Summary
Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.
Abstract
Spinal kord nöronlarının izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunmaktayız. Nöronlar yenidoğan C57BL / 6 farelerinden elde edilir ve 1-3 doğum sonrası izole edilir. Bir fare çöpü, genellikle bir üreme çiftinden doğan 4-10 yavru, bir deney için toplanır ve izofluran ile ötenazi yapıldıktan sonra omurilik kordları her fareden ayrı ayrı toplanır. Spinal kol disseke edilir ve omurilik o kolondan salınır. Omurga kordonları nöronların ve diğer hücrelerin dokudan salınmasına izin veren bir enzimatik proteaz için teslimat yüzey alanını arttırmak üzere kıyılır. Tritürasyon daha sonra hücreleri çözeltiye boşaltmak için kullanılır. Bu çözelti, daha sonra, nöronların izole edilmesine olanak tanıyan, çözeltideki çeşitli hücreleri ayırmak için bir yoğunluk derecesinde fraksiyon haline getirilir. Bir çöp grubundan yaklaşık 1-2.5 x 106 nöron izole edilebilir. Nöronlar daha sonra yapışkanlı fiillerle kaplanmış oyukların üzerine serilirUygun gelişme ve olgunlaşma için izin verilen rs. Nöronlar büyüme ve kültür ortamında olgunluğa erişmek için yaklaşık 7 gün alır ve bundan sonra tedavi ve analiz için kullanılabilir.
Introduction
Spinal kord patolojisini anlamak, makroskopik ve mikroskobik seviyelerde çeşitli modellerin kullanılmasını gerektirir. Büyük ve küçük hayvan modelleri 1 , 2 , 3 spinal kord hastalığının ve yaralanmasının in vivo araştırmalarında kullanılır. Bu sorunların in vivo incelenmesi esastır ancak omurilik analizi, tüm omurilik homojenatı veya doku kesitleri 4 ile sınırlıdır. Bu, var olan nöronlar ve çevresindeki glialar arasında omurilikteki spesifik tepkileri ve hedefleri ayırmaya çalışırken bazı belirsizlik yaratır. Genetik olarak manipüle edilmiş farelerin artan miktarda bulunması, biyolojinin hücresel ve moleküler seviyelerde daha ayrıntılı araştırılmasına olanak tanır. Böylece, in vitro omurilik nöronlarının benzersiz özelliklerini ve biyolojisini incelemek için, burada neonatal bir fare modeli kullanılır.
In vitro olarak nöronların izolasyonu ve bakımı özellikle net değildir Yetişkin kemirgenlerin korteks dokusundan nöron tecrit teknikleriyle nispeten bol miktarda izole nöron ( yani milyonlarca) elde edilmesi beklenir , 6 , 7. Bunun aksine, omurilik dokusundan alınan nöronların verimi, daha az doku kütlesi nedeniyle kısmen 8 , 9 , 10'dur . Ayrıca, farelerde, yenidoğanın izolasyonu için teknikler göreceli olarak az sayıdadır Omurilik nöronları ve mevcut yöntemler, daha düşük nöron verimleri (yüzlerce) veya embriyonik farelerin izolasyonunu gerektiren zahmetli ve ağır kaynaklı tekniklerle sınırlıdır 10 .Bu protokolde,Yenidoğan farelerinin spinal kordlarından önemli miktarda nöronun maliyet ve kaynak etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayan bir teknik kullanın. Daha önce yayınlanan tekniklerde yaygın olarak görüldüğü gibi papain enzimatik bir proteaz olarak kullanılmaktadır ve 5 , 6 omurilik dokusundan nöronların salınmasına izin vermektedir. Ek olarak, rafine edilmiş hücre ayrıştırması için daha önce etkili olduğu 6,10 olduğu gösterilen yoğunluk derecesini kullanıyoruz. Hücrelerin inkübe edildiği ortam tecrübemiz ve daha önce yayınlanan 11'de farklılık gösterse de, taze B27 kültürü takviyesi takviyesi, nöron ömrü için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Nöronlar, tipik olarak, tedavinin yapılmasına olanak tanıyan 10 gün boyunca uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedürdeki hayvanlara bakım ve tedavi, Colorado Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. Çözüm Hazırlama
- Tüm çözeltileri, Tablo 1'de gösterildiği gibi uygun sıcaklıklarda hazırlayın ve saklayın.
