorro del grifo durante 2 min deshidratar tres veces de 2 minutos cada uno en 200 mL de alcohol al 100%. Claro tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.
- Fotografía las diapositivas (por lo menos diez campos con 40 aumentos del septo interventricular de cada corazón) y medir la densidad de área de Pecam-1 usando el libremente disponible de software ImageJ 31. Use el plugin de 32 color deconvolución para DAB y hematoxilina y ajustar el contraste de la imagen al mismo nivel.
Nota: en caso de que el color marrón y púrpura/azul tienen una superposición espectral significativa, que puede causar dificultades con deconvolución de color, uno podría tratar de diferentes marcas de hematoxilina en solución para obtener coloración nuclear transparente, de color azul. Alternativamente, podría realizar inmunofluorescencia o conteo manual de los tubos capilares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En la figura 1, representante ecocardiográficas grabaciones demuestran la utilidad de la ecocardiografía para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente. Puede identificar fácilmente la diferencia entre un ratón con función cardíaca normal (figura 1A) y un animal con un ventrículo izquierdo dilatado y función reducida de la LV (figura 1B). Figura 2 muestra la comparación de los cardiomiocitos diámetro medidas en animales sin (figura 2A) y con hipertrofia cardiaca (figura 2B) usando la hematoxylin-eosina-manchadas parafina corazón secciones y medidas de secciones longitudinales de tejido cardíaco. La figura 3 ilustra la medición de los diámetros transversales de cardiomiocitos usando las secciones de la parafina teñida de WGA de corazones de control animales con hipertrofia cardiaca (figura 3B) y ratones (Figura 3A). Figura 4 muestra la utilidad de la inmunohistoquímica de Pecam-1 (DAB sustrato, marrón manchas) de secciones cardiacas para determinar la densidad de vasos del tejido cardiaco normal (Figura 4A) y corazones con mayor angiogénesis (Figura 4B ).
Figura 1: Ecocardiografía de resolución estándar (> 10 MHz) dimensiones métrica del LV de la sistólica y diastólica y la función cardiaca en ratones con dilatada hipertrofia cardiaca tras infarto de miocardio versus animales de control.
Representante grabaciones ecocardiográficas de ratones normales, sanos (A) y animales con dilatación del LV y la función reducida del LV después de infarto de miocardio (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratones)5 (B). El LVAW, LVID, LVPW se indica. Las barras blancas representan sistólica y diastólica puntos de medición. Corresponde a los cursores puntos para las mediciones y se explican en el paso de protocolo 1.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: las secciones Hematoxylin-eosina-manchadas para medir diámetros de cardiomiocitos en longitudinalmente seccionados células de ratones con dilatación cardiaca hipertrofia y control animales. Imágenes representativas de diámetros de cardiomiocitos de ratones con tamaños de cardiomiocitos normales (A) y los animales con mayor cardiomiocitos tamaños (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratones)5 (B). Las líneas negras indican los diámetros medidos. Están representados los valores de cada medida. Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: las secciones manchadas de WGA para medir los diámetros transversales de cardiomiocitos en secciones de tejido de corazón de ratones con hipertrofia cardiaca dilatada versus controlan animales. Imágenes representativas para diámetros de cardiomiocitos de ratones con el tamaño de los cardiomiocitos normales (A) y los animales con mayor cardiomiocitos tamaños (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratones)5 (B). Los núcleos fueron contratinción con DAPI. Las líneas blancas indican los diámetros medidos en el nivel de los núcleos (azul). Están representados los valores de cada medida. Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Pecam-1 immunolabeled secciones para analizar la densidad de vasos cardiacos en ratones de control y los animales con mayor angiogénesis.
