Summary
Denna studie presenterar en teknik för isolering av neuroner från WT-neonatala möss. Det kräver noggrann dissektion av ryggmärgen från neonatalmusen, följt av separering av neuroner från ryggmärgsvävnaden genom mekanisk och enzymatisk klyvning.
Abstract
Vi presenterar ett protokoll för isolering och kultur av ryggmärgsneuroner. Neuronerna erhålls från neonatal C57BL / 6 möss och isoleras på postnatal dag 1-3. En muskull, vanligtvis 4-10 valpar födda från ett avelspar, samlas in för ett försök, och ryggraden samlas individuellt från varje mus efter eutanasi med isofluran. Ryggraden dissekeras och sedan frigörs ryggmärgen från kolonnen. Spinalkablarna mals sedan för att öka ytan av leverans för ett enzymatiskt proteas som tillåter att neuronerna och andra celler frigörs från vävnaden. Trituration används sedan för att frigöra cellerna i lösning. Denna lösning fraktioneras därefter i en densitetsgradient för separation av de olika cellerna i lösning, vilket möjliggör för neuroner att isoleras. Cirka 1-2,5 x 106 neuroner kan isoleras från en kullgrupp. Neuronerna utsöndras sedan på brunnar belagda med adhesiv factoRs som möjliggör riktig tillväxt och mognad. Neuronerna tar cirka 7 dagar för att nå mognad i tillväxt och odlingsmedium och kan därefter användas för behandling och analys.
Introduction
Förståelse av ryggmärgspatologi kräver användning av olika modeller, både på makroskopiska och mikroskopiska nivåer. Stora och små djurmodeller 1 , 2 , 3 används för in vivo undersökningar av ryggmärgs sjukdom och skada. Samtidigt som man studerar dessa problem in vivo har dess fördelar är analys av ryggmärgen begränsad till hela ryggmärgshomogenatet eller till vävnadssektionerna 4 . Detta skapar viss tvetydighet när man försöker isolera specifika svar och mål i ryggmärgen bland sina inhemska neuroner och omgivande glia. Den ökande tillgängligheten av genetiskt manipulerade möss möjliggör mer detaljerade undersökningar av biologin vid cellulära och molekylära nivåer. Således används en nyfödd musmodell här, vilket möjliggör studier av de unika egenskaperna och biologin hos ryggmärgsneuroner in vitro .
Ent "> Isolering och underhåll av neuroner in vitro är inte särskilt okomplicerat. Det finns ett relativt överflöd av tekniker för neuronisolering från den kortikala vävnaden hos vuxna gnagare som verkar resultera i ett betydande antal isolerade neuroner ( dvs miljoner) 5 , 6 , 7. I motsats härtill är utbytet av neuroner från ryggmärgsvävnad lägre 8 , 9 , 10 , delvis på grund av den mindre vävnadsmassan. Dessutom är det hos mus en relativ paucitet av tekniker för isolering av neonatal Ryggmärgsneuroner, och befintliga metoder begränsas av lägre neuronutbyten ( dvs. hundratals) 9 eller mödosamma och resurs-tunga tekniker som kräver isolering av embryonala möss 10 .I detta protokoll, viAnvänd en teknik som möjliggör kostnad och resurseffektiv isolering av ett väsentligt antal neuroner från ryggmärgen hos neonatala möss. Som är vanligt vid tidigare publicerade tekniker använder vi papain som ett enzymatiskt proteas, vilket möjliggör frisättning av neuroner från ryggmärgsvävnaden 5 , 6 . Dessutom använder vi en densitetsgradient för raffinerad cellskillnad, som tidigare visat sig vara effektiv 6 , 10 . Medan mediet där cellerna inkuberas kan variera, enligt vår erfarenhet och som tidigare publicerad 11 , har tillskott med färskt B27 odlingsmediumtillskott visat sig vara avgörande för neuronlängden. Neuronerna är vanligtvis livskraftiga i upp till 10 dagar, vilket möjliggör behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vård och behandling av djur i denna procedur utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutionen för djurvård och användning vid University of Colorado.
1. Förbereda lösningar
- Förbered och lagra alla lösningar vid lämpliga temperaturer, som visas i Tabell 1 .
2. Beläggning brunnar och diabilder
OBS! Neuroner klibbar inte bra på plast- eller glasytor.
