Summary
Stamceller är lovande terapeutiska bärare för att behandla hjärntumörer på grund av deras inneboende tumör tropism. Icke-invasiv intranasal stamceller levererar ombi blodhjärnbarriären och visar stark potential för klinisk översättning. Denna artikel sammanfattar de grundläggande principerna för intranasal stamcellsleverans i en musmodell av gliom.
Abstract
Den inhemska tropismen mot hjärnans maligniteter gör stamceller som lovande bärare av terapeutiska medel mot maligna tumörer. Leveransen av terapeutiska stamceller via den intranasala vägen är en nyligen upptäckt alternativ strategi med stark potential för klinisk översättning på grund av dess icke-invasiva natur jämfört med intrakranial implantation eller leverans via systemiska vägar. Bristen på blodhjärnbarriär stärker ytterligare den terapeutiska potentialen hos stamceller som genomgår intranasal hjärninfångning. Denna artikel sammanfattar de väsentliga tekniker som används i våra studier och skisserar de grundläggande principerna för intranasal strategi för stamcellsleverans med hjälp av en musmodell av intrakraniella gliomentraler. Vi demonstrerar de optimerade procedurerna som genererar konsekventa och reproducerbara resultat med specifika förutbestämda experimentella parametrar och ger riktlinjer för effektiviserat arbetsflöde som säkerställer effektiv körning och pålitlig experimentNtal utfall. Artikeln är utformad för att fungera som en grundlinje för ytterligare experimentell anpassning baserad på hypotes, stamcellstyper eller tumörspecifika.
Introduction
Låg toxicitet, låg immunogenicitet och inneboende hjärntumör-tropism hos humana stamceller är attraktiva drag för leveransen av terapeutiska vehiklar 1 . Nya stamcellsbaserade läkemedel för maligna hjärntumörer är lovande innovationer utvecklade de senaste åren och den intranasala anpassningen av denna terapeutiska strategi utgör ett steg mot klinisk översättning, eftersom icke-invasiv och upprepad administrering dramatiskt kan minska barriären för patientapplikationer och Kan vara anpassningsbar för outpatienttjänster utan allmänbedövning eller långvarig in-patient service i samband med invasiva kirurgiska ingrepp 1 , 2 , 3 , 4 .
Vi och andra har banat på den intranasala vägen för stamcellsleverans till hjärntumörer och har lagt grundarbetet för några av de grundläggande principernaAv translationell forskning med användning av mus xenograftmodeller 2 , 3 , 4 , samt undersökt migrering av stamceller in vivo via magnetisk resonansbildningsreagens (MRI) reagensbärare 2 . Genom dessa pilotutredningar har vi samlat stor erfarenhet och fått insikt om hur man bäst kan konstruera en robust preklinisk utvärderingsstrategi med hjälp av väletablerade patientbaserade xenograft (PDX) musmodeller av malignt gliom, samtidigt som undersökningsupplösningen upprätthålls för att undersöka Nyanserade mekaniska detaljer av de sofistikerade biologiska fenomenen av den intranasala hjärnanpassningen av terapeutiska stamceller som levereras till näshålan. Här beskriver vi principerna för ett standardiserat operationsprotokoll för att visa det aktuella tillståndet för experimentella undersökningar med användning av en väletablerad human neural stamcellslinje HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförfaranden måste godkännas av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) eller motsvarande. Om det råder någon osäkerhet angående de specifika procedurer som beskrivs häri, fortsätt inte. Förtydligas med institutionens IACUC och en utsedd veterinärmedlem.
1. Säkerställa steriliteten hos odlade celler och följa principerna om aseptiska tekniker
- Följ standard god laboratoriepraxis i alla cellkulturprocedurer och IACUC-krav för celltestning och patogenfri statusbekräftelse före administrering till mus 9 , 10 .
- Följ NIH-kravet för cellgodkännande för att säkerställa reproducerbart resultat 11 .
- Följ etablerade aseptiska metoder för smådiagnostik som beskrivs i detta manuskript 4 .
2. Framställning av gliomceller för <Em> In vivo Experiment 2 , 4
- Kulturgliomceller (GBM43, GBM6 och U87MG) i seruminnehållande (10% fetalt bovint serum i Dulbecco's Modified Eagle's medium [DMEM]) eller serumfritt medium (Neurobasal medium med tillägg B27, N2, heparin, epidermal tillväxtfaktor [ EGF], basisk fibroblasttillväxtfaktor [bFGF], antibiotika och L-glutamin 12 ), i en fuktad CO-cell-odlingsinkubator.
- Testa alla cellinjer via musklart panel kör från kommersiella tjänsteleverantörer.
- Samla vidhäftande celler genom att avlägsna odlingsmedium. Inkubera med 0,05% trypsin i 5 minuter vid rumstemperatur (1 ml trypsin för T25-kolv, 2 ml för T75-kolv, skala därefter för odlingsflaskor med större ytarea) och tvätta sedan celler med Ca 2+ och Mg 2+ fritt fosfat Buffrad saltlösning (PBS).
- Tryck påKolv för att lossna celler och neutralisera omedelbart med ett överskott av serumhaltigt medium (8 - 9 ml). Använd sedan serologiska pipetter för att aspirera cellsuspensionen i centrifugrör.
- Centrifugcelsuspension vid 400 xg under 5 min. Tvätta cellen åtminstone två gånger med 10 ml PBS genom upprepad centrifugering.
- Samla gliomceller odlade som tumörkulor i serumfritt medium via centrifugering (samma hastighet och varaktighet som ovan); Dissociera cellpelleten genom inkubation i 1 - 2 ml celllösningslösning vid 37 ° C under 5 minuter före tvättning två gånger med 10 ml PBS genom centrifugering (400 x 5 x 5 min).
- Återupplösa gliom i steril saltlösning i en koncentration av 50 000 - 200 000 celler per 2,5 μl. Cellnummer som används för injektion i mushinnan beror på den etablerade tillväxttakten för varje gliomcellinje. Använd här 25 000 och 100 000 för respektive GBM43 och GBM6 patient-härledda tumörceller.
- Förbered dubbla mängden av näsanSsarycellnummer för implantation för att beräkna förlusten av en fraktion under proceduren. Överför den injicerbara cellsuspensionen till ett sterilt mikrocentrifugrör och placera röret på is. Håll celler på is under högst 2 timmar under operationen, förbered ny sats om förlängda operationer är planerade.
3. Intrakranial Implantation för att skapa Xenograft Mouse Modeller ( Figur 1A ) 2 , 4 , 13
- Före operationdagen sterilisera alla kirurgiska verktyg i en autoklav och förbereda allt före och efter kirurgiskt djurvårdsmaterial per IACUC-godkänt protokoll. Sterilisera stereotaxisk ram och perifer utrustning för att säkerställa intraoperativa aseptiska förhållanden, vilket minimerar komplikationer.
- Organisera operationsområdet för att minimera rodnad och risk för förorening.
- Klä i lämplig personlig skyddsutrustningMent (PPE) per IACUC-krav.
- Ställ in lämplig postoperativ återvinningskammare. Se till att anestetika och smärtstillande preparat är beredda fräscha med hjälp av oexpanderade reagenser. Ställ in lämpliga instrument för underhåll av kroppsvarmer per IACUC-godkänt protokoll.
- För att fastställa mänskliga patient-härledda gliomcell xenotransplantat för testning av intranasal administrering av humana NSC, använd immunförkortad musart, såsom nu / nu athymisk mus av något kön vid ungefär 6 veckors ålder.
- Bedöda djuret baserat på kroppsvikt med hjälp av de godkända reagenserna, antingen via en intraperitoneal (ip) injektion av en blandning av ketamin (50-100 mg / kg, se institutionell IACUC för godkänt dosintervall) och xylazin (5-10 mg / Kg, konsultera institutionell IACUC för godkänt dosintervall) i 200-250 μL steril saltlösning eller via 4-5% isoflurananestesi med hjälp av en inhalationsanordning.
- Se till att djuret har nått det kirurgiska anestesiplanet bTånen klämmer fast innan huden snittas. Applicera riklig steril oftalmisk gel för att säkerställa det fuktiga tillståndet hos hornhinnorna hos djuret.
- Sterilisera skallen med hjälp av upprepade och alternerande cirkulära servetter av betadin och isopropylalkohol per Pritchett-Corning et al. 14 .
- Leverera pre-incisions analgesi genom injektion av Buprenex (0,05-2 mg / kg) före snittet med användning av kirurgiska bladet.
- Använd steriliserad bomullsspetsapplikator för att hjälpa hemostat medan du utsätter skallen; Använd 3% väteperoxid för att underlätta avlägsnandet av tillfällig blödning.
- Använd en batteridriven, handhållen elektrisk kulspetsborrmaskin (mindre än 1 mm bredd) för att skapa ett borrhål på 2 mm lateral, antingen vänster eller höger, till mittlinjen och 2 mm bakom Bregma (positionskoordinaterna kan skräddarsys baserat På tumörmodellen avsedd för en viss studie).
- Montera djuret i den stereotaxa ramen till lämpligtE huvudposition, så att den infogade Hamilton mikrosprutan är vinkelrät mot kranens yta runt burrhålet. Var försiktig så att djurets bedövningsplan står i gott skick vid tånen. Beakta andningsfrekvensen för att säkerställa att djuret inte är under smärtstress under följande steg.
* Vi understryker inte in-ear-placeringar eftersom:- Vi har förborrat burrhålet för att placera nålen, och därför är exakta kraninkoordinater inte nödvändiga.
- Mus öra kanaler är bräckliga, och den exakta in-ear placering av örat barer kräver mer involverad träning som inte är relevant för vårt syfte. Riskerna för skador på murina öronkanaler överväger fördelarna med en exakt placering;
- Cheek support är mycket lättare att utföra och kan uppnå samma nivåer av mushuvudsstabilitet och balans vid positionering. Det är en extra fördel för flera tidskänsliga operationer för att säkerställaAktuell slutförande med god cell livskraft.
- Använd de stereotaxiska ramknapparna för att placera den platta mikrosprayen i borrhålet och sänk sedan långsamt till 3 mm under duraytan. Dra tillbaka 0,5 mm för att hålla nålens spets vid 2,5 mm under dura.
- Injicera 2,5 jil av förspända gliomceller under perioden 1 min. Låt nålen bibehålla sin position i ytterligare 1-2 minuter före långsamt, under loppet av 1 minut, dra ut nålen ur hjärnan och ta hand om att minimera cellflödet. Applicera sterilt benvax för att undvika extrakraniell tumörutväxt.
- Stäng såret med rostfritt stål sårklämmor (7 mm). Leverera en subkutan (sc) injektion av 1 ml steril, laktat Ringer-lösning (förvärmd till 37 ° C) och placera djuret i en återvinningskammare som ligger halvvägs på en värmepanna.
- Återvänd djuren till det ventilerade stället när de återvinner rörligheten och följ rutinmässig eftervård för att säkerställa smootH återhämtning.
4. In vivo Bioluminescence Imaging (BLI) av tumörtillväxt ( Figur 1B ) 15
OBS: De patient-härledda gliomcellerna modifieras för att uttrycka firefly-luciferas. Detta gör det möjligt för oss att följa tumörprogression efter intrakranial implantation.
- Ge djur en ip-injektion av D-luciferin, kaliumsaltet (150 mg / kg) 10 min före bildsessionen.
- Placera omedelbart djur i en oxygenerad isofluran induktionskammare som godkänts av IACUC.
- Placera djur inuti den uppvärmda (37 ° C) bildkammaren för att fånga BLI-signalen med hjälp av programinställningar (för detaljer, se tillverkarens anvisning).
5. Hela hjärnbestrålningen ( Figur 1C ) 2 , 4 , 13
4 .
- Använd en ip-injektion av en ketamin och xylazinblandning (50-100 mg / kg respektive 5-10 mg / kg, se institutionell IACUC för godkänt dosintervall) med subkirurgisk anestesiplan för att måttligt framkalla anestesi för möss.
- Använd ett provfack för att placera mössen inuti kammaren mellan blyskyddsblock, vilket möjliggör exponering för strålningsbanan endast för huvudet ( Figur 2 ).
- Ge möss med positiv BLI-bekräftelse på tumörtillväxt (normalt vid dag 7-8 efter gliomcellerimplantation) en daglig dos av 2 Gy bestrålning under 5 på varandra följande dagar. Utför BLI-bedömning av tumör efter den sista bestrålningsdosen.
6. Genetisk modifiering av humana neurala stamceller (NSCs; FigurE 3A) 4
- Bibehålla humana NSC (klon HB1.F3.CD) 6 , 7 i DMEM-medium med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin i en fuktad 37 ° C inkubator under 95% rumsluft och 5% CO2 ( N NSC).
- Utför genetisk överuttryck av kemotaxiska receptorer, såsom CXC-motivkemokinreceptorn 4 (CXCR4), i hNSCs genom transduktion med lentiviruskodning för human CXCR4.
- När NSC är nära 75-80% konfluens, sätt CXCR4 lentivirus till odlingsmediet tillsammans med polybren (8 μg / ml) och inkubera i 8 h eller över natten.
- Byt virusinnehållande medium med färskt medium innehållande blasticidin vid 4 μg / ml för positivt urval av transducerade celler.
- Validera nivån av CXCR4-uttryck i modifierade hNSCs ( CXCR4 NSC) via flödescytometri med användning av anti-CXCR4-antikropp och matchande isotypantikropp och viEn kvantitativ RT-PCR med användning av ett par primrar som amplifierar CXCR4 och glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) cDNA 4 .
- Generera vektorkontroll NSC ( VC NSC) med samma strategi, med RFP som ersätter CXCR4-genen och verifiera via mikroskopi eller flödescytometri på grund av närvaron av RFP-fluorescens.
7. Hypoxisk förkonditionering av humana NSC ( Figur 3A ) 4
- Plattodlade NSC i T75-odlingsflaskor såsom beskrivits ovan tills 90% konfluens uppnås.
- Placera cellodlingskolvarna inuti en fuktad CO 2 -kammare / inkubator med bibehållna 1% O 2 nivåer under 24 h, via N 2 gasförsörjning styrd av en automatiserad inbyggd flödesmätare. Dessa celler kallas H NSCs. Kontroll N NSC beskrivs i steg 7.1.
8. Lastning av HuMan NSC med onkolytiskt virus ( Figur 3B -3H ) 5
- 8.1.Infect N NSC, H NSC, VC NSC och CXCR4 NSC med 50 villkorliga replikativa adenovirus (CRAd) -S-pk7 viruspartiklar / celler 4 , 16 .
- 8.2. Efter 2 timmars inkubation vid rumstemperatur med periodisk tappning, tvätta celler tre gånger med media för att avlägsna obundna viruspartiklar och suspendera celler i steril saltlösning för injektion.
VARNING: Utför alla virusrelaterade in vitro -cellodlingsprocedurer i anläggningar med lämplig biosäkerhetsnivåbeteckning, såsom BSL2. Lämplig personlig skyddsutrustning ska bäras av forskare som hanterar det onkolytiska viruset enligt riktlinjerna 4 , 16 för institutionella djuranläggningar.
9. Laddar stamceller med mikroParamagnetiska järnoxider av n-storlek (MPIO) för spårning in vivo via magnetisk resonansbildning (MRI; Figur 3B -3H ) 2
- För att märka stamceller, tillsätt MPIO till stamceller vid ~ 80% konfluens, i närvaro av transfektionsreagens för inkubation över natten. Effektiviteten av stamcellsmärkning (NSCs 4 eller MSCs 2 ) med MPIO (flash-rött konjugerad) bestäms av flödescytometri.
- För att visualisera stamceller migration och distribution i hjärnorna hos gliombärande djur, förvärva både multi-skiva högt upplösning T2-vägd Snabbförvärv med Snabbförvärv för spin-eko-bilder och Multi-Slice T1-viktiga snabba lågvinkelskott (FLASH) -gradient-ekosekvenser till Utvärdera strukturen via både hjärnans 2 koronala och axiella plan.
10. Intranasal leverans av terapeutiska NSC ( Figur 3D ) 2 , 4
- Kultur och samla NSC ( N NSC, H NSC, VC NSC och CXCR4 NSC) enligt protokollet som beskrivs i avsnitt 3.
VARNING: Alla djurprocedurer som involverar OV-laddade NSC måste genomföras i anläggningar med lämplig biosäkerhetsnivåbeteckning, såsom BL2 eller BSL2-anläggningar. - Bedöva möss via ip-injektion av en ketamin och xylazinblandning enligt steg 3.6.
- Placera möss på en ren drapering uppåt med en värmepanna under för att upprätthålla kroppstemperaturen. Justera en vadderad kudde gjord av valsade pappershanddukar med tejp för att säkerställa upprätt vinkel på näsborrarna när de placeras under muspekaren.
OBS: Förbehandling av hyaluronidas (totalt 100 U som fyra upprepade inokuleringar med 5 min intervaller, 3 μl i varje näsborre) i näsanPithelium beskrevs tidigare 2 , 17 . - Använd en mikropipett, fördela 2 μL NSC-suspension till varje näsborre i musen. Visuellt bekräfta droppens aspiration innan du flyttar till nästa mus. Det totala antalet levererade celler kan bestämmas av användaren; Använd 62,500-125 000 celler / μl, så att 0,5-1 miljoner celler kan levereras i 4 x 2 | il doser.
- Använd en timer för att säkerställa 5 minuters mellanrum mellan varje celluppslagsadministration, upp till 4 gånger.
- Låt djur återfå rörlighet i en återhämtningskammare, med den bakre positionen bibehållen hela tiden.
11. Överlevnadsanalys ( Figur 3E )
- Ange djurens överlevnadsdata i statistisk programvara och utför statistiska jämförelser med hjälp av log-rank-testet med följande signifikansbeteckningar: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.
12. Vävnadsamling och histologi / Immunocytokemi Verifikation av intranasal stamcellsinmatning 2 , 4
- Vid slutet av studien avlivar möss via de IACUC-godkända protokollen. En standardpraxis använder en flödesstyrd CO 2 -kammare för att offra djuren som den primära eutanasistrategin följt av exsanguination genom perfusionsfixering.
- Omedelbart efter att ha offrat, utför en intrakardiell perfusion med PBS på djuret för att säkerställa eliminering av blodrester från blodkärl och bevarande av vävnader för efterföljande histologisk analys.
- Placera det CO 2 -utaniserade djuret ovanpå en absorberande dynan i den bakre positionen, fortsätt med en laparotomi för att exponera membranmuskeln, som dissekeras tillsammans med ribbburet, för att exponera hjärtat.
- Efter maKunga ett nick på höger atrium med hjälp av ett par dissektionssaxar, accelerera exsanguinationen med en 3-5 ml PBS-injektion via vänster ventrikel vid toppunktet. Injicera iskall 4% paraformaldehyd (PFA) i cirkulation med användning av en spruta; Perifera muskelspasmer ger visuell bekräftelse att det inte finns någon större blockering i cirkulationen som skulle förhindra korrekt vävnadsfixering.
- Ta bort huvudet på slaktkroppen kirurgiskt och bevara i ett 50 ml centrifugrör i 4% PFA vid 4 ° C över natten. Ändra lösningen till 30% sackaros följande dag före hjärnvävnadsdissektion ytterligare 24 h senare.
- Bädda in hjärnvävnaden i OCT-förening och bli fryst på isopentan på torris. Utför kryosektion av det resulterande vävnadsblocket för att generera 10-20 μm vävnadssnitt för histologi och immunocytokemiapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både hypoxisk förbehandling ( Figur 4A ) 4 och CXCR4-överuttryck (Figurerna 4B och 4C ) 4 uppskattar signifikant cellemembran närvaron av CXCR4-receptorer som demonstreras genom flödescytometri. Tumör tropismen demonstrerad av NSC (blå pilar), visas i tumörvävnadshistologi (röd cirkel). Närvaron av MPIO-märkta ( Figur 4D ) stamceller i tumören bekräftas via preussisk blå färgning ( Figur 4E ). 4
En vävnadsanalys indikerar att strålningsbestrålning ( Figur 2 ) inducerar reduktion i tumörvolymen, liksom uppreglering av SDF-1 i tumör och omgivande vävnad (figurerna 5A och 5B )4, vilket bekräftar hypotesen att CXCR4 receptor uppreglerat uttryck i NSC kan underlätta tumör tropism efter XRT.
Survivalanalys indikerar att även om bestrålning (XRT) ensamt är fördelaktig för överlevnad av tumörbärande djur ( Figur 6A ) 4 , kan ytterligare fördelar uppnås med användning av H NSCs laddade med OV över N NSC-laddade med OV i samband med XRT ( Figur 6B ) 4 . Betydande överlevnadsfördelar kan också ses med genetiskt konstruerade CXCR4 NSC i samma kontextuella terapeutiska regim ( Figur 6C ) 4 .
Vävnadsanalys bekräftar att både H NSC och CXCR4 NSC förbättrar signifikant den tumörinriktade leveransen av OV, vilket visas av staIning för ett viralt hexonprotein (figurerna 7A och 7B ) 4 .
Figur 1: Schematisk flödesdiagram av de allmänna djurprocedurerna involverade. ( A ) Tumörmodeller skapas via xenograft av patient-härledda gliomceller. ( B ) Tumörtillväxt övervakas via BLI. ( C ) Endast strålningsbehandlingsbehandling tillhandahålls som beskrivet i procedur 6. ( D ) Supine- och huvud-tiltställningen upprätthålls under den terapeutiska intranasala stamcellsavlämningen, såsom detaljerad i procedur 11. ( E ) Övervakning av överlevnad övervakning av överlevnad, litet djur Bildbehandling och histologisk analys av vävnad om nödvändigt följs upp. Vänligen klicka här för att visaEn större version av denna figur.
Figur 2: Uppställning av djur för bestrålning. Narkoserade möss är placerade mellan blyskärmar inuti provfacket vilket möjliggör strålningsbestrålning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: En flödesschema för generella stamcellsberedningsprocedurer involverade före intranasal leverans. ( AC ) Hypoxisk förbehandling eller genetiska modifieringar av stamceller för att överuttrycka CXCR4. ( BD ) Tvättning, enzymatisk dissociation, cellinsamling och räkningssteg är perFormad för efterföljande laddning av stamceller med terapeutisk eller diagnostisk last. ( E ) Terapeutiska reagenser, såsom onkolytiska virus eller diagnostiska spårämnen, såsom MPIO-partiklar, kan laddas i uppsamlade stamceller i lämpliga koncentrationer med periodisk skakning och mild omrörning ( F ). ( GI ) De laddade stamcellerna kan sedan tvättas och räknas för intranasal leverans till möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av stamcellsmodifikationer för CXCR4 Expression och MPIO Loading. ( AC ) Flödescytometri kan köras för att verifiera fenotypiska modifikationer av stamceller som ett resultat av hypoxisk förbehandling eller genetiskteknik. (Detaljer kan hittas i Dey et al. 4 ) ( DE ) Detekteringen av framgångsrik MPIO-laddning av stamceller och in vivo- utfall kan uppnås genom flödescytometri respektive prussianblåfärgning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Den hypotes som bestrålning underlättar SDF-1 (gröna signaler) Uppreglering i gliom och omgivande vävnad bekräftas Via histopatologi och immuncytokemi av vävnadssektioner. Bestrålning ökar SDF-1-uttryck i GBM43 xenograft. Analysen av H & E-färgning och immuncytokemi av hjärnvävnadssektioner från kontroll och bestrålad möss visarAtes reducerade tumörbördan men ökade SDF-1-nivåer vid tumörställena efter XRT-behandling. ( A ) SDF-1-uttryck (grönt) lokaliseras starkt på tumörstället (vita lådor) efter XRT. ( B ) Densitometriskvantifiering av betraktningsfälten visar en fyrfaldig ökning av SDF-1-uttryck i XRT-behandlade djur jämfört med kontrolldjur (n = 3 experiment, *** p <0,001, studentens t-test). Detaljer finns i Dey et al. 4 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Överlevnadsfördelar med modifierade NSC: er observerades (Detaljer kan hittas i Dey et al. 4 ). ( A ) Kontexten av terapeutiska fördelar med XRT fastställdes (*** p <0,001, logrundtest). ( B ) Hypoxisk förbehandling av stamceller laddade med OV ökar djuröverlevnad (* p <0,05). C. CXCR4 genetisk förbättring förbättrar ytterligare överlevnad av djur (** p = 0,0013). Detaljer finns i Dey et al. 4 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bekräftelse av OV-leverans av Hypoxia- eller CXCR4-förstärkta NCS till Brain Tumor Xenografts uppnås via Viral Hexon Protein Detection genom Immunocytochemistry (Green Dots) av vävnadssektioner från hjärnor av möss behandlade med antingen H A ) eller CXCR4 NSCs ( B ), *** p <0,001 t test. Detaljer finns i Dey et al. 4 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om den intranasala vägen för läkemedelsleverans har undersökts allmänt för små molekyler, nanomedicin och proteinföreningar lika 18 , är tillämpningen av terapeutiska stamceller för intranasal hjärntumörinriktning väldigt ny i spektret av hjärntumörterapeutik under utveckling 2 , 3 , 4 . Det finns inneboende komplexiteter involverade beträffande beteenden av stamceller i näshålan, och molekylära detaljer kvarstår fortfarande oklara. Stamcellernas storlek och deras fördelningsmekanismer längs kraniala nerver skiljer sig dramatiskt från icke-cellbiologiska eller småmolekylers, och vi är för närvarande involverade i detaljerade mekaniska undersökningar som involverar beteenden hos terapeutiska stamceller i nasepiteln. Molekylära interaktioner som involverar stamcellsyt-cytokinreceptoruttrycksprofiler, såväl som extracellulär matris(ECM) vidhäftningsmolekyler, såsom integrin, undersöks för att belysa grunden för intranasala hjärninträdet i stamceller. De kritiska stegen inom det aktuella protokollet är multifold: 1) Korrekt etablering av intrakranial gliomenograft, som variationer i tumörplats och tillväxtmönster kan påverka kemotaxen som NSCs är beroende av för migrering mot tumör; 2) Korrekt beredning av NSC och deras hälsotillstånd och fenotyper som påverkar det kemotaxiska migrerande beteendet. 3) Tillräcklig beredning av näshålan med hyaluronidas, vilket har visat sig förbättra migrationen av stamceller från näshålan till hjärnan 17 ; Och 4) Korrekt bakre hållning hos möss under intranasal stamcellsavgivning för att förhindra cellförlust utanför näsborrarna och efter NSC-skötselvård av djuren. MRI 2 eller radiotracerbaserade bildteknik 13 i levande djur kan appliceras för th E realtidsbedömning av in vivo stamceller migration efter intranasal leverans.
För en preklinisk studie med användning av djurmodeller finns det begränsningar för att förutsäga det terapeutiska resultatet i översättningen till kliniska humana patientstudier. Det finns signifikanta skillnader i kranialnervändningsfördelningsmönstren mellan gnagare och människor 19 , 20 ; Därför bör strategier för att styra terapeutiska stamceller att distribuera längs nervändningsnät som är mer relevanta för mänsklig hjärninfarkt genom den intranasala vägen vara fokus för framtida forskning. Dessa detaljer är nycklar till framgångsrik klinisk översättningsinsats och principerna som beskrivs här är väsentliga för att skapa grunden för ytterligare diversifiering av forskningsparametrar utformade för att särskilja molekylära signaler och de funktionella och anatomiska skillnaderna mellan musmodeller och humana applikationsspecifika.
Ent "> I denna pilot demonstration av de grundläggande principerna för användning av mus PDX-modeller av humant gliom visar vi potentialen för diversifierade strategier för att förbättra tumör tropism av hNSCs via hypoxisk förkonditionering och genetisk förbättring vid kemotropism som främjar CXCR4-receptoruttryck till måltumör- Associerade cytokiner. Betydelsen av denna omfattande beskrivning av intranasal terapeutisk stamcellsleverans teknik är uppenbar, eftersom det är det första steg för steg protokollet som beskriver en alternativ terapeutisk stamcellsleveransstrategi till centrala nervsystemet (CNS) utan invasiva metoder Krävs för CNS-störningar. Vi strävar efter att ge en robust experimentell terapeutisk plattform till framkant av utvecklingsmedicin för maligna hjärntumörer, så att större mekanistiska detaljer kan uppstå vid breda forskningsundersökningar i det vetenskapliga samfundet. Framtida utvidgade tillämpningar för behandling av CNS-störningar i bred Komplexitet och mekanisk mångfald kan bE utforskas av forskare inom respektive område.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har ingen intressekonflikt att förklara.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
