Summary
Synaptiske vesicle endocytose oppdages ved * lys av pHluorin smeltet sammen med synaptic vesicle protein og elektronmikroskop for vesicle opptak.
Abstract
Under endocytose hentes smeltet synaptic blemmer på nerve terminaler, slik at vesicle resirkulering og dermed vedlikehold av synaptic overføring under repeterende nerve avfyring. Nedsatt endocytose patologiske forhold fører til nedgang i synaptiske styrke og hjernen fungerer. Her beskriver vi metoder brukes til å måle synaptic vesicle endocytose på pattedyr hippocampus synapse i neuronal kultur. Vi overvåket synaptic vesicle protein endocytose kombinerer en synaptic vesicula membran protein, inkludert synaptophysin og VAMP2/synaptobrevin, på vesicula lumenal side, med pHluorin, en pH-sensitive grønne fluorescerende protein som øker sin fluorescens intensiteten som pH øker. Under exocytosis, vesicula lumen pH øker, mens under endocytose vesicula lumen pH er nytt sur. Dermed indikerer en økning av pHluorin fluorescens fusion, mens en nedgang angir endocytose av merket synaptic vesicle protein. I tillegg til metoden pHluorin imaging for å registrere endocytose, overvåket vi vesicula membran endocytose av elektronmikroskop (EM) målinger av pepperrot peroxidase (HRP) opptak av blemmer. Til slutt, vi overvåket dannelsen av nerve terminalen membran groper i ulike tider etter høy kalium-indusert depolarization. Time course of HRP opptak og membran grav formasjon angir time course of endocytose.
Introduction
Nevrotransmittere er lagret i synaptic blemmer og utgitt av exocytosis. Den synaptiske vesicle membran protein er internalisert endocytose, og på nytt i neste runde av exocytosis. Endocytose av synaptic blemmer er viktig for å opprettholde synaptic vesicle bassenger og fjerner utstående blemmer fra plasma membranen. PH-sensitive grønne fluorescerende protein pHluorin, som er slukket under Sure forhold og dequenched i nøytral pH, har blitt brukt til å måle endocytose tiden kurs i lever celler1,2,3. PHluorin protein er vanligvis knyttet til lumenal siden av synaptic vesicle proteiner, for eksempel synaptophysin eller VAMP2/synaptobrevin. Ved hvile, er pHluorin slukket i 5,5 pH lumen av synaptic blemmer. Vesicle fusion å plasma membranen eksponerer den vesicula lumen til ekstracellulære løsning der pH er ~ 7.3, resulterer i en økning i pHluorin fluorescens. Etter exocytosis, økt fluorescens henfaller, på grunn av endocytose synaptic vesicle proteiner etterfulgt av vesicle re forsuring innenfor de gjenopprettede blemmer. Selv om forfallet gjenspeiler både endocytose og vesicula re forsuring, gjenspeiler hovedsakelig endocytose, fordi re forsuring er raskere enn endocytose i de fleste forhold1,4. Tiden konstant av re forsuring er 3-4 s eller mindre5,6, som er generelt raskere enn 10 s eller mer kreves for vesicle endocytose4,5. Hvis eksperimenter er nødvendig å skille endocytose fra re forsuring, kan acid slukke eksperimenter med 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) løsningen (25 mM) med en pH på 5.5 brukes til å bestemme om synaptic vesicle proteiner er Hentet fra plasma membranen via endocytose1,3,4. Dermed pHluorin fluorescens intensitet økningen gjenspeiler en balanse av exo- og endocytose, og nedgangen etter nervestimulering spesifikt gjenspeiler endocytose.
