Summary
Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri artan sayıda son yıllarda kullanılabilir hale gelmiştir. Ayrıca, farmakolojik çalışmalar farelerde gerçekleştirilen sayısı yüksektir. Bu fare modelleri fenotipik karakterizasyonu de kardiyak fonksiyon ve Morfoloji incelenmesi gerekir. Ekokardiyografi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kardiyak fonksiyon ve Morfoloji farelerde karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Küçük kemirgen kullanımda ve pahalı bir özel alanı gerektirir için Ekokardiyografik ve MRI donanımları uzman. Bu iletişim kuralı bir 15 MHz insan vasküler sonda ile klinik bir Ekokardiyografik sistemiyle farelerde kardiyak ölçüleri açıklar. Ölçümler imzalat yetişkin fareler üzerinde gerçekleştirilir. En az üç görüntü sıralarını kaydedilir ve her hayvan için M-modu parasternal kısa eksenli görünümünde analiz. Daha sonra kardiyak histolojik inceleme yapılır ve cardiomyocyte çapları Hematoksilen üzerinde belirlenir-Eozin - ya da buğday tohumu agglutinin (WGA)-parafin kesitler lekeli. Gemi kararlı morphometrically Pecam-1 immunostaining sonra yoğunluğudur. Protokol farmakolojik çalışmalar başarıyla uygulanan ve farklı genetik hayvan modelleri temel koşullar altında hem de deneysel akut miyokard infarktüsü sol ön inen koroner arter (kalıcı ligasyonu tarafından sonra oldu ÇOCUK). Bizim deneyim, Ekokardiyografik inceleme imzalat hayvanlara sınırlıdır ve en az ağırlığında yetişkin farelerde uygulanabilirdir 25 gr.
Introduction
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, büyük bir çeşitlilik vardır ve farmakolojik çalışmalar farelerde yüksek1,2sayısıdır. Ekokardiyografi ve MRI kardiyak fonksiyon ve Morfoloji bu fare modelleri3fenotipik karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Amacı sunulan protokolü, kardiyak fonksiyon ve Morfoloji yetişkin farelerde analiz etmektir. Ekokardiyografi, histolojik, birleştirir ve immunohistokimyasal ölçümleri. Ekokardiyografik inceleme fareler4,5,6,7,8,9,10,11'yaygın olarak kullanılır, 12. Pachon vd. 205 çalışmalar kan dolaşımı, Kan dolaşımı araştırma, Amerikan Journal Fizyoloji - kalp ve dolaşım fizyolojisive Kardiyovasküler araştırma 2.012 ve 2015 ki arasında yayınlanan 11 tespit Ekokardiyografik inceleme hayvanlarda kullanılan.
Ekokardiyografi kalp fenotipleri genetiği değiştirilmiş fare5,6,13,14,15,16, tanımlamak için kullanılır 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , kronik aşırı kaynaklı hipertrofisi, miyokardiyal iskemi ve kardiyomiyopati modelleri (12incelendi) farelerde kardiyak fonksiyon analiz olarak 22, de. Geliştirilmiş Ekokardiyografi cihazları bırakmak için standart ölçü birimi (LV) sol ventrikül sistolik ve diyastolik boyutların, doku Doppler görüntüleme, miyokardiyal kontrast echography ve LV bölgesel fonksiyon ve koroner rezerv değerlendirilmesi 12. ideal olarak, Ekokardiyografik inceleme bilinçli farelerde contractile işlev, otonomik refleks kontrolü, anestezi olumsuz etkilerini önlemek için gerçekleştirilmesi ve kalp hızı11. Bununla birlikte, bu yaklaşım hayvanları eğitmek için gereksinimin tarafından sınırlıdır; vücut ısısı istikrarlı tutmak zorlukları; hareket eserler; stres; çok yüksek kardiyak Frekanslar; ve özellikle çok sayıda hayvan soruşturma altında iseniz deneme, gerçekleştirmek en az iki müfettişler gereksinimi. İlginçtir, bir çalışmada eğitimli ve eğitimsiz hayvanlar19Ekokardiyografik parametreler yok farklılıkları bildirdi. Ekokardiyografik ölçümlere imzalat farelerde gerçekleştiriyoruz. Farklı anestezi protokoller aşağıda ele alınacaktır.
Her ne kadar standart çözünürlük Ekokardiyografi (> 10 MHz) olduğunu ölçü LV sistolik ve diyastolik boyutlar ve kardiyak fonksiyon yetişkin farelerde yeterli, belgili tanımlık yöntem açıklamasını temel yapısal olayları sınırlıdır. Böylece, biz vivo ölçümleri ile histolojik birleştirmek ve immunohistological analizler, örneğin, cardiomyocyte çap ve gemi yoğunluğunu ölçmek için. Nükleer silahların yayılmasına karşı belirlenmesi, sınav apoptosis, enfarktüsü boyut ölçüleri, fibrozis ve belirli işaret ifade, belirlenmesi gibi diğer histolojik ve immunohistological araştırmalar da aynı tür üzerinde gerçekleştirilebilir doku işlenen ama bu protokol konusu değildir. Vivo Ekokardiyografik inceleme histolojik analizler ile kombinasyonu temel yapısal değişiklikler ilgili ek bilgiler sağlar. Ek bir adım olarak, bu ölçümler moleküler ve ultra yapısal İncelemeler ile tamamlayabilirsiniz. Histolojik analizler sadece Ekokardiyografik inceleme tamamlamak ama Ekokardiyografi çözünürlük yeterli olmadığında da vazgeçilmez olmak. Bu özellikle modelleri genetiği değiştirilmiş farelerin embriyonik öldürücü23,24olan durumdur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ilgili Kurumsal ve Fransız hayvan refah yasaları, kuralları ve ilkeleri ile uyumlu burada açıklanan deneyler yapılmıştır. Fransız Etik Komitesi tarafından onaylanmış olan (Comité Institutionnel d ' ki Pour l ' hayvan de Laboratoire; sayı NCE/2012-106).
1. Ekokardiyografi
- kullanarak uygun konumlandırma emin olmak için bir standart laboratuvar denge hafifçe kuyruğundan tutarak farenin vücut ağırlığını belirlemek.
- 50 mg/kg Fentobarbital 25 , 26 mayi (IP) enjeksiyonu ile hayvan anestezi.
Not: aynı iletişim kuralını çalışma kullanılırsa, anestezi başka türlü kullanılabilir. Avantajları ve dezavantajları aşağıda tartışılacaktır. - Fare geri kendi kafes ve bekleyin kadar tepkisiz yerine, sürekli nefes gösterir ve arka ayak refleks yok. Bu test etmek için bir ayak hafifçe sıkmak ve bacak hala geri çeker olup olmadığını gözlemlemek.
- Sol tarafındaki Toraks ve ticari bir kemirgen tıraş makinesi kullanarak sol koltuk altı tıraş.
Not: Ekokardiyografik ölçümdeki girişimi engellemek için iyi fare saç tamamen kaldırılması için adanmış bir kemirgen tıraş makinesi kullanımına izin verir. Onlar genellikle, o uyanır sonra hangi hayvan rahatsız kokulu gibi ticari saç kaldırma krem veya çözümleri, kaçınılmalıdır. Isı kaybı arttıkça önlemek aşırı tıraş. - 40-42 ° C-12 kafa ile bir sığ sol taraflı pozisyonda ayarla bir sıcak yastık üzerinde uyku hayvan koymak o ' saat ve 6 kuyruk o ' saat. Sol kol, sol ayak ve kuyruk bant ile düzeltmek.
- Uygula önceden Ekokardiyografi jel traş göğüs ve dönüştürücü başkanı üzerine ısındı.
- Dönüştürücü parasternal sağdan sola, Papiller kas düzeyde bir iki boyutlu (2D) parasternal uzun eksen görünümü elde etmek için boynun sağ tarafında yönlendiren yerleştirin. Dönüştürücü 90 ° papilary kas düzeyinde bir kısa-eksen görünümü elde etmek için saat yönünde çevir. Görüntü kalitesi veya kare hızını en üst düzeye çıkarmak için en az derinlik ayarı ve zoom kullanın. Tarama hızını maksimuma ayarlayın.
Bu ayar, farklı yakınlaştırma ve derinlik ayar seçenekleri elde etmek için
- , makine ve yazılıma bağlı olarak kullanılabilir. Kayıt 2D güdümlü M-modu kısa-eksenindeki 27 görüntüleri. şekil 1A ve B 27 için başvurun.
Not: göğüs için aşırı basınç uygulamaktan kaçının bu bradikardiyi neden dikkatli ol.
- , makine ve yazılıma bağlı olarak kullanılabilir. Kayıt 2D güdümlü M-modu kısa-eksenindeki 27 görüntüleri. şekil 1A ve B 27 için başvurun.
- Kayıt en az 3 Serisi 3 kalp beat cine döngüler her hayvan için.
Not: Bu çalışmada kullanılan echocardiograph yazılım için basın " edinme/Kaydet " yalnızca bir kez düğme. Bu metodoloji echocardiograph bu yazılım ile özeldir. Diğer yazılım paketleri ile farklı makineleri kullanılabilir.
Başarılı kayıtları, silme Ekokardiyografi kapalı fare Toraks, Isıtma yastığını ve dönüştürücü jel sonra - . Bacaklarda ve kuyruk bandı çıkarın.
- Fare yukarı uyanır kadar gereksiz ışık pozlama ve ısı kaybına yol açmamak için doku ile kaplı Isıtma yastığını gözlem altında
- Hayvan geri onun kafes içinde yerine.
- Analiz parasternal kısa eksen görünümü sol ventrikül (LV) boyutu ve işlevi belirlemek için M-modu görüntüleri kaydetti. Sistol ve diastole (LVAWs ve LVAWd), LV iç son sistolik ve diyastolik uç çapı (LVIDs ve LVIDd) ve Sistol ve diastole (LVPWs ve LVPWd) kullanarak LV posterior duvar kalınlığı (LVPW) LV ön duvar kalınlığını ölçmek stok imge doku-kan arabirimde tanımlaması.
- Belirgin maksimal LV diyastolik boyutları anda diyastolik boyutlarını ölçün ve son sistolik boyutları en ön sistolik gezi LV posterior duvar saatinde LV. Dokunmatik ekran dokunun " analiz " simgesini ve sonra " LVAWd " simgesi. Sağ ventrikül boşluğuna ve diastole LV anterior duvarda arasında arayüz elektronik Kaliper çubuğuyla.
- LV ön duvar ve LV diyastolik ön duvar kalınlığı elde etmek için LV boşluğu arasında arayüz elektronik Kaliper çubuğuyla; yazılım doğrudan LV iç end-diastolik ölçüm için geçiş.
- LV kavite ve LV LV iç son diyastolik çap elde etmek için posterior duvar arasında arayüz Kaliper çubuğuyla; yazılım LV posterior duvar kalınlığı ölçümü için geçiş.
- LV posterior duvar ve LV diyastolik posterior duvar kalınlığı elde etmek için kalp zarını arasında arayüz Kaliper getirin. Dokunmatik ekran dokunun LV sistolik boyutları için " LVAWs " simgesi ve Sistol pozisyonda sağ ventrikül boşluğuna ve LV ön duvar arasında arayüz üzerinde elektronik Kaliper.
- Elektronik Kaliper LV ön duvar ve LV sistolik ön duvar kalınlığı elde etmek için LV boşluğu arasında arayüz üzerinde konumlandırın. LV iç son sistolik çapı ve LV sistolik posterior duvar kalınlığı için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. Ekokardiyografi Amerikan toplum tarafından kabul edilen öncü Kongre endocardial ve epicardial sınırları 13 , 27 izlemek için kullanın.
Not: Önceki ölçümleri kullanarak LV contractile işlev parametreleri otomatik olarak hesaplanır. LV (FS) kısaltılması kesirli FS (%) tanımlanan [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd =] x 100. LV ejeksiyon fraksiyonu (EF) değiştirilmiş Teicholz formülüyle hesaplanır nerede EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. şekil 1A ve B başvurun. - CD'ler veya USB bellek sopa verileri depolamak ve yedek kopyalarını.
- Alma, analiz ve uygun yazılımı kullanarak veri ihracat.
Not: Bu temel ölçü birimlerinin sonra deneme duraklatılmış. Nakavt hayvanlar ve vahşi-türü littermates arasında doğrudan bir karşılaştırma yapmak, histolojik analizler 6 ile devam edin. CRE-ERT2 için; füme balığı/füme balığı fare hatları, açıklanan 5 , 24 olarak ı.p. enjeksiyonla tamoxifen indüksiyon ile ertesi gün devam. Deneysel akut miyokard infarktüsü sol koroner arter 5 , 28 ligasyonu tarafından inducing takdirde doğrudan Ekokardiyografi ölçümleri sonra ameliyat yapılır zaman fareler anestezi altında bulunmaktadır. Aksi takdirde, anestezi iki tur arasında bir haftanın en az bir gecikme ameliyat sonrası ölümcül hızını sınırlamak için saklanması gerekebilir.
2. Histolojik değerlendirme için kalp örnekleri hazırlanması
- kurban hayvanlar tarafından servikal çıkığı. Onların beden ağırlık ölçmek. Göğüs ve karın bir % 70 alkol bez kullanarak dezenfekte.
- Enine bir kesi Cilt 1 cm distal göğüs kemiği için yapmak. Künt forseps kullanarak, baş yönde hareket Toraks cilt kaldırın. Göğüs kemiği hafifçe iyi Forseps ile tutun ve iyi makas künt sonuna ekleyerek diyafram açın.
- Göğüs kafesi her iki tarafta göğüs kemiği paralel kesti. Göğüs kemiği kafa yönünde taşır. Kalp göğüs bulun. İyi Forseps ile kalp damar gövde tutun ve iyi makas kullanarak aşağıda kesti.
- Sandığı aç ve toraks dışında tüm kalp tüketim, kalp ağırlık ölçmek ve bir kalp vücut ağırlığı oranı 4 , 5 , 6 , kurmak 23 , 29 , 30 < /SUP >.
- Düzeltme 2 mL % 10 tarafsız tampon formalin çözeltisi 15 mL tüpler kalbinde gecede, 4 ° C.
Dikkat: tehlike! Formalin çözümleri ile iş bir kimyasal duman mahallede yapılmalıdır; eldiven ve koruyucu gözlük.
Not: arabellek oluşturma formalin çözümler için farklı tedarikçiler ile değişir gibi çalışma boyunca aynı tedarikçi kullanın. - Ertesi gün, kalpleri transvers düzlemde ortasında, kesilmiş ve parafin yerleştirme, kaset içine aktarmak otomatik bir gömme cihazı kullanarak patoloji laboratuarında yapıldığı.
- Gerçekleştirmek kesit.
- Bölüm parafin blok bir microtome ve onları 40 ° C suda banyo içeren distile su kayan nokta kullanarak 3 µm kalınlığında.
- Bölümleri slaytlar üzerine aktarın. Kuru gecede slaytlara 37 ° C kuluçka makinesine izin ve kullanım için hazır kadar 4 ° C'de depolayabilirsiniz.
Not: kullanıcı (Adım 3) boyama için hazır olması ne kadar protokol burada duraklatılmış.
- Deparaffinize ve suyla temasa doku slaytlar.
- Kavanoz cam ekler parafin eritmek 10 dk 55 ° C fırında ile boyama slaytları yerleştirin.
- Deparaffinize 200 ml Ksilen veya Ksilen yerine 5 min için iki değişiklik slaytları.
Dikkat: Son derece yanıcı ve zehirli! Kimyasal duman mahallede iş; eldiven ve koruyucu gözlük. - 200 mL % 100 alkol slaytları aktarın. 3 min için iki değişiklik yapmak ve bir kez 200 mL % 95 alkol 3 dakika süreyle aracılığıyla transfer
Dikkat: Son derece yanıcı! Ateşleme kaynaklarından uzak tutun; sigara içmek yasak. - 200 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 5 min için içinde iki defa durulayın ve adım 3, 4 veya 5'e geçin.
3. Hematoksilen ve Eozin boyama
- Slaytlar onların bölümlerde distile su ile durulama.
- 8 dakika süreyle Hematoksilen Çözümle çekirdeklerin leke
- Musluk suyu 10 dakika süreyle çalışan durulama
- 2 min. Eozin çözüm ile leke
- Dehydrate % 100 etanol (alkol) 2 min için üç kez. Ksilen veya Ksilen yerine 2 min için üç kez temizleyin. Montaj montaj Ksilen tabanlı ortamda.
- Fotoğraf slaytlar ve boyuna interventricular septum bölümlerini çekirdeğinde düzeyde cardiomyocyte çapı ölçmek. Bölüm ve kalp başına üç bölüm başına en az 100 hücre ölçmek.
4. WGA boyama
- Adım 2.7 tetramethylrhodamine (ya da diğer floresan boyalar) ile elde edilen slaytlar kuluçkaya-nemli bir oda oda sıcaklığında 60 dk için WGA (1: 100 PBS içinde) Birleşik.
- Yıkama üç kez PBS ile 5 dk her.
- Dağı ile floresan DAPI içeren ortam takma. Stok Analiz önce karanlıkta 4 ° C'de.
Dikkat: Göz koruması ve uyumlu kimyasal dayanıklı eldiven giymek. - Fotoğraf slaytları.
- Kullanım Floresans epi-aydınlatma ve filtre ile donatılmış bir mikroskop DAPI ve tetramethylrhodamine (Tablo malzemeler için başvurmak) için ayarlar. Maksimum diyafram otomatik poz için parlaklığı ayarlayın.
- Edinme resimleri, mavi ve kırmızı kanalları için 400 x büyütme ayrı. Görüntüleri ImageJ içinde açın. Parlaklığı ayarlayın ve gerekirse kontrast (görüntü > ayarla > Parlaklık/Kontrast).
- Ayarla her görüntüyü 8 bitlik (görüntü > türü > 8-bit). DAPI ve WGA görüntüleri yerleşimi. Mavi kanal DAPI ve kırmızı kanalı için WGA için yeşil ve gri kanalları yok olarak ayarlayın (görüntü > renk > birleştirme kanalları) 31.
- Cardiomyocyte çapları interventricular septum enine bölümlerini çekirdeğinde düzeyde belirlemek.
- Tanımla ImageJ Albümdeki ölçeğini. Bu amaçla, (Örneğin, bir hemasitometre odası kalp bölümler aynı büyütmede; adım 4.4) bilinen boyutlardaki fotoğraf.
- Başından sonuna kadar bir çizgi çizmek için normal amortisman aracı kullanmak bilinen yapısı (Analyze > ayarla ölçek).
Not: Olan uzaklığını piksel otomatik olarak görüntülenir; bilinen uzaklık ve uzunluk birimi girilmesi gerekir. Cardiomyocyte ölçümler çekirdek düzeyde devam. - WGA-pozitif zar DAPI pozitif çekirdeği ile WGA-pozitif hücre zarının ters siteye düz bir çizgi çizmek (Analyze > ölçü birimi). Sonuçları penceresinde uzunluğu değerleri anlamlı sayıda ondalık basamak bulunduğundan emin olun (Analyze > ayarla ölçümleri > ondalık basamak).
- Bölüm ve kalp başına üç bölüm başına en az 100 hücre ölçmek. Sonuçları Excel'e ver (tıklatın sonuçlarına > dosyayı > olarak kaydedin > .csv) 6 , 31.
5. Pecam-1 Immunostaining
- antijen maskesini gerçekleştirmek.
Bir düdüklü tencere
- ekleyin 1 600 mL sodyum sitrat arabelleğe (10 mM sodyum sitrat, %0.05 ara 20, pH 6.0). Ocağın üzerinde düdüklü tencere yerleştirin ve tam güç açın. Bu noktada düdüklü tencere kapağı güvenli olmayana; Sadece üst üzerinde bekletin.
Dikkat: Sıcak!
Sodyum sitrat arabellek kaynar bir kez - düdüklü tencere 2.5 adımından slaytları aktarın. Düdüklü tencere kapağı güvenli. En kısa zamanda tam basınç Ocak ulaşmıştır için 7 dakika bekleyin. 7 dk. geçen zaman, ocağın açmak ve boş bir lavaboda düdüklü tencere yerleştirin. Basınç yayın Vana etkinleştirmek ve soğuk su Ocak üzerinde çalıştırın. Bir kez de-basınçlı, kapağı açın ve soğuk su içine Ocak 5 dk. yer için slaytları 200 mL PBS çalıştırın.
Not: her ne kadar aşırı ısınma riski artar alternatif olarak, mikrodalga antijen maskesini, kullanılabilir gibi.
- ekleyin 1 600 mL sodyum sitrat arabelleğe (10 mM sodyum sitrat, %0.05 ara 20, pH 6.0). Ocağın üzerinde düdüklü tencere yerleştirin ve tam güç açın. Bu noktada düdüklü tencere kapağı güvenli olmayana; Sadece üst üzerinde bekletin.
- Kullanımı % 0,3 hidrojen peroksit blok endojen peroksidaz aktivitesi 5 dakika süreyle metanol içinde durulama slaytlar için üç kez 2 min için PBS içinde her 200 mL.
Dikkat: Yanıcı ve toksik! - 15dk Serumda bir avidin bloğu (4 damla 1 ml) da içeren seyreltilmiş normal engelleme (% 5 normal keçi serum içinde PBS) slaytlarını kuluçkaya.
- Dikkatle sıvı bölümlerden dokunun ve onları kuluçkaya Pecam-1 antikor tavşan üzerinden, seyreltilmiş 1:50 % 2.5 normal keçi serum ve biotin blok mL başına 4 damla içeren PBS ile. Slaytları gecede nemli bir Odası 4'te kuluçkaya ° C.
- 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın. Biotinylated keçi Anti-tavşan IgG antikor seyreltilmiş 1: 200, oda sıcaklığında 1 h için % 2.5 normal keçi serum içeren PBS içinde bölümlerle kuluçkaya. 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın.
- t kuluçkayao bölümleri için 20 dk (Reaktif A ve Reaktif B kombine 30 dakika önceki gerek kullanmak için) bir peroksidaz avidin/biotin tabanlı sistemi ile. 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın.
- Erimesi 1 3.3 '-diaminobenzidine (DAB) ve 1 üre hidrojen peroksit tablet 5 mL çift distile su. Yaklaşık 3 dk., renk geliştirme dikkatle izlenmesi için DAB çözüm bölümlerle kuluçkaya. Yavaşça 200 mL PBS slaytları yıkayarak renk reaksiyonu durdurmak.
Dikkat: Kanserojen; kimyasal dayanıklı eldiven giymek! - Çekirdeği Hematoksilen ile 6 min için counterstain. 2 dk. Dehydrate 2 min için üç kez musluk suyu 200 mL % 100 alkol durulama. Üç kez 2 min için Ksilen veya Ksilen yerine içinde her 200 mL temizleyin. Montaj montaj Ksilen tabanlı ortamda.
- Slaytlar (en az on alanları, her kalp interventricular septum üzerinden 40 x büyütme) Fotoğraf ve serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım 31 kullanarak Pecam-1 alan yoğunluğunu ölçmek. Renk deconvolution 32 eklenti DAB ve Hematoksilen ve görüntü kontrastı ile aynı düzeye ayarlayın.
Not: kahverengi ve mor/mavi renk var zorluklar ile renk deconvolution neden olabilir, önemli spektral çakışma durumunda bir Hematoksilen çözüm açık, açık mavi nükleer boyama elde etmek için farklı markalar deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, ayirt veya el ile kılcal damarlar sayma yerine olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1' de, genetiği değiştirilmiş farelerde kardiyak fenotipleri tanımlamak için Ekokardiyografi kullanışlılığı temsilcisi Ekokardiyografik kayıtları gösterir. Bir fare ile normal kardiyak fonksiyon (şekil 1A) ve dilate sol ventrikül ve azaltılmış LV fonksiyonu (şekil 1B) bir hayvanla arasındaki fark kolayca tespit edilebilir. Resim 2 (şekil 2A) olmadan hayvanlarda çapı ölçümleri cardiomyocyte karşılaştırılması gösterir ve Hematoksilen Eozin lekeli parafin kalp bölümleri ve ölçümleri kullanarak kalp hipertrofisi (şekil 2B) ile kalp doku boyuna kesitler. Şekil 3 kalpler WGA lekeli parafin bölümleri kontrol kullanarak cardiomyocyte transvers çapı ölçümü gösterir fare (şekil 3A) ve kalp hipertrofisi (şekil 3B) hayvanlarla. Şekil 4 (DAB substrat, kahverengi boyama) Pecam-1 immünhistokimya normal kalp doku (4A rakam) ve kalpleri artan angiogenez (şekil 4B ile gemi yoğunluğunu belirlemek için kardiyak bölümlerin yarar gösteriyor ).
Resim 1: Standart çözünürlüklü Ekokardiyografi (> 10 MHz) ölçü LV sistolik ve diyastolik boyutlar ve miyokard infarktüsü denetim hayvanlar karşı sonra dilate kalp hipertrofisi ile farelerde kardiyak fonksiyon.
Normal, sağlıklı fareler (A) ve hayvanlardan LV dilatasyon ve miyokard infarktüsü (Tie2-CreERT2; sonra indirimli LV fonksiyonu ile temsilcisi Ekokardiyografik kayıtları PPARβ/δ + Tamoxifen fareler)5 (B). LVAW, LVID ve LVPW belirtilir. Beyaz çubuklar sistolik ve diyastolik ölçüm noktaları gösterir. Onlar Puan ölçülerini ayarla ve protokol adım 1.12 açıklandığı imleci karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: fare ile boyuna kesitli hücrelerdeki cardiomyocyte çapı ölçmek için bölümler Hematoksilen Eozin lekeli büyümüş kalp hipertrofisi ve denetim hayvanlar. Temsilcisi görüntüleri cardiomyocyte çapları normal cardiomyocyte boyutları(a)ile fareler ve hayvanlarda artan cardiomyocyte boyutlarında (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen fareler)5 (B). Siyah çizgiler ölçülen çapları gösterir. Her ölçüm için değerleri gösterir. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fare ile dilate kalp hipertrofisi karşı dokusundan kalp bölümlerini cardiomyocyte transvers çapı ölçmek için WGA lekeli bölümleri kontrol hayvanlar. Temsilcisi görüntüler için cardiomyocyte çapları normal cardiomyocyte boyutu(a)ile fareler ve hayvanlarda artan cardiomyocyte boyutlarında (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen fareler)5 (B). Çekirdeklerin DAPI ile counterstained. Beyaz çizgiler ölçülen çapları çekirdekleri (mavi) düzeyde gösterir. Her ölçüm için değerleri gösterir. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kalp damar yoğunluğu kontrol fare ve artan angiogenez hayvanlarla analiz etmek için Pecam-1 immunolabeled bölümler.
Gemi normal vasküler yoğunluk(a)ve gelişmiş vaskülarizasyon (Tie2-CreERT2; hayvanlarla farelerde etiketleme için temsil edici görüntüleri PPARβ/δ + Tamoxifen fareler)5 (B). Çekirdeklerin Hematoksilen ile counterstained. Okları Pecam 1 pozitif gemiler için gelin. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyak yapısı ve fonksiyonu farelerde, Ekokardiyografi, kontrast-artırılmış MRI, CT mikro ve PET taraması gibi değerlendirmek için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Maliyet-etkililik ve kolaylık nedeniyle Ekokardiyografi fareler11fonksiyonel analiz için en çok kullanılan tekniktir. Genel olarak, kalp ve nabız farelerde, dönüştürücü bir frekans ile yüksek frekans küçük boyutu nedeniyle > 10 MHz kullanılmalıdır, her ne kadar başarılı ölçümleri 8 ya da 9 MHz güç çeviriciler4ile,7 bildirilmiştir . Kardiyak fonksiyon yakından vücut ısısını ve kalp frekans ile ilgili olarak, çalışma boyunca bu parametreleri denetlemek önemlidir. Bir Isıtma yastığı üzerinde fareyi yerleştirerek imzalat hayvanın vücut ısısını sabit tutmak için önemlidir. İdeal olarak, vücut ısısı 38 ° C için ayarlamak için bir rektal sonda ile kontrollü Isıtma yastığını kullanılmalıdır. Bu kullanılamıyorsa, Isıtma yastığını iki üç derece bu değerin ayarlanması gerekir. Araştırmacı ve hayvanların aşırı ısınma riski için görev karmaşık hale Isıtma lambaları, kaçınılmalıdır.
Kalp atış hızı ve kardiyak fonksiyon denetlemek için anestezi türü önem arz etmektedir. Anestezi bir indüksiyon odasında (% 3 isoflurane) Solunduğunda ikna etmek kolay, bir solunum maskesi (% 1-2 isoflurane) yolu ile korunabilir ve sadece kısa süreli olarak en çalışmaları isoflurane, kullanın. Yaygın olarak kullanılan diğer maddelerin 2,2,2-tribromoethanol, Fentobarbital ve ketamin +11,12xylazine karışımları. Doğal olarak, isoflurane Ekokardiyografik ölçümlerde kardiyak fonksiyon uzlaşmaya bildirdi ve bu etkisi daha da belirgin ketamin + xylazine grubu11. Ketamin yalnız bu çalışmada11' en iyi çalıştı. Gao ve ark. 2,2,2-tribromoethanol12en tekrarlanabilir sonuçlar bildirdi. İsoflurane, 2,2,2-tribromoethanol ve Fentobarbital12için aynı aralıkta sonuçlar alındı. Ayrıca, kalp hızı 2,2,2-tribromoethanol içinde farklı değildi ve Fentobarbital12gruplandırır. Kalp ve ark. bildirilen düşük kalp hızı ketamin + xylazine grubu ile karşılaştırıldığında 2,2,2-tribromoethanol grup16. Bizim deneylerde kullanarak farklı transgenik fare suşları ve Fentobarbital anestezi, ortalama kalp hızı 350 ve 450 bpm arasında değişiyordu. Bununla birlikte, ejeksiyon fraksiyonları kullanmıştır > %80, bilinçli hayvanlar11değerlere karşılık gelir. Ekokardiyografi ölçümleri koşullardır bizim laboratuvar4,5,6 aynı aralıkta taban çizgisi altında başka bir yerde11,12,14 bildirdi ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . Fentobarbital aksine, ketamin, isoflurane ve 2,2,2-tribromoethanol hızlı başlangıç ve kurtarma ile karakterizedir. Böylece, anestezi ve Ekokardiyografik ölçümler arasındaki zamanlama çalışmada farklı derece anestezi kurtarma önlemek için tüm hayvanlar için aynı olması gerekir. Fentobarbital artık bu davranır, ancak küçük bir tedavi pencere dezavantajı doz sıkı vücut ağırlığı ile ilgili olarak bir düzenleme yapmak mecburi hale vardır. Fentobarbital kullanarak uzun süreli anestezi temel Ekokardiyografik ölçü birimlerinin sonra cerrahi işlemler-ebilmek var olmak kılınmak ezelî belgili tanımlık lüzum için yeniden enjeksiyon5avantajı vardır. Deneyim, bir haftadan az bir zaman aralığı ile enjeksiyonu artan Postoperatif mortalite sonuçlandı, tekrarlayan anestezi Fentobarbital kullanarak kaçınılmalıdır.
Ekokardiyografi ile farelerde gerçekleştirirken bir > 10 Mhz transducer, resim kalitesi genel LV işlev belirlemek yeterli olmalıdır. Birden çok resim beat beat varyasyonları ve hareket eserler azaltmak her hayvan için alınması gerekir. Eğitimli bir kardiyolog veya Ekokardiyografi farelerde deneyimi olan bir bilim adamı uzman tavsiyesi başında görüntü kalitesini değerlendirmek için istenmelidir. Birçok Ekokardiyografi makinesi EF LV iç çapı Teicholz formül11,12kullanarak hesaplayın. LV boyutları ölçmek kolay olsa bile, LV ideal, Basitleştirilmiş herhangi bir geometrik şekle uygun değil çünkü onlar LV birimleri ve alanları kusurlu bir değerlendirmesini sağlar. Teicholz formülü ile elde edilen kesirli ne kısalma ne de fırlatma kesir olarak her ikisi de bir geometrik varsayımına dayanır ve sadece iki duvar contractility tarif LV contractile işlev, belirlemek için mükemmel bir parametredir. Çift kanatlı Simpson'ın yöntemi ile değerlendirildi ejeksiyon fraksiyonu daha doğru olur, ancak bu her hayvan burada kullanılan donanımı ile elde etmek mümkün değildi.
Akut miyokard infarktüsü sonrası Ekokardiyografik görüntüleme ile ilgili bazı sorunlar karşı karşıya. İlk olarak, görüntü kalitesi büyük ölçüde Torakotomi yara tarafından engel oldu. İkinci olarak, hayvanlar için tekrarlanan anestezi çok daha hassas olduğunu. Son olarak, M-modu tabanlı LV hacim ve işlev ölçümleri LV geometri homojen olduğu varsayılmaktadır. Sonuç olarak, bu endeksi kullanımı akut miyokard infarktüsü sonrası LV duvar anomalisi varlığında daha tartışmalı hale gelir.
Bizim ellerde 15-MHz prob Doppler görüntüler zaman zaman ama değil sistematik, kayıt için izin. Çok daha yüksek Frekanslar LV bölgesel işlevi belirlemek için veya sadece kemirgenler12' ye özel ekipman ile elde edilebilir miyokardiyal kontrast Ekokardiyografi gerçekleştirmek için gereklidir.
Ek olanaklar ve bu kemirgen özgü sistemlerin daha yüksek çözünürlük göz önüne alındığında, bir gelecekte onları kullanmayı düşünmelisiniz. Dezavantajları yüksek maliyetleri ve ayrılmış bir alan ihtiyacı vardır. Bu yüksek teknolojili, kemirgen adanmış echocardiographs sadece soruşturma altında yeterli hayvanlardır ve bilim adamları sayıda kullanın karlı olacaktır. Bu makineler için verilen özel eğitimler ile onlar değil içinde Kardiyoloji uzman bilim adamları tarafından kullanılabilir. Klinik Ekokardiyografi cihazları yukarıda da belirtildiği gibi sınırlı bir çözüm sağlar. Yine de, hala başarılı farklı deneyimli l içinde kullanılıraboratories11,12; kolayca yetenekli bilim adamları ve kardiyolog tarafından kullanılabilir; daha fazla hareket eden ve daha az bir özel alanı talep olduğunu; ve makineleri yüksek sayıda nedeniyle (Kiralama, klinik kullanımda olmayan ekipman edinme veya ikinci el alışveriş yapmamesela ) maliyetlerini azaltmak için farklı seçenekler değerlendirilmesi için izin verir.
Histolojik analizler için organ yalıtım ve doku fiksasyon arasındaki süreyi en aza indirmek için ilk kritik nokta var. Bu protokolü olduğu gibi çoğu boyama ve histolojik analizler iletilen ışık mikroskobu üzerinde temel alır; formol kalp dokusunda fiksasyonu daldırma yeterlidir. Bir projenin odak Floresans mikroskobik boyama daha fazla ise, bir perfüzyon fiksasyon imzalat hayvan doku, kırmızı kan hücreleri kaldırmak için parlak otomatik Floresans özetinizi düşünmelisiniz.
Parafin katıştırma içinde varyasyonları önlemek için otomatik bir gömme cihazı kullanın. Erime noktası ve sertlik parafin markalar arasında farklı olarak, çalışma boyunca aynı tedarikçi kullanmanızı öneririz. Parafin kesit bir döner microtome kullanarak önceden soğutulmuş bloklar üzerinde gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bölüm kalınlığı sabit tutulması gerekir. 3-µm bölüm kalınlığı cardiomyocyte çapları doğru ölçüm için gerekli, Hematoksilen Eozin lekeli kalp bölümlerde membran sınırlarının net görselleştirme sağlar. Cardiomyocytes şeklinde düzensiz olduğu için ölçümler çekirdek düzeyde gerçekleştirilmesi gerekir. WGA boyama hücre zarı leke için alternatif bir yol sağlar ve Hematoksilen-Eozin boyama olarak aynı değerleri neden olur. Xarakteristikaları analizleri önce bir tane açıkça tanımlamak (Yani, sol veya sağ ventrikül ücretsiz duvar veya septum) kalp hangi parçası ölçülecek ve cardiomyocyte kesit uzun ya da kısa eksen olup olmadığı belirlenir. Enine, sarmal ve boyuna cardiomyocytes ' kalbinde yönünü nedeniyle, aynı enine bölümün boyuna ve enine bölümlerini cardiomyocytes üzerinde elde etmek mümkündür. Hücreleri çekirdek düzeyde analiz edilir sürece olup boyuna veya transvers çapı ölçülür bir kongre, meselesi.
Çalışmalarımız, biz Ekokardiyografik boyutları ve kalp vücut ağırlığı oranları ve cardiomyocyte boyutları4,5,6arasında bir anlaşma gözlenen ama histolojik ölçümleri cardiomyocyte boyutu yok her zaman ejeksiyon fraksiyonu değerlerine karşılık gelen. Örneğin, egzersiz eğitim korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ve artan cardiomyocyte çapları artmış kardiyak boyutları sonuçlanır. Ancak, dekompanse kalp yetmezliği artmış kardiyak boyutları, bir düşük ejeksiyon fraksiyonu ve artan cardiomyocyte çapları33ile karakterizedir. Ayrıca, biz son zamanlarda artan kalp damar yoğunluğu nedeniyle endotel özgü overexpression PPARβ, geliştirilmiş kardiyak fonksiyon temel koşullar altında ne de gelişmiş kurtarma akut miyokard infarktüsü sonrası5 yol açmaz olduğunu gösterdi .
İmmünhistokimya için negatif denetimleri eklemek ve iletişim kuralında sağlanan farklı engelleme adımları gerçekleştirmek için önemlidir. Protokol antijen maskesinin adımda kullanılan birincil antikor için özeldir. Farklı birincil antikor, düşük veya yüksek pH maskesinin arabellekleri içinde daha iyi bir sinyal neden olup olmadığını belirlemek gereklidir. Farklı fiksasyon teknikleri spesifik antijen algılamak için kullanılabilir. Örneğin, aynı fiksasyon thrombomodulin antikor34için arka plan azaltmak için ek adımlar gerekli en iyi çinko sabit, parafin gömülü doku üzerinde çalışmaya Pecam-1 etiketleme bildirilmiştir. Böylece, farklı antijenler çeşitli çalışma genişletmek için izin normal formalin fiksasyon kullanın. Seçimli-e doğru Pecam-1 immunostaining, isolectin B4 damarları görselleştirmek için sık kullanılır. Endotel hücreleri35oranının yanı sıra isolectin B4 Ayrıca glia36 ve makrofajlar37Etiketler. Ayrıca, antijenleri çeşitli Arteryel ve venöz endotel hücreleri38arasında ayırt etmek için kullanılabilir. Zarif bir şekilde işlevsel görselleştirmek için gemiler periosteum veya gemi belirlemek için çimlenme veya regresyon Floresans birleştiğinde lektin cryosections24analiz tarafından takip intravenöz enjeksiyon. Ancak, bu yaklaşım ek antijenler tespit etmek ve cryosections farklı kalitesi nedeniyle xarakteristikaları çözümlemesi yapma olasılıkları büyük ölçüde sınırlar.
Nereye sinyal ile DAB görselleştirildiği immunostained bölümlerde alan yoğunluğu kantitatif serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımını kullanarak belirlenebilir. Ancak, sinyal doğrusal olmadığı gibi kahverengi boyama derecesi tam olarak protein ifade düzeyine karşılık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma "Yatırımlar gelecek için" LABEX SIGNALIFE program sayesinde (başvuru ANR-11-LABX-0028-01) (Ulusal araştırma ajansı, ANR) Fransız hükümeti tarafından desteklenen ve K. hibe tarafından Derneği'nden D. W. pour la Recherche sur le kanser, Fondation de France ve kanser INSERM planı. D. B. ve A. V. Arkadaş grupları sırasıyla Fondation pour la Recherche Médicale ve Nice şehir aldı. Philips tarafından sağlanan echocardiograph ve dönüştürücü nazik idi. A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Karatepe, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini ve S. M. Wagner onların yetenekli teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H.
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F.
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al.
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