- En dag före isolering av neuronerna belägger brunnarna i en steril 24-brunns odlingsplatta med 0,5 ml Poly-D-Lysin (PDL; Tabell 2 ) och lämnar den i en laminär flödeskåpa O / N.
OBS! Den föredragna metoden är att använda plattor med 24 brunnar och att belägga endast centrumbrunnarna, eftersom avdunstning från de perifera brunnarna tenderar att accelereras mer och leda till inkonsekventa resultat. Dessutom kan glasskivor placeras inuti brunnarna före tO beläggning. Neuronerna kommer att fästa på de belagda glasskivorna och kan avlägsnas senare för ytterligare mikroskopisk bildbehandling . - På isoleringsdagen, ta bort PDL från brunnarna. Tvätta med sterilt vatten i några minuter innan du tar bort eventuellt kvarvarande vatten och låt det torka i 1 h (se nedan).
- Efter torkning, täcka glidarna med laminin ( tabell 2 ).
OBS: Ca 10 μL laminin (10 μg / μl) räcker för att belägga varje brunn i en steril 24-brunnsplatta. Detta blandas med 340 μl medium (total volym: 350 μl) för att täcka hela brunnen. Låt detta sitta i 2 h vid RT i en kåpa och sedan aspirera före beläggning av cellerna.
3. Skörd av ryggrad
OBS: Alla instrument ska autoklaveras (135 ° C och 30 psi i 4 x 7 min cykler) för sterilitet.
- Euthanize 1-3 dag-gamla C57BL / 6 muspuppar i en kammare med isofluran. Vänta30 s efter avslutad rörelse och nypa benet för att bekräfta brist på svar.
- Separera huvudet från kroppen genom att använda sax, med pup i utsatt position.
- Stabilisera bakbenen eller svansen och armarna på procedurbordet med dorsalsidan vänd mot användaren.
- Skär av huden med krökt iris sax.
- Skär ryggmärgen från ländryggen strax ovanför höfterna och fortsätt att klippa båda sidorna av bröstkorgen för att skilja den från kroppen.
OBS: Detta kräver noggrann dissektion av ryggmärgen från viscerala organ för att undvika oavsiktlig skada på andra organ ( Figur 1a ). - Tvätta sekventiellt i 10 s i 3 x 10 cm petriskålar innehållande 5 ml 0,2 μm filtersteriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för avlägsnande av överskott av vävnad.
- Sätt i en 22 g nål och en spruta fylld med 5 ml filtersteriliserad PBS i ryggraden i kaskala änden och spola kranellt, så att sladden tO Utgång till en fjärde Petriskålen ( Figur 1b ).
- Samla ryggmärgen i ett 15 ml rör med 5 ml HABG ( tabell 1 ) på is. Använd försiktighet för att undvika att krossa ryggmärgen.
- Upprepa steg 3.1-3.8 för varje valp i kullen.
OBS! Ideellt bör denna process ta mindre än 30 min per ryggmärg för att säkerställa sund neuron isolering.
4. Isolerande neuroner
OBS! Följande steg ska utföras i en laminär flödesskydd. Förtrogenhet med grundläggande steril teknik förväntas.
- Tissue Mincing
- Ta röret som innehåller ryggraden och skaka lätt för att suspendera vävnaden.
- Häll vävnad från röret i en 60 mm glas petriskål och tärning med ett rakblad för att skapa fina bitar ~ 0,5 mm i storlek.
- Överför vävnaden med en brettborrpipett i ett 15 ml rör innehållande 5 ml HABG.
- Placera den i en30 ° C vattenbad i 30 minuter för att tillåta cellerna att jämviktas vid denna temperatur. Håll cellerna på en shaker tillräckligt för att de ska kunna hängas i vätskan.
OBS! Detta steg är gjort för att undvika att chocka cellerna vid överföring från is till matsmältningsmediet. Att hålla cellerna vid 30 ° C bidrar till att minska celldöd i samband med en annars ökad metabolism vid 37 ° C.
- Förbered digestionsmediet ( Tabell 1 ).
- Förbered densitetsgradienten (tabell 1).
- Förbered var och en av de fyra skikten i 4 separata 15 ml rör, såsom beskrivs i tabell 1 .
- Tillsätt 1 ml från varje lager till ett nytt 15 ml rör. Börja med lager 1 längst ner och lägg till i följd tills du når lager 4 överst. Undvik att störa lagren när du lägger till.