pHluorin imaging kan brukes ikke bare til å måle tid selvfølgelig endocytose, men også størrelsen på synaptic vesicle bassenger7,8, og sannsynligheten for vakte utgivelsen og spontan slipp9. Mange faktorer og proteiner involvert i å regulere endocytose, som kalsium, løselig NSF-vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner, hjerne-avledet nevrotropisk factor(BDNF) og calcineurin har blitt identifisert ved hjelp av pHluorin bildebehandling1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. videre utgivelsen av nevrotransmitter kan oppdages i ikke bare primære neurons men i neuroblastom celler med TIRFM17. Nylig ble pHluorin varianter, dsRed, mOrange og pHTomato utviklet for å overvåke samtidig opptak av flere faktorer i en enkelt synapse18,19. For eksempel er pHTomato smeltet sammen med synaptophysin og brukes med en genetisk kodet kalsium indikator (GCaMP5K) til å overvåke presynaptic vesicle fusion og Ca2 + tilstrømningen i postsynaptic rommet20. Derfor gir pHluorin knyttet til synaptic proteiner en nyttig metode for å analysere forholdet mellom endocytose og exocytosis.
EM er en annen metode brukes vanligvis til å studere endocytose, på grunn av høy romlig oppløsning som viser ultrastructural endringer under endocytose. To generelle områder er muligheten til å visualisere patologiske forandringer i neuronal celler21 og spore vesicle proteiner22. Spesielt observasjon av synaptic vesicle opptak, membran kurvatur belagt med clathrin i den periactive sonen, og endosomal strukturer er mulig med EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mens EM involverer potensielle artefakter som bindemiddel-indusert misdannelser, som kan påvirke endocytose og dataanalyse er arbeidsintensiv, oppløsningen gir en attraktiv mulighet å visualisere cellestruktur. Potensielle etappe, den stabiliserende problemer og begrensning i EM midlertidig løsning kan overvinnes ved høyt trykk frysing, gir en rask og ikke-kjemisk metode til å stabilisere skjøre strukturer under endocytose27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: følgende protokollen beskriver pHluorin tenkelig metoder og EM-metoder som brukes i kulturperler hippocampus neurons. pHluorin skjermer synaptic vesicle protein opptak i levende celler og EM oppdager opptak av synaptic vesicle og ultrastructural endringer.
dyr omsorg og prosedyre følges NIH retningslinjer ble godkjent av NIH dyr omsorg og bruk komiteen.
1. pHluorin Imaging
- hippocampus Nevron kultur
- forberede Hippocampus Buffer (HB) ved å kombinere 4 mM NaHCO 3 og 5 mM HEPES og justere pH 7.3 med 5 M NaOH. Gjør kultur medium ved å blande neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. I tillegg klargjør en blanding av HB buffer med 20% fosterets Bovine Serum (HB/20% FBS).
Merk: Denne culturing protokollen er basert på Sankaranarayanan, et al. 29 og Wu et al. 24 - halshugge musen pups mellom postnatal dag 0 til dag 2 i kultur medium og ekstra hjernen i 4 ° C HB/20% FBS. Fjern hjernestammen og thalamus å avsløre hippocampi. Dissekere ut hippocampi, etter utsette den ved fjerning av hjernestammen og thalamus, og overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS.
Merk: Avkastning er vanligvis rundt 4 x 10 5 celler/mL for ettall pup (to hippocampi). Feilfri av overholde membraner pinsett eller saks, deretter overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS. Rulle dentate gyrus isolere i subiculum ved å klippe med saks, og overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS. - Dele hver hippocampus, ved å kutte fra ende til ende, i ca 10 skiver og overføre dem til en 15 mL polypropylen konisk tube.
- Tillater vevet å avgjøre, vask med 10 mL av HB/20% FBS og deretter vaskes tre ganger med 10 mL HB.
- Forberede fordøyelsen løsning av 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 7 mM Na2HPO 4 og 25 mM HEPES, og justere pH 7.2 med 5 M NaOH. Fjern nedbryting fra hippocampi. Legg til 10 mg av trypsin og 1 mg DNase 2 mL fordøyelsen løsning, og filtrere gjennom en steril 0.22 µm membran direkte på prøven pellet.
- Ruge hippocampi i 5 minutter ved 37 ° C, deretter vaske to ganger med 10 mL av HB/20% FBS, og deretter vaske en gang med 10 mL HB.
- Dissociate cellene med 6 mg MgSO 4 ∙ 7 H 2 O og 1 mg DNase 2 mL HB og sterile filter på hippocampi pellets gjennom et sterilt 0.22 µm filter. Forsiktig distansere cellene av forsiktig triturating, mens du tar vare å unngå introdusere luftbobler. Kan vev partikler å bosette seg i 2 minutter, og deretter sakte overføre nedbryting til en annen tube.
- Legge 3 mL HB/20% FBS til celle suspensjon og sentrifuger eller 10 min på 4 ° C og 1000 rpm. Forkaste nedbryting og resuspend kultur medium.
- Plate 60.000 celler suspendert i 150 µL kultur medium på en Poly-D-Lysine belagt 25 mm diameter dekkglassvæske, uten søl av dekkglassvæske. Legg 2 mL forvarmes kultur medium 2t etter plating. Coverslips vedlikeholdes i 6-godt dyrking plater eller sterilt Petri retter.
- Behold cellene på 37 ° C i en 5% CO 2 fuktet inkubator kultur medium i 14-21 dager før opptak. Under kultur veksten, endre den øverste halvdelen av mediet to ganger i uken.
- forberede Hippocampus Buffer (HB) ved å kombinere 4 mM NaHCO 3 og 5 mM HEPES og justere pH 7.3 med 5 M NaOH. Gjør kultur medium ved å blande neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. I tillegg klargjør en blanding av HB buffer med 20% fosterets Bovine Serum (HB/20% FBS).
- Hva
- 6-7 dager etter plating, transfect synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) eller VAMP2-pHluorin i hippocampus neurons. Bruke en Cytomegalovirus (CMV) promoter, inn pcDNA3 vektor 30 SpH. VAMP2-pHluorin, bruke en CMV promoter inn en pCI vektor 31.
- Transfect en vektor av lipid transportør til målcellene, bruker 1 µg av plasmider. Bruke kultur medium fra protokollen trinn 1.1.1, som mangler serum, transfection. Endre mediet 2t etter hva å redusere toksisitet.
Merk: Ved lav uttrykk for SpH i boutons, øke DNA konsentrasjonen til 2 µg eller inkubasjon tiden med lipid transportøren, med mindre cellene er usunn. Vanligvis 4-10 celler (0.006-0.008%) av neurons var transfekterte.
- * Lys
- forberede vanlig saltvann består av 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 KCl, 25 mM HEPES (pH 7.4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione ( CNQX), og 0.05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric syre (AP5). Ta en dekkglassvæske fra kultur medium plate og sted på en tenkelig kammer som lar feltet stimulering, bruke glidemiddel og tetningsmasse for å unngå lekkasjer. Unngå å la glass tørr under overføring av en dekkglassvæske fra platen til kammeret ved umiddelbart å legge 750 µL vanlig saltvann.
Merk: CNQX og AP5 ble brukt til å blokkere postsynaptic aktivitet, som har potensial for tilbakevendende aktivitet. Før du plasserer et kammer på en invertert fluorescens mikroskop, bruke rengjøring vev for å bekrefte at kammeret ikke lekke. Langsom lekker forårsaker fokuset endres under innspillingen av blanding av normal saline og innlevelse olje, som resulterer i endringer i brytningsindeksen. - Stimulering og opptak
- bildet på en invertert widefield mikroskop med en 60 X (1,4 numeriske blenderåpning) oljeneddyp linse med metall metallhalid lampe. Visualisere pHluorin med en filtersettet for en eksitasjon toppen av 480 nm, et 490 nm lang pass speil, en 500-550 nm utslipp filter og en manuell flip lukkertid. Ta bilder hvert 100 ms, med 2 x 2 binning, bruker et elektron multiplisere kostnad kombinert enhet (EMCCD) kamera.
Merk: Flere funksjoner bør vurderes å oppnå riktig betingelsene for å unngå photobleaching, inkludert image capture intervallet, og filtrere binning, som er avhengig av utstyr. Ved AC confocal bildebehandling anses laser makt og eksponering tid å unngå photobleaching. Oppsettet ble bestemt etter innspillingen minst 3 min uten stimulans og innspillingen ble utført i minst 10 s uten stimulans etter photobleaching. - Velge et område med en høy tetthet av boutons for enkel analyse i hvert eksperiment. Identifisere transfekterte celler av sine grønne fluorescens signal, med vekt på runde eller ovale mønstre i bouton og kontinuerlig uttrykk mellom boutons.
- Indusere endocytose av feltet stimulering bruke 1 ms puls, 20 mA handling potensial (AP) levert fra en puls stimulator og leveres gjennom en platina elektrode i stimulans isolasjon enheten. Bilde fluorescens aktivitet i løpet av stimulering og i celle utvinning.
Merk: I tilfelle av død celler, var sterkere enn levende boutons og viste et usammenhengende mønster mellom boutons.
- bildet på en invertert widefield mikroskop med en 60 X (1,4 numeriske blenderåpning) oljeneddyp linse med metall metallhalid lampe. Visualisere pHluorin med en filtersettet for en eksitasjon toppen av 480 nm, et 490 nm lang pass speil, en 500-550 nm utslipp filter og en manuell flip lukkertid. Ta bilder hvert 100 ms, med 2 x 2 binning, bruker et elektron multiplisere kostnad kombinert enhet (EMCCD) kamera.
- forberede vanlig saltvann består av 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 KCl, 25 mM HEPES (pH 7.4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione ( CNQX), og 0.05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric syre (AP5). Ta en dekkglassvæske fra kultur medium plate og sted på en tenkelig kammer som lar feltet stimulering, bruke glidemiddel og tetningsmasse for å unngå lekkasjer. Unngå å la glass tørr under overføring av en dekkglassvæske fra platen til kammeret ved umiddelbart å legge 750 µL vanlig saltvann.
- Image analysis
- Analysere fluorescens intensiteten i en enkelt bouton, satt opp et område av interesse (ROI) som en 1,5 x 1,5 µm kvadrat; størrelsen på en bouton ligger ca. 1,5 µm. Bruk spor før stimulering å se etter photobleaching og trekk som bakgrunn.
- Normalize fluorescens endre (ΔF) med ligningen:
der F max og F 0 refererer til maksimal økning etter stimulering og planlagte fluorescens, henholdsvis. Måle endocytose priser som rate av forfall under først 4-10 s etter maksimum punkt av pHluorin fluorescens. Få tiden konstant (τ) av endocytose omrisset pHluorin fluorescens forfallet av topp økning i den opprinnelige planen med mono-eksponentiell funksjon.
2. Elektronmikroskop
- forberede en Poly-D-Lysine belagt 6-vel platen ved å bruke 1,5 mL 0,01% sterilt-filtrert Poly-D-Lysine løsning i hver brønn 1t ved romtemperatur, og deretter vaske tre ganger med sterilisert vann. Dissekere, kultur og vedlikeholde hippocampus nerveceller i trinn 1.1.1, 1.1.2 og 1.1.3, henholdsvis.
- Forberede en høy K + stimulering løsning med HRP som 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7.4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0.05 mM AP5 og 5 mg/mL HRP, Juster til pH 7.4 med 5 M NaOH.
- Stimulere hippocampus Nevron kulturen med 1,5 mL høy K + stimulering løsning ved romtemperatur (referert til som K +) av tillegg av 1,5 mL i hver brønn for 90 s. I hvile tilstand (referert til som R), bruke samme konsentrasjonen av 5 mg/mL HRP for 90 s, men med vanlig saltvann. For gjenoppretting prøven, bruke høy K + stimulering løsning som med K + prøven, deretter raskt vask og erstatte med vanlig saltvann og ruge for 10 min.
- Fiksering og flekker
- forberede 0.1 M Na cacodylate buffer ved hjelp 21.4 finans Na cacodylate ved pH 7.4. Fastsette celler med 4% glutaraldehyde inne 0.1 M Na cacodylate buffer for minst 1 time i rom temperatur. Vask tre ganger med 0.1 M Na cacodylate buffer i 7 min.
- Forberede Diaminobenzidine (DAB) løsning, består av 0,5 mg/mL DAB med 0,3% H 2 O 2 i ddH 2 O og filter med filtere 0.22 µm. Bruke 1,5 mL DAB løsning for 30 min på 37 ° C. vask tre ganger med 0.1 M Na cacodylate buffer i 7 min.
FORSIKTIG: DAB er en giftig og mistenkt kreftfremkallende. Bruk hansker og labfrakker.
Merk: Merking DAB oppstår på grunn av sin oksidasjon av H 2 O 2, som katalysert av HRP. Små økninger i komponentene resultere i en økt signal i utvalget. Øker konsentrasjonen av HRP raskere effekten av katalysator. Tilstrekkelig store konsentrasjoner av H 2 O 2 tillater ødeleggende siden reaksjoner med HRP, begrenser effekten av merking 32. I dette arbeidet, konsentrasjonen av merking systemet ble valgt basert på tilgjengelige forskning 33 , 34. - Ruge neurons med 1,5 mL 1% OsO 4 inne 0.1 M Na cacodylate buffer 1t på 4 ° C som bokfører fiksering. Vask tre ganger med 1,5 mL 0.1 M Na cacodylate buffer i 7 min.
FORSIKTIG: Toksisitet og reaktivitet OsO 4, holde prøven på isen i kjemiske hette er å foretrekke i mange tilfeller å bruke kjøleskap for inkubasjon. - Forberede 0.1 M natrium acetate buffer med 13.61 finans natrium acetate og 11,43 mL/L iseddik ved pH 5.0. Vask tre ganger med 1,5 mL 0.1 M acetate buffer ved pH 5.0 i 7 min og ruge med 1,5 mL 1% uranyl acetate inne 0.1 M acetate buffer ved pH 5.0 1t på 4 ° C. Wash tre ganger med 1,5 mL 0.1 M acetate buffer i 7 min.
- Epoxy innebygging
- tørke Nevron kulturen med enkelt 1,5 mL vasker av 50% og 70% 90% etanol, i 7 min i hver og deretter 3 vasker av 1,5 mL 100% etanol i 7 min hver i avtrekksvifte.
- Blanding 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) epoxy harpiks, 160 mL/L dodecenyl succinic anhydride (DDSA), 340 mL/L Methyl-5-Norbornene-2,3-Dicarboxylic Anhydride (NMA) og 15 mL/L 2,4,6-tris (dimethylaminomethyl) fenol (DMP-30) til å opprette epoxy harpiks. Blandingen godt, deretter lagre under vakuum å fjerne luftbobler.
Merk: Det er viktig å fjerne luftbobler i harpiks, særlig de som er mindre enn synlig for det blotte øye, fordi de kan forårsake hulrom i harpiks under snitting. - Infiltrere prøven ved å erstatte etanol med 50% epoxy harpiks i etanol i 30 min ved romtemperatur på en shaker, og 70% epoxy harpiks i etanol i 30 min ved romtemperatur i en shaker.
- Switch epoxy harpiks løsning med 100% epoxy harpiks og ruge i 10 min på 50 ° C. utføre to utveksling av fersk 100% epoxy harpiks med incubations 1t på 50 ° C. Legg frisk 100% epoxy harpiks og kunne herde ved 50 ° C over natten og deretter på 60 & #17 6. C over 36 h å stivne.
- Fjerne hvert utvalg fra muti-vel platen med en gullsmed ' s håndsag. Velg områdene av interesse, tette konsentrasjoner av celler, bruker en invertert lys mikroskop, og deretter kutte 70 til 80 nm blokker snitting av mikrotomen. Montere kuttet regionen i mikrotomen chuck og laste mikrotomen. Plasser chuck i mikrotomen og montere en diamant kniv med kanten parallell til overflaten av blokken. Samle deler av 70 til 80 nm tykkelse direkte på individuelle rutenett.
- Oppløses uranyl acetate i vann for en 1% løsning av vekt, og oppløses separat bly citrate i vann etter en 3% løsning av vekt. Counterstain delene ved neddykking med 1% vandig uranyl acetate i 15 min og deretter 3% vandig bly citrate i 5 min å forbedre kontrasten av prøvene.
- EM imaging
- undersøke avsnittene med transmission elektron mikroskop og ta bilder med en CCD digitalkamera på en primær forstørrelse på 10.000-20, 000 X 3.
- Statistikk
- utfører en t-test for å identifisere betydelige forskjeller ved å sammenligne av mean og standard feil av måling (s.e.m.) mellom kontrollen og eksperimentelle prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med metoden lipid carrier ble SpH uttrykt i hippocampus neurons, tillater for identifisering av boutons (figur 1a). Elektrisk stimulering av cellene indusert exocytosis, og en tilsvarende økning i fluorescens intensitet. Økningen i fluorescens (ΔF) ble stoppet av slutter stimulans (figur 1b). Den økte fluorescensen ble etterfulgt av en langsom nedgang, på grunn av endocytose. I VAMP2-pHluorin diffunderer VAMP2 langs axon fra en bouton etter stimulans4. Rådata brukt vilkårlig enheter, og var normalisert i den opprinnelige planen å få frekvensen av forfall og τ (figur 2a-c). Siden målingene ble gjort fra normalisert spor, gjenspeiler frekvensen av forfall første forfallet av fluorescens i prosenten av peak ΔF per sekund (ΔF/s). I vår eksperimentelle forhold, endocytose (vanligvis lengre enn 10 s) var mye tregere enn reacidification (~ 3-4 s)4,5. Dermed gjenspeiler fluorescens forfallet av pHluorin hovedsakelig endocytose4,5. I presynaptic boutons, ΔF er større enn axon unntatt bouton og begynnelsen tid-av-økningen ble matchet med innvielse av elektriske stimulans. I axon unntatt bouton, ΔF var lavere i forhold til områder med boutons og begynner tid-av-økning var forsinket i forhold til initiering av elektriske stimulans (figur 2b). ΔF indusert i bouton og axon unntatt bouton var 82.9 ± 9.0% (n = 5 eksperimenter) og 23.2 ± 4,0% (n = 5 eksperimenter), henholdsvis (figur 2b). ΔF av SpH forfalt mono-eksponentielt med en τ 17,7 + 0,3 (n = 5 eksperimenter) og 20,7 ± 0,2 (n = 4 eksperimenter) i 50 AP og 200 AP, henholdsvis (figur 1b). I 200 AP, τ var ikke signifikant forskjellig før eller etter normalisering med den opprinnelige planen. I VAMP2-pHluorin transfekterte celler var hvilket uttrykk VAMP2-pHluorin høyere enn SpH (figur 3a-c). Spor av VAMP2-pHluorin ble også innhentet ved å normalisere til grunnlinjen (figur 3b).
EM ble utført i kulturperler nevroner og clathrin belagt blemmer ble undersøkt i forhold til kontroll prøver, som ble inkubert med 5 mg/mL av HRP for 90 s i fravær av stimulans (figur 4a-b). Clathrin belagt gropene ble det observert en sannsynlighet for 0,05 per bouton i fravær av stimulans. Stimulering med høy K+ forårsaket bulk endosome og synaptic blemmer opptak, som ble identifisert av HRP merking (figur 5a). Synaptiske blemmer ble definert som blemmer med en diameter mindre enn 50 nm og bulk endosomes ble definert som har en diameter over 80 nm eller med et kors tverrsnitt areal på mer enn en 80 nm vesicle. Indusert bulk endosome opptak ble redusert med gjenoppretting med vanlig saltvann (figur 5b).
Figur 1: transfekterte bilder av SpH neurons og spor av SpH transfekterte celle Svar å elektrisk stimulering. (et) et eksempel bilde av kultivert hippocampus neurons transfekterte med SpH av liposome levering. SpH var svært uttrykt i boutons, presentere sirkel eller oval mønstre, med relativt lavere uttrykk langs axon. Hvite bokser angir avkastning som inneholder boutons (1,5 x 1,5 µm). Skala bar: 20 µm. (b) svar av SpH transfekterte cellene til en elektrisk stimulans 50 AP på 20 Hz (n = 5 eksperimenter) eller 200 AP på 20 Hz (n = 4 eksperimenter). Hvert eksperiment var basert på 20-60 boutons. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Rate av forfall og tau verdi for endocytose. (en) svar til 50 AP på 20 Hz ble konvertert fra vilkårlig enheter til normalisert spor (n = 5). Fluorescens endringen var normalisert i den opprinnelige planen. Dette tallet er endret fra Wu et al., 20163. (b) Normalized svar til 200 AP på 20 Hz i boutons (svart, n = 4 eksperimenter, venstre panel) og axon unntatt bouton (rød, n = 4 eksperimenter, venstre panel). Fluorescens endringen var normalisert i den opprinnelige planen. Stiplede boksen er forstørret i panelet til høyre. (c) bruke normalisert grunnlinjen, frekvensen av forråtnelse eller τ ble beregnet i 50 AP (n = 5 eksperimenter) og 200 AP (n = 4 eksperimenter) på 20 Hz. Før beregning, var ΔF normalisert til 100%. Τ av endocytose er Hentet fra normalisert spor mellom tidspunktet for maksimal fluorescens og slutten av eksperimentet. Forfall (betyr + s.e.m., øvre panel) og τ (betyr + s.e.m., nedre panel) indusert av 50 AP og 200 AP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilder av VAMP2-pHluorin transfekterte neurons og eksempler på spor. (en) A Eksempelbilde kulturperler hippocampus neurons transfekterte med VAMP2-pHluorin av liposome levering. Hvite bokser angir Avkastningen som inneholder boutons (1,5 x 1,5 µm). Skala bar: 20 µm. (b) spor for VAMP2-pHluorin-svar til 200 AP på 20 Hz (n = 4 eksperimenter). Fluorescens endringen var normalisert i den opprinnelige planen. (c) Fbase (a.u.) (betyr + s.e.m.) i VAMP2-pHluorin (n = 4 eksperimenter) og SpH (n = 7 eksperimenter) transfekterte boutons. **, p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bilder av EM i presynaptic terminal. (en) Synaptic blemmer ble vist i kulturperler hippocampus neurons bruker EM. Dette tallet er endret fra Wu et al., 20163. Skala bar = 200 nm. (b) Magnified bildet viser clathrin belagt groper. Skala bar: 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bilder av presynaptic terminal i stimulert neurons med høyt kalium. (en) EM bilder av neurons. Cellene ble løst uten stimulans (R), umiddelbart etter stimulering med 90 mM KCl for 90 s inneholder løselig HRP (K+), eller etter stimulering og deretter ruges i 10 minutter i normal saline. Dette tallet er endret fra Wuet al., 20163. Skala bar = 200 nm. (b) forhold til kontroll HRP (-) synaptic blemmer ble redusert og HRP (+) blemmer ble økt ved KCl. Bulk endosome opptak var forårsaket av KCl og gradvis redusert med utvinning (betyr + s.e.m., hver gruppe var fra 40-100 synaptic profiler). * p < 0.1; ** p < 0.01, viktig å hvile; ##p < 0.01, betydelig til K+. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi to metoder for å kartlegge synaptic vesicle endocytose. I den første metoden overvåket vi pHluorin smeltet sammen med et synaptic vesicle protein i transfekterte nevroner og senere påtrykkes. Dernest brukte vi EM avbilding av HRP opptak som forårsaket av KCl. Vi brukte ulike stimuli for to grunner. Først høyt kalium programmet induserer depolarization for alle neurons i kulturen. Dette forenkler EM undersøkelse, gitt at vår EM-metode ikke kan skille mellom ikke-stimulert og stimulert neurons. Andre, ultra strukturelle morfologiske endringer ble mer pålitelig observert etter intens stimulering, som høyt kalium stimulering, mens pHluorin fluorescens endringer kan observeres etter en kort tog handling potensialer eller selv en handling potensial.
* Lys imaging bruker pHluorin viser synaptic vesicle protein fusion og opptak med høy timelige oppløsning i levende celler. Det kan brukes å studere mekanismer som regulerer endocytose time course og størrelsen på synaptic vesicle bassenger. pHluorin imaging er ikke bare brukt for overvåking synaptic protein endocytose, men også for overvåking vakte eller spontane enkelt vesicle utgivelse, kortsiktige synaptiske plastisitet, og for måling av utgivelsen sannsynlighet35. Bruke pHluorin har vist at synaptic vesicula protein bassengene blir utgitt ikke er de samme som blir hentet36,37. Nylig ble pHluorin smeltet sammen med synaptic proteiner brukt til å oppdage skjebnen til nylig smeltet blemmer38og bulk endocytose39. Derfor er pHluorin smeltet sammen med et synaptic protein et verdifullt verktøy for å studere exocytosis og endocytose i levende synapser.
Begrensning av denne teknikken er at forfallet av fluorescens intensiteten gjenspeiler ikke bare endosomes, men også vesicula re forsuring. Disse to komponentene kan potensielt være atskilt av behandling med bafilomycin, en inhibitor av V-ATPase10,40. Videre reflekterer fluorescens økningen i elektrisk stimulering netto utfallet av exocytosis og endocytose. Selv om pHluorin imaging ikke finner membran invagination, kan denne begrensningen overvinnes ved andre teknikker, spesielt EM.
I EM, sterkt stimulerte celler viste økt HRP-positive synaptic blemmer og bulk endosomes. Disse bulk endosomes gradvis blitt så regenererer i synaptic blemmer24. Denne teknikken viser synaptic vesicle opptak av avslørende ultrastructure i presynaptic terminalen i både kontrollen og stimulert celler. En ulempe med denne teknikken er vurdere synaptic vesicle opptak i fast celler i stedet for levende celler. I tillegg muligheten for et bindemiddel indusert gjenstand ikke kan utelukkes. Kjente gjenstandene påvirker membranen inkluderer blebbing membran erosjon og protein endringer41. Disse forskjellene fra naturlig forekommende staten i en celle er en iboende bekymring til alle metoder for visualisere celler og spesiell oppmerksomhet ble betalt til EM dataene presentert for å vurdere muligheten for slike gjenstander41,42 ,43. Mens denne teknikken alene ikke kan vise funksjonelle skaper endocytose synaptic proteiner, kombinere det med * lys, som kan gi levende bilder av endocytose prosessen, en mer fullstendig oversikt over denne mobilnettet mekanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yong-Ling Zhu for å gi synaptophysin-pHluorin2x konstruksjon og Dr. James E. Rothman for å gi VAMP2-phluorin. Vi takker Dr. Susan Cheng og Virginia Crocker NINDS elektronmikroskop anlegg for kundestøtte og hjelp. Dette arbeidet ble støttet av National Institute av nevrologiske lidelser og hjerneslag Intramural Research Program i USA og et stipend fra KRIBB initiativ forskningsprogrammet (koreansk biomedisinsk forsker Fellowship Program), Korea forskningsinstitutt Bioscience og bioteknologi, Sør-Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -È Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
