Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы опишем технику, белок фильм инфракрасный электрохимии, который позволяет иммобилизованных редокс белки спектроскопически изучаться под непосредственным контролем электрохимических на углеродных электродов. Инфракрасные спектры образец одного белка могут быть записаны в диапазоне прикладной потенциалов и при различных условиях решение.

Abstract

Понимание химии редокс белки требования методы, которые обеспечивают точный контроль над редокс центров в рамках белка. Техника белка электрохимии фильм, в котором белок иммобилизованных на поверхности электрода, таким образом, что электрод заменяет физиологических электрона доноров и акцепторов, предоставил функциональных проницательность в окислительно-восстановительных реакций целого ряда различных белки. Полный химический понимание требует электрохимического контроля в сочетании с другими методами, которые можно добавить дополнительные структурные и механистического понимания. Здесь мы показываем, техника, белок фильм инфракрасный электрохимии, который сочетает в себе белок фильм электрохимии инфракрасную спектральные выборки редокс белков. Техника использует несколько отражение аттенуированные всего отражения геометрии зонда редокс белка, иммобилизованных на большую площадь поверхности электрода сажи. Включение этого электрода в ячейку потока позволяет рН раствора или концентрации вещества быть изменены во время измерений. Это особенно мощный в решении окислительно-восстановительных ферментов, где быстрый оборот катализатора может быть устойчивой и контролируется на электроде, позволяя спектроскопических наблюдений долгоживущих промежуточных видов в механизме катализатора. Мы продемонстрировать технику с экспериментов на E. coli hydrogenase 1 условиях оборот (H2 окисления) и не оборот.

Introduction

Ключевой задачей в изучении белков функции предполагает развитие в situ методов, которые позволяют прямого наблюдения белков, выполнении их физиологических функций, либо в естественных условиях или с помощью изолированных образцы протеина. Это требует интеграции управления или запуска процессов в экспериментальной процедуры и использования комбинированных методов, которые позволяют как реакционную способность оценить и отдельных химических шаги во время функции протеина измеряется, одновременно. В случае редокс белки это часто приравнивается к сочетания электрохимических методов, которые точно контролировать прикладной потенциал, но не дают прямой химической информации, с спектроскопических методов, которые чувствительны к химически конкретных изменения, связанные с функцией белка. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry — общий термин для ряда сопряженных электрохимических и спектральные методы, которые охватывают различные спектральные методы и уровни электрохимического контроля. Многие белки могут обмениваться с искусственным, растворимые электрона доноров и акцепторов электронов и это была использована в исследованиях, которые используют маленькие молекулы посредничать перенос электрона, включая сцепление с УФ видно,4,5 , 6 , 7 магнитных круговой дихроизма8 и ИК5,9,10,11,12,13,14 (IR) Рентгеновская спектроскопия. В ограниченном числе случаев оказалось возможным использовать безрассудной, контролируемой диффузии электронного обмена между белками и электродов. 15 , 16

Для каталитических реакций проводимых окислительно-восстановительных ферментов, решение электрохимии подходы настоящий четкий недостаток. Передачи электронно контролируемые диффузии через редокс посредников в растворе может стать ограничение скорости. Кинетические и механистические информацию о фермента может быть потеряно, или по крайней мере стать трудно deconvolute от диффузии артефакты в результате экспериментального метода. Прямые, электрохимических управления поэтому является важным инструментом для изучения редокс белков и ферментов. Техника белка фильм электрохимии (PFE) использует белки Редокс электроды прикол, таким образом, что электроны передаются непосредственно в или из кофакторов редокс внутри белка как электрод поляризовано на серию потенциалов. 17 , 18 , 19 PFE имеет особую ценность для изучения реакции окисления или сокращения, катализируемые окислительно-восстановительных ферментов, как поверхностное электрона передачи может быть достигнуто с очень высокой скоростью. Например электрокаталитические текучести hydrogenase ([NiFe]) никель железо от фолиевой vinosum был измерен PFE как ca 1000-10000 s−1 для окисления H2 . 20 электродный потенциал действует как триггер для катализа «на» или «Выкл», и текущие отчеты электрокаталитическая на активность фермента. PFE поэтому является ценным методом для анализа реактивности комплекс ферментов, которые тесно зависят от потенциала, например реакциях железо ди активного узла [FeFe]-трансгидрогеназы с CO и O2,21 или потенциал индуцированной инактивация реакции трансгидрогеназы, дегидрогеназа окиси углерода22 ,23 и других сложных окислительно-восстановительных ферментов. 24

Главным препятствием для объединения спектроскопических методов с прямых электрохимических управления, обеспечиваемой PFE обусловлена низким поверхности покрытия окислительно-восстановительных ферментов, порядка 1-2 пмоль см-2 для [NiFe] hydrogenase от A. vinosum, 20 относительно в situ исследования поверхности науки адсорбатов малых молекул на массовых металлическими электродами. Это представляет собой проблему для чувствительности спектроскопических измерений. Несколько методов spectroelectrochemical были зарегистрированы для изучения иммобилизованных редокс белков на широкий спектр различных электродов: УФ видимый спектроскопии в прозрачной окиси металла электродов; 25 , 26 , 27 флуоресцентной спектроскопии в Золотые электроды; 28 , 29 поверхности расширенной инфракрасного поглощения (SEIRA) спектроскопия в Золотые электроды; 30 , 31 , 32 , 33 и поверхности расширения спектроскопических методов Раман, главным образом на серебряных электродов. 34 , 35