- Tvätta de PDL-belagda plattorna från steg 2.2. Tvätta med sterilt vatten i några minuter innan du tar bort eventuellt kvarvarande vatten ochLåt dem torka i 1 h.
- Överför vävnaden till matsmältningsmediet.
- Ta bort det vävnadshaltiga röret från skakvattenbadet vid 30 ° C och låt det sätta sig i några minuter.
- Ta bort matsmältningsröret från 37 ° C vattenbadet och aspirera det i en låsningsspruta.
- Aspirera bort överskott av HABG från det vävnadsinnehållande röret.
- Använd ett leur-lock 0,2 μm filter på sprutan för att tillsätta smältmedium till det vävnadsinnehållande röret.
- Placera röret i ett 30 ° C vattenbad under 30 minuter. Håll cellerna skaka tillräckligt för att de ska kunna hängas i vätskan.
OBS! Det är viktigt att inte hålla cellerna i matsmältningsmediet för länge eller låta temperaturen bli för hög, vilket kan leda till överdriven matsmältning och resultera i att vävnaden blir suspenderad i en gelatinös blandning.
- Under denna period täcker du laminin som i steg 2.3. <Li> Utför trituration ( dvs separera cellerna från vävnaden).
- Ta bort röret från 30 ° C vattenbad och låt det settas i några minuter.
- Aspirera överskottsmedelsmedium.
- Suspensionera vävnaden i 2 ml HABG.
- Använd en smalborrpipett, triturat 10x i 45 s.
OBS! Det här är förmodligen det enda mest avgörande steget och kan avsevärt minska avkastningen om det inte görs korrekt.- Aspirera vävnaden i pipetten och töm innehållet omedelbart.
- Undvik att införa luft, eftersom det kommer att avsevärt sänka det lönsamma utbytet.
ANMÄRKNING: Den perfekta pipetten är en 9-tums glaspipett. Spetsen på pipetten ska vara brandpolerad för att släta ut grova ytor. Den ska sedan silikoniseras genom placering i en 1:20 lösning av diklorodimetylsilan (DMDCS) i kloroform och vänster O / N. Pipetten ska sedan avlägsnas och tillåtas lufttorka. Därefter sAutoklaveras för sterilisering.
Varning: DMDCS och kloroform är mycket brandfarliga, och kiseliseringen bör utföras i en avluftningsluft.
- Aspirera den översta 2 ml supernatanten och placera den i ett nytt 15 ml rör märkt "samling".
- Upprepa steg 4.7.3-4.7.5 ytterligare två gånger (celluppsamlingsröret ska ha 6 ml vid slutet).
- Långsamt överför uppsamlingsrörets innehåll till gradientröret framställt i steg 4.2, för att undvika störning av gradienten.
- Ta bort det tidigare framställda neurobasala mediet ( tabell 1 ) från kylskåpet och låt det värma i ett 37 ° C bad.
- Rening av neuronerna.
- Centrifugera lutningsröret i 15 minuter vid 800 xg och 22 ° C.
- Samla önskade skikt med pipett ( Figur 2 ) och sätt in ett nytt 15 ml rör. För neuro med hög renhetN isolering ( dvs. > 90%), samla lager 3. För mer utbyte med mindre renhet ( dvs. > 70-80%) samla lag 2 & 3.
- Späd ut densitetsgradienten genom att tillsätta 5 ml HABG till de nyligen uppsamlade skikten.
- Centrifugera vid 200 xg i 2 min vid 22 ° C.
- Kassera supernatanten, suspendera igen i 5 ml HABG och fläck pelleten för att suspendera cellerna.
- Centrifugera i 2 min 200 xg vid 22 ° C.
- Kassera supernatanten, resuspendera i 3 ml neurobasalt medium och flik pelleten för att resuspendera cellerna.
- Räkna cellerna
- Ta 10 μL av lösningen, nu med celler i neurobasalt medium, och blanda med 10 μL Trypan Blue.
- Placera 10 μl av denna blandning i en glasräkningskammare.
- Använd ett standardglasräkningskammare, räkna antalet celler i var och en av de fyra 4 x 4 kvadranterna. Lägg till alla celler som räknas (n), multiSkikt med 2 (utspädningsfaktor), divideras med 4 (antal kvadranter räknade) multipliceras med 3 (volym neurobasalt medium) och multipliceras med 10 4 för att erhålla koncentrationen av celler i celler / ml.
