Summary
Denne studien presenterer en teknikk for isolering av nevroner fra WT-neonatale mus. Det krever forsiktig disseksjon av ryggmargen fra nyfødtmusen, etterfulgt av separasjon av nevroner fra ryggmargsvevet gjennom mekanisk og enzymatisk spaltning.
Abstract
Vi presenterer en protokoll for isolasjon og kultur av ryggmargenneuroner. Nevronene er oppnådd fra neonatal C57BL / 6-mus og er isolert på postnatal dag 1-3. Et musekull, vanligvis 4-10 pupper født fra ett avlspar, samles for ett forsøk, og spinalkabler samles individuelt fra hver mus etter eutanasi med isofluran. Ryggsøylen blir dissekert og deretter frigjøres ryggmargen fra kolonnen. Spinalkablene blir deretter hakket for å øke leveringsflaten for en enzymatisk protease som tillater at nevronene og andre celler frigjøres fra vevet. Triturering brukes da til å frigjøre cellene i oppløsning. Denne oppløsningen fraksjoneres deretter i en tetthetgradient for å separere de forskjellige cellene i oppløsning, slik at nevroner kan isoleres. Omtrent 1-2,5 x 10 6 nevroner kan isoleres fra en kullgruppe. Nevronene blir så seedet på brønner belagt med klebende factoR som tillater riktig vekst og modning. Nevronene tar omtrent 7 dager for å oppnå modenhet i vekst- og kulturmediet og kan deretter brukes til behandling og analyse.
Introduction
Forståelse av ryggmargspatologi krever bruk av ulike modeller, både på makroskopiske og mikroskopiske nivåer. Store og små dyremodeller 1 , 2 , 3 brukes til in vivo undersøkelser av ryggmargs sykdom og skade. Mens studiene av disse problemene in vivo har sine fordeler, er ryggradsanalyse begrenset til hele ryggmargenhomogenatet eller til vevseksjoner 4 . Dette skaper noe tvetydighet når man prøver å isolere spesifikke svar og mål i ryggmargen blant sine hjemmehørende neuroner og omkringliggende glia. Den økende tilgjengeligheten av genetisk manipulerte mus muliggjør mer detaljerte undersøkelser av biologien ved cellulære og molekylære nivåer. Dermed brukes en neonatal musemodell her, noe som gjør det mulig å studere de unike egenskapene og biologien til ryggmargenerne in vitro .
Ent "> Isolering og vedlikehold av nevroner in vitro er ikke spesielt grei. Det er en relativ overflod av teknikker for nevronisolasjon fra det kortikale vev hos voksne gnagere som synes å resultere i et betydelig antall isolerte nevroner ( dvs. millioner) 5 , 6 , 7. I motsetning til dette er utbyttet av nevroner fra ryggmargsvev lavere 8 , 9 , 10 , delvis på grunn av den mindre massen av vev. Videre er det hos mus en relativ sparsomhet av teknikker for isolering av neonatal Ryggmargsneuroner, og eksisterende metoder er begrenset av lavere neuronutbytter ( dvs. hundrevis) 9 eller arbeidsomme og ressurskrevende teknikker som krever isolering av embryonale mus 10 .I denne protokollen, viBruk en teknikk som muliggjør kostnadseffektiv og isolerende isolasjon av et betydelig antall nevroner fra ryggraden til neonatalmus. Som det er vanlig i tidligere publiserte teknikker, bruker vi papain som en enzymatisk protease, som tillater frigivelse av nevroner fra ryggmargsvev 5 , 6 . I tillegg bruker vi en tetthetgradient for raffinert celleseparasjon, som tidligere har vist seg å være effektiv 6 , 10 . Selv om mediet hvor cellene er inkubert, kan det variere, i vår erfaring og som tidligere publisert 11 , at tilskudd med fersk B27-dyrkningsmedium supplement har vist seg å være kritisk for nevronlevetiden. Nevronene er vanligvis levedyktige i opptil 10 dager, slik at behandling kan utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleie og behandling av dyr i denne prosedyren ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutt for dyrepleie og bruk ved University of Colorado.
1. Forberedelse av løsninger
- Forbered og oppbevar alle løsninger ved passende temperaturer, som vist i tabell 1 .
2. Coating brønner og lysbilder
MERK: Neuroner holder seg ikke godt til plast- eller glassflater.
- En dag før isolering av nevronene, belegge brønnene i en steril 24-brønn kulturplate med 0,5 ml Poly-D-Lysin (PDL; Tabell 2 ) og la den ligge i en laminær strømnings hette O / N.
MERK: Den foretrukne metoden er å bruke brønner med 24 brønner og å belegge bare sentrumsbrønnene, da fordampning fra de perifere brønnene har en tendens til å bli akselerert og føre til inkonsekvente resultater. I tillegg kan glassglass plasseres inne i brønnene før tO belegg. Nevronene vil feste seg på de belagte glassglassene og kan fjernes senere for videre mikroskopisk avbildning . - På isolasjonsdagen, fjern PDL fra brønnene. Vask med sterilt vann i noen minutter før du fjerner gjenværende vann og la det tørke i 1 time (se nedenfor).
- Etter tørking, beleg glidene med laminin ( tabell 2 ).
MERK: Omtrent 10 μl laminin (10 μg / μL) er nok til å belegge hver brønn i en steril plate med 24 brønner. Dette blandes med 340 μl medium (totalt volum: 350 μL) for å dekke hele brønnen. La dette sitte i 2 timer ved RT i en kultur hette og deretter aspirere før du belegger cellene.
3. Høsting av spinalkabler
MERK: Alle instrumenter skal autoklaveres (135 ° C og 30 psi i 4 x 7 min sykluser) for sterilitet.
- Euthanize 1-3 dag gamle C57BL / 6 musepupper i et kammer med isofluran. Vente30 s etter opphør av bevegelse og klem på beinet for å bekrefte mangel på respons.
- Separat hodet fra kroppen ved hjelp av saks, med pup i utsatt stilling.
- Stabilisér bakbenene eller halen og armene på prosedyrebordet, med dorsalsiden vendt mot brukeren.
- Klipp huden av med buet iris saks.
- Skjær ryggmargen fra lumbaleområdet rett over hofter og fortsett å kutte begge sider av thoraxen for å skille den fra kroppen.
MERK: Dette krever omhyggelig disseksjon av ryggmargen fra viskoser for å unngå utilsiktet skade på andre organer ( figur 1a ). - Vask sekvensielt i 10 s i 3 x 10 cm petriskål inneholdende 5 ml 0,2 μm filtersterilisert fosfatbuffert saltvann (PBS) for å fjerne overflødig vev.
- Sett inn en 22 G nål og en sprøyte fylt med 5 ml filtersterilisert PBS i den kaudale enden av ryggraden og flush kranen, slik at ledningen tO utgang til en fjerde petriskål ( figur 1b ).
- Samle ryggmargen i et 15 ml rør med 5 ml HABG ( tabell 1 ) på is. Pass på å unngå å knuse ryggraden.
- Gjenta trinn 3.1-3.8 for hver valp i søppelet.
MERK: Ideelt sett bør denne prosessen ta mindre enn 30 minutter per ryggmargen for å sikre en sunn neuronisolasjon.
4. Isolerende Neuroner
MERK: Følgende trinn skal utføres i en laminar-hettehette. Kjennskap til grunnleggende steril teknikk forventes.
- Tissue Mincing
- Ta røret som inneholder ryggraden og rist lett for å suspendere vevet.
- Hell væv fra røret inn i en 60 mm glass petriskål og terninger med et knivblad for å lage fine stykker ~ 0,5 mm i størrelse.
- Overfør vevet med en brøndpipett i et 15 ml rør som inneholder 5 ml HABG.
- Plasser den i a30 ° C vannbad i 30 minutter for å tillate at cellene balanserer ved denne temperaturen. Hold cellene på en rist akkurat slik at de kan bli suspendert i væsken.
MERK: Dette trinnet er gjort for å unngå å sjokkere cellene ved overføring fra is til fordøyelsesmediet. Ved å holde cellene ved 30 ° C bidrar det til å redusere celledød forbundet med ellers økt metabolisme ved 37 ° C.
- Forbered fordøyelsesmediet ( tabell 1 ).
- Forbered tetthetgradienten (Tabell 1).
- Klargjør hver av de 4 lagene i 4 separate 15 ml rør, som angitt i tabell 1 .
- Tilsett 1 ml fra hvert lag til et nytt 15 ml rør. Begynn med lag 1 nederst og sett i rekkefølge til du når lag 4 øverst. Unngå å forstyrre lagene mens du legger til.
- Vask de PDL-belagte plater fra trinn 2.2. Vask med sterilt vann i noen minutter før du fjerner gjenværende vann ogSlik at de kan tørke i 1 time.
- Overfør vevet til fordøyelsesmediet.
- Fjern det vevsbestemte røret fra rystervannbadet ved 30 ° C og la det stå opp i noen minutter.
- Fjern fordøyelsesmediumrøret fra 37 ° C vannbadet og aspirer det i en leurlåsesprøyte.
- Aspirer av det overskytende HABG fra det vevholdige røret.
- Bruk et leur-lock 0,2 μm filter på sprøyten for å legge til fordøyelsesmedium til det vevsholdige røret.
- Plasser røret i et 30 ° C vannbad i 30 minutter. Hold cellene rystende akkurat nok slik at de kan suspenderes i væsken.
MERK: Det er viktig å ikke holde cellene i fordøyelsesmediet for lenge, eller la temperaturen bli for høyt, noe som kan føre til overdreven fordøyelse og føre til at vevet blir suspendert i en gelatinøs blanding.
- I løpet av denne perioden, beleg laminin som i trinn 2.3. <Li> Utfør triturering ( dvs. separering av cellene fra vevet).
- Fjern røret fra det rystende 30 ° C vannbadet og la det stå opp i noen minutter.
- Aspirere overflødig fordøyelsesmedium.
- Stopp vevet i 2 ml HABG.
- Bruk en smalboringspipett, triturat 10x i 45 s.
MERK: Dette er sannsynligvis det eneste mest avgjørende trinnet, og kan redusere avkastningen vesentlig dersom det ikke gjøres riktig.- Aspirer vevet inn i pipetten og tøm innholdet umiddelbart igjen.
- Unngå å innføre luft, da det vil redusere levedyktig avkastning betydelig.
MERK: Den ideelle pipetten er en 9-tommers glasspipette. Spissen av pipetten bør være brannpolert for å glatte ut tøffe overflater. Den skal deretter silisiseres ved plassering i en 1:20 løsning av diklormetylsilan (DMDCS) i kloroform og venstre O / N. Pipetten bør da fjernes og tillates å lufttørke. Deretter sSkal autoklaveres for sterilisering.
Forsiktig: DMDCS og kloroform er svært brannfarlig, og silikonisering bør utføres i en avtrekksdeksel.
- Aspirer toppen 2 ml supernatant og legg den inn i et nytt 15 ml rør merket "samling".
- Gjenta trinn 4.7.3-4.7.5 to ytterligere ganger (celleoppsamlingsrøret bør ha 6 ml ved enden).
- Langsomt overføre oppsamlingsrørinnholdet til gradientrøret fremstilt i trinn 4.2, unngår forstyrrelsen av gradienten.
- På dette tidspunkt fjerner du det tidligere preparerte neurobasale mediet ( Tabell 1 ) fra kjøleskapet og la det varme opp i et 37 ° C bad.
- Rens neuronene.
- Sentrifuger gradientrøret i 15 minutter ved 800 xg og 22 ° C.
- Saml det ønskede laget (e) med en pipette ( Figur 2 ) og sett inn et nytt 15 ml rør. For neuro med høyeste renhetN isolasjon ( dvs. > 90%), samle lag 3. For mer utbytte med mindre renhet ( dvs. > 70-80%), samle lag 2 og 3.
- Fortynn tetthetgradienten ved å tilsette 5 ml HABG til de nyoppsamlede lagene.
- Sentrifuger ved 200 xg i 2 minutter ved 22 ° C.
- Kast supernatanten, resuspender i 5 ml HABG, og pell pelletet for å suspendere cellene.
- Sentrifuger i 2 minutter 200 xg ved 22 ° C.
- Kast supernatanten, resuspender i 3 ml neurobasalt medium, og pell pelletet for å resuspendere cellene.
- Telle cellene.
- Ta 10 μL av løsningen, nå med celler i neurobasalt medium, og bland med 10 μL Trypanblå.
- Plasser 10 μl av denne blandingen i et glass tellerrom.
- Bruk et standard glass tellerrom, teller antall celler i hver av de fire 4 x 4 kvadranter. Legg til alle cellene som er talt (n), multiLag med 2 (fortynningsfaktor), divider med 4 (antall kvadranter telt), multipliser med 3 (volum av neurobasalt medium) og multipliser med 10 4 for å oppnå konsentrasjonen av celler i celler / ml.
- Sæd cellene på kulturplater
- Fortynn cellesuspensjonen til 300.000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
MERK: Basert på konsentrasjonen av celler oppnådd i trinnene ovenfor, tilsettes ytterligere neurobasalt medium for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 3 * 105 celler / ml. Ligningen er C1V1 = C2V2, hvor C1 er den opprinnelige konsentrasjonen av celler oppnådd fra høsten; Vl er 3 ml; Og C2 er 3 * 105 celler / ml, som diskutert ovenfor. Ligningen er løst for V 2 . Legg til volumet av neurobasalt medium som er nødvendig for å gjøre det totale volumet av celler i oppløsning likV 2 . - Rist forsiktig for å distribuere cellene i oppløsning og tilsett 1 ml til hver brønn i de belagte 24-brønnplatene.
- Fortynn cellesuspensjonen til 300.000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne teknikken muliggjør et enkelt kull (4-10 pupper) isolering av 1-2,5 10 6 nevroner egnet for såing på kulturplater. Vanligvis blir 4-8 brønner sådd ved konsentrasjonen nevnt ovenfor ( dvs. 300.000 celler / ml). Figur 3 demonstrerer utseendet av nevroner ved denne konsentrasjonen etter en uke i kultur ved lav- ( a ) og høy- ( b ) forstørrelseslysmikroskopi. Vi har imidlertid også vært i stand til å dyrke celler ved konsentrasjoner så høyt som 500.000 celler / brønn og så lavt som 100.000 celler / brønn. Bruk av høyere konsentrasjoner krever mer medium og forsiktig oppmerksomhet på miljøforhold, da næringsstoffer kan tømmes raskt, noe som fører til et giftig surt miljø for cellene. Med lavere konsentrasjoner har cellene en tendens til ikke å oppnå full modenhet, og en overvekst av støttende celler ( dvs. oligodendrocyter, miCroglia og astrocytter) observeres.
Cellene vil vanligvis begynne å kle seg til overflaten innen de første par timer ( figur 4a ). Axons vil begynne å spire innen de første 24-48 timer ( Figur 4b -4c ). Forbindelser mellom ulike neuroner i kultur når vanligvis modenhet på 7 dager ( Figur 4d ), på hvilket tidspunkt eksperimenter utføres typisk på nevronene.
Neuroner er identifiserbare under lysmikroskopi, da de har tydelige aksonale fremspring. Våre isolasjoner ved hjelp av lag 3 ( figur 2 ) gir ~ 80-90% nevroner i kultur. Dette ble bekreftet ved bruk av immunofluorescerende farging av nevonspesifikke markører. I figur 5c er nevron-cytoskeletalproteinet Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) sVist, viser konturer og axonale projeksjoner av nevronene etter en uke i kultur. På samme måte, i figur 6c , er den neuron-spesifikke nukleare markøren NeuN farget, og viser neuronale kjerner. Disse neuronmarkørene er kombinert med kjerne (DAPI, Figur 5a , 6a ) og cytoplasma (GFP, Figur 5b , 6b ), og de resulterende bildene slås sammen ( Figur 5d , 6d ), og angir relativ overflod av nevroner til andre celler i kultur. Ved bruk av lag 2 og 3 er utbyttet av nevroner litt høyere; Imidlertid pleier det å være færre nevroner i den rene løsningen (~ 70%).
Figur 1: Spinalkolonne Dissected and Spinal Cord Utgitt fra en 3-dagers neonatalmus. DePilen i ( a ) peker mot den bakre delen av ryggraden, der en nål settes inn for å løsne ryggraden. En frigjort ryggrad ( b ) er vist nedsenket i PBS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tetthetgradient, med celler tilsatt etter sentrifugering. Lagene er skissert og bedre visualisert på tegneserieutsnittet. Det mest overfladiske laget (0) er generelt rusk fra ryggmargsvevet. Lag 1 er rik på oligodendrocytter og astrocytter. Lag 2 og 3 inneholder de fleste nevroner. Mens lag 3 inneholder nevroner med høyeste renhet, finnes noen støttende celler ( dvs. astrocytter og oligodendrocytter) i lag 2. PeLlet nederst inneholder hovedsakelig mikroglialceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lysmikroskopi av neuronale cellekulturer etter 7 dager isolasjon. Ved 10x forstørrelse ( a ) kan axonale forbindelser mellom ulike konglomerater av nevroner ses. Ved 40x forstørrelse ( b ) kan nevronene visualiseres nærmere med deres aksonale fremspring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Immunfluorescerende flekk av neuroner ved bruk av neuronal cytoskeletal markør MAP2. Kjernefarging (DAPI) er vist i blå ( a ), med cytoplasmisk farging (GFP) i grønt ( b ) og neuron-cytoskeletalt protein (MAP2) i rødt ( c ). De sammenslåtte bildene ( d ) er kombinert, og viser den relative overflod av nevroner.Target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Immunfluorescerende flekk av neuroner ved bruk av Neuronal Nuclear Marker NeuN. Kjernefarging (DAPI) er vist i blå ( a ), med cytoplasmisk farging (GFP) i grønt ( b ) og nevronkjerner (NeuN) i rødt ( c ). De sammenslåtte bildene ( d ) er kombinert, og viser den relative overflod av nevroner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Media | Oppbevaring | ingredienser | Forberedelse | ||
| HABG | 4 ° C / 24 timer | 100 ml | - Tin B27 i 4 ° C kjøleskap O / N - Filter steriliser (0,22 μm) | ||
| Hibernate A | 97,8 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Neurobasal Media | 4 ° C / 1 uke | 100 ml | - Tin B27 i 4 ° C kjøleskap O / N - Filter steriliser (0,22 μm) - Aliquot 50 ml porsjoner i 50 ml rør (oppbevares ved 4 ° C) | ||
| Neurobasal A | 97 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 ml | ||||
| Digestion Media | Day of Isolation | 10 ml | - Rist kraftig - La det sitte i 37 ° C bad i 30 minutter (ideelt forberedt 30 min før bruk) - Filter steriliser (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 ml | ||||
| papain | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
| Tetthet Gradient | Day of Isolation | 1 Gradient | |||
| Lag | OptiPrep | HABG | |||
| (0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
| 1 bunn | 0,26 ml | 1,24 ml | |||
| 2 | 0,19 ml | 1,31 ml | |||
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml | |||
| 4 toppen | 0,11 ml | 1,39 ml | |||
Tabell 1: Forberedelse av media og løsninger som brukes i denne protokollen.
| Coating Substrate | Oppbevaring | ingredienser | Forberedelse | |
| PDL | Frys-tin en gang | Poly-D-Lysinhydrobromid | 5 mg | - Aliquot 4 ml i 15 ml rør og lagre umiddelbart i -20 ° C - 0,5 ml / brønn (brønn med 24 brønner) |
| Sterilt vann | 50 ml | |||
| laminin | Dag med belegg | Laminin (1 mg / ml) | 80 μl | - Nok til 8 brønner i en brønn på 24 brønner - 0,35 ml / brønn (brønn med 24 brønner) |
| Neurobasal Medium | 2,72 ml | |||
Tabell 2: Fremstilling av de belagte substratene som brukes til å belegge brønnene hvor nevronene dyrkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken tillater pålitelig kultur av ryggmargsneuroner. Når ferdighetene i teknikken er oppnådd, tar det ca. 3,5 timer å fullføre. Vi har vært i stand til å utføre isolasjonen av nevroner fra 2 separate kuller (16 mus totalt) på ca 4 timer. Nøkkeltrinnet i gjennomførbarhet er å være i stand til å utdanne spinalkordene effektivt fra musene. Utbyttet tillater plating flere brønner og for evnen til å teste nevronene under forskjellige forhold. Vi har vært i stand til å behandle nevronene etter modenhet og på en pålitelig måte vurdere proteinuttrykk ved hjelp av Western blot-analyse. Videre muliggjør bruk av glassriller inne i brønnene for nevron-vedleggene den videre fargingsanalyse av nevronene.
Denne fremgangsmåten er fordelaktig ved at den ikke krever embryonalt vev og den tilhørende arbeidsintensiteten. Videre er det ikke nødvendig å bruke voksne spinal ledninger til å samle nok vev til adekvatE neuron isolasjon. Dette forhindrer faktoren av aldersforbindelsesadferd i neuronfysiologi, som sett med voksne mus. Denne teknikken er imidlertid ikke uten begrensninger. Som tidligere nevnt, er alderen nevroner ekskludert ved bruk av neonatalmus, og dette kan være en begrensning dersom aldersrelatert atferd og biologi er undersøkelsesområdet. Det er en læringskurve i prosedyren, som ikke bare er nødvendig for å optimalisere utbyttet, men for å sikre at de isolerte nevronene er sunne. Ryggmargenekstraksjonsteknikken kan ta litt tid å mestre, spesielt med nyfødte mus. Vi har lagt merke til at langvarig tid forbundet med utvinning av ryggraden fører til nevroner som kan dyrkes i en betydelig kortere periode. Dette blir noe lindret ved plassering av nevronene på isen; Men tiden spiller fortsatt en nøkkelrolle.
Det er viktige skritt i prosedyren som bidrar til å sikre det optimale utbyttet av nevroner. Hvis neuronutbyttet ikke er som eXpected, noen få trinn bør evalueres. For det første bør antall spinalkord ideelt sett være over 4. Når 3 spinalkabler eller mindre brukes, er utbyttet vanligvis mindre enn 1 million nevroner. Tilstrekkelig tilberedning av fordøyelsesmediet må sikres (trinn 4.5). Hvis du forlater vevet for lenge i fordøyelsesmediet, vil det føre til overdreven nedbrytning av celler, mens bruk av fordøyelsesmedium som ikke er aktivert ved 37 ° C, vil resultere i færre isolerte neuroner. Til slutt må triturasjonsteknikken (trinn 4.7) utføres med presisjon. Lavt utbytte skyldes vanligvis utilstrekkelig triturering. En god indikator er å se om løsningen blir overskyet under tritureringen - hvis dette ikke skjer, er det sannsynlig at tritureringen er for mild.
Hvis utbyttet er som forventet, men nevronene ikke ser ut til å regenerere prosesser innen de første 1-2 dagene, er problemet vanligvis en feil i riktig belegg, med enten utilstrekkelig vaskingEller tørking (trinn 2.2). Hvis cellene først prosjekterer prosesser, men senere blir apoptotiske før 5-7-dagersmerket, kan det være flere problemer. Først må du sørge for at HABG-løsningen er utarbeidet innen 24 timer med isolasjon, og at det nye B27-supplementet som er blitt tint ut samme dag med HABG-preparat, brukes. Antioksidanter i dette supplementet må være friske og ikke utgått. Sørg for at ingen bobler blir introdusert under tritureringsprosessen (trinn 4.7). Innføringen av luftbobler bidrar til dette problemet og kan være relatert til tørking av nevronene. Sørg også for at kulturen ikke er overveldet av forurensning, noe som kan tilskrives feil i sterilitet.
Her beskriver vi bruk av brønner med 24 brønner hvorfra nevronene kan frøes. Noen ganger er det nødvendig å utføre tid og / eller doseringsforsøk, for eksempel når man bruker farmakologiske midler. Teknikken kan modifiseres og nevronene kan frøes til 48-brønnsplAtes i stedet. Siden overflaten av en brønn i en brønn på 48 brønner er halvparten av den i en brønn på 24 brønner, bør mengdene av beleggingsløsninger som brukes, bli kuttet i halvparten. Cellene skal også belegges til halvparten av volumet ( dvs. 0,5 ml i stedet for 1,0 ml). Imidlertid bør konsentrasjonen forbli den samme ( dvs. 1-5 x 105 celler / ml). Mens denne studien har blitt utført ved hjelp av C57BL / 6-mus, bør teknikken brukes over andre genetisk manipulerte stammer.
Ryggmargsekskemi og beskyttelse er et område med voksende interesse 12 , 13 , 14 . Klinisk kan thoracoabdominal aorta-kirurgi føre til ødeleggende lammelse relatert til ryggmargs-iskemi og reperfusjon, hvis patofysiologi forblir fullstendig forstått 15 , 16 . Forstå hvordan nevroner reagerer på detDet er mulig å ta tak i iskemi ved hjelp av denne modellen. Vår gruppe har tidligere publisert på ryggmargsneuronskader relatert til iskemisk fornærmelse gjennom oksygenglukoseavhengighet ved hjelp av denne teknikken 17 . Modellen har også blitt utvidet til å omfatte kulturen av astrocytter, skilt fra nevroner 18 .
Som konklusjon er denne teknikken verdifull for studien av ryggmargspatofysiologi og nevronmikrobiologi. Den serumfrie kulturen tillater nøyaktig miljøkontroll. Det gir direkte tilgang til bruk av farmakologiske midler. Kombinert med ytterligere teknikker, som for eksempel oksygenglukoseavstand, kan denne teknikken være nyttig for å utvide vår forståelse av patofysiologien av determinantal ryggmargs-iskemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen opplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