Здесь мы описываем метод сцепления PFE с ИК-спектроскопии, в метод, известный как белка фильм инфракрасный электрохимии (PFIRE). 36 PFIRE метод исследования окислительно-восстановительных ферментов, иммобилизованных на большую площадь поверхности углерода рабочих электродом в сочетании с аттенуированные полного отражения IR (ATR-IR) геометрии, используя простота адсорбции целого ряда белков на поверхности углеродных. ИК-спектроскопии полезны в изучении окислительно-восстановительных ферментов и белков, как многие малые молекулы, лиганды и кофакторы диагностических absorbances, которые могут быть использованы для оценки реактивности, привязки, торможение и окислительно-восстановительного состояния. Примеры включают привязку нет центров железо сера,37 исследования необходим,38,39,40 малых молекул привязки к гема центры и т.д. 41 ATR-IR геометрии позволяет строительство оптимизированный тремя электродами (spectro) электрохимической ячейки42 и таким образом обеспечивает отличную электрохимического контроля. Решение сопротивления и потенциальных дрейф сведены к минимуму путем размещения электрод сравнения рядом рабочих электродом. Большую площадь поверхности Счетчик электроды используются которые совместимы с токами высокой электрокаталитическая производства быстро фермента оборот на рабочем электроде. Потока раствора через spectroelectrochemical клеток позволяет легким контролировать концентрацию субстратов, ингибиторы и рН. 36 , 43 , 44 PFIRE метод позволяет ИК спектры быть записанные на месте во время устойчивого фермента электрокатализа. 36 , 44 PFIRE способен также предоставление химической информации в отсутствие каталитических ток,43 , в отличие от PFE, где он может быть трудным для извлечения информации из не каталитических процессов в окислительно-восстановительных ферментов. 45 , 46

Мы продемонстрировали метод PFIRE для изучения электрокаталитическая H2 окисления [NiFe] трансгидрогеназы, которые содержат встроенные CO и CN лигандов, координируемых Фе на биметаллического активного узла. 36 , 43 , Трансгидрогеназы 44 [NiFe] поэтому особенно хорошо подходит для изучения PFIRE. Метод PFIRE предоставляет информацию о видах, которые присутствуют во время статичных оборот и таким образом обеспечивает решающую механистический понимание помимо богатства литературы ИК спектроскопии трансгидрогеназы без экспериментальной контроля за оборот. 47 , 48 Дайер и коллеги использовали время решена ИК методы для изучения NiFe трансгидрогеназы,,,495051 использование триггера света либо применить небольшой отрицательный потенциал шаг (через использование решение посредников и источник «клетке» электрона) или фотолизу связанного Гидрид. Хотя метод PFIRE не может в настоящее время обеспечивают разрешение время для соответствия этих измерений,40 он позволяет исследование восстановительной и окислительных каталитических процессов, доступны в целый ряд четко определенных потенциалов и свободной от массового транспорта ограничения.

Метод PFIRE отличается от исследования SEIRA редокс белков, которые также используют ATR-IR геометрии и использовать шероховатую наноразмерных металлическим электродом для повышения поглощения ИК молекул адсорбироваться на поверхности электрода. 30 SEIRA является чрезвычайно полезен для изучения мембранных белков, в частности адсорбированные на или в пределах подражательный мембраны архитектуры,32 , но потребность в металлический электрод может ограничить субстрата и АБС битор благодаря реактивности электрод поддержки к малых молекул, таких, как CO, CN, CO2 и т.д. Протон сокращения и собственн-собранные монослоя десорбции могут быть проблематичными на металлических поверхностях на весьма негативные потенциалы,1,52 хотя фермента электрокатализа на незащищенные металлические электроды сообщалось. 53 , 54 недостатком PFIRE относительно SEIRA является относительная трудность включения мембранных белков в родной или миметические мембраны архитектуры. Однако относительная химическая инертность углеродных электродов для конкурирующих реакций активации малые молекулы делает PFIRE отличную технику для изучения электрокатализа фермента, особенно в области низкопродуктивных отношение к биологической окислительно-восстановительные процессы, такие как Протон сокращения трансгидрогеназы. 1 , 43

Целью этой статьи является ознакомление PFIRE метод как метод для изучения белков Редокс электроды прикол, используя NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) от кишечной палочки в качестве примера. Обсуждаются вопросы пробоподготовки, требование, хороший субстрат потока и обработки данных. PFIRE является широко применимым методом, хорошо подходит для изучения любой редокс белок (с характерным IR absorbances), который может адсорбироваться на углеродных электродов, либо непосредственно или с помощью модификации поверхности, таким образом, что она может обмениваться электронов с электрод.

Protocol

1. Повторное создание внутренней образец купе спектрометром FTIR внутри анаэробных, сухой бардачком и экспериментальной общие требования