- Sätta cellerna på odlingsplattor
- Späd cellsuspensionen till 300 000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
OBS: Baserat på koncentrationen av celler som erhållits i ovanstående steg tillsätts ytterligare neurobasalt medium för att erhålla en slutlig koncentration av 3 * 105 celler / ml. Ekvationen är Cl V1 = C2V2, där Cl är initialkoncentrationen av celler erhållna från skörden; Vl är 3 ml; Och C2 är 3 * 105 celler / ml, såsom diskuterats ovan. Ekvationen löses för V 2 . Tillsätt volymen av neurobasalt medium som är nödvändigt för att göra den totala volymen av celler i lösning lika medV 2 . - Skaka försiktigt för att fördela cellerna i lösning och tillsätt 1 ml till varje brunn i de belagda plattorna med 24 brunnar.
- Späd cellsuspensionen till 300 000 celler i 1 ml neurobasalt medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna teknik möjliggör en enskild kull (4-10 valpar) isoleringen av 1-2,5 10 6 neuroner som är lämpliga för sådd på odlingsplattor. Vanligen utsöndras 4-8 brunnar vid den ovan nämnda koncentrationen ( dvs 300 000 celler / ml). Figur 3 visar utseendet av neuroner vid denna koncentration efter en vecka i odling vid låg-( a ) och hög- ( b ) förstoringsljusmikroskopi. Vi har emellertid också kunnat odla celler i koncentrationer upp till 500 000 celler / brunn och så låga som 100 000 celler / brunn. Användning av högre koncentrationer kräver mer medium och noggrann uppmärksamhet åt miljöförhållandena, eftersom näringsämnen kan tömmas snabbt, vilket leder till en giftig sur miljö för cellerna. Med lägre koncentrationer tenderar cellerna inte att uppnå full mognad och en överväxt av stödjande celler ( dvs. oligodendrocyter, miCroglia och astrocyter) observeras.
Cellerna börjar typiskt vidhäfta till ytan inom de första timmarna ( Figur 4a ). Axons kommer att börja spira inom de första 24-48 timmarna ( Figur 4b -4c ). Anslutningar mellan olika neuroner i odlingen når typiskt mognad vid 7 dagar ( Figur 4d ), vid vilken tidpunkt försök typiskt utförs på neuronerna.
Neuroner är identifierbara under ljusmikroskopi, eftersom de har olika axonala utsprång. Våra isoleringar med skikt 3 ( Figur 2 ) ger ~ 80-90% neuroner i odling. Detta bekräftades med användning av immunofluorescerande färgning av neuronspecifika markörer. I figur 5c är neuroncytoskeletala proteinet Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) sVisade, visar konturer och axonala prognoser av neuronerna efter en vecka i kulturen. På samma sätt, i Figur 6c , färgas den neuronspecifika nukleära markören NeuN som visar neuronala kärnor. Dessa neuronmarkörer kombineras med bildning av kärnor (DAPI, Figur 5a , 6a ) och cytoplasma (GFP, Figur 5b , 6b ) och de resulterande bilderna slås samman ( Figur 5d , 6d ), som beskriver den relativa överflöd av neuroner till andra celler i kultur. Vid användning av skikt 2 och 3 är utbytet av neuroner något högre; Det brukar emellertid vara färre neuroner i ren lösning (~ 70%).
Figur 1: Spinalkolonn Dissected and Spinal Cord Släppt från en 3-dagars Neonatal Mouse. DePilen i ( a ) pekar mot den bakre delen av ryggraden, där en nål sätts in för att lossna ryggmärgen. En frigiven ryggmärg ( b ) visas nedsänkt i PBS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Densitetsgradient, med celler tillsatt efter centrifugering. Skikten skisseras och visualiseras bättre på tecknade bilder. Det mest ytliga skiktet (0) är i allmänhet skräp från ryggmärgsvävnaden. Layer 1 är rik på oligodendrocyter och astrocyter. Lager 2 och 3 innehåller majoriteten av neuroner. Medan skikt 3 innehåller neuroner med högsta renhet, finns några stödjande celler ( dvs astrocyter och oligodendrocyter) i skikt 2. Den peLlet i botten innehåller huvudsakligen mikrogialceller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ljusmikroskopi av neuronala cellkulturer efter 7 dagar isolering. Vid 10X förstoring ( a ) kan axonala kopplingar mellan olika konglomerat av neuroner ses. Vid 40X förstoring ( b ) kan neuronerna visualiseras närmare med sina axonala utsprång. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Immunfluorescerande fläck av neuroner med användning av neuronal cytoskeletalmarkör MAP2. Kärnfärgning (DAPI) visas i blå ( a ), med cytoplasmisk färgning (GFP) i grönt ( b ) och neuroncytoskeletalt protein (MAP2) i rött ( c ). De sammanslagna bilderna ( d ) kombineras, vilket visar den relativa överflöd av neuroner.Target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Immunfluorescerande fläck av neuroner med användning av neuronal kärnmarkör NeuN. Kärnfärgning (DAPI) visas i blå ( a ), med cytoplasmisk färgning (GFP) i grön ( b ) och neuronal kärnor (NeuN) i röd ( c ). De sammanslagna bilderna ( d ) kombineras, vilket visar den relativa överflöd av neuroner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Media | Lagring | Ingredienser | Förberedelse | ||
| HABG | 4 ° C / 24h | 100 ml | - Tina B27 i 4 ° C kylskåp O / N - Filtrera sterilisera (0,22 μm) | ||
| Viloläge A | 97,8 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Neurobasal Media | 4 ° C / 1 vecka | 100 ml | - Tina B27 i 4 ° C kylskåp O / N - Filtrera sterilisera (0,22 μm) - Aliquot 50 ml portioner i 50 ml rör (förvara vid 4 ° C) | ||
| Neurobasal A | 97 ml | ||||
| B27 [2%] | 2 ml | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml | ||||
| Pen / Strep [1%] | 1 ml | ||||
| Digestion Media | Isolationsdagen | 10 ml | - Skaka kraftigt - Låt den sitta i 37 ° C bad i 30 minuter (perfekt beredd 30 min före användning) - Filtrera sterilisera (0,22 μm) | ||
| HA-Ca | 10 ml | ||||
| papain | 25 mg | ||||
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml | ||||
| Densitetsgradient | Isolationsdagen | 1 Gradient | |||
| Lager | OptiPrep | HABG | |||
| (0,13 ml) | (5,29 ml) | ||||
| 1 botten | 0,26 ml | 1,24 ml | |||
| 2 | 0,19 ml | 1,31 ml | |||
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml | |||
| 4 Top | 0,11 ml | 1,39 ml | |||
Tabell 1: Förberedelse av media och lösningar som används i detta protokoll.
| Beläggningsunderlag | Lagring | Ingredienser | Förberedelse | |
| PDL | Frys-tina en gång | Poly-D-Lysinhydrobromid | 5 mg | - Aliquot 4 ml i 15 ml rör och förvara omedelbart i -20 ° C - 0,5 ml / brunn (brunn med 24 brunnar) |
| Sterilt vatten | 50 ml | |||
| laminin | Beläggningsdag | Laminin (1 mg / ml) | 80 pl | - Nog för 8 brunnar i en brunn med 24 brunnar - 0,35 ml / brunn (brunn med 24 brunnar) |
| Neurobasal Medium | 2,72 ml | |||
Tabell 2: Framställning av de belagda substraten som användes för att belägga brunnarna på vilka neuronerna odlas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik möjliggör tillförlitlig odling av ryggmärgsneuroner. När kunskaper i tekniken uppnåtts tar det ungefär 3,5 timmar att slutföra. Vi har kunnat genomföra isoleringen av neuroner från 2 separata kullar (16 mus totalt) på ca 4 h. Det viktigaste steget i genomförbarhet är att på ett skickligt sätt kunna extrahera ryggmärgen från mössen. Utbytet möjliggör plätering av flera brunnar och för förmågan att testa neuronerna under olika betingelser. Vi har kunnat behandla neuronerna efter mognad och på ett tillförlitligt sätt utvärdera proteinuttryck med hjälp av Western blot-analys. Vidare möjliggör användningen av glasskivor inuti brunnarna för neuronbindningar den ytterligare färgningsanalysen av neuronerna.
