Summary
Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.
Abstract
Während der Endozytose sind verschmolzen synaptischen Vesikel Nervenausgänge, zulassend Vesicle recycling und damit die Aufrechterhaltung der synaptischen Übertragung während des Brennens von sich wiederholenden Nerv abrufbar. Beeinträchtigt Endozytose in pathologischen Zuständen führt zu einer Abnahme in der synaptischen Stärke und Gehirn-Funktionen. Hier beschreiben wir Methoden zur Messung der synaptischen Vesikel Endozytose an Säugetieren hippocampal Synapse in neuronalen Kultur. Wir überwachen synaptischen Vesikel Protein Endozytose durch die Verschmelzung einer synaptischen vesikuläre Membranprotein, einschließlich Synaptophysin und VAMP2/Synaptobrevin, mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein, das erhöht die vesikuläre lumenal Seite seiner Fluoreszenzintensität als der pH-Wert erhöht. Während Exozytose vesikuläre Lumen pH-Wert erhöht, während bei Endozytose vesikuläre Lumen pH wieder angesäuert ist. So zeigt eine Steigerung von pHluorin Fluoreszenzintensität Fusion, während eine Abnahme Endozytose des Proteins gekennzeichnet synaptischen Vesikel anzeigt. Neben der Verwendung der pHluorin-imaging-Methode Endozytose aufnehmen, überwacht wir vesikuläre Membran Endozytose durch Elektronenmikroskopie (EM) Messungen der Meerrettich Peroxidase (HRP) Aufnahme von Vesikeln. Schließlich überwacht wir die Bildung von Nerven terminal Membran Gruben zu verschiedenen Zeitpunkten nach hohen Kalium-induzierte Depolarisation. Der zeitlichen Verlauf des HRP-Aufnahme und Membran-Grube-Bildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Endozytose.
Introduction
Neurotransmitter im synaptischen Vesikeln gespeichert und durch Exozytose freigesetzt. Die synaptischen Vesikel Membran Protein sind dann durch Endozytose internalisiert und in die nächste Runde der Exozytose wiederverwendet. Endozytose von synaptischen Vesikel ist wichtig für die Aufrechterhaltung der synaptischen Vesikel Pools und entfernt überstehende Vesikel aus der Plasmamembran. Die pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein-pHluorin, die unter sauren Bedingungen abgeschreckt und dequenched im pH-neutralen, wurde zur Endozytose Zeitmessung Kurse in Zellen1,2,3live. Das pHluorin-Protein ist in der Regel der lumenal Seite der synaptischen Vesikel Proteine, wie Synaptophysin oder VAMP2/Synaptobrevin beigefügt. Im Ruhezustand wird pHluorin in 5,5 pH-Lumen der synaptischen Vesikel abgeschreckt. Fusion der Vesikel an die Plasmamembran macht das vesikuläre Lumen, die extrazelluläre Lösung, wenn der pH-Wert ~ 7.3 beträgt, was zu einem Anstieg in pHluorin Fluoreszenz. Nach Exozytose zerfällt die erhöhte Fluoreszenz durch Endozytose von synaptischen Vesikel Proteine gefolgt von Vesikel Re Versauerung innerhalb dieser wiederhergestellten Vesikel. Obwohl der Zerfall Endozytose und vesikuläre Re Versauerung reflektiert, spiegelt es meist Endozytose, weil Re Versauerung schneller als Endozytose in den meisten Bedingungen1,4. Die Zeitkonstante der Re Versauerung ist 3-4 s oder weniger5,6, die in der Regel als die 10 schneller s oder mehr erforderlich für Vesikel Endozytose4,5. Wenn Experimente erforderlich sind, um erneute Übersäuerung Endozytose unterscheiden, können Säure abschrecken Experimente mit 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES)-Lösung (25 mM) mit einem pH-Wert von 5,5 verwendet werden, um festzustellen, ob die synaptischen Vesikel Proteine abgerufen werden von der Plasmamembran über Endozytose1,3,4. So der pHluorin Fluoreszenz Intensität Anstieg spiegelt ein ausgewogenes Verhältnis von Exo und Endozytose, und die Abnahme nach Nervenstimulation speziell spiegelt Endozytose.
