Summary
تقدم هذه الدراسة تقنية لعزل الخلايا العصبية من الفئران حديثي الولادة وت. فإنه يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الماوس حديثي الولادة، تليها فصل الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي من خلال الانقسام الميكانيكية والانزيمية.
Abstract
نقدم بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا العصبية الحبل الشوكي. يتم الحصول على الخلايا العصبية من حديثي الولادة C57BL / 6 الفئران ويتم عزلها في يوم ما بعد الولادة 1-3. يتم جمع القمامة الماوس، وعادة 4-10 الجراء ولدت من زوج تربية واحد، لتجربة واحدة، ويتم جمع الحبال الشوكي بشكل فردي من كل الماوس بعد القتل الرحيم مع إيسوفلوران. يتم تشريح العمود الفقري بها ومن ثم يتم تحرير الحبل الشوكي من العمود. ثم يتم مفرغة الحبل الشوكي لزيادة مساحة سطح التسليم للبروتياز الأنزيمية التي تسمح للخلايا العصبية والخلايا الأخرى أن يطلق سراحه من الأنسجة. ثم يتم استخدام تريتوراتيون لإطلاق الخلايا في حل. هذا الحل في وقت لاحق مجزأة في التدرج الكثافة لفصل الخلايا المختلفة في حل، مما يسمح للعصبية لتكون معزولة. يمكن عزل ما يقرب من 1-2.5 × 10 6 الخلايا العصبية من مجموعة القمامة واحدة. ثم يتم تصنيف الخلايا العصبية على الآبار المغلفة مع فاكتو لاصقةرس التي تسمح للنمو السليم والنضج. وتستغرق الخلايا العصبية حوالي 7 أيام للوصول إلى مرحلة النضج في النمو والثقافة المتوسطة ويمكن استخدامها بعد ذلك للعلاج والتحليل.
Introduction
فهم أمراض الحبل الشوكي يتطلب استخدام نماذج مختلفة، سواء على المستويات المجهرية والميكروسكوبية. وتستخدم النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1 ، 2 ، 3 في التحقيقات في الجسم الحي من مرض الحبل الشوكي والإصابات. في حين دراسة هذه القضايا في الجسم الحي له مزاياه، وتحليل الحبل الشوكي يقتصر على كامل جنون الحبل الشوكي أو أقسام الأنسجة 4 . هذا يخلق بعض الغموض عند محاولة عزل ردود محددة والأهداف في الحبل الشوكي بين الخلايا العصبية المقيمين والدبقية المحيطة بها. زيادة توافر الفئران التلاعب وراثيا يسمح لإجراء تحقيقات أكثر تفصيلا في علم الأحياء على المستويات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يتم استخدام نموذج الماوس حديثي الولادة هنا، مما يسمح لدراسة خصائص فريدة من نوعها وعلم الأحياء من الخلايا العصبية الحبل الشوكي في المختبر .
إن "عزل الخلايا العصبية في المختبر وصيانتها ليس واضحا بشكل خاص، وهناك وفرة نسبية من تقنيات عزل العصبونات من الأنسجة القشرية للقوارض البالغة التي يبدو أنها تؤدي إلى عدد كبير من الخلايا العصبية المعزولة ( أي الملايين) 5 ، 6 ، 7. في المقابل، فإن العائد من الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي هو أقل 8 ، 9 ، 10 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى كتلة أصغر من الأنسجة.وعلاوة على ذلك، في الفئران، وهناك قلة نسبي من التقنيات لعزل حديثي الولادة والخلايا العصبية الحبل الشوكي، والأساليب القائمة محدودة من قبل انخفاض الخلايا العصبية ( أي المئات) 9 أو التقنيات الشاقة والموارد الثقيلة التي تتطلب عزل الفئران الجنينية 10 .في هذا البروتوكول، ونحناستخدام تقنية تسمح لعزل فعالة من حيث التكلفة والموارد من عدد كبير من الخلايا العصبية من الحبل الشوكي من الفئران حديثي الولادة. كما هو شائع في التقنيات المنشورة سابقا، ونحن نستخدم غشاء كما الأنزيمية الأنزيمية، مما يسمح للإفراج عن الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي 5 ، 6 . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم التدرج الكثافة لفصل الخلية المكرر، والتي سبق أن ثبت أن تكون فعالة 6 ، 10 . في حين أن الوسيط الذي يتم فيه حضانة الخلايا يمكن أن تختلف، في تجربتنا وكما نشرت سابقا 11 ، مكملات مع الطازجة B27 تكملة متوسطة الثقافة وقد ثبت أن تكون حاسمة لطول العمر العصبية. الخلايا العصبية هي عادة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 يوما، مما يسمح للعلاج أن تنفذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت رعاية وعلاج الحيوانات في هذا الإجراء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسي في جامعة كولورادو.
1. إعداد الحلول
- إعداد وتخزين جميع الحلول في درجات الحرارة المناسبة، كما هو مبين في الجدول 1 .
2. طلاء الآبار والشرائح
ملاحظة: الخلايا العصبية لا تلتزم بشكل جيد إلى الأسطح البلاستيكية أو الزجاج.
- قبل يوم واحد من عزل الخلايا العصبية، معطف آبار لوحة معقم 24-ثقافة جيدا مع 0.5 مل من بولي- D- يسين (بدل، الجدول 2 ) وتركها في غطاء تدفق الصفحي O / N.
ملاحظة: الطريقة المفضلة هي استخدام لوحات 24-جيدا ولطلاء فقط آبار مركز، والتبخر من الآبار الطرفية يميل إلى أن يكون أكثر تسارعا ويؤدي إلى نتائج غير متناسقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن وضع الشرائح الزجاجية داخل الآبار قبل to طلاء. الخلايا العصبية سوف نعلق على الشرائح الزجاجية المغلفة ويمكن إزالتها في وقت لاحق لمزيد من التصوير المجهري . - في يوم العزلة، وإزالة بدل من الآبار. يغسل بالماء المعقم لبضع دقائق قبل إزالة أي ماء متبقي والسماح لها لتجف لمدة 1 ساعة (انظر أدناه).
- بعد التجفيف، معطف الشرائح مع لامينين ( الجدول 2 ).
ملاحظة: ما يقرب من 10 ميكرولتر من لامينين (10 ميكروغرام / ميكرولتر) ما يكفي لمعطف كل بئر من لوحة معقم 24 جيدا. يتم خلط هذا مع 340 ميكرولتر من المتوسطة (الحجم الكلي: 350 ميكرولتر) من أجل تغطية جيدا جيدا. السماح لهذا الجلوس لمدة 2 ساعة في رت في غطاء محرك السيارة والثقافة ثم نضح قبل طلاء الخلايا.
3. حصاد الحبل الشوكي
ملاحظة: ينبغي تعقيم جميع الصكوك (135 درجة مئوية و 30 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 4 × 7 دقائق دورات) للعقم.
- الموت ببطء 1-3 من العمر الجراء الماوس C57BL / 6 في غرفة مع إيسوفلوران. انتظر30 ثانية بعد توقف الحركة وقرصة الساق لتأكيد عدم وجود استجابة.
- فصل الرأس من الجسم باستخدام مقص، مع الجرو في وضعية العرض.
- استقرار الساقين الخلفيتين أو الذيل والذراعين على طاولة الإجراء، مع الجانب الظهري التي تواجه المستخدم.
- قطع الجلد قبالة باستخدام مقص القزحية المنحنية.
- قطع الحبل الشوكي من منطقة أسفل الظهر فقط فوق الوركين والمضي قدما في قطع جانبي الصدر لفصلها عن الجسم.
ملاحظة: وهذا يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الأجهزة الحشوية لتجنب الضرر غير المقصود لأعضاء أخرى ( الشكل 1A ). - غسل بالتتابع لمدة 10 ثانية في 3 × 10 سم أطباق بتري تحتوي على 5 مل من 0.2 ميكرون مرشح تعقيم الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لإزالة الأنسجة الزائدة.
- إدراج إبرة 22 G والمحاقن مليئة 5 مل من برنامج تلفزيوني مرشح تعقيم في نهاية الذيلية من العمود الفقري ودافق كرانيالي، والسماح الحبل رس الخروج إلى طبق بتري الرابع ( الشكل 1B ).
- جمع الحبل الشوكي في أنبوب 15 مل مع 5 مل من هبغ ( الجدول 1 ) على الجليد. استخدام الرعاية لتجنب سحق الحبل الشوكي.
- كرر الخطوات 3،1-3،8 لكل الجرو في القمامة.
ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تستغرق هذه العملية أقل من 30 دقيقة في الحبل الشوكي لضمان عزل الخلايا العصبية صحية.
4. عزل الخلايا العصبية
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة التالية في غطاء تدفق الصفحي. ومن المتوقع الألفة مع تقنية معقمة الأساسية.
- الأنسجة المفرمة
- اتخاذ أنبوب يحتوي على الحبل الشوكي ويهز بخفة لتعليق الأنسجة.
- صب الأنسجة من أنبوب إلى 60 ملم طبق بيتري الزجاج والنرد مع شفرة حلاقة لخلق قطع غرامة ~ 0.5 ملم في الحجم.
- نقل الأنسجة مع ماصة واسعة تحمل في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من هبغ.
- وضعه في30 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا أن تتوازن في هذه الدرجة. إبقاء الخلايا على شاكر بما فيه الكفاية للسماح لهم أن يتم تعليقها في السائل.
ملاحظة: يتم هذه الخطوة لتجنب صدمة الخلايا عند نقل من الجليد إلى المتوسطة الهضم. الحفاظ على الخلايا في 30 درجة مئوية يساعد على تقليل موت الخلايا المرتبطة مع زيادة التمثيل الغذائي على خلاف ذلك عند 37 درجة مئوية.
- إعداد وسط الهضم ( الجدول 1 ).
- إعداد التدرج الكثافة (الجدول 1).
- إعداد كل من 4 طبقات في 4 أنابيب منفصلة 15 مل، على النحو المبين في الجدول 1 .
- إضافة 1 مل من كل طبقة إلى أنبوب 15 مل جديد. تبدأ مع الطبقة 1 في الجزء السفلي وتسلسل إضافة حتى الوصول إلى الطبقة 4 في الأعلى. تجنب إزعاج الطبقات أثناء إضافة.
- غسل لوحات المغلفة بدل من الخطوة 2.2. اغسل بالماء المعقم لبضع دقائق قبل إزالة أي ماء متبقي ومما يسمح لهم لتجف لمدة 1 ساعة.
- نقل الأنسجة إلى المتوسطة الهضم.
- إزالة الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة من حمام الماء شاكر في 30 درجة مئوية والسماح لها لتسوية لبضع دقائق.
- إزالة أنبوب المتوسطة الهضم من 37 درجة مئوية حمام الماء ونضح في حقنة ليور قفل.
- نضح قبالة هبغ الزائدة من الأنسجة التي تحتوي على أنبوب.
- استخدام ليور قفل 0.2 ميكرون مرشح على حقنة لإضافة المتوسطة الهضم إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
- وضع أنبوب في 30 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة. إبقاء الخلايا تهز ما يكفي للسماح لهم أن يتم تعليقها في السائل.
ملاحظة: من المهم عدم إبقاء الخلايا في وسط الهضم لفترة طويلة جدا أو للسماح لدرجة الحرارة الحصول على مرتفعة جدا، مما قد يؤدي إلى الهضم المفرط ويؤدي إلى أن تصبح الأنسجة معلقة في خليط هلامي.
- خلال هذه الفترة، معطف لامينين كما هو الحال في الخطوة 2.3. <لي> أداء تريتوراتيون ( أي فصل الخلايا من الأنسجة).
- إزالة الأنبوب من هز 30 درجة مئوية حمام الماء والسماح لها لتسوية لبضع دقائق.
- نضح الزائد الهضم المتوسطة.
- تعليق الأنسجة في 2 مل من هبغ.
- باستخدام ماصة ضيقة تتحمل، تريتورات 10X لمدة 45 ثانية.
ملاحظة: هذا هو على الارجح خطوة واحدة الأكثر أهمية ويمكن أن تقلل بشكل كبير من العائد إذا لم يتم بشكل صحيح.- نضح الأنسجة في ماصة وفراغ محتويات على الفور.
- تجنب إدخال الهواء، كما أنها سوف تقلل بشكل كبير من العائد قابلة للحياة.
ملاحظة: ماصة مثالية هو ماصة الزجاج 9 "، وينبغي أن يكون طرف ماصة النار مصقول لتلطيف الأسطح الخام، وينبغي بعد ذلك سيليكونيزد عن طريق التنسيب في حل 01:20 من ثنائي كلوروديميثيلزيلان (دمدكس) في الكلوروفورم واليسار O / N. وينبغي بعد ذلك إزالة ماصة ويسمح للهواء الجاف، وبعد ذلك، فإنه قهولد يكون تعقيمها للتعقيم.
الحذر: دمدكس والكلوروفورم قابلة للاشتعال للغاية، وينبغي أن يتم السيليكونية في غطاء الدخان.
- نضح أعلى 2 مل من طاف ووضعه في أنبوب 15 مل جديد المسمى "جمع".
- كرر الخطوات 4.7.3-4.7.5 مرتين إضافيتين (يجب أن يكون أنبوب جمع الخلايا 6 مل بنهاية).
- نقل ببطء محتويات أنبوب جمع في أنبوب التدرج أعدت في الخطوة 4.2، وتجنب تعطيل التدرج.
- عند هذه النقطة، إزالة المتوسطة نيوروباسال أعدت سابقا ( الجدول 1 ) من الثلاجة والسماح لها لتدفئة في حمام 37 درجة مئوية.
- تنقية الخلايا العصبية.
- الطرد المركزي أنبوب التدرج لمدة 15 دقيقة في 800 x ج و 22 درجة مئوية.
- جمع الطبقة المطلوبة (ق) مع ماصة ( الشكل 2 ) ومكان في أنبوب 15 مل جديد. للحصول على أعلى النقاء العصبية( أي أكثر من 90٪)، وجمع الطبقة 3. للحصول على مزيد من المحصول مع أقل نقاء ( أي > 70-80٪)، وجمع طبقات 2 و 3.
- تمييع التدرج الكثافة بإضافة 5 مل من هبغ إلى الطبقات التي تم جمعها حديثا.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة عند 22 درجة مئوية.
- تجاهل طاف، إعادة تعليق في 5 مل من هبغ، ونفض الغبار بيليه لتعليق الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي في لمدة 2 دقيقة 200 x ج في 22 درجة مئوية.
- تجاهل طاف، ريسوسبيند في 3 مل من المتوسطة العصبية، ونفض الغبار بيليه ل ريسوسبيند الخلايا.
- عد الخلايا.
- خذ 10 ميكرولتر من الحل، والآن مع خلايا في المتوسطة العصبية، وتخلط مع 10 ميكرولتر من الأزرق تريبان.
- مكان 10 ميكرولتر من هذا الخليط في غرفة العد الزجاج.
- باستخدام غرفة العد الزجاج القياسية، عد عدد الخلايا في كل من أربعة 4 × 4 الأرباع. إضافة جميع الخلايا عد (ن)، متعددةمن خلال 2 (عامل التخفيف)، وتقسيم بنسبة 4 (عدد من الأرباع عد)، تتضاعف من قبل 3 (حجم الوسط العصبي القاعدي)، وتضاعف من قبل 10 4 للحصول على تركيز الخلايا في الخلايا / مل.
- البذور الخلايا على لوحات الثقافة
- تمييع تعليق الخلية إلى 300،000 خلية في 1 مل من المتوسطة العصبية.
ملاحظة: استنادا إلى تركيز الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوات المذكورة أعلاه، يضاف المتوسطة العصبية إضافية للحصول على تركيز النهائي من 3 * 10 5 خلايا / مل. المعادلة هي C 1 V 1 = C 2 V 2 ، حيث C 1 هو التركيز الأولي للخلايا التي تم الحصول عليها من الحصاد؛ V 1 هو 3 مل. و C 2 هو 3 * 10 5 خلايا / مل، كما نوقش أعلاه. يتم حل المعادلة ل V 2 . إضافة حجم المتوسطة العصبية اللازمة لجعل الحجم الكلي للخلايا في حل يساويV 2 . - يهز بلطف لتوزيع الخلايا في حل وإضافة 1 مل لكل بئر في لوحات 24-جيدا المغلفة.
- تمييع تعليق الخلية إلى 300،000 خلية في 1 مل من المتوسطة العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه التقنية، والقمامة واحدة (4-10 الجراء) يسمح لعزل 1-2.5 10 6 الخلايا العصبية مناسبة للبذر على لوحات الثقافة. عادة، يتم تصنيف البذور 4-8 بئر في التركيز المذكور أعلاه ( أي 300،000 خلية / مل). ويبين الشكل 3 ظهور الخلايا العصبية في هذا التركيز بعد أسبوع في الثقافة في المنخفضة ( أ ) وعالية ( ب ) التكبير المجهر الضوئي. ومع ذلك، كنا أيضا قادرة على خلايا الثقافة في تركيزات عالية تصل إلى 500،000 خلية / جيدا و منخفضة تصل إلى 100،000 الخلايا / جيدا. استخدام التركيزات العالية يتطلب المزيد من الاهتمام المتوسط والحذر للظروف البيئية، حيث يمكن استنفاد المواد الغذائية بسرعة، مما يؤدي إلى بيئة حمضية سامة للخلايا. مع تركيزات أقل، الخلايا تميل إلى عدم الوصول إلى مرحلة النضج الكامل، و فرط نمو الخلايا الداعمة ( أي أوليغوديندروسيتس، ميكروغليا، و أستروسيتيس).
وعادة ما تبدأ الخلايا الانضمام إلى السطح خلال أول بضع ساعات ( الشكل 4A ). والمحاور تبدأ في تنبت داخل أول 24-48 ساعة ( الشكل 4B -4C ). الاتصالات بين الخلايا العصبية المختلفة في الثقافة وعادة ما تصل النضج في 7 أيام ( الشكل 4D )، وعندها يتم إجراء التجارب عادة على الخلايا العصبية.
الخلايا العصبية يمكن التعرف عليها تحت المجهر الضوئي، كما أن لديهم توقعات محور عصبي متميزة. العزلات لدينا باستخدام طبقة 3 ( الشكل 2 ) ينتج ~ 80-90٪ الخلايا العصبية في الثقافة. وقد أكد هذا باستخدام تلطيخ إمونوفلورزنت من علامات عصبية محددة. في الشكل 5C ، والبروتين الخلية الخلوية العصبية بروتين ميكروتوبول المرتبطة 2 (MAP2) هو قملطخة، والتي تبين الخطوط العريضة وإسقاطات محور عصبي من الخلايا العصبية بعد أسبوع في الثقافة. وبالمثل، في الشكل 6C ، هو ملطخة علامة النووية العصبية محددة نيون، والتي تبين نوى الخلايا العصبية. يتم الجمع بين هذه العلامات العصبية مع نواة (دابي، الشكل 5A ، 6A ) والسيتوبلازم (غفب، الشكل 5B ، 6B ) التصوير، ويتم دمج الصور الناتجة ( الشكل 5D ، 6D )، بالتفصيل وفرة النسبية من الخلايا العصبية لخلايا أخرى في حضاره. عند استخدام الطبقات 2 و 3، وعائد الخلايا العصبية أعلى قليلا. ومع ذلك، هناك تميل إلى أن تكون الخلايا العصبية أقل في الحل النقي (~ 70٪).
الشكل 1: العمود الفقري تشريح والحبل الشوكي صدر من 3 سنة من العمر حديثي الولادة الماوس. الالسهم في ( أ ) يشير إلى نهاية الذيلية في العمود الفقري، حيث يتم إدخال إبرة لإطلاق الحبل الشوكي. يظهر الحبل الشوكي صدر ( ب ) المغمورة في برنامج تلفزيوني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكثافة التدرج، مع خلايا المضافة على بعد الطرد المركزي. يتم توضيح الطبقات وتصور أفضل على رسم الرسوم المتحركة. الطبقة الأكثر سطحية (0) هو عموما الحطام من أنسجة الحبل الشوكي. طبقة 1 غنية في أوليغوديندروسيتس و أستروسيتس. الطبقات 2 و 3 تحتوي على غالبية الخلايا العصبية. في حين أن الطبقة 3 تحتوي على الخلايا العصبية مع أعلى النقاء، وبعض الخلايا الداعمة ( أي الخلايا النجمية و أوليغوديندروسيتس) توجد في طبقة 2. و بيليت في الجزء السفلي يحتوي أساسا خلايا ميكروغليال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المجهر الضوئي من الثقافات خلية الخلايا العصبية بعد 7 أيام من العزلة. في 10X التكبير ( أ )، وصلات محور عصبي بين تكتلات مختلفة من الخلايا العصبية يمكن أن ينظر إليه. في التكبير 40X ( ب )، يمكن تصور الخلايا العصبية بشكل وثيق مع توقعات محور عصبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مناعي وصمة عار من الخلايا العصبية باستخدام الخلايا العصبية مارتوس MAP2. يظهر تلطيخ النووي (دابي) باللون الأزرق ( أ )، مع تلطيخ السيتوبلازم (غفب) في الأخضر ( ب ) والبروتين الخلوي العصبي (MAP2) باللون الأحمر ( ج ). يتم دمج الصور المدمجة ( د )، والتي تبين وفرة النسبية من الخلايا العصبية.تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مناعي وصمة عار من الخلايا العصبية باستخدام العصبية النووية ماركر نيون. يظهر تلطيخ النووي (دابي) باللون الأزرق ( أ )، مع تلطيخ السيتوبلازم (غفب) في الأخضر ( ب ) والنوى العصبية (نيون) باللون الأحمر ( ج ). يتم دمج الصور المدمجة ( د )، والتي تبين وفرة النسبية من الخلايا العصبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وسائل الإعلام | تخزين | مكونات | تجهيز | ||
| HABG | 4 درجة مئوية / 24 ساعة | 100 مل | - ذوبان الجليد B27 في 4 درجة مئوية الثلاجة O / N - تصفية تعقيم (0.22 ميكرون) | ||
| السبات A | 97.8 مل | ||||
| B27 [2٪] | 2 مل | ||||
| غلوتا ماكس [0.5 ملي] | 0.25 مل | ||||
| نيوروباسال وسائل الإعلام | 4 درجة مئوية / 1 أسبوع | 100 مل | - ذوبان الجليد B27 في 4 درجة مئوية الثلاجة O / N - تصفية تعقيم (0.22 ميكرون) - قسامة 50 مل أجزاء إلى 50 مل أنابيب (مخزن في 4 درجات مئوية) | ||
| نيوروباسال أ | 97 مل | ||||
| B27 [2٪] | 2 مل | ||||
| غلوتا ماكس [0.5 ملي] | 0.25 مل | ||||
| القلم / بكتيريا [1٪] | 1 مل | ||||
| الهضم وسائل الإعلام | يوم العزلة | 10 مل | - يهز بقوة - السماح لها الجلوس في 37 درجة مئوية حمام لمدة 30 دقيقة (أعدت بشكل مثالي 30 دقيقة قبل الاستخدام) - تصفية تعقيم (0.22 ميكرون) | ||
| HA-كا | 10 مل | ||||
| غراء | 25 ملغ | ||||
| غلوتا ماكس [0.5 ملي] | 0.025 مل | ||||
| الكثافة التدرج | يوم العزلة | 1 التدرج | |||
| طبقة | OptiPrep | HABG | |||
| (0.13 مل) | (5.29 مل) | ||||
| 1 أسفل | 0.26 مل | 1.24 مل | |||
| 2 | 0.19 مل | 1.31 مل | |||
| 3 | 0.15 مل | 1.35 مل | |||
| 4 أعلى | 0.11 مل | 1.39 مل | |||
الجدول 1: إعداد وسائل الإعلام والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
| طلاء الركيزة | تخزين | مكونات | تجهيز | |
| PDL | تجميد ذوبان الجليد مرة واحدة | بولي-D- يسين هيدروبروميد | 5 ملغ | - قسامة 4 مل في أنابيب 15 مل وتخزينها فورا في -20 درجة مئوية - 0.5 مل / جيدا (24-لوحة جيدا) |
| ماء معقم | 50 مل | |||
| Laminin | يوم الطلاء | لامينين (1 ملغ / مل) | 80 ميكرولتر | - يكفي ل 8 بئر في لوحة 24 جيدا - 0.35 مل / جيدا (24-جيدا لوحة) |
| نيوروباسال المتوسطة | 2.72 مل | |||
الجدول 2: إعداد ركائز الطلاء المستخدمة في معطف البئر التي هي مثقف الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية تسمح للثقافة موثوق بها من الخلايا العصبية الحبل الشوكي. بمجرد تحقيق الكفاءة في هذه التقنية، يستغرق حوالي 3.5 ساعة لإكمال. كنا قادرين على تنفيذ العزلة من الخلايا العصبية من 2 ليترز منفصلة (16 الفئران المجموع) في حوالي 4 ساعات. الخطوة الرئيسية في الجدوى هو أن تكون قادرة على استخراج ببراعة الحبل الشوكي من الفئران. العائد يسمح لطلاء عدة آبار وللقدرة على اختبار الخلايا العصبية في ظل ظروف مختلفة. لقد تمكنا من علاج الخلايا العصبية بعد النضج وتقييم موثوق للتعبير البروتين باستخدام تحليل لطخة غربية. وعلاوة على ذلك، باستخدام الشرائح الزجاجية داخل الآبار لمرفقات الخلايا العصبية يسمح لمزيد من تحليل تلطيخ الخلايا العصبية.
هذا الإجراء مفيد في أنه لا يتطلب الأنسجة الجنينية وكثافة اليد العاملة المرتبطة بها. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من الضروري استخدام الحبل الشوكي الكبار لجمع ما يكفي من الأنسجة ل أفيكاته العزلة العصبية. هذا يمنع عامل العمر السلوك المركب في علم وظائف الأعضاء العصبية، كما رأينا مع الفئران الكبار. ومع ذلك، هذه التقنية ليست بلا قيود. كما ذكر سابقا، يتم استبعاد الخلايا العصبية القديمة باستخدام الفئران حديثي الولادة، وهذا يمكن أن يكون محدودا إذا السلوك المرتبط بالعمر وعلم الأحياء هو مجال التحقيق. هناك منحنى التعلم لهذا الإجراء، وهو أمر ضروري ليس فقط لتحسين العائد، ولكن لضمان أن الخلايا العصبية معزولة هي صحية. تقنية استخراج الحبل الشوكي يمكن أن يستغرق بعض الوقت لإتقان، وخاصة مع الفئران حديثي الولادة. لقد لاحظنا أن الوقت المطول المرتبطة باستخراج الحبل الشوكي يؤدي إلى الخلايا العصبية التي يمكن استزراعها لفترة أقصر بكثير. وهذا يخفف إلى حد ما عن طريق وضع الخلايا العصبية على الجليد. ومع ذلك، لا يزال الوقت يلعب دورا رئيسيا.
هناك خطوات رئيسية في الإجراء الذي يساعد على ضمان العائد الأمثل من الخلايا العصبية. إذا كان العائد الخلايا العصبية ليس كما هإكسكتد، بضع خطوات ينبغي تقييمها. أولا، عدد الحبال الشوكية ينبغي أن يكون مثاليا أكثر من 4. عندما يتم استخدام 3 الحبل الشوكي أو أقل، وعادة ما يكون العائد أقل من 1 مليون الخلايا العصبية. يجب ضمان إعداد مناسب لهضم الهضم (الخطوة 4.5). ترك الأنسجة لفترة طويلة جدا في وسط الهضم سوف يسبب انهيار المفرط للخلايا، في حين أن استخدام الهضم المتوسطة التي لم يتم تفعيلها عند 37 درجة مئوية سوف يؤدي إلى عدد أقل من الخلايا العصبية معزولة. وأخيرا، يجب أن يتم تنفيذ تقنية تريتوراتيون (الخطوة 4.7) بدقة. وعادة ما تنتج الغلة المنخفضة من عدم كفاية التريتور. وهناك مؤشر جيد هو معرفة ما إذا كان الحل يصبح غائما خلال تريتوراتيون - إذا لم يحدث هذا، فمن المرجح أن تريتوراتيون لطيف جدا.
إذا كان العائد كما هو متوقع ولكن الخلايا العصبية لا يبدو لتجديد العمليات في غضون 1-2 أيام الأولى، والمشكلة عادة ما يكون الفشل في الطلاء السليم، إما مع عدم كفاية الغسيلأو التجفيف (الخطوة 2.2). إذا كانت الخلايا في البداية عمليات المشروع ولكن في وقت لاحق تصبح موت الخلايا المبرمج قبل علامة 5-7 يوم، يمكن أن يكون هناك العديد من القضايا. أولا، تأكد من أن يتم إعداد حل هبغ في غضون 24 ساعة من العزلة وأنه يتم استخدام الملحق B27 الطازجة التي تم ذوبان بها في نفس اليوم من إعداد هبغ. مضادات الأكسدة في هذا الملحق تحتاج إلى أن تكون جديدة وليس منتهية الصلاحية. بعد ذلك، تأكد من عدم إدخال فقاعات أثناء عملية تريتوراتيون (الخطوة 4.7). إدخال فقاعات الهواء يساهم في هذه المسألة، ويمكن أن تكون ذات صلة لتجفيف الخلايا العصبية. أيضا، تأكد من أن الثقافة ليست طغت مع التلوث، والتي يمكن أن تعزى إلى الفشل في العقم.
هنا، نحن تصف استخدام لوحات 24-جيدا التي لبذور الخلايا العصبية. في بعض الأحيان، فمن الضروري إجراء تجارب الوقت و / أو الجرعة، مثل عند استخدام وكلاء الدوائية. يمكن تعديل هذه التقنية، ويمكن أن تصنف الخلايا العصبية على 48 بل جيدابدلا من ذلك. وبما أن مساحة سطح البئر في لوحة 48-جيدا هي نصف ذلك في لوحة 24-جيدا، يجب قطع أحجام حلول الطلاء المستخدمة في النصف. وينبغي أيضا أن تكون المغلفة الخلايا في نصف حجم ( أي 0.5 مل بدلا من 1.0 مل). ومع ذلك، ينبغي أن تبقى تركيزها على نفس ( أي 1-5 × 10 5 خلية / مل). في حين أجريت هذه الدراسة باستخدام C57BL / 6 الفئران، وينبغي أن تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق عبر سلالات أخرى التلاعب وراثيا.
الحبل الشوكي نقص التروية والحماية هي مجال الاهتمام المتزايد 12 ، 13 ، 14 . سريريا، يمكن أن يؤدي إلى جراحة الشريان الأورطي الصدرية في الشلل المدمر المتعلقة نقص تروية الحبل الشوكي وضخه، والفسيولوجيا المرضية التي لا تزال مفهومة تماما 15 ، 16 . فهم كيفية استجابة الخلايا العصبية للثه الإجهاد من نقص التروية هو ممكن باستخدام هذا النموذج. وقد نشرت مجموعتنا سابقا على إصابة الحبل الشوكي العصبية المتعلقة إهانة الدماغية من خلال الأكسجين الحرمان من الجلوكوز باستخدام هذه التقنية 17 . كما تم توسيع النموذج ليشمل ثقافة الخلايا النجمية، منفصلة عن الخلايا العصبية 18 .
في الختام، هذه التقنية هي قيمة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الحبل الشوكي وعلم الأحياء الدقيقة الخلايا العصبية. وتتيح الثقافة الخالية من المصل التحكم البيئي الدقيق. فإنه يتيح الوصول المباشر لتطبيق وكلاء الدوائية. جنبا إلى جنب مع تقنيات إضافية، مثل الحرمان من الجلوكوز الأكسجين، وهذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة لتوسيع فهمنا للفيزيولوجيا المرضية من نقص التروية الحبلية الحبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أية إفصاحات.
Acknowledgments
المؤلفين ليس لديهم اعترافات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