Denna procedur är fördelaktig genom att den inte kräver embryonal vävnad och den tillhörande arbetsintensiteten. Vidare är det inte nödvändigt att använda vuxna ryggmärgsslangar för att samla tillräckligt mycket vävnad för adekvatE-neuron isolering. Detta förhindrar faktorn av åldersförbättrande beteende i neuronfysiologi, såsom ses med vuxna möss. Denna teknik är dock inte utan begränsningar. Som nämnts tidigare utesluts åldrade neuroner med användning av neonatala möss, och detta kan vara en begränsning om åldersrelaterat beteende och biologi är undersökningsområdet. Det finns en inlärningskurva för proceduren, vilket inte bara är nödvändigt för att optimera avkastningen, men för att säkerställa att de isolerade neuronerna är friska. Ryggmärgs extraktionsteknik kan ta lite tid att behärska, särskilt med nyfödda möss. Vi har märkt att långvarig tid i samband med extraktionen av ryggmärgen leder till neuroner som kan odlas under en betydligt kortare period. Detta lindras något av placeringen av neuronerna på isen. Men tiden spelar fortfarande en nyckelroll.
Det finns viktiga steg i förfarandet som hjälper till att säkerställa det optimala utbytet av neuroner. Om neuronutbytet inte är som eXpected, några steg bör utvärderas. För det första bör antalet ryggradsspår helst vara mer än 4. När 3 spinalband eller mindre används, är utbytet vanligtvis mindre än 1 miljon neuroner. Lämplig beredning av matsmältningsmediet måste säkerställas (steg 4.5). Om du lämnar vävnaden för länge i matsmältningsmediet kommer det att orsaka överdriven nedbrytning av celler, medan man använder digereringsmedium som inte har aktiverats vid 37 ° C kommer att resultera i färre isolerade neuroner. Slutligen måste triturationstekniken (steg 4.7) utföras med precision. Låga utbyten beror vanligen på otillräcklig triturering. En bra indikator är att se om lösningen blir grumlig under triturationen - om det inte händer, är det troligt att triturationen är för mild.
Om utbytet är som förväntat men neuronerna inte verkar regenerera processer inom de första 1-2 dagarna, är problemet vanligen ett fel vid korrekt beläggning, med antingen otillräcklig tvättningEller torkning (steg 2.2). Om cellerna initialt projekterar processer men därefter blir apoptotiska före 5-7-dagarsmärket, kan det finnas flera problem. Först och främst försäkra dig om att HABG-lösningen är beredd inom 24 h isolering och att nytt B27-tillägg som har tinas ut samma dag för HABG-preparat används. Antioxidanterna i detta tillskott behöver vara färskt och inte utgått. Se till att inga bubblor införs under triturationsprocessen (steg 4.7). Införandet av luftbubblor bidrar till denna fråga och kan relateras till torkningen av neuronerna. Se till att kulturen inte är överväldigad med förorening, vilket kan hänföras till fel i sterilitet.
Här beskriver vi användningen av 24-brunnsplattor, på vilka fröerna kan utsöndras. Ibland är det nödvändigt att genomföra tids- och / eller dosförsök, t.ex. vid användning av farmakologiska medel. Tekniken kan modifieras och neuronerna kan utsädes på 48-brunnsplAtes istället. Eftersom ytan på en brunn i en 48-brunnsplatta är hälften av den i en brunn med 24 brunnar, bör de använda beläggningslösningarna halveras. Cellerna bör också beläggas med halva volymen ( dvs 0,5 ml istället för 1,0 ml). Koncentrationen bör emellertid förbli densamma ( dvs. 1-5 x 105 celler / ml). Medan denna studie har utförts med användning av C57BL / 6-möss, bör tekniken tillämpas över andra genetiskt manipulerade stammar.
Ryggmärgs ischemi och skydd är ett område med växande intresse 12 , 13 , 14 . Kliniskt kan thoracoabdominal aorta-kirurgi resultera i förödande förlamning relaterad till ryggmärgs-ischemi och reperfusion, vars patofysiologi förblir fullständigt förstådd 15 , 16 . Förstå hur neuroner svarar på thE stress med ischemi är möjlig med denna modell. Vår grupp har tidigare publicerat ryggmärgsneuronskada relaterad till ischemisk förolämpning genom syre glukosberoende genom att använda denna teknik 17 . Modellen har också utvidgats till att inkludera astrocytskulturen, separerad från neuroner 18 .
Sammanfattningsvis är denna teknik värdefull för studien av ryggmärgspatofysiologi och neuronmikrobiologi. Den serumfria kulturen möjliggör exakt miljökontroll. Det möjliggör direkt åtkomst för tillämpning av farmakologiska medel. Kombinerad med ytterligare tekniker, såsom syre glukos berusning, kan denna teknik vara användbar för att utöka vår förståelse för patofysiologin av determinantal ryggmärgs ischemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