pHluorin Bildgebung verwendet werden, nicht nur um den zeitlichen Verlauf der Endozytose, sondern auch die Größe der synaptischen Vesikel Becken7,8zu messen, und die Wahrscheinlichkeit der evozierten Freisetzung und spontan release9. Viele Faktoren und Proteinen, die bei der Regulierung der Endozytose, wie Kalzium, lösliche NSF-Anlage Protein (SNARE) Rezeptorproteine, Brain-derived neurotrophen factor(BDNF) und Calcineurin wurden mit pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Darüber hinaus Freisetzung von Neurotransmitter nachgewiesen werden konnte, nicht nur primäre Neuronen sondern Neuroblastom-Zellen mit TIRFM17. Vor kurzem wurden pHluorin Varianten, DsRed, mOrange und pHTomato entwickelt, für die Überwachung der gleichzeitige Aufnahmen von mehreren Faktoren in eine einzige Synapse18,19. Beispielsweise wurde pHTomato mit Synaptophysin verschmolzen und mit einem genetisch codierte Kalzium-Anzeige (GCaMP5K) zum Überwachen von präsynaptischen Vesikel Fusion und Ca2 + Zustrom in die postsynaptischen Fach20verwendet. Daher bietet pHluorin angeschlossen an synaptischen Proteine eine nützliche Methode zur Analyse der Beziehung zwischen Endozytose und Exozytose.
EM ist eine andere Methode, die häufig verwendet, um die Endozytose, aufgrund der hohen räumlichen Auflösung zu studieren, die Ultrastrukturforschung Änderungen während der Endozytose zeigt. Zwei allgemeine Bereiche sind die Fähigkeit zu visualisieren, pathologische Veränderungen in Nervenzellen21 und Vesikel Proteine22zu verfolgen. Insbesondere die Beobachtung der synaptischen Vesikel-Aufnahme, Krümmung der Membran beschichtet durch Clathrin in der Periactive Zone und Endosomal Strukturen sind möglich mit EM3,23,24,25 ,26,27,28. Während EM mögliche Artefakte wie Fixiermittel-induzierte Fehlbildungen umfasst Endozytose beeinflussen können, und Datenanalyse ist sehr arbeitsintensiv, die Auflösung bietet eine attraktive Möglichkeit, Zellstruktur zu visualisieren. Fixativ Probleme und die Begrenzung in EM zeitlicher Auflösung können durch hohen Druck Einfrieren, bietet eine schnelle und nicht-chemischen Methode stabilisieren die filigranen Strukturen bei Endozytose27überwunden werden.
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Protocol
Hinweis: das folgende Protokoll beschreibt die pHluorin bildgebenden Verfahren und EM Methoden in kultivierten hippocampal Neuronen. pHluorin Monitore synaptischen Vesikel Protein Aufnahme in lebenden Zellen und EM erkennt Aufnahme von synaptischen Vesikel und Ultrastrukturforschung Änderungen.
Tierpflege und Verfahren NIH Richtlinien befolgt und waren von der NIH Tier Pflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.
1. pHluorin Imaging
- Hippocampal Neuronen Kultur
- Prepare Hippocampus Puffer (HB) durch die Kombination von 4 mM Nahco3 3 und 5 mM HEPES und pH 7.3 mit 5 M NaOH einstellen. Machen Sie das Kulturmedium durch Mischen Neurobasal Mittel, 2 % B27, 0,5 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Darüber hinaus bereiten Sie eine Mischung von HB Puffer mit 20 % fötalen Rinderserum (HB/20% FBS).
Hinweis: Diese Kultivierung Protokoll basiert auf Sankaranarayanan, Et al. 29 und Wu Et al. 24 - Maus Welpen zwischen postnatale Tag 0, Tag 2 in Kulturmedium zu enthaupten, und entpacken Sie das Gehirn in 4 ° C HB/20% FBS. Entfernen Sie den Hirnstamm und Thalamus, die Hippocampi verfügbar zu machen. Sezieren, die Hippocampi nach durch Entfernung der Hirnstamm und Thalamus, Freilegung und transfer zum frischen 4 ° C HB/20% FBS.
Hinweis: In der Regel ergibt sich eine ca. 4 x 10 5 Zellen/mL für einen Welpen (zwei Hippocampi). Reinigen Sie die anhaftenden Membranen mit Schere oder Pinzette, dann übertragen auf frischen 4 ° C HB/20% FBS. Entrollen dentate Gyrus und das Subiculum durch Schneiden mit der Schere zu isolieren, dann transfer zum frischen 4 ° C HB/20% FBS. - Jeder Hippocampus, durch Schneiden von Anfang bis Ende in etwa 10 Scheiben teilen und übertragen Sie sie auf eine 15 mL Polypropylen konischem Rohr.
- Nach Abzug des Gewebes zu begleichen, mit 10 mL HB/20% FBS waschen und waschen dann dreimal mit 10 mL HB.
- Aufschlusslösung von 137 mM NaCl, KCl 5 mM und 7 mM Na2HPO 4 25 mM HEPES vorzubereiten und auf pH 7,2 mit 5 M NaOH einstellen. Die Hippocampi entfernen Sie überstand. 2 mL der Aufschlusslösung 10 mg Trypsin und 1 mg DNase hinzu, und Filtern Sie durch eine sterile 0,22 µm Membran direkt auf die Probe-Pellet.
- Hippokampi für 5 min bei 37 ° C inkubieren dann zweimal mit 10 mL HB/20% FBS waschen und waschen dann einmal mit 10 mL der HB.
- Distanzieren die Zellen mit 6 mg MgSO 4 ∙ 7 H 2 O und 1 mg zu 2 mL HB und Sterilfilter auf die Hippocampi DNase pellet durch einen sterilen 0,22 µm-Filter. Distanzieren Sie sanft die Zellen durch vorsichtig verreiben und kümmert sich um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Gewebe-Partikel für 2 min vereinbaren lassen, und übertragen Sie dann langsam den Überstand auf eine andere Röhre.
- Add 3 mL HB/20% FBS Zellsuspension, und Zentrifuge oder 10 min bei 4 ° C und 1.000 u/min. Den Überstand verwerfen und in Kulturmedium Aufschwemmen.
- Platte 60.000 Zellen in 150 µL Nährmedium auf einem Poly-D-Lysin beschichtet 25 mm Durchmesser Deckgläschen, ohne Überlauf aus dem Deckglas ausgesetzt. Fügen Sie 2 mL vorgewärmten Kulturmedium 2 h nach Beschichtung. Deckgläsern in Kultivierung 6-Well-Platten oder sterile Petrischalen gepflegt werden.
- Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer 5 % CO 2 befeuchteten Inkubator in Kulturmedium für 14-21 Tage vor der Aufnahme. Die obere Hälfte des Mediums ändern während des Wachstums Kultur zweimal pro Woche.
- Prepare Hippocampus Puffer (HB) durch die Kombination von 4 mM Nahco3 3 und 5 mM HEPES und pH 7.3 mit 5 M NaOH einstellen. Machen Sie das Kulturmedium durch Mischen Neurobasal Mittel, 2 % B27, 0,5 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Darüber hinaus bereiten Sie eine Mischung von HB Puffer mit 20 % fötalen Rinderserum (HB/20% FBS).
- Transfection
- 6-7 Tage nach der Beschichtung, transfizieren Synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) oder VAMP2-pHluorin in hippocampal Neuronen. Verwenden Sie für SpH Cytomegalovirus (CMV) Förderer, eingefügt in eine pcDNA3-Vektor- 30. Für VAMP2-pHluorin, verwenden Sie einen CMV-Promotor in einem PCI-Vektor 31 eingefügt.
- Transfect entweder Vektors durch Lipid-Träger in Zielzellen, mit 1 µg Plasmid. Verwenden Sie Kulturmedium von Protokoll Schritt 1.1.1, die Serum fehlt, für die Transfektion. Ändern des Mediums 2 h nach Transfektion Toxizität reduzieren.
Hinweis: Bei geringer Expression von SpH in der Boutons, erhöhen Sie die DNA-Konzentration 2 µg oder die Inkubationszeit mit der Lipid-Träger, wenn die Zellen ungesund sind. In der Regel 4-10 Zellen (0,006-0,008 %) von Neuronen wurden transfiziert.
- Lichtmikroskopie
- normale Kochsalzlösung vorbereiten, bestehend aus 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0,01 mM) CNQX) und 0,05 mM DL-2-amino-5-Phosphonovaleric Säure (AP5). Nehmen Sie ein Deckglas aus dem Kulturmedium Platte und auf eine bildgebende Kammer, die Feld-Stimulation, mit Schmier- und Dichtungsmittel um Leckagen zu vermeiden kann. Lassen Sie das Glas während des Transfers von einem Deckgläschen aus der Platte in die Kammer trocknen durch Zugabe von sofort 750 µL normale Kochsalzlösung.
Hinweis: CNQX und AP5 wurden zur postsynaptischen Aktivität zu blockieren, die das Potenzial für wiederkehrende Aktivität hat. Vor eine Kammer auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop Reinigungstuch um zu bestätigen, dass die Kammer nicht leckt, verwenden. Langsam undicht Fokusänderungen während der Aufnahme durch das Mischen von normalen Kochsalzlösung und Immersion Öl, führt zu Veränderungen in der Brechungsindex Ursachen. - Stimulation und Aufnahme
- Bild auf eine invertierte Weitfeld-Mikroskop mit einer 60 X (1.4 numerische Apertur) Ölimmersion Objektiv mit einem Metalldampflampen. Visualisieren von pHluorin mit einem Filtersatz für eine Erregung Peak von 480 nm, 490 nm langen Pass Spiegel, einen 500-550 nm Emission Filter und ein manueller Flip Shutter. Die Aufnahmen alle 100 ms, mit 2 x 2 binning, mit einem Elektron Multiplikation kostenlos gekoppelten Gerät (EMCCD) Kamera.