Imágenes representativas para el recipiente etiquetado en ratones con densidad vascular normal (A) y los animales con mayor vascularización (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratones)5 (B). Los núcleos fueron contratinción con hematoxilina. Las flechas señalan a los buques de Pecam-1-positive. Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se han desarrollado diferentes métodos para evaluar la estructura cardiaca y la función en los ratones, incluyendo ecocardiografía, poner en contraste-realzado MRI, micro CT y PET scan. Debido a su eficacia y simplicidad, la ecocardiografía es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis funcional en ratones11. En general, debido al pequeño tamaño del corazón y el de alta frecuencia del ritmo cardíaco en ratones, transductores con una frecuencia de > debe utilizarse 10 MHz, aunque se han reportado mediciones exitosas con 8 o 9 MHz transductores4,7 . Como la función cardiaca está estrechamente relacionada con la temperatura corporal y frecuencia cardiaca, es importante controlar estos parámetros durante todo el estudio. Colocando el ratón sobre una almohadilla de calefacción es esencial para mantener constante la temperatura corporal del animal anestesiado. Idealmente, puede usarse una almohadilla térmica controlada mediante una sonda rectal para ajustar la temperatura corporal a 38 ° C. Si esto no está disponible, la almohada debe establecerse en dos a tres grados por encima de este valor. Lámparas de calefacción debe evitarse, ya que complican la tarea para el investigador y el riesgo de sobrecalentamiento de los animales.
Para controlar la frecuencia cardíaca y la función cardiaca, el tipo de anestesia es muy importante. Mayoría de los estudios utiliza isoflurano, como anestesia es fácil inducir por inhalación en una cámara de inducción (3% isoflurano), se puede mantener a través de una máscara de inhalación (1-2% isoflurano) y es solamente de duración corta. Otras sustancias utilizadas 2,2,2 tribromoethanol, pentobarbital y ketamina + xilacina mezclas de11,12. Sorprendentemente, isoflurane se ha divulgado para comprometer la función cardíaca en las mediciones ecocardiográficas, y este efecto fue más pronunciado en la ketamina + xilacina grupo11. Ketamina sola mejor trabajado en este estudio11. Gao et al. reportó los resultados más reproducibles con 2,2,2-tribromoethanol12. Los resultados fueron en el mismo rango de isoflurano, 2,2,2 tribromoethanol y pentobarbital12. Además, tasas de corazón no fueron diferentes en el tribromoethanol 2,2,2 y pentobarbital grupos12. Corazón et al informó de tasas más bajas del corazón en la ketamina + xilacina grupo en comparación con la del 2,2,2-tribromoethanol16. En nuestros experimentos con cepas de ratón transgénico diferente y anestesia de pentobarbital, la frecuencia cardíaca media oscilado entre 350 y 450 bpm. Sin embargo, fueron fracciones de eyección > 80%, que corresponde a los valores en animales conscientes11. Medidas ecocardiográficas en base las condiciones de nuestro laboratorio4,5,6 están en la misma gama que divulgado a otra parte11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . En contraste con pentobarbital, ketamina, isoflurano y 2,2,2 tribromoethanol se caracterizan por inicio rápido y recuperación. Así, el tiempo entre las mediciones ecocardiográficas y la anestesia debe ser el mismo para todos los animales en el estudio para evitar diferentes grados de recuperación de la anestesia. Pentobarbital actúa ya, pero tiene la desventaja de una ventana terapéutica pequeña, lo que es necesario ajustar la dosis bien con respecto al peso corporal. La anestesia de larga duración utilizando pentobarbital tiene la ventaja de que, después de mediciones ecocardiográficas iniciales, procedimientos quirúrgicos puede realizarse sin la necesidad de reinyección5. Repetitiva anestesia con pentobarbital debe evitarse ya que, en nuestra experiencia, las inyecciones con un intervalo de menos de una semana dio lugar a aumento de la mortalidad postoperatorio.
Cuando se realiza la ecocardiografía en ratones con una > transductor de 10 Mhz, la calidad de las fotografías debe ser suficiente para determinar la función global del VI. Deben tomarse varias fotos de cada animal reducir las variaciones latido a latido y artefactos de movimiento. Se debe pedir asesoramiento de un cardiólogo entrenado o un científico con experiencia en ecocardiografía en ratones al principio para evaluar la calidad de las imágenes. Mayoría de las máquinas la ecocardiografía calcula EF de diámetros internos de LV con el Teicholz fórmula11,12. Incluso cuando LV dimensiones son fáciles de medir, que proporcionan una evaluación imperfecta de áreas y volúmenes de LV porque LV no se ajusta a cualquier forma geométrica ideal y simplificado. Ni fraccionaria fracción de acortamiento ni eyección obtenida con la fórmula de Teicholz es un parámetro perfecto para determinar la función contráctil del VI, ya que ambos se basan en un supuesto geométrico y describen la contractilidad de sólo dos paredes. Fracción de eyección con el método de Simpson biplano sería más preciso, pero esto era imposible de obtener en cada animal con el equipo utilizado aquí.
Infarto de miocardio, enfrentamos varios problemas relacionados con la proyección de imagen ecocardiográfica. En primer lugar, la calidad de imagen fue obstaculizada grandemente por la cicatriz de la toracotomía. En segundo lugar, los animales eran mucho más sensibles a la anestesia repetida. Finalmente, las mediciones de volumen y función de LV M modo basado en asuman que geometría de LV es homogénea. Como consecuencia, el uso de estos índices se convierte más controversial en la presencia de anormalidades de movimiento de la pared del LV después de infarto de miocardio.
En nuestras manos, permite la utilización de una sonda de 15 MHz para la grabación ocasional, pero no sistemática, de imágenes de Doppler. Frecuencias mucho más altas se requieren para determinar la función regional del VI o realizar ecocardiografía miocárdica de contraste, que sólo puede obtenerse con el equipo dedicado a roedores12.
Teniendo en cuenta las posibilidades adicionales y mayor resolución de estos sistemas específicos del roedor, uno debe considerar usarlas en el futuro. Las desventajas son mayores costos y la necesidad de un espacio dedicado. Estos echocardiographs de gama alta, dedicada al roedor será rentables sólo si suficientes animales están bajo investigación y uso de un número crítico de los científicos del equipo. Con el entrenamiento especial para estas máquinas, pueden ser utilizados por científicos no expertos en cardiología. El equipo de ecocardiografía clínica proporciona una resolución limitada, como se mencionó anteriormente. Sin embargo, se utiliza todavía con éxito en diferentes l experimentadoaboratories11,12; puede ser utilizado fácilmente por los expertos científicos y cardiólogos; es más móvil y menos exigentes en un espacio dedicado; y, debido al alto número de máquinas, permite la consideración de diversas alternativas para reducir los costos (por ejemplo, alquilar, obtener equipo que no está en uso clínico o hacer compras de segunda mano).
Para análisis histológicos, el primer punto crítico es minimizar el tiempo entre órgano aislamiento y fijación del tejido. En este protocolo, más análisis de tinción e histológicos se basan en microscopía de luz transmitida; fijación de inmersión del tejido del corazón en formol es suficiente. Si el foco de un proyecto es más fluorescencia microscópica tinción, uno debe considerar la fijación de la perfusión de animales anestesiados para eliminar los glóbulos rojos de los tejidos, que muestran fluorescencia auto brillante.
Para evitar variaciones en la inclusión en parafina, utilizamos un aparato automatizado de empotrar. Como el punto de fusión y la dureza difieren entre marcas de la parafina, se recomienda utilizar el mismo proveedor durante todo el estudio. Secciones de la parafina deben realizarse en bloques previamente enfriados mediante un micrótomo rotatorio. Espesor de la sección debe mantenerse constante. Un espesor de sección de 3 μm permite la visualización clara de fronteras de la membrana en secciones hematoxylin-eosina-manchadas del corazón, que es necesaria para la medición precisa de diámetros de cardiomiocitos. Como la forma de cardiomiocitos es irregular, las mediciones deberán realizarse a nivel del núcleo. WGA coloración proporciona una manera alternativa para teñir la membrana celular y dará lugar a los mismos valores que la coloración de hematoxilina-eosina. Antes de los análisis morfométricos, uno debe definir claramente qué parte del corazón (es decir, ventrículo derecho o izquierdo libre de la pared o tabique) se medirán y si se determinan los cortes transversales de cardiomiocitos en el eje largo o corto. Debido a la transversal, el espiral y la orientación longitudinal de cardiomiocitos en el corazón, es posible obtener en las mismas secciones de sección transversal longitudinal y transversal de cardiomiocitos. Si se miden diámetros longitudinales o transversales es una cuestión de Convención, como las células se analizan a nivel del núcleo.
En nuestros estudios, observamos un acuerdo entre las dimensiones ecocardiográficas y los cocientes de peso del corazón al cuerpo y cardiomiocitos tamaños4,5,6, pero mediciones histológicas del tamaño de los cardiomiocitos no siempre corresponden a los valores de la fracción de eyección. Por ejemplo, entrenamiento produce mayor dimensiones cardiacas, con una fracción de eyección conservada y cardiomiocitos mayores diámetros. Sin embargo, la insuficiencia cardíaca descompensada se caracteriza por dimensiones cardiacos mayor, con una fracción de eyección reducida y cardiomiocitos mayor diámetro33. Además, recientemente demostró que buque cardiaca mayor densidad debido a la sobreexpresión de endoteliales específicos del PPARβ no resulta en función cardiaca mejorada bajo las condiciones iniciales, ni en la recuperación mejorada después de infarto de miocardio5 .
Por inmunohistoquímica, es importante incluir controles negativos y realizar los diferentes pasos bloqueo previstos en el protocolo. El paso Desenmascarando al antígeno en el protocolo es específico para el anticuerpo primario utilizado. Para diferentes anticuerpos primarios, es necesario determinar si bajo o alto pH buffers Desenmascarando al resultan en una mejor señal. Técnicas de fijación diferentes podrían usarse para detectar un antígeno específico. Por ejemplo, etiquetado de Pecam-1 se ha divulgado para trabajar mejor en cinc-fijo, parafina-encajados del tejido, mientras que la misma fijación requiere pasos adicionales para reducir el fondo de un anticuerpo de trombomodulina34. Así, utilizamos la fijación normal de formalina, que permitieron extender el estudio a una variedad de diferentes antígenos. Alternativa a la inmunotinción de Pecam-1, proteína B4 se utiliza con frecuencia para visualizar los vasos. Además de una proporción de células endoteliales35, proteína B4 también etiquetas glia36 y macrófagos37. Además, una variedad de antígenos podría utilizarse para distinguir entre las células endoteliales arteriales y venosos38. Una manera elegante de visualizar funcional perfundidos vasos o determinar buque brotación o regresión es la inyección intravenosa de lectina fluorescencia junto seguido por el análisis de cryosections24. Sin embargo, este enfoque limita en gran medida las posibilidades para detectar antígenos adicionales y realizar análisis morfométricos debido a la diferente calidad de los cryosections.
En las secciones immunostained donde la señal se visualiza con el lenguado, la densidad de área puede determinarse cuantitativamente utilizando el software ImageJ libremente disponible. Sin embargo, como la señal no es lineal, el grado de tinción de color marrón no exactamente se corresponde con el nivel de expresión de la proteína.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por el gobierno francés (Agencia Nacional de investigación, ANR) a través del programa de "Inversiones para el futuro" LABEX SIGNALIFE (referencia ANR-11-LABX-0028-01) y por donaciones a K. W. D. de la Asociación pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France y Plan de cáncer Inserm. D. B. y a. V. recibieron becas de la Fundación pour la Recherche Médicale y de la ciudad de Niza, respectivamente. La ecocardiografía transesofágica y el transductor fueron amablemente proporcionados por Philips. Agradecemos A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini y S. M. Wagner por su ayuda técnica especializada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H.
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F.
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al.
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