2. Kaplama Kuyuları ve Slaytlar
NOT: Nöronlar plastik veya cam yüzeylere iyi yapışmamaktadır.
- Nöronların izolasyonundan bir gün önce steril 24-çukurlu bir kültür plakasının kuyularını 0.5 mL Poly-D-Lysine (PDL, Tablo 2 ) ile kaplayın ve O / N'lik bir laminer akış kapağında bırakın.
NOT: Tercih edilen yöntem, 24 delikli plakalar kullanmak ve yalnızca çevre kuyularını kaplamaktır, zira periferik kuyulardan buharlaşma daha hızlanmaya ve tutarsız sonuçlara neden olma eğilimindedir. Ek olarak, cam slaytlar kuyulardan önce yerleştirilebilirO kaplama. Nöronlar kaplanmış cam slaytlara tutturulacak ve daha ileri mikroskobik görüntüleme için daha sonra çıkarılabilecektir . - İzolasyon gününde PDL'yi kuyulardan çıkarın. Kalan suyu çıkarmadan ve 1 saat boyunca kurumaya bırakmadan önce steril suyla birkaç dakika yıkayın (aşağıya bakınız).
- Kurumadan sonra, slaytları laminin ile kaplayın ( Tablo 2 ).
NOT: Yaklaşık olarak 10 μL laminin (10 μg / μL) steril 24 gözlü plakanın her bir kuyusunun kaplanması için yeterlidir. Bu, 340 ul'lik ortamla (toplam hacim: 350 | iL) karıştırılır ve böylece tüm kuyu kaplanır. Bir kültür kaputunda oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve daha sonra hücreleri kaplamadan önce aspire edin.
3. Omurga Kordonlarının Hasat Edilmesi
NOT: Bütün cihazlar sterilizasyon için otoklavda (135 ° C ve 30 psi 4 x 7 dakika çevrim) yapılmalıdır.
- 1-3 yaşındaki C57BL / 6 fare yavrularını isofluran içeren bir odasında euthanize edin. BekleyinHareketsizlikten 30 saniye sonra ve yanıt eksikliğini teyit etmek için bacağınızı sıkıştırın.
- Başı makas kullanarak vücudundan ayırın, yavru eğilimli konumdadır.
- Arka bacakları veya kuyruk ve kolları dorsal yüzü kullanıcıya bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin.
- Kıvrımlı iris makası kullanarak cildi kesin.
- Omurganın kalçanın hemen üstündeki omurilik bölgesinden kesin ve vücudunuzdan ayırmak için göğüs kafesinin her iki tarafını kesmeye devam edin.
NOT: Bu, organların istem dışı hasar görmesini önlemek için omuriliğin visseral organlardan dikkatli bir şekilde parçalanmasını gerektirir ( Şekil 1a ). - Fazla doku kaldırmak için 5 mL 0.2 μm filtre sterilize Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içeren 3 x 10 cm Petri kaplarında 10 s boyunca sırayla yıkayın.
- Spinal kolonun kaudal ucuna 5 mL'lik filtre ile sterilize edilmiş PBS ile dolu 22 G'lik bir iğne ve şırınga yerleştirin ve kranial olarak yıkayın, böylece kordonunO dördüncü bir Petri kabına çıkın ( Şekil 1b ).
- Buz üzerinde 5 mL HABG ( Tablo 1 ) ile 15 mL tüp içinde omurilik toplamak. Omurganın ezilmesini önlemek için dikkatli olun.
- Çöp kutusundaki her yavru için 3.1-3.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: İdeal olarak, sağlıklı nöron izolasyonu sağlamak için bu işlem omurilikte 30 dakikadan az sürmelidir.
4. İzole Edici Nöronlar
NOT: Aşağıdaki adım laminer bir akış davlumbazında yapılmalıdır. Temel steril teknik hakkında bilgi sahibi olması beklenir.
- Doku Mincing
- Omurilik kordonlarını içeren tüpü alın ve dokuyu askıya almak için hafifçe sallayın.
- Tüpteki dokuları 60 mm'lik bir cam Petri kabına dökün ve ~ 0.5 mm boyutlarında ince parçalar oluşturmak için tıraş bıçağı ile zar atın.
