Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H2 Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Her, beskriver vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som tillader immobiliseret redox proteiner studeres hjælp under direkte elektrokemisk kontrol på en kul elektrode. Infrarød spektre af en enkelt protein prøve kan optages på en række anvendte potentialer og under en række løsning betingelser.

Abstract

Forståelse af redox proteiner krav metoder, som giver præcis kontrol over redox kemi centre inden for protein. Teknikken med protein film elektrokemi, hvor et protein er immobiliseret på en elektrode overflade, sådan at elektroden erstatter fysiologiske electron donorer eller acceptorer, har givet funktionelle indblik i en vifte af forskellige redox-reaktioner proteiner. Fuld kemiske forståelse kræver elektrokemiske kontrol skal kombineres med andre teknikker, som kan tilføje ekstra struktur- og mekanistiske indblik. Her viser vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som kombinerer protein film elektrokemi med infrarød spektroskopiske prøvetagning af redox proteiner. Teknikken bruger en multiple-refleksion svækkede samlede Reflektionsgraden geometri for at sonde en redox protein immobiliseret på et højt areal kønrøg elektrode. Indarbejdelse af denne elektrode i en flow-celle tillader løsning pH eller opløste koncentrationer ændres under målingerne. Dette er særligt effektive i håndteringen af redox enzymer, hvor hurtig katalytiske omsætning kan opretholdes og kontrolleret på elektroden tillader spektroskopiske observation af langlivede mellemliggende arter i den katalytiske mekanisme. Vi demonstrere teknik med eksperimenter med E. coli hydrogenase 1 under omsætning (H2 oxidation) og ikke-omsætning betingelser.

Introduction

En central udfordring i studiet af protein funktion indebærer udvikling af i situ metoder, der giver mulighed for direkte observation af proteiner udfører deres fysiologiske roller, enten i vivo eller ved hjælp af isolerede protein prøver. Dette kræver integration af kontrol eller udløse processer i eksperimentelle procedurer og anvendelse af kombinerede teknikker, der tillader både reaktivitet skal vurderes, og enkelte kemiske trin under protein funktion skal måles, samtidigt. I tilfælde af redox proteiner svarer dette ofte til at kombinere elektrokemiske teknikker, som netop kontrollere den anvendte potentiale, men giver ingen direkte kemiske oplysninger, med spektroskopiske teknikker, der er følsomme over for kemisk-specifikke ændringer forbundet med protein funktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generel betegnelse for en række koblede elektrokemiske og spektroskopiske metoder, som omfatter en række teknikker, spektroskopiske og elektrokemiske kontrolniveauerne. Mange proteiner kan udveksle elektroner med kunstige, opløseligt electron donorer og acceptorer og dette er blevet udnyttet i undersøgelser, der anvender små molekyler for at mægle elektron overførsel, herunder kobling med UV-synlige,4,5 , 6 , 7 magnetiske cirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I et begrænset antal tilfælde har det været muligt at udnytte uformidlede, diffusion-kontrollerede elektron udveksling mellem proteiner og elektroder. 15 , 16

For katalytiske reaktioner udført af redox enzymer, løsning elektrokemi tilgange til stede en klar ulempe. Diffusion-kontrollerede elektron overførsel via redox mæglere i løsning er tilbøjelige til at blive hastighedsbegrænsning. Kinetiske og mekanistiske information om enzymet kan gå tabt eller i det mindste blive vanskeligt at deconvolute fra diffusion artefakter som følge af den eksperimentelle metode. Direkte og uformidlede elektrokemiske kontrol er derfor et vigtigt redskab for studiet af redox proteiner og enzymer. Teknikken med protein film elektrokemi (PFE) beskæftiger elektrode-immobiliseret redox proteiner, på en sådan måde, at elektroner er overført direkte til eller fra redox cofaktorer inden for protein som elektroden er polariseret på en række potentialer. 17 , 18 , 19 PFE er af ganske særlig værdi for studiet af oxidation eller reduktion reaktioner katalyseret af redox enzymer, som interfacial elektron overførsel kan opnås med en meget høj hastighed. For eksempel, blev electrocatalytic omsætning sats af nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt af Løbeunderlag som ca 1.000-10.000 s1 for H2 oxidation. 20 elektrode potentielle fungerer som en udløser til Drej katalyse 'on' eller 'off' og electrocatalytic aktuelle rapporter på enzymaktiviteten. Løbeunderlag er derfor en værdifuld metode til at analysere reaktiviteten af komplekse enzymer, der er intimt afhængige potentiale, såsom reaktioner di-jern aktive site [Lasse]-hydrogenases med CO og O2,21 eller potentiale-induceret inaktivering reaktioner af hydrogenases,22 kulilte dehydrogenase,23 og andre komplekse redox enzymer. 24

Den vigtigste hindring for kombinerer spektroskopiske teknikker med direkte elektrokemisk kontrol af Løbeunderlag udspringer af den lave overfladedækning af redox enzymer, om 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflade videnskabelige studier af lille molekyle adsorbates på bulk metal elektroder. Dette er en udfordring for følsomheden af de spektroskopiske målinger. Flere spectroelectrochemical metoder er blevet rapporteret til at studere immobiliseret redox proteiner på en række forskellige elektroder: UV-synlige spektroskopi på gennemsigtige metaloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 overflade forbedret infrarød absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflade øget Raman spektroskopiske teknikker, hovedsagelig på sølv elektroder. 34 , 35

Her beskriver vi en metode for kobling PFE med IR-spektroskopi, i en teknik kendt som protein film infrarød elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metode undersøgelser redox enzymer immobiliseret på et højt areal carbon arbejder elektrode sammenholdt med en svækket samlede Reflektionsgraden IR (ATR-IR) geometri, at udnytte lethed af adsorptionen af en række proteiner på carbon overflader. IR-spektroskopi er nyttig i undersøgelser af redox enzymer og proteiner, som mange små molekyler, ligander og cofaktorer har diagnostisk absorptioner, der kan bruges til at vurdere reaktivitet, bindende, hæmning og redox stat. Eksempler omfatter binding af nej til jern-svovl centre,37 undersøgelse af flavoproteins,38,39,40 små molekyler binding til hæm Centre etc. 41 the ATR-IR geometri giver mulighed for opførelse af en optimeret tre-elektrode (spectro) elektrokemisk celle42 og derfor giver fremragende elektrokemiske kontrol. Løsning modstand og potentielle drift er minimeret ved at placere en referenceelektrode tæt på arbejde elektrode. Der anvendes høj areal counter elektroder, der er kompatible med høj electrocatalytic strømme produceret af hurtig enzym omsætning på arbejde elektrode. Strømmen af løsning gennem cellen spectroelectrochemical giver mulighed for facile kontrol over koncentrationen af substrater, hæmmere og pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metode tillader derfor IR spektre at være optaget i situ under vedvarende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er også i stand til at levere kemiske oplysninger i mangel af katalytisk aktuelle,43 i modsætning til PFE hvor kan det være svært at udtrække oplysninger fra ikke-katalytiske processer i redox enzymer. 45 , 46

Vi har vist PFIRE metoden til undersøgelse af electrocatalytic H2 oxidation af [NiFe] hydrogenases, som indeholder iboende CO og KN ligander koordineret til Fe på et bimetal aktive site. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor særligt velegnet til at studere ved PFIRE. Metoden PFIRE indeholder oplysninger om de arter, der er til stede under steady-state omsætning, og derfor giver afgørende mekanistiske indblik ud over rigdommen af litteratur på IR-spektroskopi af hydrogenases uden eksperimentelle kontrol over omsætning. 47 , 48 Dyer og kollegaer har ansat tidsopløst IR metoder til undersøgelse af NiFe hydrogenases,49,50,51 bruge en lys udløser til enten anvende en lille negativ potentielle skridt (via brugen løsning mæglere og en "bur" elektron kilde) eller photolyse et bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE ikke kan på nuværende tidspunkt, giver tidsopløsning at matche disse målinger,40 det giver mulighed for undersøgelse af både reduktiv og oxidativ katalytiske processer, adgang til en række veldefinerede potentialer og gratis fra massetransporten begrænsninger.

Metoden PFIRE er adskilt fra SEIRA undersøgelser af redox proteiner, som også bruger en ATR-IR geometri og ansætte en nanoskala-ru metal elektrode til at forbedre IR absorbansen af molekyler adsorberet på elektrode overflade. 30 SEIRA er en yderst værdifuld teknik til at studere Membranproteiner, især adsorberet på eller inden for mimetiske membran arkitekturer,32 , men behovet for en metal elektrode kan begrænse substrat og inhibitor reaktivitet elektrode støtte til små molekyler som CO, KN--, CO2 osv. Proton reduktion og selvsamlede éncellelag desorption kan være problematisk på metaloverflader på meget negative potentialer, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttede metal elektroder blevet rapporteret. 53 , 54 en ulempe ved PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheden ved at indarbejde Membranproteiner i native eller mimetiske membran arkitekturer. Men den relative kemisk inaktive af Kulelektroder konkurrerende lille molekyle aktivering reaktioner gør PFIRE en fremragende teknik til at studere enzymet electrocatalysis, især i lav-potentiale domæne relevante for biologiske redox processer som proton reduktion af hydrogenases. 1 , 43

Formålet med denne artikel er at indføre metoden PFIRE som en teknik til at studere elektrode-immobiliseret redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli, som eksempel. Overvejelser af prøveforberedelse, kravet om godt substrat flow og data håndtering diskuteres. PFIRE er et bredt gældende teknik, velegnet til at undersøge enhver redox protein (med karakteristiske IR absorptioner), der kan være adsorberet på Kulelektroder, enten direkte eller ved hjælp af overflade ændring, således at det kan udveksle elektroner med den elektrode.

Protocol

1. genskabe indre prøve rum i en FTIR spektrometer inde en anaerob, tør handskerum og generelle eksperimentelle krav

  1. Brug en kommerciel FTIR spektrometer udstyret med en ekstern kviksølv cadmium telluride (MCT) detektor og ATR tilbehør. Rense kroppen af spektrometer med tør luft eller dinitrogenoxider, eller alternativt bruge et spektrometer med en evakueret optisk bænk.
  2. Placer spektrometer på en stabil, vibrationsfri tabel på samme højde som en anaerob (< 1 ppm O2), tør (dugpunkt <-75 ° C) handskerum. Aflede IR fjernlys i spektrometeret i handskerum, gennem en IR gennemsigtigt vindue, der er stor nok til at rumme den område stråle.
    Bemærk: Det er vigtigt, at afstanden mellem handskerum og spektrometer også er renset eller evakueret, især hvis en hygroskopisk vindue materiale, såsom NaCl eller KBr f.eks bruges.
  3. Replikere den interne prøve rum af spektrometer inde i handskerum.
    1. Direkte stråle inde handskerum på en off-axis elliptisk spejl, ideelt med samme brændvidde som intern fokusering spejlet i spektrometeret.
      Bemærk: Det er nyttigt at have to ekstra fly spejle placeret før denne fokusering spejl, for at give både højde og retning af IR strålen justeres inde i handskerum; Dette vil opveje enhver unøjagtighed i oprindelig placering i spektrometeret.
    2. Placere en ekstern MCT detektor, komplet med en passende fokus optik (f.eks. en kort brændvidde ZnSe linse, eller off-axis parabolske spejl, med en kort brændvidde) inde i handskerum, placeret som for at kopiere dimensionerne af den interne prøve rum i spektrometeret.
    3. Justere fokus for IR fjernlys at være omtrent samme afstand mellem fokus-spejl og MCT detektor.
  4. Cool dewar af eksterne MCT-detektor med flydende kvælstof.
  5. Montere ATR tilbehør i handskerum prøve rum. Juster input og output fokuserer optik og ATR tilbehør til at opnå maksimal overførselshastighed til MCT detektor. Brug om nødvendigt en blænde eller andre egnede dæmpning (såsom en wire gitter) at forhindre oversaturation detektor signal.
    Bemærk: For de data præsenteres her, en fem-refleksion ATR tilbehør med alle reflekterende optik og en aftagelig trapezformet Si indre refleksion element (IRE) bruges (Crystal GmbH, dimensioner ca 5 × 8 × 1 mm3, ansigt vinkel 39,5 °). VREDE er monteret i en flytbar sokkel bearbejdet fra polyestersegmenter ether keton (PEEK).
  6. Bruge et handskerum til at huse genskabt prøve rum med egnet feedthroughs til at tillade forbindelse til et eksternt husede potentiostat (gas tight BNC forbindelser er nyttige til dette formål), gas adgang, og kablet til at overføre signalet fra MCT detektor. Det er vigtigt at bevare nogen afskærmning på detektor kablet for at undgå at indføre støj eller forstyrrelser i målingerne.
  7. Placer en peristaltisk pumpe, i stand til at strømningshastigheder større end 60 mL/min. inde i handskerum. En skematisk oversigt over spektrometeret, ATR tilbehør, peristaltisk pumpe og potentiostat setup er vist i figur 1.
  8. Konstruere en spectroelectrochemical celle, som vist skematisk i figur 2, at sæler på ATR tilbehør. Cellen skal indeholde et højt areal tæller elektrode (Pt wire eller gaze), en forbindelse til arbejdet elektrode (carbon stang) og en miniature referenceelektrode. Cellen skal indeholde mindst to yderligere havne som indsugnings- og udstødningsporte for hurtig strøm af løsninger gennem cellen.
    Bemærk: En miniature mættede calomel-referenceelektrode er ideelle til dette formål. 36

2. fremstilling af Carbon Black partikler modificeret med E. coli Hydrogenase 1

  1. I en 'wet' anaerob handskerum, bland 20 mg af høje overfladeareal kønrøg partikler (> 1.000 m3/g) med 1 mL ultrahigh renhed vand (resistivitet > 18 MΩ cm) i et microcentrifuge rør. Sprede partikler af energibesparende ultralydbehandling (< 100 W) i mindst 15 min, eller indtil spredningen er ensartet og gør ikke sediment inden for 1 time, for at give en kønrøg dispersion med en ladning af ca 20 mg/mL.
  2. Tage en alikvot af E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, tilberedt efter en offentliggjort procedure55) ved en koncentration på ~ 7 mg protein/mL og bytte den til en lav ionisk styrke buffer på en pH tæt på det isoelektriske punkt (for eksempel kalium fosfat, 15 mM, pH 5,8, ingen ekstra salt). For at opnå de bedste resultater, skal du bruge et enzympræparat, der er så aktiv som muligt. Udføre buffer udveksling af koncentration og fortynding, i en centrifugal filter enhed med en passende molekylevægt cutoff (50 kDa virker godt for for Hyd1).
    1. Tilføje en Hyd1 til filter enhed.
    2. Fortyndes med ca 450 µL af exchange buffer.
    3. Reconcentrate til et volumen på 50 µL ved hjælp af mild centrifugering (< ~ 2700 × g) at forhindre uoprettelige nedbør.
    4. Gentag trin 2.2.2 og 2.2.3 indtil buffer exchange er komplet (typisk indenfor ~ 5 cyklusser).
  3. Bland en 5 µL diskenhed på 20 mg/mL kønrøg dispersion (udarbejdet i 2.1) med 50 µL alikvot af buffer-udvekslet Hyd1. Store enzym-partikel blandingen i køleskab (ved 0 ° C) natten over for at tillade enzym til adsorberes. Det kan være nødvendigt at ryste blanding lejlighedsvis at sikre partikler forbliver spredte.
  4. Vask Hyd1-ændret partikler med lav ionisk styrke buffer (kalium fosfat, 15 mM, pH 5,8, ingen ekstra salt) af successive bundfældning og re dispersion cykler i et microcentrifuge (~ 2.700 × g). Gentag denne proces 3 - 5 gange til at fjerne ikke-adsorberet enzym.
    Bemærk: Før den første vask skal supernatanten være næsten farveløs, der viser god adsorption af enzymet.
  5. Koncentrere partikler til en endelige mængden af ~ 5 µL, for at give en endelig belastning af ~ 20 mg/mL af enzym-modificerede partikler.
    Bemærk: Hyd1-ændret partikler kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger hvis de forbliver hydreret; Dette opnås bedst ved at gemme partikler fortyndet med ~ 50 µL ultrahigh renhed vand.

3. forberedelse af PFIRE målinger på E. coli Hydrogenase 1

  1. Ren Si IRE af lav-drevne ultralydbehandling (< 100 W), først i H24 (< 90% w/w) for ~ 15 min og derefter HNO3 (70% w/w) for op til 1 time. Denne rengøring procedure bør føre til en hydrofil IRE overflade. Hvis yderligere rengøring er nødvendig IRE kan placeres i piranha løsning (1:3 ratio af H2O2: H2SO4) til at oxidere resterende organisk materiale.
    Bemærk: Barske sure rensemetoder kan ikke være egnet til brug med alle IRE materialer. Piranha løsning er stærkt ætsende og en stærk oxidant, overflader skal være rimeligt rene før brug af piranha løsning og pleje skal tages under forberedelse og brug af piranha løsning på grund af eksoterme karakteren af processen - altid tilføje H2O 2 langsomt til H2SO4 og henvise til de relevante sikkerhedsprocedurer for fremstilling, anvendelse og bortskaffelse.
  2. Skylles ren IRE i ultrahigh renhed vand, og tør under en strøm af tør nitrogen gas. Udføre alle prisme håndtering ved hjælp af ren pincet til at undgå forurening.
  3. Forsegle IRE i ATR tilbehør bundpladen ved hjælp af en tynd strimmel af elektrisk-grade silicone fugemasse. Sørge for at begrænse fugemasse til kanterne af VREDE. Tillad fugemasse til at tørre helt.
  4. Overføre ATR tilbehør sokkel til spektrometer handskerum og montere det på ATR tilbehør. Foranstaltning referencespektrum (baggrunden) mellem 4000-1.000 cm-1 på 4 cm-1 opløsning, ved hjælp af de standard hurtig scan mode af spektrometret og 1024 gennemsnit interferograms (måling tid ~ 3-5 min). Bruge dette spektrum som input til beregning af absorbans spectra senere i eksperimentet.
    Bemærk: På grund af den lille absorbans forventes for Hyd1 aktive site er det nødvendigt at indsamle spektre med højt signal til støj forhold.
  5. Overføre ATR tilbehør sokkel til det 'våde' handskerum, som indeholder den tilberedte Hyd1-ændret partikel dispersion (afsnit 2). Drop-cast 1 µL alikvot af partikel spredning på det store ansigt af VREDE, og sprede dem jævnt hen over overfladen. Bemærk: Ikke Tillad partikler at blive helt tør på IRE.
  6. Skær et stykke karbonpapir, som den, der anvendes som gas diffusion layer materiale i brændselsceller til en størrelse ~0.1 mm mindre end overfladen af IRE (dvs. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Arealet af karbonpapir bør være stor nok til at dække drop-cast Hyd1 modificerede partikler, men ikke så store, overlapper silikone fugemasse bruges til at sikre IRE. Sættetid karbonpapir i vand, og Anbring det forsigtigt over toppen af filmens partikel. Karbonpapir vil give en god elektrisk forbindelse på tværs af hele partikel filmen.
    Bemærk: Det er gavnligt at forberede flere stykker af karbonpapir på forhånd og gemme dem pre dyppet i ultrahigh renhed vand inde i den «våde» anaerob handskerum.
  7. Montere spectroelectrochemical celle (beskrevet i 1.7 og vist skematisk i figur 2) over IRE, sikkert det i bundpladen med skruer. Tilføje ~ 200 µL af den eksperimentelle buffer til at holde enzymet hydreret. En blandet buffersystem, i stand til at buffer over et bredt pH-område og er nyttige for studier på NiFe hydrogenases:56 natriumacetat, 2-[N'-morpholino] Ethan-sulfonsyre syre (MES), N'-[2-hydroxyethylmethacrylat] piperazin -N' -[2-Ethan-sulfonsyre syre] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] methyl-3-amino-propan-sulfonsyre syre (VANDHANER), og 2-[N'-cyclohexylamino] Ethan-sulfonsyre syre (ska), med hver komponent i en endelig koncentration på 15 mM og indeholder 0,1 M koncentreret NaCl som støtte elektrolyt, med pH-værdi justeres til pH 6 ved hjælp af NaOH og HCl.
    Bemærk: Elektrode arbejdsforbindelse bør rager lidt under plan af spectroelectrochemical celle top (~0.1 mm) at sikre god elektronisk forbindelse til karbonpapir (figur 2).
  8. Tilslut løsning indsugnings- og udstødningsporte af cellen spectroelectrochemical til en flow-system, der indeholder peristaltisk pumpe slangen og et hætteglas med den eksperimentelle buffer. Overføre den forsamlede celle til den 'tør' handskerum indeholdende spektrometeret.
  9. Mount spectroelectrochemical celle forsamling på ATR tilbehør. Tilslut arbejde, counter og referenceelektroder til potentiostat. Tilslut peristaltisk pumpe slangen til pumpen.
  10. Optage en absorbans spektrum med 1024 i gennemsnit interferograms på 4 cm-1 opløsning over en spektral vifte af 4.000-1.000 cm-1, ved hjælp af spektret indsamlet i 3.4 som reference/baggrund. På dette tidspunkt spektret bør indeholde signifikant (> 100 mO.D.) akrylamid II bands på ~ 1,540 cm-1 og aktive site bands af Hyd1 bør være klart i den spektrale region 1.850-2.150 cm-1, stort set i oxideret, inaktive stater (figur 3 ).

4. aktivering af E. coli Hydrogenase 1 og test Spectroelectrochemical celle

  1. Anvende en reducerende potentiale (−0.8 V vs SCE) til Hyd1-ændret partikel film. Mætte den eksperimentelle buffer med H2 og flow buffer langsomt gennem cellen spectroelectrochemical. Lad prøven overnight fuldt aktivere Hyd1.
    Bemærk: Det er vigtigt at bruge anaerob H2, N2 osv., og så alle anaerob gasser skal videregives gennem et O2 filter.
  2. Optage en absorbans spektrum af prøven efter aktivering. ΝCO og vKN bands af det aktive site viser nu en fordeling af reduceret, 'aktive' stater. Dette ses nemmest ved hjælp af en forskel spektrum, i forhold til spektret indspillet i 3.10 (figur 4).
  3. Test den elektriske tilslutning af cellen spectroelectrochemical. For at gøre dette, mætte den eksperimentelle buffer med N2 gas. Anvende en sekvens af oxiderende (0 V vs SCE) og reducere (−0.8 V vs SCE) potentialer (i ca 30 min. varighed) til Hyd1-ændret partikel film, og optage en absorbans spektrum på hver. Hyd1 skal blive hurtigt oxideret og reduceret, og hvis filmens partikel er godt forbundet 100% af prøven bør reagere på de anvendte potentiale.
  4. Sæt en passende strømningshastigheden af den eksperimentelle buffer. For at gøre dette, anvende en reducerende potentiale (−0.8 V vs SCE) til prøven og mætte den eksperimentelle buffer med H2. Optage en serie af cyklisk voltammograms mellem-0.707 - 0,039 V vs SCE på en scanning på 10 mV/s. gradvist øge flowet af H2-mættede buffer mellem voltammograms indtil katalytisk bølgeform ved brug af minder på en planar roterende Disc elektrode55 og den maksimale strøm er uafhængig af strømningshastighed (figur 5).
    Bemærk: Opløselighed af H2 i vand er ~0.8 mM på 293 K og 1 bar.
  5. Da prøven er nu klar til PFIRE målinger, indsamle spectra på en række potentialer, under en række løsning forhold (pH, temperatur, H2 koncentration osv.). Optage alle elektrokemiske data ved hjælp af potentiostat software, da det er vigtigt at være i stand til at korrelere spektroskopiske og elektrokemiske data, især når man studerer electrocatalytic processer såsom H2 oxidation af Hyd1.