Hinweis: Einige Features sollte als erreichen die richtigen Bedingungen Immunofluoreszenz, einschließlich das Bild Erfassungsintervall zu vermeiden und Filtern und binning, welche Ausrüstung abhängig. Bei konfokale Bildgebung berücksichtigen die Laser Power und Belichtung Zeit Immunofluoreszenz zu vermeiden. Das Setup war entschlossen, nach der Aufnahme mindestens 3 min ohne Reiz und die Aufnahme erfolgte für mindestens 10 s ohne Reiz für Immunofluoreszenz überprüfen. - Wählen Sie einen Bereich mit einer hohen Dichte von Boutons zur Erleichterung der Analyse in jedem Experiment. Transfizierte Zellen zu identifizieren, durch ihre grüne Fluoreszenzsignal, mit Schwerpunkt auf runden oder ovalen Expressionsmuster in der Bouton und kontinuierlichen Ausdruck zwischen Boutons.
- Induzieren Endozytose durch Feld Stimulation mit einer 1 ms Pulse, 20 mA Aktionspotential (AP) aus einem Puls-Stimulator versorgt und durch eine Platin-Elektrode innerhalb der Reiz-Isolierung-Einheit geliefert. Fluoreszenz-Aktivität im Verlauf der Stimulation und während der Zelle Wiederherstellung Bild.
Hinweis: Im Falle von abgestorbenen Zellen, Ausdruck war stärker als lebende Boutons und zeigte ein lückenhaftes Muster zwischen Boutons.
- Bild auf eine invertierte Weitfeld-Mikroskop mit einer 60 X (1.4 numerische Apertur) Ölimmersion Objektiv mit einem Metalldampflampen. Visualisieren von pHluorin mit einem Filtersatz für eine Erregung Peak von 480 nm, 490 nm langen Pass Spiegel, einen 500-550 nm Emission Filter und ein manueller Flip Shutter. Die Aufnahmen alle 100 ms, mit 2 x 2 binning, mit einem Elektron Multiplikation kostenlos gekoppelten Gerät (EMCCD) Kamera.
- normale Kochsalzlösung vorbereiten, bestehend aus 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0,01 mM) CNQX) und 0,05 mM DL-2-amino-5-Phosphonovaleric Säure (AP5). Nehmen Sie ein Deckglas aus dem Kulturmedium Platte und auf eine bildgebende Kammer, die Feld-Stimulation, mit Schmier- und Dichtungsmittel um Leckagen zu vermeiden kann. Lassen Sie das Glas während des Transfers von einem Deckgläschen aus der Platte in die Kammer trocknen durch Zugabe von sofort 750 µL normale Kochsalzlösung.
- Bildanalyse
- Für die Analyse der Fluoreszenzintensität in einem einzigen Bouton, festgelegt, eine Region von Interesse (ROI) als ein 1,5 x 1,5 µm quadratisch; die Größe des ein Bouton befindet sich etwa 1,5 µm. Gebrauchsspuren vor Stimulation für Immunofluoreszenz zu überprüfen und subtrahieren als Hintergrund.
- "Normalisieren" Fluoreszenz ändern (ΔF) mit der Gleichung:
wo F max und F 0 beziehen sich auf maximale Erhöhung nach Stimulation und Grundlinie Fluoreszenz, beziehungsweise. Messen Sie Endozytose Preise als die Rate des Zerfalls während der ersten 4-10 s nach dem maximalen Punkt der pHluorin Fluoreszenz. Erhalten die Zeitkonstante (τ) der Endozytose durch den Einbau des pHluorin Fluoreszenz Zerfalls aus der Erhöhung der Gipfel an der Grundlinie mit einem Mono-Exponentialfunktion.
2. Elektronenmikroskopie
- bereiten ein Poly-D-Lysin beschichtet 6-Well-Platte durch Anwendung von 1,5 mL 0,01 % steril filtriert Poly-D-Lysin-Lösung in jede Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur, dann dreimal mit sterilisierten Wasser waschen. Sezieren, Kultur und hippocampale Neuronen wie in den Schritten 1.1.1, 1.1.2 und 1.1.3, bzw. zu erhalten.
- Bereiten Sie eine hohe K +-Stimulation-Lösung mit HRP als 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 und 5 mg/mL HRP, dann passen Sie auf pH 7.4 mit 5 M NaOH.
- Stimulieren die hippocampal Neuronen-Kultur mit 1,5 mL hohe K + Stimulation Lösung bei Raumtemperatur (bezeichnet als K +) durch Zugabe von 1,5 mL in jede Vertiefung für 90 s. Im ruhenden Zustand (R genannt), gelten die gleiche Konzentration von 5 mg/mL HRP für 90 s, aber mit normalen Kochsalzlösung. Für die Wiederherstellung Probe gelten hohe K + Stimulation Lösung wie bei der K +-Probe, dann schnell waschen und mit normalen Kochsalzlösung ersetzen und inkubieren 10 min.
- Fixierung und Färbung
- 0,1 M Na Cacodylate Puffer mit 21,4 g/L Na Cacodylate bei pH 7.4 vorbereiten. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na Cacodylate Puffer für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Waschen dreimal mit 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min.
- Bereiten Diaminobenzidine (DAB) Lösung, bestehend aus 0,5 mg/mL des DAB mit 0,3 % H 2 O 2 in DdH 2 O und Filter mit einem 0,22 µm-Filter. Wenden Sie 1,5 mL DAB Lösung für 30 min bei 37 ° c zu waschen dreimal mit 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min.
Achtung: DAB ist eine giftige und Verdacht Karzinogen. Bitte benutzen Sie Handschuhe und Kittel.
Hinweis: Etikettierung mit DAB durch die Oxidation von H 2 O 2, tritt, wie von HRP katalysiert. Kleine Erhöhungen in den Komponenten ergeben ein erhöhtes Signal in der Probe. Erhöhung der Konzentration von HRP beschleunigt die Wirkung des Katalysators. Ausreichend hohe Konzentrationen von H 2 O 2 ermöglichen schwächenden Nebenreaktionen mit HRP, hemmen die Wirkung der Beschriftung 32. In dieser Arbeit wurden die Konzentrationen von dieser Kennzeichnung System basierend auf derzeit verfügbaren Forschung 33 , 34 ausgewählt. - Brüten die Neuronen mit 1,5 mL 1 % OsO 4 in 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 1 h bei 4 ° C als Fixierung post. Waschen dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Na Cacodylate Puffer für 7 min.
Achtung: Aufgrund der Toxizität und Reaktivität von OsO 4, der im Beispiel auf Eis in einem chemischen Haube zu halten empfiehlt sich in vielen Fällen mit einem Kühlschrank für die Inkubation. - Vorbereiten 0,1 M Natrium-Acetat-Puffer mit 13,61 g/L Natrium Acetat und 11,43 mL/L Eisessig bei pH 5,0. Drei Mal mit 1,5 mL 0,1 M Acetat-Puffer bei pH 5,0 für 7 min waschen und inkubieren Sie mit 1,5 mL 1 % Uranyl Acetat in 0,1 M Acetat-Puffer bei pH 5,0 für 1 h bei 4 ° C. Wash dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Acetat-Puffer für 7 min.
- Epoxidharz einbetten
- entwässern die Neuron-Kultur mit einzelnen 1,5 mL Waschungen von 50 %, 70 % und 90 % Ethanol, für 7 min in jedem und dann 3 wäscht von 1,5 mL 100 % Ethanol für 7 min in einer Dampfhaube.
- Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) Epoxydharz, 160 mL/L Dodecenyl Bernsteinsäure Anhydrid (DDSA), 340 mL/L Methyl-5-Norbornen-2,3-Dicarboxylic-Anhydrid (NMA) und 15 mL/L 2,4,6-Tris (Dimethylaminomethyl) Phenol (DMP-30) erstelle ich das Epoxidharz Harz. Mischung gründlich, dann speichern unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen.
Hinweis: Es ist wichtig, im Harz, insbesondere kleiner als mit dem bloßen Auge sichtbaren Luftblasen zu entfernen, da sie Hohlräume im Harz während schneiden verursachen können. - Infiltrat die Probe durch das Ersetzen des Ethanols mit 50 % Epoxy Harz in Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker, dann 70 % Epoxid-Harz in Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
- Schalter das Epoxid Harz Lösung mit 100 % Epoxidharz und inkubieren Sie für 10 min bei 50 ° c führen zwei Börsen frische 100 % Epoxidharz mit Inkubationen für 1 h bei 50 ° c hinzufügen frischen 100 % Epoxy Harz und lassen Sie Sie bei 50 ° C über Nacht und dann bei 60 & #17 verhärten 6; C für mehr als 36 h aushärten.
- Entfernen Sie jede Probe aus der Muti-Well-Platte mit einem Juwelier ' s Handsäge. Wählen Sie Regionen von Interesse, hohe Konzentration an Zellen, mit Hilfe einer invertierten Lichtmikroskop und schneiden dann 70 bis 80 nm Blöcke für durch Mikrotom schneiden. Montieren Sie die geschnittenen Region im Mikrotom Futter und laden Sie das Mikrotom. Positionieren Sie das Futter im Mikrotom und montieren ein Diamant Messer mit der Kante parallel zur Oberfläche des Blocks. Abschnitte von 70 bis 80 nm dicke direkt auf einzelne Netze sammeln.
- Lösen sich Uranyl Acetat in Wasser für eine 1 % ige Lösung von Gewicht und separat lösen Blei Citrat in Wasser für eine 3 % ige Lösung von Gewicht. Counterstain in den Abschnitten durch Überflutung mit 1 % wässrige Uranyl Acetat für 15 min und dann 3 % wässrige Blei Citrat für 5 min um den Kontrast der Proben zu verbessern.
- EM Bildgebung
- untersuchen die Abschnitte mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop und Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Digitalkamera bei einer primären Vergrößerung von 10.000-20, 000 X 3.
- Statistik
- führen einen t-Test auf signifikante Unterschiede identifizieren durch den Vergleich der Mittelwert und Standardfehler der Messung (SEM) zwischen Steuerung und experimentellen Proben.
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Representative Results
Mit der Lipid-Träger-Methode, SpH hippocampal Neuronen, äußerte ermöglicht die Identifizierung des Boutons (Abbildung 1a). Die elektrische Stimulation von Zellen induziert Exozytose und eine entsprechende Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die Zunahme der Fluoreszenz (ΔF) wurde durch die Beendigung des Stimulus (Abbildung 1 b) gestoppt. Die erhöhte Fluoreszenz folgte eine langsame Abnahme durch Endozytose. Bei VAMP2-pHluorin diffundiert VAMP2 entlang dem Axon aus einem Bouton nach Anregung4. Die Rohdaten verwendet willkürliche Einheiten und wurde normiert auf der Grundlinie, die Rate von Verfall und τ (Abbildung 2a–c) zu erhalten. Da die Messungen aus einer normalisierten Ablaufverfolgung vorgenommen wurden, spiegelt die Rate des Zerfalls den anfänglichen Verfall der Fluoreszenz des Anteils an der Spitze ΔF pro Sekunde (ΔF/s). In unseren experimentellen Bedingungen Endozytose (in der Regel länger als 10 s) war viel langsamer als Reacidification (~ 3-4 s)4,5. So spiegelt der Fluoreszenz-Zerfall des pHluorin in erster Linie Endozytose4,5. Im präsynaptischen Boutons ΔF ist größer als das Axon außer Bouton und der Anfang von Zeit der Anstieg war mit Beginn der elektrische Reiz abgestimmt. Im Axon außer Bouton ΔF verringerte sich im Vergleich zu Regionen mit Boutons und verzögerte sich ab Zeitpunkt der Erhöhung im Vergleich zu die Einleitung der elektrische Reiz (Abb. 2 b). ΔF induzierte Bouton und Axon außer Bouton 82,9 ± 9,0 % (n = 5 Experimente) und 23,2 ± 4,0 % (n = 5 Experimente) bzw. (Abb. 2 b). ΔF von SpH zerfallen Mono-exponentiell mit τ 17.7 ± 0,3 (n = 5 Experimente) und 20,7 ± 0,2 (n = 4 Experimente) in 50 AP und 200 AP, bzw. (Abbildung 1 b). In 200 AP, τ war nicht signifikant unterschiedlich, vor oder nach der Normalisierung an der Grundlinie. Bei VAMP2-pHluorin-transfizierten Zellen übertraf die Expression des VAMP2-pHluorin SpH (Abbildung 3a–c). Spuren von VAMP2-pHluorin wurden auch durch die Normalisierung der Grundlinie (Abb. 3 b) gewonnen.
EM in kultivierten Neuronen durchgeführt wurde und die Clathrin-coated Vesikel untersucht wurden, im Vergleich zu Kontrollproben, die mit 5 mg/mL HRP für 90 inkubiert wurden s in Abwesenheit des Stimulus (Abbildung 4a–b). Die Clathrin coated Pits wurden bei einer Wahrscheinlichkeit von 0,05 pro Bouton bei fehlender Reiz beobachtet. Stimulation mit hohen K+ induzierte Bulk Endosom und synaptischen Vesikel-Aufnahme, die von HRP Kennzeichnung (Abb. 5a) identifiziert wurden. Synaptischen Vesikel wurden definiert, wie Bläschen mit einem Durchmesser von weniger als 50 nm und Bulk Endosomen definiert wurden, als mit einem Durchmesser über 80 nm oder mit einer Querschnittsfläche von mehr als 80 nm Vesikel. Induzierte Bulk Endosom Aufnahme wurde von Erholung mit normalen Kochsalzlösung (Abb. 5 b) verringert.
Abbildung 1: Bilder von SpH transfiziert Neuronen und Spuren von SpH transfiziert-Zell-Reaktionen auf elektrische Stimulation. (ein) eine Probe Bild von kultivierten hippocampal Neuronen transfiziert mit SpH durch Liposomen Lieferung. SpH äußerte hoch Boutons, Kreis oder Oval Muster, mit relativ niedriger Ausdruck entlang den Axon zu präsentieren. Weiße Kästchen zeigen an ROI mit Boutons (1,5 x 1,5 µm). Maßstabsleiste: 20 µm. (b) Antworten von SpH transfizierten Zellen auf einen elektrischen Reiz von 50 AP bei 20 Hz (n = 5 Versuche) oder 200 AP bei 20 Hz (n = 4 Experimente). Jedes Experiment beruhte auf 20-60 Boutons. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Rate der Zerfall und Tau Endozytose. (ein) Antworten auf 50 AP bei 20 Hz von willkürliche Einheiten auf normalisierten Spuren umgestellt wurden (n = 5). Fluoreszenz-Änderung wurde auf der Grundlinie normalisiert. Diese Zahl wurde von Wu Et Al., 20163geändert. (b) normalisierte Antworten auf 200 AP bei 20 Hz in Boutons (schwarz, n = 4 Experimente, links Panel) und Axon außer Bouton (rot, n = 4 Experimente, links Panel). Fluoreszenz-Änderung wurde auf der Grundlinie normalisiert. Gestrichelter Rahmen wird auf der rechten Seite vergrößert. (c) Using normalisierte Grundlinie, die Rate des Zerfalls oder τ errechnete sich in 50 AP (n = 5 Experimente) und 200 AP (n = 4 Experimente) bei 20 Hz. Vor der Berechnung war ΔF auf 100 % normalisiert. Τ der Endozytose aus normalisierten Spur zwischen dem Zeitpunkt der maximalen Fluoreszenz und am Ende des Experiments ermittelt. Rate des Verfalls (Mittelwert + s.e.m, obere Leiste) und τ (Mittelwert + s.e.m, untere Leiste) induziert durch 50 AP und 200 AP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bilder der VAMP2-pHluorin transfiziert Neuronen und Beispiele für Spuren. (ein) A Beispielbild von kultivierten hippocampal Neuronen transfiziert mit VAMP2-pHluorin von Liposomen Lieferung. Weiße Felder zeigen den ROI mit Boutons (1,5 x 1,5 µm). Maßstabsleiste: 20 µm. (b) Spuren für VAMP2-pHluorin Reaktionen auf 200 AP bei 20 Hz (n = 4 Experimente). Fluoreszenz-Änderung wurde auf der Grundlinie normalisiert. (c) FBasis (AE) (Mittel + s.e.m) in VAMP2-pHluorin (n = 4 Experimente) und SpH (n = 7 Experimente) Boutons transfiziert. **, p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Bilder von EM in präsynaptischen Terminal. (ein) Synaptic Vesikel wurden in kultivierten hippocampal Neuronen mit EM gezeigt. Diese Zahl wurde von Wu Et Al., 20163geändert. Maßstabsleiste = 200 nm. (b) Magnified Darstellung Clathrin coated Gruben. Maßstabsleiste: 50 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bilder des präsynaptischen Terminal in stimulierte Nervenzellen mit hohen Kalium. (ein) EM Bilder von Neuronen. Die Zellen wurden behoben ohne Reiz (R), sofort nach der Stimulation mit 90 mM KCl für 90 s mit löslichen HRP (K+), oder nach der Stimulation und dann für 10 min in normalen Kochsalzlösung inkubiert. Diese Zahl wurde von Wu modifiziertEt Al., 20163. Maßstabsleiste = 200 nm. (b) im Vergleich zu kontrollieren, HRP (-) synaptischen Vesikel wurden gesenkt und HRP (+) Bläschen stiegen von KCl. Bulk Endosom Aufnahme wurde durch KCl induziert und degressiv von Erholung (Mittel + s.e.m war jede Gruppe von 40-100 synaptischen Profile). * p < 0,1; ** p < 0,01, bedeutende ruhen; ##p < 0,01, bezeichnend, K+. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier zeigen wir Ihnen zwei Methoden zur Überwachung der synaptischen Vesikel Endozytose. Bei der ersten Methode überwacht wir pHluorin mit einem synaptischen Vesikel Protein in transfizierten Neuronen verschmolzen und anschließend elektrisch stimuliert. Zweitens haben wir EM Bildgebung der HRP-Aufnahme, wie von KCl induziert. Wir haben verschiedene Reize aus zwei Gründen. Zunächst hohe Kalium-Anwendung induziert Depolarisation aller Neuronen in der Kultur. Dies erleichtert EM Prüfung, angesichts der Tatsache, dass unsere EM-Methodik nicht stimulierten und stimulierte Nervenzellen nicht unterscheiden konnte. Zweite, Ultra-strukturelle morphologische Veränderungen beobachtet zuverlässiger nach intensiven Stimulation, wie die hohen Kalium-Stimulation, während pHluorin Fluoreszenz Änderungen nach einem kurzen Zug Aktionspotentiale oder sogar eine einzelne Aktion beobachtet werden kann Potenzial.
Lichtmikroskopie imaging mit pHluorin zeigt synaptischen Vesikel Protein Fusion und Aufnahme mit hoher zeitlicher Auflösung in lebenden Zellen. Es kann verwendet werden, Mechanismen zu untersuchen, die den Endozytose zeitlichen Verlauf und die Größe der synaptischen Vesikel-Pools zu regulieren. pHluorin Imaging wurde nicht nur für die Überwachung der synaptischen Protein Endozytose, aber auch für die Überwachung der evozierten oder spontane einzelne Vesikel Release, kurzfristige synaptische Plastizität, und für die Messung der Freigabe Wahrscheinlichkeit35eingesetzt. Mit pHluorin hat gezeigt, dass die synaptische vesikuläre Protein-Pools freigesetzt nicht identisch mit denen wird abgerufen am36,37. Vor kurzem wurde pHluorin verschmolzen mit synaptischen Proteine verwendet, um das Schicksal der neu fusionierten Vesikel38zu erkennen, und bulk-Endozytose39. Daher ist pHluorin verschmolzen mit einem synaptischen Protein ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung Exozytose und Endozytose in lebenden Synapsen.
Die Einschränkung dieser Technik ist, dass der Zerfall der Fluoreszenzintensität nicht nur Endosomen, sondern auch vesikuläre Re Versauerung widerspiegelt. Diese beiden Komponenten könnte möglicherweise durch Behandlung mit Bafilomycin, ein Inhibitor von V-ATPase10,40getrennt werden. Darüber hinaus spiegelt die Fluoreszenz-Vergrößerung während der elektrischen Stimulation das net Ergebnis der Exozytose und Endozytose. Obwohl pHluorin Bildgebung Einschnürung der Membran nicht erkennen konnte, kann diese Einschränkung durch andere Techniken, vor allem EM überwunden werden.
In EM, stark stimulierte Zellen zeigten erhöhte HRP-positiven synaptischen Vesikel und bulk-Endosomen. Diese Masse, die Endosomen allmählich verschwunden dann regenerieren in synaptischen Vesikel24. Diese Technik zeigt die synaptischen Vesikel-Aufnahme durch die Enthüllung der Ultrastruktur im präsynaptischen Terminal in Kontrolle und stimulierten Zellen. Ein Nachteil dieses Verfahrens prüft synaptischen Vesikel Aufnahme in lebenden Zellen, anstatt feste Zellen. Darüber hinaus die Möglichkeit, ein Fixiermittel induzierte Artefakt nicht ausgeschlossen werden kann. Bekannten Artefakte, die Auswirkungen auf die Membran gehören Blebbing, Membran-Erosion und Protein Änderungen41. Diese Unterschiede von den natürlich vorkommenden Zustand einer Zelle sind eine inhärente Anliegen, alle Methoden der Visualisierung Zellen, und besonderes Augenmerk wurde auf die EM-Daten vorgestellt, um die Möglichkeit einer solchen Artefakten41,42 ,43. Während diese Technik alleine nicht funktionale zeigen schafft Endozytose von synaptischen Proteine, in Kombination mit Lichtmikroskopie, die live-Bilder von der Endozytose-Prozess zur Verfügung stellen kann, ein umfassenderes Bild von diesem zellulären Mechanismus.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Yong-Ling Zhu für Synaptophysin-pHluorin2x Konstrukt, und Dr. James E. Rothman für die Bereitstellung von VAMP2-Phluorin. Wir danken Dr. Susan Cheng und Virginia Crocker NINDS Elektronenmikroskopie Anlage für ihre technische Unterstützung und Hilfe. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall Intramural Research Program in den USA und einen Zuschuss aus dem KRIBB Initiative Forschungsprogramm (Koreanisch biomedizinische Wissenschaftler Fellowship Program), Korea Research Institute of unterstützt. Biowissenschaften und Biotechnologie, Republik Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
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