  1. Использование коммерческих Спектрометр FTIR, оснащен внешней Меркурий кадмий теллурид (MCT) детектор и ATR аксессуар. Очистить тело спектрометр с сухого воздуха или азота, или альтернативно использовать спектрометр с эвакуированных оптическая скамья.
  2. Место спектрометр на таблицу стабильной, вибраций на той же высоте, как анаэробные (< 1 ppm O2), сухие бардачком (точка росы <-75 ° C). Отвлечь ИК луч спектрометра в бардачком, через ИК прозрачное окно, которое достаточно большой, чтобы вместить расфокусированные луча.
    Примечание: Важно что пространство между бардачком и спектрометр также очищена или эвакуированы, особенно если используется например, гигроскопичная окна материал, например NaCl или KBr.
  3. Реплицировать внутренней образец купе спектрометра внутри бардачком.
    1. Прямой луч внутри бардачком на внеосевые эллипсоидальной зеркало, в идеале с же Фокусное расстояние как внутренней фокусировки зеркало спектрометра.
      Примечание: Это полезно иметь две дополнительные плоскости зеркал размещены до этого фокусируя зеркало, с тем чтобы позволить высоты и направления ИК луча необходимо скорректировать внутри бардачком; Это будет компенсировать неточности в первичное размещение спектрометра.
    2. Место внешней MCT-детектор, с подходящей упором оптика (например, короткий Фокусное ZnSe линзы, или Внеосевые параболические зеркало, с фокусным расстоянием короткий) внутри бардачком, позиционируется как реплицировать размеры внутреннего образца отсек для спектрометра.
    3. Отрегулируйте «фокус» ИК луч быть примерно одинаковом расстоянии между фокусируя зеркало и MCT-детектор.
  4. Прохладный Дьюар внешней MCT-детектор с жидким азотом.
  5. Смонтируйте ATR аксессуар в отсеке образца бардачком. Совместите ввода и вывода, Оптика и ATR аксессуар для достижения максимальной пропускной способности для MCT-детектор. При необходимости, используйте диафрагмы или других подходящих затухания (например проволочной сеткой) во избежание перенасыщения детектор сигнала.
    Примечание: для данных, представленных здесь, в пяти отражение ATR аксессуар с всеми Светоотражающий оптике и съемный трапециевидной Si, используется элемент внутреннего отражения (IRE) (Crystal GmbH, размеры ca 5 × 8 × 1 мм3, угол лицом 39,5 °). IRE монтируется в съемный baseplate вырезаются из полиэфирных кетонов эфира (PEEK).
  6. Используйте бардачком дом воссозданный образец купе с подходящим проходные разрешить подключение к внешне здание потенцио (газ, туго BNC соединения полезны для этой цели), газ доступ и кабель для передачи сигнала от MCT детектор. Важно сохранить любые защитные на детектор кабеля, чтобы избежать введения шум или вмешательства для измерения.
  7. Место Перистальтический насос, способный более чем 60 мл/мин внутри бардачком скорости потока. Схематическое представление спектрометра, ATR аксессуар, Перистальтический насос и потенцио установки показано на рисунке 1.
  8. Постройте spectroelectrochemical ячейки, например, схематически показанное на рисунке 2, что тюлени на ATR аксессуар. Ячейка должна содержать большую площадь поверхности Счетчик электрода (Pt проволоки или марлей), подключение для рабочих электродом (род углерода) и электрод сравнения миниатюрные. Ячейка должна содержать по крайней мере два дополнительные порты как вход и выход для быстрого потока решений через ячейку.
    Примечание: Электрод сравнения насыщенных каломель миниатюрные идеально подходит для этой цели. 36

2. Подготовка частиц сажи, модифицированные с E. coli Hydrogenase 1

  1. В «влажный» анаэробных бардачком, смешать 20 мг большой площадью поверхности частиц сажи (> 1000 м3/г) с 1 мл сверхвысокой чистоты воды (удельное сопротивление > 18 MΩ см) в пробки microcentrifuge. Дисперсные частицы, sonication малой мощности (< 100 Вт) для по крайней мере 15 минут, или до тех пор, пока дисперсии единообразных и делает не осадков в течение 1 ч, чтобы дать сажи дисперсии с загрузкой около 20 мг/мл.
  2. Возьмите Алиготе E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, приблизительно 50 мкл, подготовленный в соответствии с опубликованным процедура55) в концентрации белка ~ 7 мг/мл и обменять его в низкой ионной силы буфер рН недалеко от изоэлектрической точки (для Пример фосфат калия, 15 мм, pH 5.8, без дополнительных соли). Для достижения наилучших результатов, используйте ферментный препарат, который так активно, как возможно. Выполните буфер обмена по концентрации и разрежения, в устройство центробежного фильтра с соответствующей низкомолекулярных отсечки (50 kDa работает хорошо для Hyd1).
    1. Добавьте Hyd1 в фильтр устройства.
    2. Разбавьте приблизительно 450 мкл буфера обмена.
    3. Reconcentrate объемом 50 мкл, используя мягкий центрифугирования (< ~ 2700 × g) для предотвращения необратимого осадков.
    4. Повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3, до тех пор, пока буфер обмена полный (обычно в течение ~ 5 циклов).
  3. Смешайте 5 мкл объем 20 мг/мл сажи дисперсии (подготовлен в 2.1) с 50 мкл Алиготе буфера обмена Hyd1. Храните смесь ферментов частиц в холодильнике (при 0 ° C) на ночь чтобы позволить энзим адсорбируются. Это может быть необходимо взбалтывают смесь иногда, чтобы убедиться, что частицы остаются разрозненных.
  4. Промывочный Hyd1-модифицированные частиц с низкой ионной силы буфера (фосфат калия, 15 мм, pH 5.8, без дополнительных соли) последовательные циклы седиментации и повторного распыления в microcentrifuge (~ 2700 × г). Повторите этот процесс 3 - 5 раз для удаления не адсорбируется фермента.
    Примечание: Перед первой стирки супернатант должно быть практически бесцветная, указанием хороших адсорбции фермента.
  5. Концентрат частицы в окончательный объем ~ 5 мкл, чтобы дать окончательный загрузки ~ 20 мг/мл модифицированного фермента частиц.
    Примечание: Hyd1-модифицированные частицы могут храниться при температуре 4 ° C на срок до двух недель если они остаются обезвоживания; Это лучше всего достигается путем сохранения частиц, разбавленным с ~ 50 мкл сверхвысокой чистоты воды.