5. spektroskopiske datahåndtering

  1. Bekræfte, at det aktive site ikke er blevet permanent ændret i løbet af målingerne ved at optage spectra på 0 V og −0.8 V vs SCE i slutningen af forsøget. Disse skal være identisk med spektre registreres i 4.3, og ingen tab af aktive site bør overholdes under målingen (figur 6).
  2. Eksportere absolutte absorbans spektre fra spektrometer software i et passende format (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp etc.) til behandling ved hjælp af software som oprindelse eller Matlab.
  3. Baseline korrigere data, ved hjælp af den proces, der er illustreret i figur 7.
    1. Tage den anden afledede af hvert absorbans spektrum i vifte 1.800-2.150 cm-1, for at identificere små (< 1 mO.D.) aktive site bands baggrund stærkt buet vand.
    2. Placere baseline markør punkter på den originale absorbans spektrum, og angive punkter skal fastgøres til den eksperimentelle spektrum.
    3. Passe en baseline gennem punkter ved hjælp af en interpoleret cubic spline-funktion eller et polynomium funktion. Træk dette oprindelige funktion fra eksperimentelle data.

Representative Results

Figur 1 viser et skematisk fremstilling af den eksperimentelle arrangement af spektrometer, handskerum, ATR tilbehør, potentiostat og gas flow systemet anvendes til PFIRE målinger. Figur 2 viser en repræsentant tegning af cellen spectroelectrochemical.

Figur 3 viser absorbans spektre af drop-cast Hyd1 modificerede partikler, med den eksperimentelle buffer (et blandet buffersystem beskrevet i 3.7, pH 6.0) strømmer gennem cellen spectroelectrochemical. Overfladedækning af Hyd1 er særlig høj i eksemplet vist i figur 3, med et AMID II band intensiteten af ~ 235 mO.D. og minimal 'bulk' vand som det fremgår af omfanget af O-H strækker region (~ 3.000-3.600 cm-1) i forhold til bandet på ~ 1,640 cm-1, som er en foldning af akrylamid jeg bandet af Hyd1 og vand H-O-H bøje. Yderligere bånd på grund af proteinet kan ses i C-H strækker region (ca 2900 cm-1). Den brede band centreret omkring 2.100 cm-1 er en kombination band af H-O-H bøjning vibrationer med et sæt af lavere energi libration bands, som er begrænset rotationer af H2O molekyler på grund af brint limning netværk i flydende vand. ΝCO band oxideret, inaktive, Ni-B statens aktive site er tydeligt på 1,943 cm-1, selv uden baseline korrektion, og νKN funktioner er klart synlig mellem 2,050-2.100 cm-1 . På høje Hyd1 dækningsområder, meget af Mikroporøs struktur af carbon black film57 bliver blokeret af enzymet og derfor 'bulk' vand koncentration er sænket under PFIRE målinger.

Spektre i figur 3 viser, at før aktivering, Hyd1 film indeholder Hyd1 i oxideret, inaktive stater. Aktivering overnatning på −0.8 V vs SCE under en H2 atmosfære fører til dannelsen af reduceret, katalytisk aktive stater som vist i figur 4 , som viser en aktiveret (reduceret) minus som forberedt (oxideret) forskellen spektrum af Hyd1. Forskellen spektre af Hyd1 kan fortolkes tydeligst, ved hjælp af νCO region. Hver unik tilstand af det aktive sted har kun én CO band i forhold til to KN-bands og derfor νKN region er uløseligt mere kompliceret, med mange overlappende bands. Forskellen spektrum i figur 4 viser, at aktivering fører til tab (negativ absorption bands) af oxideret, inaktive Ni-B og en lille mængde af Ni-SI (den mest oxideret 'aktive' tilstand), der var til stede i filmens som forberedte Hyd1. Disse er erstattet af 'aktive' stater af Hyd1; Ni-C, Ni-R og Ni-L. Bemærk at der er to former for både Ni-R og Ni-L stater, som det fremgår af to νCO bands observeret efter disse arter i figur 4. Observation af flere Ni-R og Ni-L stater er enig med andre NiFe hydrogenases. 48 , 58 , 59

En central kontrol af metoden PFIRE er, at de cykliske voltammograms indspillet af Hyd1 inde i spectroelectrochemical flow celle Vis lignende katalytiske waveshapes til dem, der registreres på en planar roterende disk elektrode. 55 i praksis betyder dette, at Massetransporten af substrat (Hansen2) og produkt (H+) til/fra immobiliseret Hyd1 i cellen spectroelectrochemical er effektiv ved strømningshastigheder bruges under PFIRE målinger. Effekten af strømningshastighed på katalytiske bølgeform ved brug af er vist i figur 5, som viser successive voltammograms registreres under en H2 atmosfære (1 bar) som løsning strømningshastigheden gennem spectroelectrochemical cellen er øget. I alle tilfælde overpotential for H2 oxidation af Hyd1 er identisk (rød skraverede rektangel), men omfanget af oxidative inaktivering (hysterese mellem aktuelt i løbet af oxidative og reduktiv fejer på potentialer ovenfor ca 0 V vs SCE) og den maksimale H2 oxidation nuværende er afhængig af strømningshastigheden løsning. På strømningshastigheder over 52 mL/min. (lys grå voltamogram) katalytiske bølgeform ved brug af er ufølsom over for yderligere øger strømningshastighed.

Figur 6 sammenligner de relative intensiteter af νCO band stats Ni-B efter første aktivering og anaerob re-oxidation på 0 V vs SCE (under en Ar atmosfære, som beskrevet i 4.3) og anaerobe oxidative inaktivering under en Ar atmosfære på 0 V vs SCE efter 48 hr af kontinuerlig eksperimenter (som beskrevet i 5.1). Uden tab af aktive site band intensitet er iagttaget under måling, og alle Hyd1 prøven svarer til de anvendte potentialer.

Figur 7 viser baseline korrektionsproceduren brugt i hele dette arbejde. Den absolutte spektrum af Hyd1 prøven i det aktive site region (figur 7en) indeholder betydelige krumning på grund af vand. Faktisk er krav bruge vand som opløsningsmiddel et problem for de fleste applikationer af IR-spektroskopi i biovidenskab. Den anden afledede af den absolutte spektrum (fig. 7b), beregnes oprindelse software med Savitsky-Golay gulvafslibning over en 9 point vindue, kan bruges til at identificere skarpe bands Hyd1 aktive site på buede baggrund. Identifikation af omtrentlige peak positioner ved hjælp af en anden afledte spektrum giver baseline ankerpunkter skal placeres i områder af den absolutte spektrum, som er fri for aktive site bands (cirklerne i figur 7en). En kubisk spline funktion monteres derefter gennem disse ankerpunkter for at skabe en baseline funktion, som derefter kan trækkes fra den absolutte spektrum til at give en baseline-korrigeret spektrum der indeholder kun toppe som følge af Hyd1 aktive site (figur 7 c).

Figur 8 viser resultaterne af en PFIRE måling på Hyd1, under både ikke-omsætning (Ar atmosfære) og omsætning (H2 atmosfære) betingelser på en vifte af potentialer. 36 det aktuelle tidspunkt spor (figur 8en) rapport om den katalytiske aktuelle på hver anvendt potentiale og forblive på tæt på nul nuværende betingelser, ikke-omsætning (Ar atmosfære). Delvis spectroelectrochemical redox titrering i figur 8b rapporterer derfor på ligevægt redox opførsel af det aktive sted, viser fordelingen af stater forventes på hver potentiale i mangel af katalytiske omsætning. Spektre i figur 8c blev registreret under omsætning forhold (under en H2 atmosfære) og derfor repræsenterer steady-state fordelingen af aktive site stater stede under katalytisk H2 oxidation af Hyd1. At steady-state-betingelser er blevet opfyldt bekræftes af det faktum, at det katalytiske H2 oxidation nuværende (figur 8en, H2) forbliver konstant som funktion af tiden på −0.199 V og −0.074 V vs hun; den monotone forfald i aktuelle på +0.356 V vs hun er på grund af den velkendte anaerob oxidative inaktivering af Hyd1. 55 fordelingen af aktive site stater er klart forskellige under Ar og H2 på alle potentialer hvor Hyd1 udfører katalyse (figur 8b, spectra på −0.199, −0.074 og +0.356 V vs hun). Spektre registreres under Ar og H2 er stort set identisk på −0.594 V vs hun, dog, og dette udgør en vigtig prøve på eksperimentelle konsistens; Hyd1 reducerer ikke H+ med en betydelig hastighed på pH 6.0 (nuværende i fig. 8en under både Ar og H2 er tæt på nul), og spektre på −0.594 V forventes derfor at være den samme.

Figur 9 viser de anaerobe oxidative inaktivering af Hyd1 via dannelsen af Ni-B fra Ni-SI under H2 oxidation på +0.356 V.36 Spectra blev registreret under de grå tidsintervaller, der er noteret på det aktuelle tidspunkt spor i figur 9en. −0.074 V Hyd1 undergår ikke oxidative inaktivering og fordelingen af aktive site stater forbliver konstant i hele den hele potentielle trin. Det fremgår af spektre i figur 9bjeg, som rapporterer den absolutte baseline-korrigeret spektrum i begyndelsen af −0.074 potentielle trin, og figur 9bii som blev indspillet på et senere tid under det potentielle skridt og rapporteres som en forskel spektret i forhold til figur 9bjeg. Spektre i figur 9biii og biv rapporteres også som forskellen spektre i forhold til figur 9bjeg, og Vis gradvis omdannelse af Ni-SI til Ni-B under høj potentiel inaktivering, overensstemmelse med monoton faldet i nuværende vist på +0.356 V i figur 9en.

Spektre registreres på en række løsning pH give indsigt i proton overførsel trin under den katalytiske Hyd1 cyklus. 43 Figur 10 en viser PFIRE spektre registreres på den samme Hyd1 film på pH 3,0 og pH 9,0, bruge løsning flow i cellen spectroelectrochemical for at udveksle den eksperimentelle buffer. De relative koncentrationer af Ni-C og Ni-L staterne er klart forskellig i disse to spektre. Ved at variere den anvendte potentiale ikke-omsætning betingelser hedder den potentielle afhængighed af NiC og Ni-L kan afgøres hurtigt på en række pH værdier (figur 10b), og begge stater findes for at være isopotential over et bredt pH interval. (Bemærk, at peak absorptioner i figur 10b viser kun Ni-C og Ni-L staterne for klarhed, fuld redox titreringer af Hyd1 er blevet rapporteret af Hidalgo et al.) 36 en pH titrering af koncentrationerne af Ni-C og Ni-L kan derefter udtrækkes, tager peak absorbans på potentialer, hvor den samlede Ni-C og Ni-L koncentration er på sit højeste på hver pH (figur 10c). På denne måde, og sammenholdt med EPR data, blev en pH balance mellem Ni-C og Ni-L stater identificeret. 43

Figure 1
Figur 1: Skematisk af placeringen af IR spektrometer, anaerob handskerum, ATR tilbehør, MCT detektor, gas flow system og potentiostat anvendes til PFIRE målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk diagram over den spectroelectrochemical celle anvendes til PFIRE målinger, viser arrangement af elektroder og løsning indløb/udløb forbindelser. Celle og sokkel er bearbejdet fra polyestersegmenter ether keton (PEEK), med skruehuller til en kulstof stang arbejder elektrode forbindelse, Pt wire counter elektrode, mættede calomel-referenceelektrode, og løsningen luftindtag og -udtag. Mættede kalomel reference elektrode konstruktion er som tidligere rapporteret. 36 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: absorbans spektrum af Hyd1-ændret kønrøg partikler, deponeret på VREDE og rehydreret med buffer. Positioner af akrylamid jeg band, AMID II band og Hyd1 aktive site region er vist, sammen med yderligere funktioner på grund af C-H strækker vibrationer og opløsningsmidler vand. Indsatsen viser et forstørret billede af regionen aktive site med de vCO og vKN bands mærket. 'Som forberedt' partikler indeholder Hyd1 hovedsageligt i oxideret, inaktive Ni-B tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Aktivering af Hyd1 på −0.8 V vs SCE under en H2 atmosfære, præsenteret som en reduceret minus oxideret forskellen spektrum. Ved lav potentiel aktivering oxideret, konverterer inaktive Ni-B (og en lille koncentration af Ni-SI) til mere reduceret, aktive stater Ni-C, Ni-R og Ni-L. Bemærk, at Hyd1 har to særskilte undertilstande Ni-L og Ni-R. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Effekten af løsning strømningshastighed på bølgeform ved brug af af katalytisk cyklisk voltammograms indspillet i cellen spectroelectrochemical. Voltammograms blev optaget på stigende strømningshastigheder H2-mættet buffer som angivet. På en flow-hastighed på 20 mL/min. (rød) viser voltamogrammet betydelig inaktivering over 0 V vs hun på fremad-scanning. På strømningshastigheder over 52 mL/min omfanget af inaktivering er langt lavere og nuværende er uafhængig af flow på alle potentialer. Andre parametre: 1 bar H2, 10 mV/s scan rate. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Baseline korrigeret IR spektre i regionen aktive site νCO i oxideret, inaktive Ni-B tilstand på 0 V vs SCE. Der er ingen målelig tab af aktive site intensitet under 48 h af kontinuerlige målinger, som PFIRE, og derfor Hyd1 er adsorberet håndfast på kønrøg partikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Detaljer af baseline korrektion metoder til datahåndtering. Baseline ankerpunkter er placeret på absolut absorbans spektrum i det aktive site region (en), at tage sig til at undgå enhver νCO og νKN toppe identificeret fra en anden afledte analyse (b). Den resulterende baseline korrigeret spektrum er vist i (c). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: PFIRE målinger på Hyd1 under ikke-omsætning (Ar) og omsætning (Hansen2) betingelser. (en) aktuelt tidspunkt spor af Hyd1 i cellen spectroelectrochemical i Ar-mættet (grå) og H2-mættede (sort) buffer; (b), (c) PFIRE spektre viser νCO region på hver potentiale under Ar (b) og H2 (c). Potentialer citeret i V vs hun. Gengivet med tilladelse fra Hidalgo et al. 35 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Anaerob inaktivering af Hyd1 via dannelsen af Ni-B fra Ni-SI. (en) aktuelt tidspunkt spor under en H2 atmosfære, viser en stabil electrocatalytic nuværende på −0.074 V og langsom anaerob inaktivering (monoton fald i current) på +0.356 V vs hun. (b) spektre registreres under de grå skraverede regioner præget i (a). Spektrum bjeg er en baseline korrigeret spektrum registreret i begyndelsen af −0.074 V potentielle trin. Spektrum bii, indspillet på et senere tidspunkt under trinnet −0.074 V er rapporteret som en forskel spektret i forhold til bjeg og viser, at der sker ingen ændring i fordelingen af aktive site stater, i overensstemmelse med stabiliteten af potentiale på −0.074 V. Spectra biii og biv er også rapporteret som forskellen spektre i forhold til bjeg og Vis gradvis omdannelse af Ni-SI til Ni-B under anaerobe inaktivering på +0.356 V vs hun. Gengivet med tilladelse fra Hidalgo et al. 35 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 : Spektre registreres på en række løsning pH give indsigt i proton overførsel trin under Hyd1 katalytisk cyklus. (en) IR-spektre viser νCO regionen Hyd1, indspillet i pH 3,0 (-54 mV vs hun) og pH 9,0 (-334 mV vs hun). (b) Spectroelectrochemical titreringer blev foretaget til at bestemme den potentiale, hvormed Ni-C og Ni-L koncentrationerne er på maksimalt på en række løsning pH værdier. Kun Ni-C og Ni-L koncentrationerne er vist af hensyn til klarheden, for en fuld spectroelectrochemical titrering af Hyd1 Se Hidalgo et al. 36 (c) pH afhængighed af den relative koncentration af Ni-C og Ni-L, som bestemmes ud fra en serie af eksperimenter som dem vist i (b). Spectra blev registreret ved 20 ° C. Tilpasset med tilladelse fra Murphy et al. 42 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

PFIRE er et bredt gældende IR spektroskopiske teknik til håndtering af elektrode-immobiliseret redox proteiner. Især kan electrocatalytic reaktioner af redox enzymer blive aftestede på hurtig omsætning betingelser. PFIRE metoden bygger på direkte elektrokemisk kontrol af teknikken med Løbeunderlag, som giver ingen direkte strukturelle oplysninger, og par det til IR-spektroskopi på en kul elektrode. PFIRE tilgangen dermed tilføjer kemiske indsigt til de foreliggende oplysninger fra elektrokemi alene og er yderst velegnet til undersøgelse af redox proteiner og enzymer involveret i lille molekyle bindende og aktivering. Derudover kan PFIRE give oplysninger om potentiale-afhængige strukturelle ændringer i proteiner i mangel af katalytiske omsætning. Sådanne ikke-omsætning elektron overførsel begivenheder er ofte vanskeligt at opdage ved hjælp af 'standard' anvendelser af Løbeunderlag, selvom udvidelse af Løbeunderlag til Fourier-omdannet AC voltammetry har været brugt med stor succes. 45 , 46

Metoden PFIRE er principielt egnet til undersøgelse af eventuelle redox protein, der kan studeres ved hjælp af Løbeunderlag. Derfor, som med Løbeunderlag, protein adsorption er et kritisk skridt til et vellykket PFIRE eksperiment. I denne protokol beskriver vi en anvendelse af den PFIRE teknik ved hjælp af E. coli Hyd1 som et case study. 36 , 43 men vi har også anvendes PFIRE teknik i cytoplasmatisk regulerende hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorberet på kønrøg. 40 i alle disse tilfælde, simple fysiske adsorption til uændret høj areal carbon black (som beskrevet i denne protokol) giver en overflade dækning af protein, der er høj nok til at optage god kvalitet IR spektre med en høj signal-støj-forhold. I tilfælde hvor sådanne høje niveauer af adsorption ikke kan opnås kan det være nødvendigt at ændre overfladen af kulstof partikler, for eksempel at tillade kovalente fastgørelse af protein elektrode overflade. 60 , 61 , 62 brug af et handskerum til PFIRE målinger er kun strengt nødvendigt, når man studerer prøver, der skal håndteres anaerobt. Men i praksis den ekstremt konstant og lav (< 80 ° C dugpunkt) niveauer af vanddamp fra handskerum atmosfære Giv højt signal-støj-niveau, der tillader udvinding af meget små absorptioner. 44 i mange tilfælde en anaerobt miljø, som den, der leveres af handskerum, er også ønskelig for elektrokemisk måling (integreret med teknikken, PFIRE) for at undgå nuværende på grund af O2 reduktion på arbejde elektrode.

IR absorptioner bulk vand, eksperimentelle buffere og carbon partikler som prøve er adsorberet alle bidrage betydeligt til de eksperimentelle spektre og kunne overlapper bands af interesse, især i akrylamid I, II og III regioner af den spektrum. 63 regionen akrylamid indeholder også oplysninger fra økologisk arter som biokemi eller nicotinamid cofaktorer, som substrater og produkter af mange oxidation og reduktion af reaktioner. I forbindelse med NiFe hydrogenases, νCO og νKN bands af det aktive sted falder i et relativt klart område af spektret og så PFIRE teknikken er meget velegnet til studiet af disse enzymer. I andre tilfælde, men kan forskellen spectra kombineret med isotopiske mærkning tilgange være nødvendigt at isolere ændringer som følge af de immobiliserede protein. Lignende metoder har været anvendt til at identificere, for eksempel, protonation ændringer, strukturelle rearrangementer og studere Michaelis-Menten komplekser ved hjælp af IR-spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er således, ikke begrænset til undersøgelse af hydrogenases men kan anvendes til enhver redox protein, der indeholder (eller hvis substrater, produkter eller hæmmere indeholder) grupper med diagnostiske IR-aktive vibrationer; kulilte dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formate dehydrogenases, f.eks.

Den relaterede teknik, SEIRA, er meget velegnet til undersøgelse af membran-associerede proteiner i en biomimetiske miljø. 32 SEIRA er en tilpasning af IR-spektroskopi, der også bruger en ATR-IR konfiguration, og gør brug af en overflade enhancement effekt, der forstærker IR absorbansen af molekyler ligger tæt på (inden for et par nm) overfladen af ATR prisme (IRE). SEIRA er derfor udsøgt følsomme spektrale ændringer, der forekommer inden for den adsorberede protein og membran arkitektur og er relativt fri for konkurrerende signaler fra opløsningsmiddel og substrater-hæmmere er til stede i løsning. Dette er lidt i modsætning til den PFIRE teknik beskrevet her, som bygger på en væsentligt større indtrængningsdybde over overfladen af IRE (~ 1 µm), hvilket betyder, at PFIRE er mere følsomme over for substrater, produkter eller hæmmere præsentere i løsning. Denne øget følsomhed over for 'bulk' opløsningsmiddel kan være en fordel; Hvis underlaget eller produkt kan observeres direkte af IR, rapport PFIRE spektre om begge steady state kinetik af langlivet aktiv arter og associeret produkt dannelse under electrocatalysis. 69 evnen til at iagttage steady state koncentrationer af substrat og produkt vil være særlig værdifuld for enzymer såsom kulilte dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af CO til CO2, en stærk IR absorber) eller formate dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af formate til CO2).

PFIRE er for øjeblikket begrænset til steady-state kinetiske undersøgelser af enzymet electrocatalysis på grund af de makroskopiske Kulelektroder bruges til at koncentrere sig enzym på overfladen af en VREDE for dataindsamling i og ATR-IR geometri. I denne henseende er PFIRE undersøgelser af NiFe hydrogenases supplerer arbejdet i Dyer og kollegaer,49,50 , der bruger lys-udløst forbigående absorption IR-spektroskopi studere sub omsætning kinetik. Arbejdes til miniaturize spectroelectrochemical celle,40 og med brug af microelectrodes tidsopløsning på rækkefølgen mikrosekunder bør være opnåelige. Dette vil aktivere undersøgelse af sub omsætning kinetik for enzymer med omsætning frekvenser op til ca 100-500 s-1, og vil sætte studiet af både reduktiv og oxidative processer.

Samlet set er PFIRE en spektroskopisk teknik, der giver mulighed for kemiske karakterisering af electrocatalytic reaktioner af redox enzymer under steady state-betingelser. Metoden PFIRE tillader flere kemiske og elektrokemiske titreringer skal udføres på den samme prøve, enzym, da de høje areal elektroder anvendes giver en solid adsorption af protein og ATR-IR geometri tillader letkøbt løsning exchange. Evnen til at indsamle sådanne strukturelle oplysninger i situ under enzym funktion er et uvurderligt værktøj for den bredere bioelectrochemistry samfund.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansiel interesse.

Acknowledgments

K.A.V. og P.A.A. arbejde blev støttet af European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik og naturvidenskab forskning Rådet IB katalysator award EP/N013514/1, og bioteknologi og biologiske videnskaber forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. var støttet af Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne anerkender Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og personale på det mekaniske værksted (Institut for kemi) om bistand til design og fremstilling af spectroelectrochemical celler, der anvendes i dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48, (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64, (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394, (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38, (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105, (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10, (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359, (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187, (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44, (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45, (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13, (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113, (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8, (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119, (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108, (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38, (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131, (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107, (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129, (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283, (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28, (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37, (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134, (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133, (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125, (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828, (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10, (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136, (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53, (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142, (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88, (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137, (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119, (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656, (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107, (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114, (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137, (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55, (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138, (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115, (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126, (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285, (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125, (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827, (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3, (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84, (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22, (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121, (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48, (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7, (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119, (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52, (85), 12665-12668 (2016).
Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H<sub>2</sub> Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter