Summary
Denne undersøgelse præsenterer en teknik til isolering af neuroner fra WT neonatale mus. Det kræver en forsigtig dissektion af rygmarven fra den neonatale mus, efterfulgt af adskillelsen af neuroner fra rygmarvvævet gennem mekanisk og enzymatisk spaltning.
Abstract
Vi præsenterer en protokol for isolering og kultur af rygmarvsneuroner. Neuronerne opnås fra neonatal C57BL / 6 mus og isoleres på postnatal dag 1-3. Et musestøv, der normalt er 4-10 pupper født fra et avlspar, samles til et eksperiment, og spinalkabler opsamles individuelt fra hver mus efter eutanasi med isofluran. Ryggsøjlen er dissekeret og derefter frigives rygmarven fra søjlen. Spinalkablerne bliver derefter hakket for at forøge overføringsareal for en enzymatisk protease, der tillader, at neuronerne og andre celler frigives fra vævet. Trituration bruges derefter til at frigive cellerne i opløsning. Denne opløsning fraktioneres efterfølgende i en densitetsgradient for at adskille de forskellige celler i opløsning, hvilket tillader at neuroner isoleres. Ca. 1-2,5 x 106 neuroner kan isoleres fra en kuldgruppe. Neuronerne er så podet på brønde overtrukket med klæbende factoRs, der giver mulighed for ordentlig vækst og modning. Neuronerne tager ca. 7 dage at nå modenhed i vækst- og kulturmediet og kan derefter anvendes til behandling og analyse.
Introduction
Forståelse af rygmarvspatologi kræver brug af forskellige modeller, både på makroskopiske og mikroskopiske niveauer. Store og små dyremodeller 1 , 2 , 3 anvendes til in vivo undersøgelser af rygmarvs sygdom og skade. Mens undersøgelsen af disse problemer in vivo har sine fordele, er rygmarvanalysen begrænset til hele rygmarvshomogenat eller til vævssektioner 4 . Dette skaber en vis tvetydighed, når man forsøger at isolere specifikke svar og mål i rygmarven blandt sine residente neuroner og omgivende glia. Den stigende tilgængelighed af genetisk manipulerede mus giver mulighed for mere detaljerede undersøgelser af biologien på cellulære og molekylære niveauer. Således anvendes en neonatal musemodel her, hvilket muliggør undersøgelse af de unikke egenskaber og biologi af rygmarvsneuroner in vitro .
Ent "> Isolering og vedligeholdelse af neuroner in vitro er ikke særlig ligetil. Der er en relativ overflod af teknikker til neuronisolering fra det kortikale væv hos voksne gnavere, der synes at resultere i et betydeligt antal isolerede neuroner ( dvs. millioner) 5 , 6 , 7. I modsætning hertil er udbyttet af neuroner fra rygmarvsvæv lavere 8 , 9 , 10 , dels på grund af den mindre vævemasse. Desuden er der hos mus en relativ sparsomhed af teknikker til isolering af neonatal Rygmarvsneuroner, og eksisterende metoder er begrænset af lavere neuronudbytter ( dvs. hundredvis) 9 eller krævende og ressourcetunge teknikker, der kræver isolering af embryonale mus 10 .I denne protokol, viBrug en teknik, der muliggør den omkostningseffektive isolering af et betydeligt antal neuroner fra neonatale muses rygmarv. Som det er almindeligt i tidligere offentliggjorte teknikker bruger vi papain som en enzymatisk protease, der tillader frigivelse af neuroner fra rygmarvvæv 5 , 6 . Derudover bruger vi en densitetsgradient til raffineret celleseparation, som tidligere har vist sig at være effektiv 6 , 10 . Medens mediet, hvori cellerne inkuberes, kan variere i vores erfaring og som tidligere offentliggjort 11 , har tillæg med frisk B27-kulturmediumtilskud vist sig at være kritisk for neuronlevetiden. Neuronerne er typisk levedygtige i op til 10 dage, hvilket gør det muligt at udføre behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje og behandling af dyr i denne procedure blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Instituttet for Dyrpleje og Brug ved University of Colorado.
1. Forberedelse af løsninger
- Forbered og opbevar alle opløsninger ved passende temperaturer, som vist i tabel 1 .
2. Coating Wells og dias
BEMÆRK: Neuroner holder sig ikke godt til plast- eller glasflader.
- En dag før isolering af neuronerne belægge brøndene i en steril 24-brønds kulturplade med 0,5 ml Poly-D-Lysin (PDL; Tabel 2 ) og efterlad det i en laminær strømningshætte O / N.
BEMÆRK: Den foretrukne metode er at bruge 24-brøndsplader og kun belægge centerbrøndene, da inddampning fra de perifere brønde har tendens til at blive hurtigere og føre til inkonsekvente resultater. Derudover kan glasskinner placeres inden i brøndene før tO belægning. Neuronerne fastgøres til de coatede glasskinner og kan fjernes senere for yderligere mikroskopisk billeddannelse . - På isolationsdagen skal du fjerne PDL fra brøndene. Vask med sterilt vand i et par minutter, før du fjerner eventuelt resterende vand og lad det tørre i 1 time (se nedenfor).
- Efter tørring, belæg gliderne med laminin ( tabel 2 ).
BEMÆRK: Ca. 10 μl laminin (10 μg / μl) er tilstrækkeligt til at belægge hver brønd i en steril 24-brønds plade. Dette blandes med 340 μl medium (total volumen: 350 μl) for at dække hele brønden. Lad dette sidde i 2 timer ved stuetemperatur i en kogeplade og derefter aspirere inden belægning af cellerne.
3. Høstning af spinalkabler
BEMÆRK: Alle instrumenter skal autoklaveres (135 ° C og 30 psi i 4 x 7 min cykluser) til sterilitet.
- Euthanize 1-3 dag gamle C57BL / 6 musepupper i et kammer med isofluran. Vente30 s efter ophør af bevægelse og klemme benet for at bekræfte manglende respons.
- Adskil hovedet fra kroppen ved hjælp af en saks, med hvalp i den udsatte position.
- Stabilisér bagbenene eller halen og arme på procedurbordet, med dorsalsiden vendt mod brugeren.
- Skær huden af med buet iris saks.
- Skær rygmarven fra lændehvirvelsøjlen lige over hofterne og fortsæt for at skære begge sider af thoraxen for at adskille den fra kroppen.
BEMÆRK: Dette kræver en forsigtig dissektion af rygmarven fra viskoser for at undgå utilsigtet skade på andre organer ( figur 1a ). - Vask sekventielt i 10 s i 3 x 10 cm petriskåle indeholdende 5 ml 0,2 μm filtersteriliseret phosphatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne overskydende væv.
- Indsæt en 22 G nål og en sprøjte fyldt med 5 ml filtersteriliseret PBS i den kaudale ende af rygsøjlen og spyl cranially, så ledningen tO Afslut i en fjerde petriskål ( figur 1b ).
- Saml rygmarven i et 15 ml rør med 5 ml HABG ( tabel 1 ) på is. Pas på at undgå knusning af rygmarven.
- Gentag trin 3.1-3.8 for hver hvalp i kuldet.
BEMÆRK: Ideelt set bør denne proces tage mindre end 30 minutter pr. Rygmarv for at sikre sund neuronisolation.
4. Isolerende neuroner
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i en laminær strømningshætte. Kendskab til grundlæggende steril teknik forventes.
- Tissue Mincing
- Tag røret, der indeholder rygsøjlen og ryste let for at suspendere vævet.
- Hæld væv fra røret ind i en 60 mm glas petriskål og terninger med et barberblad for at skabe fine stykker ~ 0,5 mm i størrelse.
- Overfør vævet med en brøndpipette i et 15 ml rør indeholdende 5 ml HABG.
- Placer den i a30 ° C vandbad i 30 minutter for at tillade cellerne at ækvilibrere ved denne temperatur. Hold cellerne på en ryster lige så meget, at de kan suspenderes i væsken.
BEMÆRK: Dette trin er gjort for at undgå chokerende cellerne ved overførsel fra is til fordøjelsesmediet. Holde cellerne ved 30 ° C hjælper med at reducere celledød i forbindelse med en ellers øget metabolisme ved 37 ° C.
- Forbered fordøjelsesmediet ( tabel 1 ).
- Forbered densitetsgradienten (tabel 1).
- Forbered hvert af de 4 lag i 4 separate 15 ml rør, som skitseret i tabel 1 .
- Tilsæt 1 ml fra hvert lag til et nyt 15 ml rør. Start med lag 1 nederst og tilføj sekventielt, indtil du når lag 4 øverst. Undgå at forstyrre lagene, mens du tilføjer.
- Vask de PDL-belagte plader fra trin 2.2. Vask med sterilt vand i et par minutter, inden der tages rester af vand ogTillader dem at tørre i 1 time.
- Overfør vævet til fordøjelsesmediet.
- Fjern det vævsholdige rør fra shaker-vandbadet ved 30 ° C, og lad det aflejres i et par minutter.
- Fjern fordøjelsesmediumrøret fra 37 ° C vandbadet og aspirer det i en låsesprøjte.
- Aspirere det overskydende HABG fra det vævsholdige rør.
- Brug et leur-lock 0,2 μm filter på sprøjten for at tilføje fordøjelsesmedium til det vævsholdige rør.
- Anbring røret i et 30 ° C vandbad i 30 minutter. Hold cellerne rystende lige nok til at lade dem suspenderes i væsken.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at holde cellerne i fordøjelsesmediet for længe eller for at lade temperaturen blive for høj, hvilket kan føre til overdreven fordøjelse og resultere i, at vævet bliver suspenderet i en gelatineagtig blanding.
- I løbet af denne periode overtrækkes laminin som i trin 2.3. <Li> Udfør trituration ( dvs. at adskille cellerne fra vævet).
- Fjern røret fra det rystende 30 ° C vandbad og lad det afregne i et par minutter.
- Aspirer overskydende fordøjelsesmedium.
- Suspension vævet i 2 ml HABG.
- Brug en smalboringspipette, triturat 10x i 45 s.
BEMÆRK: Dette er nok det mest afgørende trin og kan betydeligt reducere udbyttet, hvis det ikke er gjort korrekt.- Aspirer vævet i pipetten og straks tømme indholdet tilbage.
- Undgå at indføre luft, da det vil reducere det levedygtige udbytte betydeligt.
BEMÆRK: Den ideelle pipette er en 9 "glaspipette. Spidsen af pipetten skal være brandpoleret for at udjævne ru overflader. Den skal derefter siliconiseres ved placering i en 1:20 opløsning af dichlordimethylsilan (DMDCS) i chloroform og venstre O / N. Pipetten skal derefter fjernes og får lov til at lufttørre. Derefter slukkes pipettenAutoklaveres til sterilisering.
Forsigtig: DMDCS og chloroform er meget brandfarlige, og siliconisering bør udføres i en dampkåbe.
- Aspirer den øverste 2 ml supernatant og læg den i en ny 15 ml rør mærket "samling".
- Gentag trin 4.7.3-4.7.5 yderligere to gange (celleopsamlingsrøret skal have 6 ml ved enden).
- Langsomt overføre opsamlingsrørindholdet til gradientrøret fremstillet i trin 4.2, hvorved gradientens forstyrrelse undgås.
- På dette tidspunkt fjernes det tidligere fremstillede neurobasale medium ( tabel 1 ) fra køleskabet og lader det varme op i et 37 ° C bad.
- Rens neuronerne.
- Centrifuger gradientrøret i 15 minutter ved 800 xg og 22 ° C.
- Saml det ønskede lag (er) med en pipette ( Figur 2 ), og anbring et nyt 15 ml rør. For neuro med højeste renhedN isolering ( dvs. > 90%), saml lag 3. For mere udbytte med mindre renhed ( dvs. > 70-80%), saml lag 2 & 3.
- Fortynd densitetsgradienten ved at tilsætte 5 ml HABG til de nyligt opsamlede lag.
- Centrifuger ved 200 xg i 2 minutter ved 22 ° C.
- Kassér supernatanten, resuspender i 5 ml HABG, og smør pelleten for at suspendere cellerne.
- Centrifuge ved 2 minutter 200 xg ved 22 ° C.
- Kassér supernatanten, resuspender i 3 ml neurobasalt medium og flip pelleten for at resuspendere cellerne.
- Tæl cellerne.
- Tag 10 μL af opløsningen, nu med celler i neurobasalt medium, og bland med 10 μL Trypan Blue.
- Anbring 10 μl af denne blanding i et glas tællingskammer.
- Tæller antallet af celler i hver af de fire 4 x 4 kvadranter ved hjælp af et standardtællingskammer. Tilføj alle de celler, der tælles (n), multiLag med 2 (fortyndingsfaktor) divideres med 4 (antal kvadranter talt) multipliceres med 3 (volumen neurobasalt medium) og multipliceres med 10 4 for at opnå koncentrationen af celler i celler / ml.
- Sæd cellerne på kulturplader
- Fortynd cellesuspensionen til 300.000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
BEMÆRK: Baseret på koncentrationen af celler opnået i ovenstående trin tilsættes yderligere neurobasalt medium for at opnå en slutkoncentration på 3 * 105 celler / ml. Ligningen er C1V1 = C2V2, hvor Ci er initialkoncentrationen af celler opnået fra høsten; V1 er 3 ml; Og C2 er 3 * 105 celler / ml som diskuteret ovenfor. Ligningen er løst for V 2 . Tilføj mængden af neurobasalt medium, der er nødvendigt for at gøre det totale volumen af celler i opløsning lig medV 2 . - Ryst forsigtigt for at fordele cellerne i opløsning og tilsæt 1 ml til hver brønd i de coatede 24-brøndsplader.
- Fortynd cellesuspensionen til 300.000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne teknik muliggør et enkelt kuld (4-10 pupper) isolering af 1-2,5 10 6 neuroner, der er egnede til såning på kulturplader. Typisk frøes 4-8 brønde ved den ovenfor nævnte koncentration ( dvs. 300.000 celler / ml). Figur 3 demonstrerer udseendet af neuroner ved denne koncentration efter en uge i kultur ved lav- ( a ) og høj- ( b ) forstørrelseslysmikroskopi. Vi har dog også været i stand til at dyrke celler i koncentrationer så højt som 500.000 celler / brønd og så lavt som 100.000 celler / brønd. Brug af højere koncentrationer kræver mere medium og omhyggelig opmærksomhed på miljøforhold, da næringsstoffer kan udtømmes hurtigt, hvilket fører til et giftigt surt miljø for cellerne. Med lavere koncentrationer har cellerne tendens til ikke at nå fuld modenhed, og en overvækst af støttende celler ( dvs. oligodendrocytter, miCroglia og astrocytter) observeres.
Cellerne vil typisk begynde at klæbe til overfladen inden for de første par timer ( figur 4a ). Axons begynder at spire inden for de første 24-48 timer ( Figur 4b -4c ). Forbindelser mellem forskellige neuroner i kultur når typisk modenhed efter 7 dage ( figur 4d ), på hvilket tidspunkt eksperimenter typisk udføres på neuronerne.
Neuroner er identificerbare under lysmikroskopi, da de har forskellige axonale fremspring. Vores isolationer ved hjælp af lag 3 ( figur 2 ) giver ~ 80-90% neuroner i kultur. Dette blev bekræftet under anvendelse af immunofluorescerende farvning af neuronspecifikke markører. I figur 5c er neuroncytoskeletalproteinet Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) sVist, viser konturer og axonale fremskrivninger af neuronerne efter en uge i kultur. På samme måde farves i figur 6c den neuronspecifikke nukleare markør NeuN, der viser neuronale kerner. Disse neuronmarkører er kombineret med billeddannelse af kerner (DAPI, Figur 5a , 6a ) og cytoplasma (GFP, Figur 5b , 6b ), og de resulterende billeder slås sammen ( Figur 5d , 6d ) og beskriver den relative overflade af neuroner til andre celler i kultur. Ved anvendelse af lag 2 og 3 er udbyttet af neuroner lidt højere; Der er imidlertid tendens til at være færre neuroner i den rene opløsning (~ 70%).
Figur 1: Spinal Column Dissected og Spinal Cord Udgivet fra en 3-dages Neonatal Mouse. DetPilen i ( a ) peger mod den kaudale ende af rygsøjlen, hvor en nål indsættes for at løsne rygmarven. En frigivet rygmarv ( b ) er vist nedsænket i PBS. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tæthedsgradient, med celler tilsat efter centrifugering. Lagene er skitseret og bedre visualiseret på tegneserieafbildningen. Det mest overfladiske lag (0) er generelt snavs fra rygmarvvævet. Lag 1 er rig på oligodendrocytter og astrocytter. Lag 2 og 3 indeholder størstedelen af neuroner. Mens lag 3 indeholder neuroner med højeste renhed, findes nogle understøttende celler ( dvs. astrocytter og oligodendrocytter) i lag 2. Den peLlet i bunden indeholder hovedsageligt mikroglialceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lysmikroskopi af neuronale cellekulturer efter 7 dages isolation. Ved 10X forstørrelse ( a ) kan der ses axonale forbindelser mellem forskellige konglomerater af neuroner. Ved 40X forstørrelse ( b ) kan neuronerne visualiseres nærmere med deres aksonale fremspring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Immunfluorescerende plet af neuroner ved anvendelse af neuronal cytoskeletal markør MAP2. Kernefarvning (DAPI) er vist i blå ( a ), med cytoplasmisk farvning (GFP) i grønt ( b ) og neuroncytoskeletalt protein (MAP2) i rødt ( c ). De fusionerede billeder ( d ) kombineres og viser den relative overflod af neuroner.Target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Immunfluorescerende plet af neuroner ved anvendelse af neuronal nukleær markør NeuN. Kernefarvning (DAPI) er vist i blå ( a ), med cytoplasmisk farvning (GFP) i grønne ( b ) og neuronale kerner (NeuN) i rød ( c ). De fusionerede billeder ( d ) kombineres og viser den relative overflod af neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medier | Opbevaring | ingredienser | Forberedelse | ||
| HABG | 4 ° C / 24 timer | 100 ml | - Tø B27 i 4 ° C køleskab O / N - Filtersterilisere (0,22 μm) | ||
| Hibernate A | 97,8 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Neurobasal Media | 4 ° C / 1 uge | 100 ml | - Tø B27 i 4 ° C køleskab O / N - Filtersterilisere (0,22 μm) - Aliquot 50 ml portioner i 50 ml rør (opbevares ved 4 ° C) | ||
| Neurobasal A | 97 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 ml | ||||
| Digestion Media | Isolationsdagen | 10 ml | - Ryst kraftigt - Lad det sidde i 37 ° C bad i 30 minutter (ideelt forberedt 30 min før brug) - Filtersterilisere (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 ml | ||||
| Papain | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
| Density Gradient | Isolationsdagen | 1 Gradient | |||
| Lag | OptiPrep | HABG | |||
| (0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
| 1 bund | 0,26 ml | 1,24 ml | |||
| 2 | 0,19 ml | 1,31 ml | |||
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml | |||
| 4 Top | 0,11 ml | 1,39 ml | |||
Tabel 1: Forberedelse af medier og løsninger, der anvendes i denne protokol.
| Coating Substrate | Opbevaring | ingredienser | Forberedelse | |
| PDL | Fryse-optø en gang | Poly-D-Lysinhydrobromid | 5 mg | - Aliquot 4 ml i 15 ml rør og opbevar straks i -20 ° C - 0,5 ml / brønd (brønd med 24 brønde) |
| Sterilt vand | 50 ml | |||
| Laminin | Belægningsdag | Laminin (1 mg / ml) | 80 μl | - Nok til 8 brønde i en 24-brønds plade - 0,35 ml / brønd (brønd med 24 brønde) |
| Neurobasal Medium | 2,72 ml | |||
Tabel 2: Fremstilling af belægningsunderlaget anvendt til at belægge brøndene, hvorpå neuronerne dyrkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik muliggør den pålidelige kultur af rygmarvsneuroner. Når færdigheder i teknikken er nået, tager det cirka 3,5 timer at afslutte. Vi har været i stand til at udføre isolationen af neuroner fra 2 separate kuldarter (16 mus totalt) om cirka 4 timer. Nøglefasen i gennemførlighed er i stand til at uddrage spinalkablerne effektivt fra musene. Udbyttet tillader plating af flere brønde og for evnen til at teste neuronerne under forskellige betingelser. Vi har været i stand til at behandle neuronerne efter modenhed og pålideligt evaluere proteinekspression ved hjælp af Western blot-analyse. Endvidere tillader anvendelse af glasskinner i brøndene til neuronvedhæftninger den yderligere farvningsanalyse af neuronerne.
Denne fremgangsmåde er fordelagtig, idet den ikke kræver embryonalt væv og den tilhørende arbejdsstyrke. Desuden er det ikke nødvendigt at bruge voksne rygkabel til at samle nok væv til tilstrækkeligE neuron isolation. Dette forhindrer faktor i aldersforbedringsadfærd i neuronfysiologi, som set hos voksne mus. Denne teknik er imidlertid ikke uden begrænsninger. Som tidligere nævnt udelukkes alderen neuroner ved brug af neonatale mus, og dette kan være en begrænsning, hvis aldersrelateret adfærd og biologi er undersøgelsesområdet. Der er en læringskurve til proceduren, som ikke kun er nødvendig for at optimere udbyttet, men for at sikre, at de isolerede neuroner er sunde. Rygmarvsekstraktionsteknikken kan tage lidt tid at mestre, især med nyfødte mus. Vi har bemærket, at langvarig tid i forbindelse med ekstraktionen af rygmarvene fører til neuroner, der kan dyrkes i en væsentligt kortere periode. Dette lindres noget af placeringen af neuroner på isen; Men tiden spiller stadig en central rolle.
Der er nøgle trin i proceduren, der hjælper med at sikre det optimale udbytte af neuroner. Hvis neuronudbyttet ikke er som eXpected, et par trin bør evalueres. For det første bør antallet af rygmarv helst være over 4. Når der anvendes 3 spinalkabler eller mindre, er udbyttet sædvanligvis mindre end 1 million neuroner. Tilstrækkelig fremstilling af fordøjelsesmediet skal sikres (trin 4.5). At forlade vævet i for lang tid i fordøjelsesmediet vil forårsage for stor nedbrydning af celler, mens anvendelse af fordøjelsesmedium, som ikke er blevet aktiveret ved 37 ° C, vil resultere i færre isolerede neuroner. Endelig skal triturationsteknikken (trin 4.7) udføres med præcision. Lavt udbytte skyldes normalt utilstrækkelig triturering. En god indikator er at se, om opløsningen bliver overskyet under triturationen - hvis dette ikke sker, er det sandsynligt, at triturationen er for blid.
Hvis udbyttet er som forventet, men neuronerne ikke ser ud til at regenerere processer inden for de første 1-2 dage, er problemet normalt en fejl ved korrekt belægning med enten utilstrækkelig vaskEller tørring (trin 2.2). Hvis cellerne oprindeligt projekterer processer, men efterfølgende bliver apoptotiske inden 5-7 dages mark, kan der være flere problemer. Først skal du sørge for, at HABG-opløsningen fremstilles inden for 24 h isolering, og at det nye B27-tilskud, der er blevet optøet på samme dag, af HABG-præparatet, anvendes. Antioxidanterne i dette tilskud skal være friske og ikke udgået. Derefter skal du sikre dig, at der ikke introduceres bobler under triturationsprocessen (trin 4.7). Indførelsen af luftbobler bidrager til dette problem og kan relateres til tørring af neuroner. Sørg også for, at kulturen ikke er overvældet af forurening, hvilket kan tilskrives svigt i sterilitet.
Her beskriver vi brugen af 24-brøndsplader hvorpå frøet neuronerne kan frøes. Nogle gange er det nødvendigt at udføre tids- og / eller doseringsforsøg, f.eks. Ved anvendelse af farmakologiske midler. Teknikken kan modificeres, og neuronerne kan podes på 48-brønds plAtes i stedet. Da overfladearealet af en brønd i en 48-brønds plade er halvdelen af den i en brønd på 24 brønde, skal mængderne af belægningsopløsninger, der anvendes, skæres i halvdelen. Cellerne skal også belægges ved halvdelen af volumenet ( dvs. 0,5 ml i stedet for 1,0 ml). Imidlertid bør deres koncentration forblive den samme ( dvs. 1-5 x 105 celler / ml). Mens denne undersøgelse er blevet udført ved anvendelse af C57BL / 6-mus, bør teknikken anvendes over andre genetisk manipulerede stammer.
Rygmarvs-iskæmi og beskyttelse er et område med voksende interesse 12 , 13 , 14 . Klinisk kan thoracoabdominal aorta-kirurgi resultere i ødelæggende lammelse relateret til rygmarvs-iskæmi og reperfusion, hvis patofysiologi forbliver fuldstændig forstået 15 , 16 . Forstå hvordan neuroner reagerer på thE stress af iskæmi er mulig ved hjælp af denne model. Vores gruppe har tidligere offentliggjort rygmarvsneuronskader relateret til iskæmisk krænkelse gennem oxygenglukoseafvigelse ved anvendelse af denne teknik 17 . Modellen er også blevet udvidet til at omfatte astrocytterkulturen, adskilt fra neuroner 18 .
Afslutningsvis er denne teknik værdifuld for undersøgelsen af rygmarvspatofysiologi og neuronal mikrobiologi. Den serumfri kultur giver mulighed for præcis miljøkontrol. Det muliggør direkte adgang til anvendelse af farmakologiske midler. Kombineret med yderligere teknikker, som f.eks. Iltglucosepåvirkning, kan denne teknik være nyttig til at udvide vores forståelse af patofysiologien af determinantal rygmarvs-iskæmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