3. Подготовка к PFIRE измерениям на E. coli Hydrogenase 1

  1. Чистота Si IRE, маломощных sonication (< 100 Вт), сначала в H2так4 (< 90% w/w) ~ 15 мин, а затем в HNO3 (70% w/w) до 1 ч. Эта процедура чистки должно привести к поверхности гидрофильных IRE. При необходимости дальнейшей очистки гнев могут быть размещены в растворе Пиранья (соотношение 1:3 H2O2: H2т-4) для окисления любых оставшихся органического материала.
    Примечание: Жестковатый кислотной очистки методы не могут быть пригодны для использования со всеми материалами, IRE. Пиранья решение сильнокоррозионные и сильным окислителем, поверхности должны быть разумно чистыми до использования решения Пиранья и ухода должны быть приняты в ходе подготовки и использования Пиранья решения ввиду экзотермического процесса - всегда добавить H2O 2 медленно H2т4 и обратитесь к соответствующей безопасности процедур подготовки, использования и удаления.
  2. Промойте чистой IRE в сверхвысокой чистоты воды и высушить под струей газа сухим азотом. Выполните все Призма обработки с помощью чистого пинцета, чтобы избежать загрязнения.
  3. Уплотнение IRE в аксессуар baseplate ATR, используя тонкую полоску электрических класса силиконовый герметик. Позаботьтесь, чтобы ограничить герметика к краям гнев. Разрешить герметик высохнуть полностью.
  4. Передать спектрометр бардачком ATR аксессуар плите и смонтировать его на ATR аксессуар. Мера ссылку (фон) спектра между 4000-1000 см-1 с разрешением 4 см-1 , используя стандартный быстрого сканирования режим спектрометра и 1024 усредненной интерферограмм (измерение времени ~ 3-5 мин). Используйте этот спектр качестве входных данных, чтобы разрешить вычисление спектров поглощения позже в эксперименте.
    Примечание: Из-за малого поглощения, ожидаемый для Hyd1 активного узла необходимо собрать спектры с высоким сигнал шум соотношения.
  5. Передать аксессуар baseplate ATR «влажный» бардачком, который содержит заранее подготовленные частиц Hyd1-изменение дисперсии (раздел 2). Капля литой 1 мкл Алиготе дисперсии частиц на большие лицо гнев и равномерно по всей поверхности. Примечание: Не позволяют частицы стать полностью высохнет на гнев.
  6. Отрежьте кусок бумаги углерода, например, используется в качестве газовой диффузии слой материала в топливных элементах, чтобы размер ~0.1 мм меньше, чем поверхность размеры IRE (т.е. ОК. 8.2 × 4.9 мм2). Площадь поверхности копировальная бумага должна быть достаточно большой, чтобы покрыть Hyd1-модифицированные частицы падение литой, но не настолько велико, что перекрываются силиконовый герметик используется для обеспечения гнев. Замочите копировальную бумагу в воде и осторожно поместите его в верхней части фильма частиц. Бумага копировальная обеспечит хорошее электрическое соединение через весь частиц фильм.
    Примечание: Это полезно заранее подготовить несколько кусков копировальную бумагу, и хранить их предварительно замачивают в воде сверхвысокой чистоты внутри «влажный» анаэробных бардачком.
  7. Смонтировать spectroelectrochemical клеток (описано в 1,7 и схематически показано на рис. 2) над IRE, закрепите его на плите с винтами. ~ 200 мкл экспериментальной буфера держать гидратированных фермента. Смешанные буферной системы, способной буферизации в широком диапазоне рН, полезно для исследования на NiFe трансгидрогеназы:56 ацетат натрия, 2-[N'-Морфолино] сульфонольно Этановая кислота (МЧС), N'-[2-гидроксиэтилкрахмала] пиперазина -N' -[2-Этан сульфонольно кислота] (HEPES), N'-метил-3-амино пропан сульфонольно кислоты трис [гидроксиметил] (краны) и 2-[N'-cyclohexylamino] этана сульфонольно кислоты (КМУ), с каждым компонентом в конечной концентрации 15 мм и содержащие 0,1 М NaCl в качестве электролита, с рН скорректированы с помощью рН 6 сосредоточена NaOH и HCl.
    Примечание: Рабочих электродом подключение должно выступать чуть ниже плоскости верхней ячейки spectroelectrochemical (~0.1 мм) для обеспечения хорошей электронной подключение к копировальная бумага (рис. 2).
  8. Подключите решение входе и выходе spectroelectrochemical клетки к поток системы, содержащей Перистальтический насос шланги и флакон экспериментальной буфера. Передать собранные ячейки «сухой» бардачком, содержащие спектрометр.
  9. Маунт spectroelectrochemical cell Ассамблеи на ATR аксессуар. Подключите к потенцио рабочих, счетчик и справочник электродов. Подключите насос перистальтический трубки к насосу.
  10. Запись спектр поглощения с интерферограмм 1024 в среднем на 4 см-1 резолюции в спектральном диапазоне 4000-1000 см-1, используя спектр собранных в 3.4 как ссылка/фон. В этот момент должен содержать значительный спектр (> 100 mO.D.) амидных II полос на ~ 1,540 см-1 и активного сайта полосы Hyd1 должно быть очевидным в спектральном диапазоне 1850-2 150 см-1, главным образом в Штатах окисляется, неактивные (рис. 3 ).

4. Активация E. coli Hydrogenase 1 и тестирования Spectroelectrochemical клеток

  1. Применять сокращения потенциал (−0.8 V против SCE) к фильму изменение Hyd1 частиц. Насытить экспериментальный буфер с H2 и потока буфера медленно через spectroelectrochemical клеток. Оставьте на ночь, чтобы полностью активировать Hyd1 образца.
    Примечание: Важно использовать анаэробных H2, N2 и т.д.и поэтому все анаэробных газы должны передаваться через фильтр2 O.
  2. Запись спектр поглощения образца после активации. ΝCO и полосCN vактивного сайта теперь должна показывать распределение сокращения, «активных» государств. Легче всего это наблюдается за счет использования спектра разница, по отношению к spectrum, записанная в 3.10 (рис. 4).
  3. Проверьте электрическое подключение spectroelectrochemical ячейки. Для этого, насыщают экспериментальный буфера N2 газ. Применять последовательность окисляющие (0 V против SCE) и сокращения потенциалов (−0.8 V против SCE) (продолжительностью 30 минут ca ) на Hyd1-модифицированные частиц фильм и записывать спектра поглощения на каждом. Hyd1 должен стать быстро окисляется и уменьшена, и если частица фильм хорошо связан 100% выборки должен реагировать прикладной потенциал.
  4. Установите соответствующий расход экспериментальной буфера. Для этого применяются сокращения потенциал (−0.8 V против SCE) к образцу и насыщают экспериментальный буфер с H2. Запись серии циклических voltammograms между-0.707 - 0.039 V против ПКЭ со скоростью сканирования 10 МВ/s. постепенно увеличивать скорость потока H2-насыщенный буфера между voltammograms до катализатора филировки напоминает, что в плоскости вращения диск электрода55 и максимальный ток зависит от скорости потока (рис. 5).
    Примечание: Растворимость предел2 Ч в воде составляет ~0.8 мм 293 K и 1 бар.
  5. Как образец теперь готова к PFIRE измерениям, соберите спектров в диапазоне потенциалов, под широкий спектр условий раствор (pH, температуры, концентрации H2 и т.д.). Запись всех электрохимических данных с использованием программного обеспечения потенцио, как важно иметь возможность соотнести спектроскопические и электрохимических данных, особенно при изучении электрокаталитическая процессов, таких как окисление2 H по Hyd1.

5. спектральные данные обработки

  1. Подтвердите, что на активном узле не изменялся постоянно в ходе измерений путем записывать спектры 0 V и −0.8 V против ПКЭ в конце эксперимента. Они должны быть идентичны спектры, записанная в 4.3, и без потери активного сайта должны соблюдаться во время измерения (рис. 6).
  2. Экспорт абсолютная поглощения спектров от программного обеспечения спектрометра в подходящий формат (.csv, ASCII, «matlab», Jcamp и т.д.) для обработки с использованием программного обеспечения таких как происхождение или Matlab.
  3. Базовые исправить данные, с помощью процесса, показано на рисунке 7.
    1. Возьмите вторую производную каждого абсорбция спектра в диапазоне 1800-2 150 см-1, для выявления мелких (< 1 mO.D.) активного сайта полосы на фоне высоко изогнутые воды.
    2. Место исходных точек маркеров на оригинальные спектра поглощения и задать точки «привязать» экспериментальный спектра.
    3. Установите базовые через точки, используя функцию интерполированные Кубический сплайн или выполнения полиномиальной функции. Вычтите этот базовые функции из экспериментальных данных.

Representative Results

Рисунок 1 показывает схематическое представление механизма экспериментальной системы спектрометр, бардачком, ATR аксессуар, потенцио и газового потока используется для PFIRE измерений. Рисунок 2 показывает представитель рисование ячейки spectroelectrochemical.

Рисунок 3 показывает спектры поглощения падение литой Hyd1-модифицированные частиц, с экспериментальной буфера (смешанные буфера системы, описанной в 3.7, рН 6,0) течет через spectroelectrochemical клеток. Поверхность покрытия Hyd1 особенно высока в примере, показанном на рис. 3, с интенсивностью группы II Амида ~ 235 mO.D. и минимальный «основной» воды, что подтверждается масштабы растяжения регионе O-H (~ 3000-3600 см-1) по отношению к полосе на ~ 1640 человек см-1, который является свертка Амида я полоса Hyd1 и изгиб воды H-O-H. Дополнительные полосы благодаря белок можно увидеть в регионе растяжения C-H (ca 2900 см-1). Широкая полоса вокруг 2100 см-1 — сочетание группа H-O-H изгиб вибрации с набором меньше энергии либрации полос, которые ограничены вращений H2O молекул благодаря сети соединения водорода в жидкой воды. ΝCO группа окисляется, неактивные, состояния Ni-B на активном узле совершенно очевидно в 1943 см-1, даже без коррекция базовой линии, и νCN функции хорошо видны между 2 050-2100 см-1 . На высоких Hyd1 покрытий большая часть Микропористая структура сажи фильм57 блокируется ферментом и поэтому снижается концентрация воды «основной» во время PFIRE измерений.

Спектры в рисунке 3 показывают, что до активации, Hyd1 фильмы содержат Hyd1 окисляется, неактивные государств. Активации ночь в −0.8 V против ПКЭ в атмосфере2 H приводит к образованию уменьшена, каталитически активных государств, как показано на рис. 4 , который показывает спектр как подготовленные (окисляется) разница активированные (снижение) минус из Hyd1. Разница спектров Hyd1 может интерпретироваться наиболее явно с использованием регионаCO ν. Каждое уникальное состояние активного узла имеется только одна полоса CO, по сравнению с двух полос CN и поэтому регионCN νнеразрывно сложнее, с много перекрывающихся диапазонов. Спектр разница на рисунке 4 показывает, что активация приводит к потере (отрицательный поглощающими) окисляется, неактивные Ni-B и небольшое количество Ni-SI (состояние наиболее окисленных «активных»), который присутствовал в фильме как подготовлен Hyd1. Они заменяются на «активных» государства Hyd1; Ni-C, Ni-R и Ni-л Обратите внимание, что существуют две формы Ni-R и Ni-L государства, о чем свидетельствуют два νCO полос наблюдается для этих видов на рисунке 4. Наблюдение за несколькими Ni-R и Ni-L государств согласуется с другими NiFe трансгидрогеназы. 48 , 58 , 59

Проверка метода PFIRE является, что циклических voltammograms записали Hyd1 внутри spectroelectrochemical потока клеток шоу аналогичные каталитического волновые формы для тех, кто записан на Вселенский вращающегося диска электрода. 55 на практике это означает, что массовые перевозки субстрата (2H) и продукта (H+) из иммобилизованных Hyd1 в ячейке spectroelectrochemical эффективен при скорости потока, используемые во время PFIRE измерений. Влияние скорости потока на каталитической филировки показано на Рисунок 5, который показывает последовательных voltammograms, записанный под атмосфере2 H (1 бар)) при увеличении скорости потока раствора через spectroelectrochemical клеток. Во всех случаях перенапряжение H2 окисления Hyd1 является идентичным (красный затененный прямоугольник), но степень окислительного инактивация (гистерезис между текущим во время окислительного и восстановительной зачисток потенциалов выше ca 0 V против SCE) и максимальное окисление H2 текущий зависят скорость потока раствора. При скорости потока выше 52 мл/мин (светло серые voltammogram) каталитического филировки нечувствительна к дальнейшей увеличивает скорость потока.

Рисунок 6 сравнивает относительных интенсивностей полосе νCO, Ni-B государства после первоначальной активации и анаэробных ре окисления на 0 V против ПКЭ (под Ar атмосферу, как описано в разделе 4.3) и анаэробной окислительного инактивации под Ar атмосферу на 0 V против ПКЭ после 48 ч непрерывной эксперименты (как описано в разделе 5.1). Без потери активного сайта группы интенсивности наблюдается во время измерения, и все Hyd1 образца реагирует на прикладной потенциал.

Рисунок 7 демонстрирует процедуру коррекции базовой линии, используется на протяжении всей этой работы. Абсолютная спектр Hyd1 образца в регионе активного узла (рис. 7) содержит значительные кривизны из-за воды. В самом деле требование использовать воду в качестве растворителя является проблемой для большинства приложений ИК-спектроскопии в науках о жизни. Вторая производная абсолютной спектра (рис. 7б), рассчитаны с использованием программного обеспечения происхождения с Савицкого-Голея, сглаживая 9 точки окна, может использоваться для идентификации острые полосы на активном узле Hyd1 на фоне изогнутые. Идентификация приблизительное наивысшие позиции с помощью второй производной спектра позволяет базовых опорные точки, чтобы быть помещены в регионах абсолютное спектра, которые свободны от активного узла полос (круги на рис. 7). Кубическая сплайн функции затем устанавливается через эти опорные точки для создания базовой функции, которая затем может быть вычтен из абсолютной спектра дать базовый исправлены спектра, содержащие только пики, вытекающих из Hyd1 активного узла (рис. 7 c).

Рисунок 8 показывает результаты измерений PFIRE на Hyd1, под-оборота (Ar атмосферы) и условий (H2 атмосфера) оборот в диапазоне потенциалов. 36 следы текущего времени (рис. 8) доклад о каталитической ток на каждом применяется потенциал и оставаться близко к нулевой ток-оборот условиях (Ar атмосферы). Частичная spectroelectrochemical редокс титрования в рисунке 8b поэтому сообщает о равновесия редокс поведение на активном узле, показывающий распределение государств ожидалось на каждом потенциал в отсутствие каталитических оборота. Спектры в рисунке 8c были записаны в условиях оборот (под H2 атмосферы) и поэтому представляют установившегося распределение активного сайта государств во время каталитического окисления2 H по Hyd1. Добиться устойчивого состояния подтверждается тот факт, что каталитическая H2 окисления текущего (рис. 8, H2) остается неизменным как функцию от времени на −0.199 V и −0.074 V против она; монотонная распада в ток на +0.356 V против она обусловлена известных анаэробных окислительного инактивации Hyd1. 55 распределение активного сайта государств явно отличается по2 Ar и H на всех потенциалов где Hyd1 выполняет катализа (Рисунок 8b, спектры в −0.199, −0.074 и +0.356 V против она). Спектры, записанный под Ar и H2 практически идентичны на −0.594 V против она, однако, и это представляет важный тест экспериментальной согласованности; Hyd1 не уменьшить H+ значительной скоростью при pH 6.0 (ток в рисунке 8 под Ar и H2 близка к нулю), и спектры в −0.594 V, как ожидается, поэтому быть таким же.

Рисунок 9 демонстрирует анаэробных окислительного инактивирование Hyd1 через формирование Ni-B от Ni-SI при окислении2 Ч в +0.356 V.36 спектров были записаны во время серый временных интервалов, отметил на следе текущего времени на рисунке 9. В −0.074 V Hyd1 не подвергается окислительной инактивации, и распределение активного сайта государств остается постоянной на протяжении всего потенциальных шаг. Это подтверждается спектры в рисунке 9bя, который сообщает абсолютной базовый исправлены спектра в начале −0.074 потенциал шаг и Рисунок 9bii , который был записан на более позднем время в потенциальных шаг и сообщается как разница спектра относительно Рисунок 9b,я. Спектры в рисунке 9biii и biv также помечаются как разница спектров относительно Рисунок 9b,яи шоу постепенного преобразования Ni-Si, Ni-b во время высокого потенциала инактивации, в соответствии с монотонное уменьшение тока в +0.356 V на рисунке 9.

Спектры, записанная в диапазоне pH раствора дают представление о перенос протона шаги во время Hyd1 каталитического цикла. 43 Рисунок 10 показывает PFIRE спектры, записанные на один и тот же фильм Hyd1 на pH 3.0 и рН 9,0, используя решения потока в ячейке spectroelectrochemical для экспериментальной буфера обмена. Относительной концентрации Ni-C и Ni-L государств явно отличаются в этих двух спектров. Варьируя прикладной потенциал в условиях-оборот потенциальных зависимость NiC и Ni-L государства может быть определена быстро в диапазоне значений рН (рис. 10b), и оба государства будут признаны исопотенциальной более широком диапазоне рН. (Обратите внимание, что пик absorbances на рис. 10b Показать только Ni-C и Ni-L государства для ясности, полное редокс, которую Идальго et al.сообщили титрования Hyd1) 36 рН титрования концентрации Ni-C и Ni-L можно извлечь, принимая пик поглощения потенциалов, где общая концентрация Ni-C и Ni-L находится на своего максимума на каждом рН (рис. 10c). Таким образом и в сочетании с данными ОРЭД pH равновесия между Ni-C и Ni-L государствами было определено. 43

Figure 1
Рисунок 1: Схема расположения ИК-спектрометр, анаэробные бардачком, ATR аксессуар, MCT-детектор, газовые системы потока и потенцио используется для измерения PFIRE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схема ячейки spectroelectrochemical для измерения PFIRE, показаны расположения электродов и решение соединения на входе/выходе. С резьбовыми отверстиями для углерода род работы подключения электродов, Pt провода счетчика электрода, насыщенных каломель электрод сравнения и решение входе и выходе из полиэфирных кетонов эфира (PEEK), машинной работы клеток и опорной плиты. Строительство электрода насыщенных каломель ссылку как ранее сообщалось. 36 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: спектр поглощения Hyd1-модифицированные сажи частиц, хранение на гнев и регидратации с буфером. Показаны позиции Амида, которую группы I, амидной группы II и Hyd1 активный сайт региона, наряду с дополнительными возможностями из-за растяжения вибрации C-H и жидкостной воды. Врезные показывает увеличенный вид активного сайта региона, с vCO и vCN полос помечены. «Как подготовлен» частицы содержат Hyd1 главным образом в окисляется, неактивные состояния Ni-B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Активация Hyd1 на −0.8 V против ПКЭ под H2 атмосферы, представлены как спектр окисленных разница сокращение минус . После низким потенциальным активации окисляется неактивные Ni-B (и небольшой концентрации Ni-SI) преобразует государствам больше снижение, активный Ni-C, Ni-R и Ni-л Заметим, что Hyd1 имеет два подпункта состояния Ni-L и Ni-R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Влияние скорости потока раствора на филировки каталитического циклических voltammograms записан в ячейке spectroelectrochemical. Voltammograms были записаны на увеличение скорости потока H2-насыщенный буфера, как указано. Со скоростью потока 20 мл/мин (красный) voltammogram показывает значительные инактивации выше 0 V против она вперед сканирования. При скорости потока выше 52 мл/мин значительно меньше степень инактивации и ток зависит от скорости потока на всех потенциалов. Другие параметры: 1 бар H2, 10 МВ/s скорость сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Базовые исправлены ИК спектры в регионе CO νактивного узла окисляется, неактивные состояния Ni-B на 0 V против SCE. Нет измеримые потери активного сайта интенсивности в течение 48 часов непрерывных измерений PFIRE, и поэтому Hyd1 адсорбированные надежно на частицы сажи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Сведения о базовой коррекции процедур, используемых для обработки данных. Базовые узловые точки размещаются абсолютной абсорбция спектра в регионе активного узла (), заботясь, чтобы избежать любой νCO νCN пики и определены от второй производной анализа (b). (C) показан результирующий исправленные спектр базовых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: PFIRE измерения на Hyd1 условиях-оборота (Ar) и оборот (2H). () текущего времени следы Hyd1 в ячейке spectroelectrochemical Ar насыщенный (серый) и H2-насыщенный (черный) буфер; (b), (c) PFIRE спектры показаны νCO региона на каждом потенциал под Ar (b) и (c) H2 . Потенциалы цитируется в V против она. Воспроизводится с разрешения от Идальго и др. 35 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: Анаэробных инактивации формирования Hyd1 через Ni-B от Ni-SI. () текущего времени трассировки под H2 атмосферы, показывая стабильный электрокаталитическая ток на −0.074 V и медленно анаэробных инактивации (монотонное уменьшение тока) на +0.356 V против она. (b) спектры записаны во время Серый затененный регионов, отмеченные в (). Спектра b,я это базовые исправленные спектр записаны в начале шага потенциальных −0.074 V. Спектра bii, записанная на более позднее время в ходе этапа V −0.074 сообщается как разница спектра относительно b,я и показывает, что никаких изменений в распределении государств активного сайта происходит, в соответствии с стабильности потенциал на −0.074 V. Спектры biii и biv сообщается также как разница спектров относительно b,я и показать постепенного преобразования Ni-Si, Ni-b при анаэробных инактивации на +0.356 V против она. Воспроизводится с разрешения от Идальго и др. 35 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10 : Спектры, записанная в диапазоне pH раствора дают представление о протонный перенос шагов во время цикла каталитического Hyd1. () ИК спектры показаны νCO региона Hyd1, записанная на pH 3.0 (-54 mV против она) и рН 9,0 (-334 mV против она). (b) Spectroelectrochemical титрования были проведены для определения потенциала, в которых концентрации Ni-C и Ni-L находятся на максимум в диапазоне значений рН раствора. Для ясности, для полного spectroelectrochemical титрование Hyd1 Престола Идальго et al. приведены только концентрации Ni-C и Ni-L 36 (c) рН зависимость относительной концентрации Ni-C и Ni-L, как определено из серии экспериментов, например указанных в пункте (b). Спектры были записаны при 20 ° C. Адаптирована с разрешения Мерфи и др. 42 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

PFIRE методика широко применимым ИК спектроскопических для адресации электрод прикол редокс белков. В частности электрокаталитические реакции окислительно-восстановительных ферментов может быть исследован в условиях быстрого оборота. Метод PFIRE строит на прямых электрохимических управления, представленная техника PFE, который не предоставляет прямых структурной информации и пары с ИК-спектроскопии в углеродных электродов. PFIRE подход таким образом добавляет химический анализ имеющейся информации от электрохимии самостоятельно и очень подходит для изучения редокс белков и ферментов, участвует в малые молекулы привязке и активации. Кроме того PFIRE предоставят информацию о потенциал зависимых структурные изменения в белках в отсутствие каталитических оборота. Такие события передачи электронов-оборот зачастую трудно обнаружить с помощью «стандарт» приложений PFE, хотя расширение PFE для Фурье преобразования переменного тока вольтамперометрии использовался с большим успехом. 45 , 46

Метод PFIRE является, в принципе, подходит для изучения любого редокс белков, которые могут быть изучены с помощью PFE. Таким образом как и в случае с PFE, белок адсорбции является важным шагом для успешного эксперимента PFIRE. В этом протоколе мы описывают приложение PFIRE техники, используя E. coli Hyd1 в качестве тематического исследования. 36 , 43 однако, мы также применили технику PFIRE цитоплазматических регулирования hydrogenase от р. eutropha,44 и Флавинмононуклеотид адсорбированные на углерод. 40 во всех этих случаях, простой физической адсорбции неизмененном высокой поверхности сажи (как описано в настоящем протоколе) обеспечивает поверхности покрытие белка, который является достаточно высоким, чтобы хорошее качество записи ИК спектры с высоким соотношением сигнал шум. В тех случаях, когда невозможно достичь такой высокий уровень адсорбции может быть необходимо изменить на поверхности частиц углерода, например разрешить ковалентных вложение белка на поверхности электрода. 60 , 61 , 62 бардачком для PFIRE измерений используется только строго необходимыми при изучении образцов, которые должны быть обработаны методом анаэробной очистки. Однако на практике чрезвычайно постоянной и уровней низкого (точка росы < 80 ° C) водяного пара, предоставляемый бардачком атмосфера дает высокий уровень сигнала к шуму, которые позволяют извлечение очень маленькие absorbances. 44 во многих случаях анаэробной среде, например, предоставляемый бардачком, желательно также для электрохимических измерений (неотъемлемой частью PFIRE техника) для того, чтобы избежать текущих за счет уменьшения2 O на рабочем электроде.

ИК absorbances из-за воды, экспериментальных буферов и частицы углерода, на которых адсорбированные образца все в значительной степени способствовать экспериментальные спектры и может перекрывать полос интерес, особенно в амидной I, II и III регионов спектра. 63 региона Амида также содержит информацию из органических видов, таких как flavins или никотинамид кофакторы, а также субстратов и продукции многих реакций окисления и сокращения. В случае трансгидрогеназы NiFe νCO и νCN полос на активном узле попадают в довольно ясно области спектра и так PFIRE техника очень хорошо подходит для изучения этих ферментов. В других случаях однако, разница спектров, в сочетании с изотопный маркировки подходов может быть необходимо изолировать изменения вследствие подвижности белков. Аналогичные подходы были использованы для выявления, например, изменения протонирование, структурных перестроек и учиться Михаэлиса-Menten комплексов с использованием ИК-спектроскопии. 64 , 65 , 66 PFIRE не ограничивается, поэтому, исследование трансгидрогеназы, но может быть применен к любой редокс белок, содержащий (или чьи субстратов, продукты или ингибиторы содержат) группы с диагностики ИК Активные вибрации; окиси углерода dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,флавопротеидов14 ,40 и формате дегидрогеназ, например.

Близкой методикой, SEIRA, очень хорошо подходит к изучению связанный мембранами белков в среде biomimetic. 32 SEIRA является адаптация ИК-спектроскопии, который также использует конфигурацию ATR-IR и делает использование поверхности повышение эффекта, что усиливает поглощение ИК молекул, расположенных близко к (в течение нескольких Нм) на поверхности призмы ATR (IRE). SEIRA поэтому особенно чувствительна к спектральные изменения, которые происходят в пределах адсорбированных белка и мембраны архитектуры и относительно свободны от конкурирующих сигналов от растворителя и субстратов/ингибиторы в раствор. Это отчасти в отличие от PFIRE метод, описанный здесь, которая опирается на значительно большую глубину проникновения над поверхностью IRE (~ 1 мкм), означает, что PFIRE является более чувствительным к субстратам, продуктов или ингибиторы представить в растворе. Это повышенная чувствительность к «основной» растворителя может быть выгодным; Если субстрат или продукта можно наблюдать непосредственно в ИК, PFIRE спектры доклад о обоих установившемся кинетика долгоживущих активных видов и формирования связанный продукт во время электрокатализа. 69 способность наблюдать за стационарное состояние концентрации субстрата и продукта будут особенно ценными для ферментов, таких как угарный дегидрогеназа (которая катализирует реверсивные окисления CO-CO2, сильная ИК амортизатора) или Формиат дегидрогеназа (которая катализирует реверсивные окисления Формиат CO2).

В настоящее время PFIRE ограничивается установившегося кинетические исследования фермента электрокатализа благодаря макроскопических углеродных электродов, используется для «сосредоточиться» фермента на поверхность IRE для сбора данных и ATR-IR геометрии. В этом отношении PFIRE исследования NiFe трансгидрогеназы дополняет работу Дайер и коллег,,4950 , которые используют свет срабатывает переходных поглощения ИК спектроскопии для изучения кинетики югу оборот. Чтобы уменьшить spectroelectrochemical клеток,40 ведется работа и с использованием микроэлектродов время резолюции порядка микросекунд должны быть достижимыми. Это позволит исследование кинетики югу оборота для ферментов с частотами оборот до ca s 100-500-1и даст возможность изучения восстановительной и окислительных процессов.

В целом PFIRE является спектроскопический метод, который позволяет химическая характеристика электрокаталитическая реакций окислительно-восстановительных ферментов в условиях устойчивого состояния. PFIRE подход позволяет несколько химическое и Электрохимическое титрование осуществляться на том же образце фермента, как используются электроды высокой поверхности обеспечивают надежный адсорбции белка и ATR-IR геометрии позволяет простое решение exchange. Возможность собирать такую структурную информацию на месте во время функции фермента является бесценным инструментом для более широкого сообщества bioelectrochemistry.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса.

Acknowledgments

Работа K.A.V. и P.A.A. поддержали Европейский исследовательский совет (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), инженерных и естественных наук исследовательский совет IB Катализатор премии EP/N013514/1 и биотехнологии и биологических наук исследований Совет (BB/L009722/1 и BB/N006321/1). О.в. была поддержана Ministerio де наук y Tecnologìa, Университет Коста-Рики и Линкольн колледж, Оксфорд. Авторы признают сотрудников механической мастерской (химический факультет), г-н Чарли Эванс и г-н Чарли Джонс, для оказания помощи в разработке и производстве spectroelectrochemical клетки, используемые в этой работе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48, (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64, (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394, (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38, (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105, (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10, (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359, (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187, (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44, (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45, (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13, (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113, (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8, (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119, (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108, (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38, (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131, (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107, (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129, (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283, (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28, (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37, (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134, (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133, (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125, (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828, (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10, (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136, (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53, (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142, (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88, (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137, (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119, (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656, (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107, (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114, (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137, (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55, (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138, (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115, (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126, (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285, (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125, (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827, (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3, (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84, (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22, (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121, (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48, (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7, (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119, (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52, (85), 12665-12668 (2016).
Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления<sub>2</sub> H
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter