Summary
Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.
Abstract
Het intrinsieke tropisme tegen hersentandwonden veroorzaakt stamcellen als veelbelovende dragers van therapeutische middelen tegen kwaadaardige tumoren. De levering van therapeutische stamcellen via de intranasale route is een recent ontdekte alternatieve strategie, met sterk potentieel voor klinische vertaling, vanwege het niet-invasieve karakter in vergelijking met intracraniale implantatie of afgifte via systemische routes. Het gebrek aan bloed hersenbarrière versterkt het therapeutische potentieel van stamcellen die intranasale herseninvoer ondergaan. In dit artikel wordt een overzicht gemaakt van de essentiële technieken die in onze studies worden gebruikt en schetst de basisprincipes van de intranasale strategie voor de lever van stamcellen door gebruik te maken van een muismodel van intracraniale glioma xenografen. Wij tonen de geoptimaliseerde procedures die consistente en reproduceerbare resultaten genereren met specifieke vooraf bepaalde experimentele parameters en bieden richtlijnen voor gestroomlijnde werkstroom die zorgt voor een efficiënte uitvoering en betrouwbare experimentatieNtal resultaat. Het artikel is bedoeld om als basis te dienen voor verdere experimentele aanpassing op basis van hypothese, stamcel typen of tumor specificaties.
Introduction
Lage toxiciteit, lage immunogeniciteit en intrinsieke hersentumor tropisme van menselijke stamcellen zijn aantrekkelijke eigenschappen voor de levering van therapeutische vehikel 1 . Nieuwe stamcellen gebaseerde therapieën voor kwaadaardige hersentumoren zijn in de afgelopen jaren veelbelovende innovaties ontwikkeld en de intranasale aanpassing van deze therapeutische strategie is een stap naar klinische vertaling, omdat niet-invasieve en herhaalde toediening de barrière voor patiëntstoepassingen drastisch kan verminderen en Kan aanpasbaar zijn voor outpatiëntendiensten zonder algemene verdoving of langdurige patiëntenservice in verband met invasieve chirurgische procedures 1 , 2 , 3 , 4 .
Wij en anderen hebben de intranasale route van stamcelafgifte aan hersentumoren gepresteerd en hebben de basiswerk voor een aantal basisprincipes gelegd.Van translatieonderzoek met behulp van muizen xenograftmodellen 2 , 3 , 4 , evenals de migratie van stamcellen in vivo via magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) reagens dragers 2 onderzocht. Door deze proefonderzoeken hebben we aanzienlijke ervaring opgebouwd en inzicht verkregen in het optimaliseren van een robuuste preklinische evaluatie strategie door gebruik te maken van gevestigde patiëntgerelateerde xenograft (PDX) muismodellen van kwaadaardig glioma, waarbij de onderzoeksresolutie wordt gehandhaafd om de Genuanceerde mechanistische details van de geavanceerde biologische verschijnselen van de intranasale hersenen ingang van therapeutische stamcellen afgeleverd in de neusholte. Hier beschrijven we de principes van een gestandaardiseerd operationeel protocol om de huidige stand van experimentele onderzoeken aan te tonen met behulp van een goed gevestigde humane neurale stamcellijn HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures moeten door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) of gelijkwaardig worden goedgekeurd. Als er onzekerheid bestaat over de specifieke procedures die hierin zijn beschreven, ga dan niet verder. Verduidelijkt bij de IACUC van de instelling en een aangewezen dierenarts.
1. De steriliteit van gecultiveerde cellen waarborgen en principes van aseptische technieken volgen
- Volg de standaard goede laboratoriumpraktijk bij alle celcultuurprocedures en IACUC-eisen voor celonderzoek en patogeenvrije statusbevestiging voorafgaand aan toediening aan muizen 9 , 10 .
- Volg de NIH-eis voor celverificatie om reproduceerbare uitkomst te garanderen 11 .
- Volg de gevestigde kleine dierchirurgie aseptische technieken die in dit manuscript 4 zijn beschreven.
2. Bereiding van gliomacellen voor <Em> In Vivo Experiment 2 , 4
- Cultuurgliomacellen (GBM43, GBM6 en U87MG) in serum bevattend (10% foetaal runder serum in Dulbecco's Modified Eagle's medium [DMEM]) of serumvrij medium (Neurobasal medium met supplementen B27, N2, heparine, epidermale groeifactor [ EGF], basische fibroblastgroeifactor [bFGF], antibiotica en L-glutamine 12 ), in een bevochtigde CO 2 -celkweek incubator.
- Test alle cellijnen via het muispaneel dat wordt uitgevoerd door commerciele dienstverleners.
- Verzamel hechtende cellen door het verwijderen van kweekmedium. Incubeer met 0,05% trypsine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (1 ml trypsine voor T25-fles, 2 ml voor T75 fles, dienovereenkomstig schalen voor kweekflessen met grotere oppervlakte) en vervolgens wascellen met Ca 2+ en Mg 2+ vrij fosfaat Gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Druk opKolf om cellen te verwijderen en onmiddellijk te neutraliseren met een overmaat serum bevattend medium (8 - 9 ml). Gebruik dan serologische pipetten om de celsuspensie in centrifugebuizen te aspireren.
- Centrifuge cel suspensie bij 400 xg gedurende 5 min. Was de cel minstens twee keer met 10 ml PBS door herhaalde centrifugatie.
- Verzamel gliomacellen die als tumorbolletjes in serumvrij medium worden gewonnen via centrifugatie (dezelfde snelheid en duur als hierboven); Ontleed de celpelletje door incubatie in 1 - 2 ml celafzettingsoplossing bij 37 ° C gedurende 5 minuten voordat u tweemaal wassen met 10 ml PBS door centrifugeren (400 x 5 x 5 min).
- Glioma opnieuw opschorten in steriele zoutoplossing bij een concentratie van 50.000 - 200.000 cellen per 2,5 μl. Celgetallen die worden gebruikt voor injectie in de muisbrein zijn afhankelijk van de vastgestelde groeitempo voor elke glioma cellijn. Gebruik hier 25.000 en 100.000 voor respectievelijk GBM43 en GBM6 patiënt afgeleide tumorcellen.
- Bereid dubbel de hoeveelheid van de neusSsary celnummer voor implantatie om rekening te houden met het verlies van een fractie tijdens de procedure. Breng de injecteerbare cel suspensie over naar een steriele microcentrifugebuis en plaats de buis op ijs. Bewaar cellen op ijs gedurende maximaal 2 uur tijdens de operaties, maak een nieuwe partij voor als er uitgebreide operaties zijn gepland.
3. Intracraniale implantatie om Xenograft Muismodellen te maken ( Figuur 1A ) 2 , 4 , 13
- Voorafgaand aan de operatiedag, steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen in een autoclaaf en berei alle pre- en postchirurgische dierenverzorgingsmaterialen voor per IACUC goedgekeurd protocol op. Steriliseer het stereotaxische frame en perifere apparatuur om intraoperatieve aseptische condities te waarborgen, waardoor complicaties worden geminimaliseerd.
- Organiseer het bedieningsgebied om de rommel en de mogelijkheid van verontreiniging te minimaliseren.
- Jurk in geschikte persoonlijke beschermingsuitrustingMent (PPE) per IACUC vereiste.
- Stel de juiste postoperatieve herstelkamer op. Zorg ervoor dat verdovingsmiddelen en pijnstillers vers worden bereid met onverwachte reagentia. Installeer passend lichaamshitte onderhoudsinstrumenten per IACUC goedgekeurd protocol.
- Om menselijke patiënten afgeleide glioma cel xenografen te bepalen voor het testen van intranasale afgifte van menselijke NSC's, gebruik immunocompromised mus species zoals nu / nu athymic muis van elk geslacht bij ongeveer 6 weken oud.
- Verdoof het dier op basis van lichaamsgewicht met behulp van de goedgekeurde reagentia, ofwel via een intraperitoneale (ip) injectie van een mengsel van ketamine (50-100 mg / kg; raadpleeg institutionele IACUC voor goedgekeurd dosisbereik) en xylazine (5-10 mg / Kg; raadpleeg institutionele IACUC voor goedgekeurd dosisbereik) in 200-250 μL steriele zoutoplossing, of via 4-5% isofluraananesthesie met behulp van een inhalatieapparaat.
- Zorg ervoor dat het dier het chirurgische verdovingsvlak bereikt bJe knipt voor de huidinsnijding. Breng een ruime steriele oftalmische gel aan om de vochtige toestand van de hoornvlies van het dier te waarborgen.
- Steriliseer de schedel met behulp van herhaalde en afwisselende cirkelvormige doekjes van betadine en isopropylalcohol per Pritchett-Corning et al. 14 .
- Geef de pre-incisie analgesia door een injectie van Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) voor het snijden met behulp van het chirurgische mes.
- Gebruik gesteriliseerde katoenstippeltoepassing om hemostat te helpen bij het blootstellen van de schedel; Gebruik 3% waterstofperoxide om de ontruiming van incidentele bloeding te vergemakkelijken.
- Gebruik een batterijhandige elektrische balpenboor (minder dan 1 mm in breedte) om een boorgat op 2 mm lateraal te maken, links of rechts, tot de middellijn en 2 mm achter de Bregma (de positiecoördinaten kunnen aangepast worden op basis van Op het tumormodel bestemd voor een bepaalde studie).
- Zet het dier op het stereotaxische frame op de juiste plaatsE hoofd houding, zodat de ingebouwde Hamilton micro spuit loodrecht staat op het oppervlak van de schedel rond het boorgat. Zorg ervoor dat het anesthesievlak van het dier goed in de teen staat. Let op de ademhalingssnelheid om ervoor te zorgen dat het dier tijdens de volgende stappen geen pijnstress heeft.
* We benadrukken geen in-ear-bar-plaatsen omdat:- We hebben het boorgat gepresteerd om de naald te positioneren en daarom zijn precieze schedelcoördinaten onnodig;
- Muisoorgangen zijn fragiel, en de precieze in-ear plaatsing van oorbars vereist meer betrokken training die niet relevant is voor ons doel. De risico's van schade aan de muizenoorgangen zijn hoger dan de voordelen van een precieze plaatsing;
- Cheek support is veel makkelijker te presteren en in staat om dezelfde niveaus van stabiliteit en balans van de muis te behalen tijdens de positionering. Het is een extra voordeel voor meerdere tijdgevoelige operaties om ervoor te zorgenTijdige afronding met goede cel levensvatbaarheid.
- Gebruik de stereotaxische kaderknoppen om de platspuitmicrospuit op het boorgat te plaatsen en laat deze dan langzaam naar 3 mm onder het dura oppervlak liggen. Trek 0,5 mm terug om de punt van de naald te houden op 2,5 mm onder de dura.
- Spuit 2,5 μl vooraf geladen gliomacellen over de periode van 1 minuut. Laat de naald gedurende nog eens 1 minuut zijn positie nog 1 tot 2 min. Langzamer houden, de naald uit de hersenen trekken en zorg ervoor dat de achteruitgang van de cel wordt beperkt. Breng steriele botwax aan om extracraniale tumoruitgroei te vermijden.
- Sluit de wond door gebruik te maken van roestvrijstalen gewikkelde clips (7 mm). Lever een subcutane injectie van 1 ml steriele lactated Ringer oplossing (voorverwarmd tot 37 ° C) en plaats het dier in een herstelkamer die half op een verwarmingsblok ligt.
- Breng de dieren terug naar het geventileerde rek als ze hun mobiliteit herwinnen, en volg de routine na de zorg om smoot te verzekerenH herstel.
4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) van Tumor Growth ( Figuur 1B ) 15
OPMERKING: De patiënten afgeleide gliomacellen worden aangepast om firefly luciferase uit te drukken. Dit stelt ons in staat om tumorprogressie na intracraniale implantatie te volgen.
- Geef dieren een ip-injectie van het D-luciferine, kaliumzout (150 mg / kg) 10 minuten voor de beeldsessie.
- Plaats dieren onmiddellijk in een zuurstofgezette isofluraaninductiekamer die door de IACUC is goedgekeurd.
- Plaats dieren binnen de verwarmde (37 ° C) beeldkamer om het BLI-signaal op te nemen met behulp van software-instellingen (voor details, zie fabrikant instructie).
5. Bestraling van de hele hersenen ( Figuur 1C ) 2 , 4 , 13
4 worden gebruikt.
- Gebruik een ip-injectie van een ketamine- en xylazine-mengsel (respectievelijk 50-100 mg / kg en 5-10 mg / kg; raadpleeg institutionele IACUC voor goedgekeurd dosisbereik) met subchirurgisch verdovingsvlak om de anesthesie voor muizen matig aan te leiden.
- Gebruik een steekproefbak om de muizen in de kamer te plaatsen tussen loodafschermingblokken, waardoor de blootstelling aan het stralingspad alleen kan worden blootgesteld ( figuur 2 ).
- Geef muizen met een positieve BLI-bevestiging van tumorgroei (gewoonlijk op dag 7-8 na implantatie van gliomacellen) een dagelijkse dosis van 2 Gy bestraling gedurende 5 opeenvolgende dagen. Voer BLI-beoordeling van de tumor na de laatste bestralingsdosis uit.
6. Genetische Modificatie van Menselijke Neurale Stamcellen (NSC's; FiguurE 3A) 4
- Onderhoud van menselijke NSC's (kloon HB1.F3.CD) 6 , 7 in DMEM-medium met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine in een bevochtigde 37 ° C incubator onder 95% kamerlucht en 5% CO 2 ( N NSC's).
- Voer genetische overexpressie uit van chemotaxische receptoren, zoals de CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4), in hNSCs door transductie met lentivirus codering voor humaan CXCR4.
- Wanneer NSC's bijna 75-80% confluency zijn, voeg dan de CXCR4 lentivirus toe aan het kweekmedium samen met polybrene (8 μg / ml) en incubeer gedurende 8 uur of 's nachts.
- Vervang virus bevattend medium met vers medium dat blasticidin bevat bij 4 μg / ml voor positieve selectie van getransduceerde cellen.
- Valideer het niveau van CXCR4 expressie in gemodificeerde hNSCs ( CXCR4 NSC's) via flowcytometrie met behulp van anti-CXCR4 antilichaam en bijbehorend isotype antilichaam en viEen kwantitatieve RT-PCR met behulp van een paar primers die CXCR4 en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) cDNAs 4 versterken.
- Genereer vectorcontrole NSC's ( VC NSC's) met dezelfde strategie, waarbij RFP het CXCR4-gen vervangt en via microscopie of flowcytometrie verifiëren door de aanwezigheid van RFP-fluorescentie.
7. Hypoxische preconditioning van menselijke NSC's ( Figuur 3A ) 4
- Platte gekweekte NSC's in T75 kweekflessen zoals hierboven beschreven tot 90% confluentie is bereikt.
- Plaats celcultuurflessen in een bevochtigde CO 2- kamer / incubator met 1% O 2- niveaus gedurende 24 uur, via N 2 -gasvoorziening geregeld door een geautomatiseerde ingebouwde flowmeter. Deze cellen worden aangeduid als H NSC's. Control N NSC's worden beschreven in stap 7.1.
8. Laden van HuMan NSC's met Oncolytic Virus ( Figuur 3B -3H ) 5
- 8.1.Infect N NSC's, H NSC's, VC NSC's en CXCR4 NSC's met 50 voorwaardelijke replicatieve adenovirus (CRAd) -S-pk7 virale deeltjes / cellen 4 , 16 .
- 8.2. Na 2 uur incubatie bij kamertemperatuur met periodiek tikken, wascellen drie keer met media om onbound virale deeltjes te verwijderen en cellen in steriele zoutoplossing voor injectie op te schorten.
VOORZICHTIG: Voer alle virusgerelateerde in vitro celkweekprocedures uit in voorzieningen met de juiste biosafety-niveaubenaming, zoals BSL2. Geschikte persoonlijke beschermende uitrusting moet gedragen worden door onderzoekers die het oncolytische virus hanteren volgens richtlijnen 4 , 16 van de institutionele dierenfaciliteit.
9. Stamcellen laden met microN-grootte Paramagnetische Ijzer Oxiden (MPIO's) voor In Vivo Tracking via Magnetische Resonantie Imaging (MRI; Figuur 3B -3H ) 2
- Om stamcellen te labelen, voeg MPIO's toe aan stamcelculturen bij ~ 80% samenvloeiing, in aanwezigheid van transfectie-reagens voor incubatie gedurende de nacht. De efficiëntie van stamcel-etikettering (NSC's 4 of MSC's 2 ) met MPIO's (rood rood geconjugeerd) wordt bepaald door flowcytometrie.
- Om de stamcellenmigratie en verdeling in de hersenen van glioma-dragende dieren te visualiseren, verwerven u zowel T2-gewichtsverhoging met hoge resolutie T2-gewogen Rapid Acquisition met Spin-echo-afbeeldingen met Ontspanningsverbetering en T1-gewogen Snel Laaghoek Schot (FLASH) gradiënt-echo sequenties naar Beoordeel de structuur via zowel de coronale als de axiale vlakken van de muisbrein 2 .
10. Intranasale Levering van Therapeutische NSC's ( Figuur 3D ) 2 , 4
- Cultuur en verzamel NSC's ( N NSC's, H NSC's, VC NSC's en CXCR4 NSC's) volgens het protocol beschreven in sectie 3.
VOORZICHTIG: Alle dierprocedures met OV-geladen NSC's moeten worden uitgevoerd in voorzieningen met de juiste biosafety-niveaubenaming, zoals BL2 of BSL2-faciliteiten. - Verdoof muizen via ip injectie van een ketamine en xylazine mengsel volgens stap 3.6.
- Plaats muizen op een schone drapering naar boven met een verwarmingskussen onder om de lichaamstemperatuur te behouden. Pas een opgevulde kussen aan van opgerolde papieren handdoeken met tapes om de rechte hoek van de neusgaten te verzekeren wanneer ze onder het hoofd van de muis worden geplaatst.
OPMERKING: Voorbehandeling van hyaluronidase (totaal van 100 U als vier herhaalde inoculaties met intervallen van 5 minuten, 3 μL in elke neusgat) van de nasale ePithelium werd eerder beschreven 2 , 17 . - Gebruik een micropipet, verdeel 2 μL NSC suspensie aan elke neus van de muis. Bevestig de aspiratie van de druppel visueel voordat u naar de volgende muis beweegt. Het totale aantal geleverde cellen kan door de gebruiker worden bepaald; Gebruik 62,500-125,000 cellen / μL, zodat 0,5-1 miljoen cellen in 4 x 2 μL doses kunnen worden afgeleverd.
- Gebruik een timer om 5 minuten te waarborgen tussen elke cel suspensie toediening tot 4 keer.
- Laat dieren toe om de mobiliteit in een herstelkamer te herwinnen, waarbij de rugleuning doorheen wordt gehandhaafd.
11. Overlevingsanalyse ( Figuur 3E )
- Voer de data over de overlevingsduur van dieren in statistische software in en voer statistische vergelijkingen uit met behulp van de log-rank test met de volgende significante aanduidingen: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0.001.
12. Weefsel Verzameling en Histologie / Immunocytochemie Verificatie van Intranasale Stamcellen Brain Entry 2 , 4
- Aan het eindpunt van de studie, euthanize muizen via de IACUC-goedgekeurde protocollen. Een standaardpraktijk maakt gebruik van een stroomsnelheid gecontroleerde CO 2 kamer om de dieren op te offeren als de primaire euthanasiestrategie gevolgd door exsanguinatie door perfusie fixatie.
- Onmiddellijk na het opofferen, voer een intracardiale perfusie met PBS op het dier uit om de eliminatie van bloedresiduen uit bloedvaten te waarborgen en het behoud van weefsels voor latere histologische analyse te waarborgen.
- Plaats het CO 2 -gehuwde dier op een absorberend pad in de rugliggende positie, ga verder met een laparotomie om de diafragmespier te laten zien, die samen met de ribbekleding wordt ontleed, om het hart bloot te stellen.
- Na maKoning een nick aan het rechter atrium met een paar dissectiescharen, versnelling van de exsanguinatie met een 3-5 ml PBS-injectie via de linker ventrikel bij de top. Spuit ijskoud 4% paraformaldehyde (PFA) in omloop met behulp van een injectiespuit; Perifere spierkrampen zorgen voor een visuele bevestiging dat er geen grote blokkering in de circulatie is die de juiste weefselfixatie zou voorkomen.
- Verwijder het hoofd van het karkas chirurgisch en bewaar in een 50 ml centrifugebuis in 4% PFA bij 4 ° C overnacht. Vervang de oplossing tot 30% sucrose de volgende dag voor de hersenweefseldissectie nog eens 24 uur later.
- Breng het hersenweefsel in de OCT-verbinding in en ontvries op isopentaan op droogijs. Voer cryosectie van het resulterende weefselblok uit om 10-20 μm weefselsecties te genereren voor histologie- en immunocytochemie toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zowel hypoxische voorbehandeling ( Figuur 4A ) 4 en CXCR4-overexpressie ( Figuren 4B en 4C ) 4 vertonen de celmembraan-aanwezigheid van CXCR4-receptoren aanzienlijk, zoals aangetoond door stromingscytometrie. Het tumor tropisme aangetoond door NSC's (blauwe pijlen), wordt getoond in de tumorweefselhistologie (rode cirkel). De aanwezigheid van MPIO-gelabelde ( Figuur 4D ) stamcellen in de tumor wordt bevestigd via Pruisische blauwe kleuring ( Figuur 4E ). 4
Een weefselanalyse wijst erop dat alleen-bestraling ( Figuur 2 ) reductie in tumorvolume veroorzaakt, evenals de upregulatie van SDF-1 in tumor en omringend weefsel ( Figuren 5A en 5B )4, die de hypothese bevestigt dat CXCR4 receptor upregulated expressie in NSC's tumor tropisme kan vergemakkelijken na XRT.
Overlevingsanalyse geeft aan dat hoewel bestraling (XRT) alleen gunstig is voor het overleven van tumor dragende dieren ( Figuur 6A ) 4 , kunnen extra voordelen worden bereikt met behulp van H NSC's geladen met OV over N NSC's geladen met OV in het kader van XRT ( Figuur 6B ) 4 . Significante overlevingsvoordelen kunnen ook worden gezien bij genetisch gemanipuleerde CXCR4 NSC's in hetzelfde contextueel therapeutisch regime ( Figuur 6C ) 4 .
Weefselanalyse bevestigt dat zowel H NSC's als CXCR4 NSC's de tumorgerichte afgifte van OV's aanzienlijk verbeterden, zoals blijkt uit staIn voor een viraal hexon eiwit ( figuren 7A en 7B ) 4 .
Figuur 1: Schematische stroomdiagram van de betrokken dierenprocedures. ( A ) Tumormodellen worden gecreëerd via xenograft van patiënt afgeleide gliomacellen. ( B ) Tumorgroei wordt gecontroleerd via BLI. ( C ) Bestralingsbestralingstherapie wordt afgeleverd zoals beschreven in Procedure 6. ( D ) Supine- en hoofd-kantelstandhouding wordt gehandhaafd tijdens de levering van therapeutische intranasale stamcellen, zoals gedetailleerd in Procedure 11. ( E ) Monitoring overlevingsmonitoring, klein dier Imaging en histologische analyse van weefsel indien nodig worden opgevolgd. Klik hier om te bekijkenEen grotere versie van deze figuur.
Figuur 2: De installatie van dieren voor bestraling. Anesthetized muizen worden gepositioneerd tussen loodschilden in de monsterbak waardoor alleen bestraling van het hoofd mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een stroomdiagram voor algemene stamcellen-voorbereidingsprocedures die betrokken zijn bij de intranasale afgifte. ( AC ) Hypoxische voorbehandeling of genetische modificaties van stamcellen om CXCR4 te overexpresseren. ( BD ) Was, enzymatische dissociatie, celinzameling en tellen stappen zijn perGevormd voor latere belasting van stamcellen met therapeutische of diagnostische lading. ( E ) Therapeutische reagentia, zoals oncolytische virussen of diagnostische tracers, zoals MPIO-deeltjes, kunnen in verzamelde stamcellen worden geladen in geschikte concentraties met periodieke schudden en zachte agitatie ( F ). ( GI ) De geladen stamcellen kunnen dan worden gewassen en geteld voor intranasale afgifte in muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van stamcelmodificaties voor CXCR4 Expression en MPIO Loading. ( AC ) Flowcytometrie kan worden uitgevoerd om de fenotypische modificaties van stamcellen te verifiëren als gevolg van hypoxische voorbehandeling of genetischeengineering. (Details zijn te vinden in Dey et al. 4 ) ( DE ) De detectie van succesvolle MPIO-inlading van stamcellen en in vivo -uitkomsten kan worden bereikt via respectievelijk stromingscytometrie en Pruisische blauwe kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De hypothese die bestraling vergemakkelijkt SDF-1 (Green Signals) Upregulation in Glioma en Surrounding Tissue is bevestigd Via Histopathologie en Immunocytochemie van Weefselsecties. Bestraling verhoogt SDF-1 expressie in GBM43 xenograft. De analyse van H & E-kleuring en immunocytochemie van hersenweefselsecties van controle en bestraalde muizen demonstrerenAtes verminderde de tumorbelasting maar verhoogde SDF-1 niveaus op de tumorplaatsen na XRT-behandeling. ( A ) SDF-1-expressie (groen) is sterk gelokaliseerd op de tumorplaats (witte dozen) na XRT. ( B ) Densitometrie kwantificering van de kijkvelden toont een viervoudige toename in SDF-1 expressie in XRT behandelde dieren in vergelijking met controledieren (n = 3 experimenten, *** p <0.001, Student's t-test). Details zijn te vinden in Dey et al. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Overlevingsvoordelen van gewijzigde NSC's werden waargenomen (details kunnen gevonden worden in Dey et al. 4 ). ( A ) De context van therapeutische voordelen van XRT werd vastgesteld (*** p <0.001, log rank test). ( B ) Hypoxische voorbehandeling van stamcellen geladen met OV verhoogt dierlijke overleving (* p <0,05). C. CXCR4 genetische verbetering verbetert verder het overleven van dieren (** p = 0,0013). Details zijn te vinden in Dey et al. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bevestiging van OV-Levering door Hypoxia- of CXCR4-verbeterde NCS's naar Brain Tumor Xenografts wordt bereikt via Viral Hexon Protein Detection door Immunocytochemistry (Green Dots) van Weefselsecties van Hersenen van Muizen Behandeld Met Hogen Of H A ) of CXCR4 NSC's ( B ), *** p <0,001 t test. Details zijn te vinden in Dey et al. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de intranasale route van geneesmiddelafgifte alvast verkenning is voor kleine moleculen, nanomedicines en eiwitverbindingen, zowel 18 , is de toepassing van therapeutische stamcellen voor intranasale hersentumor-targeting zeer nieuw in het spectrum van hersentumortherapie in ontwikkeling 2 , 3 , 4 . Er zijn intrinsieke complexiteiten betrokken bij het gedrag van stamcellen in de neusholte, en moleculaire details blijven nog onduidelijk. De grootte van stamcellen en hun verdelingsmechanismen langs kraniale zenuwen verschillen dramatisch van die van niet-celbiologen of kleine moleculen, en we zijn momenteel bezig met gedetailleerde mechanistische onderzoeken die betrekking hebben op het gedrag van therapeutische stamcellen in de nasale epithelia. Moleculaire interacties waarbij stamcellen cytokine receptor expressie profielen, evenals extracellulaire matrix(ECM) hechtingsmoleculen zoals integrin, worden onderzocht om licht te werpen op de basis van de intranasale herseninbreng van stamcellen. De kritieke stappen in het huidige protocol zijn veelzijdig: 1) De juiste vestiging van de intracraniale glioma xenograft, aangezien variaties in tumorlocatie en groeipatronen de chemotaxis kunnen beïnvloeden die NSC's berusten op migratie naar tumor; 2) Behoorlijke voorbereiding van de NSC's en hun gezondheidsstatus en fenotypes die de chemotaxische migratie gedrag beïnvloeden; 3) Voldoende voorbereiding van de neusholte met hyaluronidase, die is aangetoond om de migratie van stamcellen uit de neusholte in de hersenen te verbeteren 17 ; En 4) Correcte rugliggende houding van muizen tijdens de levering van intranasale stamcellen om celverlies buiten de neusgaten te voorkomen, en na de NSC-verzorgingszorg van de dieren. MRI 2 of radiotracer-gebaseerde beeldtechnieken 13 in levende dieren zouden kunnen worden toegepast voor th E realtime beoordeling van in vivo stamcel migratie na intranasale afgifte.
Voor een preklinische studie met behulp van diermodellen zijn er beperkingen om het therapeutische resultaat te voorspellen bij de vertaling naar klinische menselijke patiëntenstudies. Er zijn significante verschillen in de craniale zenuw eindverdeling verspreidingspatronen tussen knaagdieren en mensen 19 , 20 ; Daarom moeten de strategieën om therapeutische stamcellen te verdelen langs de zenuwnetwerken die meer relevant zijn voor de hersenen van de mens via de intranasale route, de nadruk liggen op toekomstig onderzoek. Deze details zijn sleutels voor succesvolle klinische vertaalinspanningen en de hierin beschreven principes zijn essentieel om de basis te vormen voor verdere diversificatie van onderzoeksparameters die zijn ontworpen om moleculaire cues te onderscheiden en de functionele en anatomische verschillen tussen muismodellen en menselijke toepassingsspecificaties.
Ent "> In deze pilot demonstratie van de basisprincipes van het gebruik van muis PDX modellen van menselijk gliom tonen we het potentieel voor gediversifieerde strategieën om het tumor tropisme van hNSCs te verbeteren via hypoxische preconditioning en genetische verbetering in chemotropisme, die CXCR4-receptor expressie bevordert op target tumor- Geassocieerde cytokines. De betekenis van deze uitgebreide beschrijving van de intranasale therapeutische stamcelaflezingstechniek is duidelijk, omdat het de eerste stap voor stap protocol is dat een alternatieve therapeutische stamcelbezorgstrategie voor het centrale zenuwstelsel (CNS) beschrijft zonder invasieve benaderingen Nodig voor CNS-aandoeningen. We streven ernaar om een robuust experimenteel therapeutisch platform in de voorhoede van ontwikkelingsgeneeskunde voor kwaadaardige hersentumoren te brengen, zodat grotere mechanistische details kunnen voortvloeien uit brede onderzoeksonderzoeken in de wetenschappelijke gemeenschap. Toekomstige uitgebreide applicaties voor de behandeling van CNS-stoornissen van brede Complexiteit en mechanistische diversiteit kunnen bE verkend door onderzoekers in de respectieve velden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen belangenconflict om te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