- 5 mL HABG içeren 15 mL'lik bir tüp içine geniş çaplı bir pipetle dokuyu aktarın.
- Koyun birHücrelerin bu sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 30 ° C su banyosu. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlayacak kadar çalkalayıcıda tutun.
NOT: Bu adım, buzun sindirim ortamına aktarılması üzerine hücrelerin şok edilmesini önlemek için yapılır. Hücreleri 30 ° C'de tutmak, 37 ° C'de aksi halde artmış bir metabolizma ile ilişkili hücre ölümünü azaltmaya yardımcı olur.
- Sindirim ortamını hazırlayın ( Tablo 1 ).
- Yoğunluk gradyanını hazırlayın (Tablo 1).
- Tablo 1'de özetlendiği gibi, 4 tabakanın her birini 4 ayrı 15 mL'lik tüp içinde hazırlayın.
- Her katmandan yeni bir 15 mL tüp içine 1 mL ekleyin. Alt katman 1 ile başlayın ve üst katman 4'e ulaşana kadar ard arda ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmeyin.
- Adım 2.2 PDL kaplı plakaları yıkayın. Kalan suyunu çıkarmadan önce steril su ile birkaç dakika yıkayın ve1 saat kurumalarını bekleyin.
- Sindirim ortamına doku aktarın.
- 30 ° C'de çalkalayıcı su banyosundan doku içeren tüpü çıkartın ve birkaç dakika yerleşmesine izin verin.
- Sindirim ortamı tüpünü 37 ° C su banyosundan çıkarıp bir leur-lock şırınga içine aspire edin.
- Fazla HABG'yi doku içeren tüpün içinden aspire edin.
- Doku içeren tüp içine sindirim ortamı eklemek için şırınga üzerine 0.2 um'lik bir filtre kullanın.
- Tüp, 30 ° C'lik bir su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirilir. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlamak için yeterince çalkalamayın.
NOT: Sindirim ortamındaki hücreleri çok uzun süre tutmamak veya sıcaklığın aşırı yükselmesine izin vermek, aşırı sindirime neden olabilmek ve dokunun jelatinimsi bir karışımda süspanse edilmesine neden olmak önemlidir.
- Bu süre zarfında, adım 2.3'deki gibi lamininini kaplayın. <Li> Öğütme yapın ( örn . Hücreleri dokudan ayırma).
- Tüpü çalkalayan 30 ° C su banyosundan çıkarıp birkaç dakika yerleşmesine izin verin.
- Aşırı sindirim ortamını aspire.
- 2 mL HABG'de dokuyu askıya alınız.
- Dar gözlü bir pipet kullanarak, 45 s boyunca 10x öğüt.
NOT: Bu muhtemelen en önemli tek adımdır ve düzgün yapılmazsa verimi önemli ölçüde düşürebilir.- Doku pipet içine aspire ve içeriğini hemen boşaltın.
- Havayı sunmaktan kaçının; çünkü canlı verimi önemli ölçüde düşürecektir.
NOT: İdeal pipet 9 inçlik bir cam pipettir Pipetin ucu pürüzlü yüzeyleri düzeltmek için ateşle cilalanmalıdır Daha sonra 1: 20 kloroformda diklorodimetilsilan (DMDCS) solüsyonu içine yerleştirilerek silikon hale getirilmeli ve kloroformda / N Sonra pipet çıkarılmalı ve hava kurumasına bırakılmalıdır.Sterilizasyon için otoklav yapılmalıdır.
Dikkat: DMDCS ve kloroform oldukça yanıcıdır ve silikonlama bir duman davlumbazında yapılmalıdır.
- Süpernatanın üst 2 mL'sini aspire edin ve "koleksiyon" etiketli yeni bir 15 mL tüp içine yerleştirin.
- 4.7.3-4.7.5 adımlarını iki kez tekrarlayın (hücre toplama tüpünün sonunda 6 mL olmalıdır).
- Gradyan bozulmasından kaçınarak, toplama tüpünün içeriğini adım 4.2'de hazırlanan gradyan tüpüne yavaşça aktarın.
- Bu noktada, buzdolabından önceden hazırlanmış nörobazal ortamı ( Tablo 1 ) çıkarın ve 37 ° C'lik bir banyoda ısıtmasına izin verin.
- Nöronları arındırın.
- Degrade tüpü, 800 xg ve 22 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- İstenen tabakayı bir pipetle toplayın ( Şekil 2 ) ve yeni bir 15 mL'lik tüp içine yerleştirin. En saflıklı nöro içinN izolasyonu ( yani >% 90), katman 3 toplamak. Daha az saflık ( yani >% 70-80) olan daha fazla verim için katmanları 2 ve 3 toplamak.
- Yeni toplanan tabakalara 5 mL HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını inceltin.
- 22 ° C'de 2 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın, 5 mL HABG'de tekrar süspanse edin ve hücreleri askıya almak için pelletini oynatın.
- 22 ° C'de 2 dakika 200 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın, 3 mL nörobazal ortamda tekrar süspansiyon haline getirin ve hücreleri tekrar süspansiyon haline getirmek için pelletini oynatın.
- Hücreleri sayın.
- Şimdi nörobazal ortamda hücrelerle 10 mcL solüsyon alın ve 10 mcL Tripan mavisi ile karıştırın.
- Bu karışımın 10 mcL'sini cam sayım odacığına yerleştirin.
- Standart bir cam sayım odası kullanarak, dört dörtlü kadranın her birindeki hücre sayısını hesaplayın. Sayılan tüm hücreleri ekleyin (n), çoklu(Seyreltme faktörü) çarpın, 4'e bölün (sayılan kadrandaki sayı), 3 ile çarpın (hücre hacmi / mL cinsinden hücre konsantrasyonu elde etmek için 104 ile çarpın.
- Kültür plakalarının üzerindeki hücreleri tohumluyor
- Hücre süspansiyonunu 1 mL nörobazal ortamda 300.000 hücreye seyreltin.
NOT: Yukarıdaki adımlarda elde edilen hücrelerin konsantrasyonuna dayanarak, nihai konsantrasyon 3 x 105 hücre / mL elde etmek için ilave nörobazal ortam ilave edilir. Denklem C 1 V 1 = C 2 V 2 , burada C 1 hasattan elde edilen hücrelerin başlangıç konsantrasyonudur; V 1 , 3 mL; Ve C2 yukarıda tarif edildiği gibi 3 x 105 hücre / mL'dir. Denklem V2 için çözülmüştür. Çözeltideki toplam hücre hacminin eşit olması için gerekli nevrobazal hacim birimini ekleyinV 2 . - Hücrelerin çözeltiye dağıtılması için hafifçe çalkalayın ve kaplanmış 24 delikli tabakların her kuyucuğuna 1 mL ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu 1 mL nörobazal ortamda 300.000 hücreye seyreltin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniği kullanarak, tek bir çöp (4-10 yavru), kültür plakalarına eklenmeye uygun 1-2.5-106 nöronların izolasyonuna olanak tanır. Tipik olarak, 4-8 oyuk yukarıda belirtilen konsantrasyonda tohumlanır ( yani 300.000 hücre / mL). Şekil 3 , düşük ( a ) ve yüksek ( b ) büyütme ışık mikroskopisinde kültürde bir hafta sonra nöronların bu konsantrasyonda görünüşünü göstermektedir. Bununla birlikte, aynı zamanda 500,000 hücre / kuyu ve 100,000 hücre / kuyucuk kadar düşük konsantrasyonlarda kültür hücreleri yapabildik. Yüksek konsantrasyonları kullanmak, besin maddeleri çabucak tüketilebileceğinden, hücreler için zehirli asidik bir çevreye neden olduğundan, ortam koşullarına daha dikkatli ve dikkatli bir şekilde dikkat etmek gerekir. Düşük konsantrasyonlarda hücreler, tam olgunluğa ulaşmamakta ve destekleyici hücrelerin aşırı büyümesine eğilimli olmaktadır ( yani oligodendrositler, miKrolia ve astrositler) gözlenmektedir.
Hücreler tipik olarak ilk birkaç saat içinde yüzeye yapışmaya başlar ( Şekil 4a ). Aksonlar, ilk 24-48 saat içinde filizlenmeye başlayacaktır ( Şekil 4b -4c ). Kültürdeki çeşitli nöronlar arasındaki bağlantılar normal olarak 7 gün içinde olgunluğa ulaşır ( Şekil 4d ), bu noktada deneyler tipik olarak nöronlar üzerinde gerçekleştirilir.
Farklı aksonal projeksiyonlara sahip oldukları için, nöronlar ışık mikroskobunda tanımlanabilir. Katman 3'ü ( Şekil 2 ) kullanarak izolasyonlarımız kültürde ~% 80-90 nöron verir. Bu nörona spesifik belirteçlerin immünofloresan boyaması kullanılarak teyit edildi. Şekil 5c'de , nöron sitoskeletal protein Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) sKültürde bir hafta sonra nöronların anahatlarını ve aksonal projeksiyonlarını gösteren kutuplar. Benzer şekilde, Şekil 6c'de nörona özgü nükleer işaretleyici NeuN boyandı ve nöronal çekirdekler gösterdi. Bu nöronal belirteçler, çekirdek (DAPI, Şekil 5a , 6a ) ve sitoplazma (GFP, Şekil 5b , 6b ) görüntüleme ile birleştirilir ve nihai görüntüler birleştirilir ( Şekil 5d , 6d ), nöronların diğer hücrelere göreceli olarak bolluk detaylandırılması kültür. Katman 2 ve 3 kullanıldığında, nöronların verimi biraz daha yüksek; Bununla birlikte, saf çözeltide daha az sayıda nöron bulunur (~% 70).
Şekil 1: Diseksiyonlanmış Spinal Kolon ve Spinal Kord, 3 günlük Yenidoğan Fare'den çıkarılmıştır.( A ) 'daki ok, omurili serbest bırakmak için bir iğne takıldığında omurganın kaudal ucuna işaret eder. Serbest bırakılmış bir omurilik ( b ), PBS içine batırılmış olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Santrifüj Sonrası Eklenen Hücrelerle Yoğunluk Derecesi. Çizgi film tasvirinde katmanlar ana hatlarıyla çizilmiş ve daha iyi görüntülenmiştir. En yüzeysel tabaka (0) genellikle omurilik dokusundan çıkan artıktır. Katman 1 oligodendrositler ve astrositler bakımından zengindir. Katmanlar 2 ve 3, nöronların çoğunu içerir. Katman 3, en yüksek saflığa sahip nöronları içeriyken, katman 2'de bazı destekleyici hücreler ( örn., Astrositler ve oligodendrositler) bulunur. PeAlt kısmında esas olarak mikroglial hücreler bulunur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: 7 Gün İzolasyondan Sonra Nöronal Hücre Kültürlerinin Işık Mikroskopisi. 10X büyütmede ( a ) nöronların çeşitli konglomeraları arasındaki aksonal bağlantılar görülebilir. 40X büyütmede ( b ), nöronlar aksonal projeksiyonlarıyla daha yakından görselleştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Nöronal Sitoskeletal Markör MAP2 Kullanan İmmünofloresan Nöron Lekesi. Nükleer boyama (DAPI) yeşil ( b ) sitoplazmik boyama (GFP) ve kırmızı renkli nöron sitoskeletal protein (MAP2) ile mavi ( a ) ile gösterilir ( c ). Birleştirilmiş görüntüler ( d ) nöronların nispeten bolluğunu gösteren bir araya getirilir.Target = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Nöronal Nükleer İşaretleyiciyi Kullanan İmmunofloresan Boyalı Leke NeuN. Nükleer boyama (DAPI) yeşil ( b ) sitoplazmik boyama (GFP) ve kırmızı renkli nöronal çekirdekler (NeuN) ile mavi ( a ) ile gösterilir ( c ). Birleştirilmiş görüntüler ( d ) nöronların nispeten bolluğunu gösteren bir araya getirilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| medya | Depolama | malzemeler | Hazırlık | ||
| HABG | 4 ° C / 24 saat | 100 mL | - B27'yi 4 ° C buzdolabında 0 ° C'de çözülmüş O / N - Filtre sterilizasyonu (0.22 μm) | ||
| Hibernate A | 97.8 mL | ||||
| B27 [% 2] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL | ||||
| Neurobasal Medya | 4 ° C / 1 hafta | 100 mL | - B27'yi 4 ° C buzdolabında 0 ° C'de çözülmüş O / N - Filtre sterilizasyonu (0.22 μm) - 50 mL'lik bölümleri 50 mL'lik tüplere alın (4 ° C'de saklayın) | ||
| Neurobasal A | 97 mL | ||||
| B27 [% 2] | 2 mL | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL | ||||
| Kalem / Strep [% 1] | 1 mL | ||||
| Sindirim Ortamı | İzolasyon Günü | 10 mL | - Titri çalkala - 30 dakika boyunca 37 ° C'de bekletin (kullanımdan 30 dakika önce hazırlanmış) - Filtre sterilizasyonu (0.22 μm) | ||
| HA-Ca- | 10 mL | ||||
| Papain | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.025 mL | ||||
| Yoğunluk Dereceli | İzolasyon Günü | 1 Gradient | |||
| tabaka | OptiPrep | HABG, | |||
| (0.13 mL) | (5.29 mL) | ||||
| 1 Alt | 0.26 mL | 1.24 mL | |||
| 2 | 0.19 mL | 1.31 mL | |||
| 3 | 0.15 mL | 1.35 mL | |||
| 4 Üstü | 0.11 mL | 1.39 mL | |||
Tablo 1: Bu Protokol'de Kullanılan Ortamların ve Çözümlerin Hazırlanması.
| Kaplama Yüzey | Depolama | malzemeler | Hazırlık | |
| PDL | Bir kez donma çözülme | Poly-D-Lizin Hidrobromür | 5 mg | - 15 ml'lik tüplere 4 ml'lik kısım alınır ve hemen -20 ° C'de depolanır. - 0.5 mL / oyuk (24 gözlü plaka) |
| Steril Su | 50 mL | |||
| laminin | Kaplama günü | Laminin (1 mg / mL) | 80 μL | - 24 delikli bir plakada 8 göz için yeter - 0.35 mL / oyuk (24 oyuklu plaka) |
| Neurobasal Ortamı | 2.72 mL | |||
Tablo 2: Nöronların Kültürlendiği Kuyuları Kaplamak İçin Kullanılan Kaplama Yüzeylerinin Hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik, omurilik nöronlarının güvenilir bir şekilde kültürlenmesine izin verir. Teknik yeterlilik elde edildiğinde, tamamlanması yaklaşık 3,5 saat sürer. Nöronların izolasyonunu, yaklaşık 4 saat içinde 2 ayrı çöpten (toplam 16 fare) gerçekleştirebildik. Fizibilitedeki ana adım, omurilik kablolarını farelerden ayıklamaktır. Verim, çeşitli kuyucukların kaplanmasına ve çeşitli koşullar altında nöronların test edilmesine imkan verir. Olgunlaşma sonrasındaki nöronları tedavi edebildik ve Western leke analizi ile protein ekspresyonunu güvenilir bir şekilde değerlendirebildik. Ayrıca, nöron ekleri için kuyuların içine cam slaytlar kullanarak, nöronların daha da boyanarak analiz edilmesini sağlar.
Bu prosedür, embriyonik doku ve buna bağlı emek yoğunluğunu gerektirmediğinden avantajlıdır. Dahası, yeterlilik için yeterli miktarda doku toplamak için yetişkin omurilik kordlarının kullanılması gerekli değildirE nöron izolasyonu. Bu, yetişkin farelerde görüldüğü gibi nöron fizyolojisinde yaş bileşimi davranış faktörünü önler. Ancak bu teknik sınırlamalı değildir. Daha önce de belirtildiği gibi, yaşlanmış nöronlar yenidoğan fareleri kullanılarak dışlanır ve yaşla ilişkili davranış ve biyoloji soruşturma alanı olması durumunda bunun bir sınırlaması olabilir. Prosedür için, sadece verimi optimize etmek için değil, izole edilmiş nöronların sağlıklı olmasını sağlamak için de bir öğrenme eğrisi vardır. Omurga çıkarma tekniği, özellikle yeni doğan farelerde ustalaşmak için biraz zaman alabilir. Omurilik kordonlarının ekstraksiyonuyla ilişkili uzatılmış zamanın, daha kısa bir süre için kültürlenebilen nöronlara yol açtığını fark ettik. Bu, nöronların buz üzerinde tutulması ile bir miktar hafifletilir; Ancak, zaman hala önemli bir rol oynamaktadır.
Prosedürde, nöronların optimum verimini sağlamaya yardımcı olan önemli adımlar vardır. Nöron verimi e kadar değilseXpected, birkaç adım değerlendirilmelidir. İlk olarak, omurilik kordonlarının sayısı ideal olarak 4'ten fazla olmalıdır. 3 omurilik kordundan daha azı kullanıldığında, verim genellikle 1 milyondan daha az nörondan daha azdır. Sindirim ortamının yeterli hazırlığı sağlanmalıdır (adım 4.5). 37 ° C'de aktive edilmemiş sindirim ortamını kullanırken, sindirim ortamında dokuyu çok uzun süre bırakmak, hücrelerin aşırı derecede parçalanmasına neden olurken daha az izole nöron ile sonuçlanır. Son olarak, öğütme tekniği (adım 4.7) kesin bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Düşük verim genellikle yetersiz tritürasyondan kaynaklanır. İyi bir gösterge, çözeltinin öğütülmesi sırasında solüsyonun bulutlu olup olmadığının görülmesidir - eğer böyle olmazsa, öğütmenin çok yumuşak olması muhtemeldir.
Verim beklendiği gibi olmasına rağmen, nöronlar ilk 1-2 gün içinde süreçleri yeniden üretmek zorunda kalmazlarsa sorun, uygun kaplamada başarısızlıktır ya yetersiz yıkamaVeya kurutma (adım 2.2). Hücreler başlangıçta süreçler tasarlarlar, ancak daha sonra 5-7 günlük işaretten önce apoptotikleşirlerse, birkaç sorun olabilir. İlk olarak, HABG solüsyonunun 24 saatlik izolasyonda hazırlandığından ve HABG hazırlama işleminin aynı gününde çözülen yeni B27 ekinin kullanıldığından emin olun. Bu ekteki antioksidanlar taze olmalı ve süresi dolmamalıdır. Sonra öğütme işlemi sırasında kabarcıkların oluşmadığından emin olun (adım 4.7). Hava kabarcıkları girişi bu konudaki katkılardan dolayı nöronların kurutulmasıyla ilgili olabilir. Ayrıca, kültürün sterildeki başarısızlıklara atfedilebilecek bulaşma ile dolup taşmadığından emin olun.
Burada nöronları tohumlamak için 24 delikli plakaların kullanımını açıklıyoruz. Bazen farmakolojik ajanlar kullanılırken olduğu gibi zaman ve / veya doz denemeleri yapmak gereklidir. Teknik değiştirilebilir ve nöronlar 48-kuyucuğaOnun yerine. 48 oyuklu bir plakadaki bir kuyunun yüzey alanı, 24 oyuklu bir plakadaki kuyunun yüzölçümü olduğundan, kullanılan kaplama çözeltilerinin hacimleri yarı yarıya kesilmelidir. Hücrelerin de yarım hacimde kaplanması gerekir ( yani 1.0 mL yerine 0.5 mL). Bununla birlikte, konsantrasyonları aynı kalmalıdır ( örn. 1-5 x 10 5 hücre / mL). Bu çalışma C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilse de, teknik, genetik olarak manipüle edilmiş diğer soylar için de geçerli olmalıdır.
Spinal kord iskemi ve korunması, artan bir ilgi alanı 12 , 13 , 14'tür . Klinik olarak, torakoabdominal aort cerrahisi, spinal kord iskemisi ve reperfüzyon ile ilgili yıkıcı felce neden olabilir ve patofizyolojisi tam olarak anlaşılacaktır 15,16. Nöronların bu konularda nasıl tepki vereceğini anlamaBu model kullanılarak iskemi stresini uygulamak mümkün olur. Grubumuz daha önce bu tekniği kullanarak oksijen glikozu yoksunluğu yoluyla iskemik hasara bağlı omurilik nöronal hasarını yayınlamıştır 17 . Model ayrıca, nöronlardan ayrı, astrosit kültürü de içerecek şekilde genişletildi 18 .
Sonuç olarak, bu teknik omurilik patofizyolojisi ve nöronal mikrobiyoloji çalışması için değerlidir. Serumsuz kültür ortamı hassas bir şekilde kontrol etmenizi sağlar. Farmakolojik ajanların uygulanması için doğrudan erişim sağlar. Oksijen glikozu yoksunluğu gibi ek tekniklerle bir araya getirilen bu teknik, determinant omurilik iskemisinin patofizyolojisini anlamamıza yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklamaları yok.
Acknowledgments
Yazarların onayları yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
