Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

Published: June 29, 2017 doi: 10.3791/55868
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

نقدم ثلاث طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي . باستخدام حيوان بسيط، العثة ماندوكا سيكستا ( ماندوكا ) ، ونحن تصف بروتوكول تشريح، واستخدام تيترودس خارج الخلية لتسجيل نشاط الخلايا العصبية مستقبلات الذوقية متعددة، ونظام لتقديم ورصد النبضات توقيت بدقة من المذاق.

Abstract

الشعور الذوق يسمح للحيوانات للكشف عن المواد الكيميائية في البيئة، مما أدى إلى السلوكيات الحاسمة للبقاء على قيد الحياة. عندما تكشف الخلايا العصبية المستقبلات الذوقية (غرس) عن جزيئات الذوق، فإنها ترمز معلومات عن هوية وتركيز المذاق كأنماط من النشاط الكهربائي التي تنتشر بعد ذلك إلى الخلايا العصبية التالية في الدماغ. هذه الأنماط تشكل تمثيلات داخلية للمذاق، والتي تسمح بعد ذلك للحيوان باختيار الإجراءات وتشكيل الذكريات. وقد كان استخدام نماذج حيوانية بسيطة نسبيا أداة قوية لدراسة المبادئ الأساسية في الترميز الحسي. هنا، نقترح ثلاث طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقية باستخدام العثة ماندوكا سيكستا . أولا، نقدم إجراء تشريح للكشف عن الأعصاب الفك العلوي والمنطقة تحت المريء (سيز)، مما يسمح بتسجيل نشاط غن من محاور عصبية. ثانيا، نحن تصف استخدام الأقطاب خارج الخلية لتسجيل نشاط غنس متعددة عن طريق وضع الشركة المصرية للاتصالاتأسلاك ترودي مباشرة في العصب الفك العلوي. ثالثا، نقدم نظام جديد لتقديم ورصد، مع الدقة الزمنية العالية، نبضات من مذاقات مختلفة. هذه الأساليب تسمح لتوصيف ردود الخلايا العصبية في الجسم الحي مباشرة من غن قبل وأثناء وبعد يتم تسليم المذاق. نحن نقدم أمثلة من آثار الجهد سجلت من غن متعددة، وتقديم مثال على كيفية يمكن تطبيق تقنية الفرز ارتفاع على البيانات لتحديد ردود الخلايا العصبية الفردية. وأخيرا، للتحقق من صحة نهج التسجيل لدينا، قارنا تسجيلات خارج الخلية التي تم الحصول عليها من غنز مع تيتروديس إلى التسجيلات داخل الخلايا التي تم الحصول عليها مع أقطاب الزجاج حادة.

Introduction

وتولد النظم الذوقية والشمية تمثيلات داخلية للمواد الكيميائية في البيئة، مما يؤدي إلى تصورات الأذواق والروائح على التوالي. هذه الحواس الكيميائية ضرورية لاستحضار العديد من السلوكيات الحاسمة لبقاء الكائن الحي، بدءا من العثور على الاصحاب والوجبات لتجنب الحيوانات المفترسة والسموم. تبدأ العملية عندما تتفاعل المواد الكيميائية البيئية مع المستقبلات الموجودة في أغشية البلازما من خلايا المستقبلات الحسية. هذه الخلايا، مباشرة أو من خلال التفاعلات مع الخلايا العصبية، ينقل المعلومات حول هوية وتركيز المواد الكيميائية في الإشارات الكهربائية. ثم يتم نقل هذه الإشارات إلى الخلايا العصبية ترتيب أعلى وإلى هياكل الدماغ الأخرى. ومع تقدم هذه الخطوات، تخضع الإشارة الأصلية دائما لتغييرات تعزز قدرة الكائن الحي على كشف المعلومات الحسية وتمييزها وتصنيفها ومقارنتها وتخزينها، واختيار الإجراء المناسب. فهم كيفية حمالة الصدرفي تحويل المعلومات حول المواد الكيميائية البيئية لأداء أفضل مجموعة متنوعة من المهام هو السؤال الأساسي في علم الأعصاب.

وقد كان يعتقد أن التشفير الذوقي بسيط نسبيا، حيث يرى رأي واسع الانتشار أن كل جزيء كيميائي ينبعث من الذوق ("مذاق") ينتمي بشكل طبيعي إلى إحدى صفات الطعم الأساسية الخمسة تقريبا ( أي الحلو والمر والحامض ، مالح وأومامي) 1 . في هذا "الذوق الأساسي" الرأي، وظيفة النظام الذوقي هو تحديد أي من هذه الأذواق الأساسية موجودة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات العصبية الكامنة وراء التمثيل الذوق الأساسي في الجهاز العصبي غير واضحة، ويعتقد أن يحكم إما "خط المسمى" 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 أو "عبر نمط الألياف" 7 ، 8 رمز. في رمز الخط المسمى، كل خلية الحسية وكل من أتباعها العصبية يستجيب لنوعية طعم واحد، معا تشكيل قناة مباشرة ومستقلة لمراكز المعالجة العليا في الجهاز العصبي المركزي مخصصة لهذا الذوق. في المقابل، في عبر نمط نمط الألياف، كل خلية الحسية يمكن أن تستجيب لصفات طعم متعددة بحيث يتم تمثيل المعلومات عن مذاق من قبل استجابة شاملة من السكان من الخلايا العصبية الحسية. ما إذا كانت المعلومات الذوقية تمثلها الأذواق الأساسية، من خلال خطوط المسمى، أو من خلال آلية أخرى، غير واضح وهو محور التحقيق الأخير 3 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ويشير عملنا مؤخرا إلى أن النظام الذوقي يستخدم رمز السكان الزماني الزمني لتوليدتمثيلات المذاق الفردية بدلا من فئات الذوق الأساسية 10 .

هنا نقدم 3 أدوات جديدة للمساعدة في دراسة الترميز الذوقية. أولا، نقترح استخدام هوكموث ماندوكا سيكستا ككائن نموذج بسيط نسبيا قابلة لدراسة الكهربية من الذوق ووصف إجراء تشريح. ثانيا، نقترح استخدام خارج الخلية "تيتروديس" لتسجيل نشاط غن الفردية. وثالثا، نقترح جهازا جديدا لتقديم ورصد بدقة نبضات توقيت المذاق للحيوان. وقد تم تكييف هذه الأدوات من التقنيات التي استخدمها مختبرنا وآخرون لدراسة نظام الشم.

الحشرات مثل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، الجراد ششيستوسيركا أميريكانا ، فضلا عن العثة ماندوكا سيكستا، على مدى عقود قدمت موارد قوية لفهم المبادئ الأساسية حول نرفوس، بما في ذلك الترميز الحسي (على سبيل المثال، والشم 13 ). في الثدييات، ومستقبلات الذوق هي الخلايا المتخصصة التي تتواصل مع الخلايا العصبية من خلال مسارات الثاني مسنغر معقدة 1 ، 14 . فمن أبسط في الحشرات: مستقبلات الذوق لها هي الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، مسارات الذوق الثدييات بالقرب من المحيط معقدة نسبيا، ويضم متعددة، والطرق العصبية الموازية، والمكونات الهامة تشكل تحديا للوصول، الواردة في هياكل عظمية صغيرة 15 . ويبدو أن مسارات طعم الحشرات أبسط. في الحشرات، واردة غنز في الهياكل المتخصصة المعروفة باسم سنسيلا، وتقع في الهوائي، فمبارتس، والأجنحة والساقين 16 ، 17 . و غنز مباشرة المشروع إلى منطقة تحت المريء (سيز)، وهو الهيكل الذي كان يعتقد أن دوره أساسا الذوق 17 ، والذي يحتوي على الدرجة الثانيةالخلايا العصبية الذوقية 10 . من هناك المعلومات يسافر إلى الجسم لدفع ردود الفعل، وإلى مناطق الدماغ أعلى لتكون متكاملة، وتخزينها، وفي نهاية المطاف لدفع الخيارات السلوكية 16 .

فمن الضروري لتوصيف ردود الطعم الطرفية لفهم كيفية نشر المعلومات طعم وتحويلها من نقطة إلى نقطة في جميع أنحاء الجهاز العصبي. الطريقة الأكثر شيوعا لمراقبة مباشرة النشاط العصبي من غنز في الحشرات هي تقنية تسجيل طرف 12 ، 18 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 . وهذا ينطوي على وضع القطب مباشرة على سنسيلوم، وكثير منها من السهل نسبيا للوصول إليها. يتم تضمين مذاق داخل القطب، والسماح لتفعيل واحد و إكستراسيلولارلي قياس ردود الخلايا العصبية من غنز في سينسيلوم. ولكن، لأن مذاق واردة في القطب، فإنه ليس من الممكن لقياس النشاط غن قبل يتم تسليم مذاق أو بعد إزالته، أو لتبادل المذاق دون استبدال القطب 20 . كما تم استخدام طريقة أخرى، وهي تقنية تسجيل "الجدار الجانبي"، لتسجيل نشاط غن. هنا، يتم إدراج القطب تسجيل في قاعدة من سنسيلوم الذوق 24 ، ويتم تسليم المذاق من خلال زجاجي الشعرية منفصلة على طرف سينسيلوم. وتقيد كلا التقنيتين التسجيل من غنز إلى سنسيلوم معين. هنا، نقترح تقنية جديدة: تسجيل من محاور غن اختيارها عشوائيا من سنسيلا مختلفة، في حين أن تسليم بشكل منفصل تسلسل من المذاق إلى خرطوم. وتتحقق التسجيلات أكسون عن طريق وضع إما أقطاب الزجاج حادة أو حزم خارج الخلية الكهربائي (تيتروديس) في العصب الذي يحمل محاور عصبية منغن في خرطوم إلى المنطقة الاقتصادية الخاصة 10 . في ماندوكا ، تعبر هذه المحاور العصب الفك العلوي، الذي يعرف بأنه محض تماما، مما يسمح بتسجيل لا لبس فيه للاستجابات الحسية 25 . هذا الأسلوب من تسجيل من محاور عصبية، يسمح، لأكثر من ساعتين، قياس مستقر من ردود غن قبل وأثناء وبعد سلسلة من العروض تذوق.

هنا، وصفنا إجراء تشريح لفضح الأعصاب الفك العلوي جنبا إلى جنب مع المنطقة الاقتصادية الخاصة، والتي يمكن أن تسمح واحدة لتسجيل في وقت واحد ردود متعددة غن والخلايا العصبية في المنطقة الاقتصادية الخاصة 10 . نحن أيضا تصف استخدام تسجيلات خارج الخلية من غن باستخدام 4-تيترد الأسلاك الملتوية حسب الطلب التي، جنبا إلى جنب مع ارتفاع طريقة الفرز، ويسمح تحليل متعددة (في أيدينا، وتصل إلى ستة) غنز في وقت واحد. نحن أيضا مقارنة التسجيلات التي أجريت مع تيتروديس إلى التسجيلات مع الخلايا حادةالأقطاب الكهربائية. وأخيرا، نحن تصف جهازا جديدا لتقديم المثيرات تذوق. إن جهازنا الجديد، الذي يتم تكييفه من المعدات التي يستخدمها العديد من الباحثين منذ زمن طويل لتقديم الروائح في دراسات الشم، يقدم مزايا لدراسة الهبات: تحسين نظام التسليم المتعدد القنوات السابق مثل تلك التي طورها ستوركو وزملاؤه (انظر المراجع 26 ، 27 )، يحقق جهازنا دقة السيطرة على توقيت تسليم مذاق مع توفير قراءات الجهد من هذا التوقيت. ويسمح تسليم سريع ومتسلسل من المحفزات تذوق متعددة 10 . الجهاز يحمي خرطوم في تدفق مستمر من المياه النظيفة التي يمكن تسليمها النبضات التي تسيطر عليها من المذاق. كل نبض تذوق يمر فوق خرطوم ثم يتم غسلها بعيدا. يحتوي المذاق على كمية صغيرة من تلوين الطعام لا طعم له، مما يسمح لجهاز استشعار الألوان لمراقبة، مع توقيت دقيق، مرور المذاق أوفإيه خرطوم.

Protocol

الحذر: غرامة، والمقاييس مسحوق صدر عن ماندوكا يمكن أن تكون مثيرة للحساسية ولذلك ينصح باستخدام قفازات السلامة المخبرية وقناع الوجه.

1. تشريح ماندوكا سيكستا للكشف عن الأعصاب الفك العلوي والمنطقة الاقتصادية الخاصة

  1. اختيار العثة المناسبة من أي من الجنسين على أساس الميزات التالية: بعد ثلاثة أيام إكلوسيون مع مظهر صحي عام (أجنحة يجب أن تمتد بشكل كامل، وينبغي أن تكون خرطوم والهوائيات سليمة).
    1. وضع العثة بشكل فردي في كوب من البلاستيك للنقل.
  2. إدراج العثة في أنبوب البولي بروبيلين.
    الحذر: نوصي بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان لمنع موازين مسحوق العثة من الانتشار.
    1. وينبغي أن يكون أنبوب أطول قليلا أن الجسم العثة ( الشكل 1A ). ويمكن إجراء الأنبوب عن طريق قطع أنبوب البولي بروبلين 15 مل.
      2. < لي> دفع العثة حتى يتعرض الرأس وإدراج بالاقتران ورقة الأنسجة حتى في الطرف الآخر من أنبوب للمساعدة في الحفاظ على عثة غير متحرك ( الشكل 1A ).
  3. إزالة الشعر من الرأس المكشوفة العثة (البطني والظهرية) عن طريق تهب الهواء المضغوط على ذلك.
    1. ويمكن إجراء طائرة هوائية من خلال ربط حقنة (1 مل مع إبرة، إد حوالي 1.4 ملم، مع إزالة طرف حاد) إلى مصدر الهواء المضغوط.
      ملاحظة: بعد إزالة الشعر جميع الخطوات التالية لا يمكن أن يؤديها خارج غطاء الدخان.
  4. مرة واحدة وقد تم إزالة معظم الشعر، وضع الأنبوب في غرفة عقد مع الجزء الظهري من الرأس مواجهة، كما هو مبين في الشكل 1B .
    1. على طبق بتري، واستخدام الطين النمذجة لبناء قاعدة الثلاثي حوالي 7 سم طويلة، وارتفاع 2.5 سم ( الشكل 1B ).

EP-together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1 : إعداد غرفة تشريح ل ماندوكا . ( A ) يتم ضبط العثة في أنبوب. يتعرض الرأس على طرف واحد، في حين يتم توصيل الطرف الآخر مع المناديل الورقية. ( B ) ويظهر غرفة تشريح مصنوعة من طبق بتري ونمذجة الطين. الجزء الظهري من الرأس يواجه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حماية الهوائيات و خرطوم.
    1. إعداد 3 أنابيب صغيرة عن طريق قطع طرف ماصة (نصائح صفراء، 1-200 ميكرولتر) مع شفرة حلاقة في 3 قطع من حوالي 0.5 سم في الطول. القطر الداخلي يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية بحيث الهوائي و خرطوم يمكن أن تناسب بشكل مريح.
    2. إعداد هوك من قبلالانحناء سلك (22 أوغ، من حوالي 7 سم طويلة). تمديد خرطوم العثة ثم إدراجه في واحدة من أنابيب صغيرة عن طريق سحبه من خلال ربط السلك حتى يصل الأنبوب إلى الجزء القريب من خرطوم.
    3. تأمين أنبوب صغير مع الشمع الباتيك شركة (باستخدام، على سبيل المثال، الشمع الكهربائية الأسنان لتذوب وتوجيه الشمع) إلى الجزء الظهري من الرأس كبسولة العثة ( الشكل 2A اليسار).
    4. وضع كل هوائي في أنبوب وتأمين الأنابيب مع الشمع الباتيك كما هو مبين في الشكل 2A (يسار). كن حذرا لتجنب إتلاف الهوائيات مع الشمع الساخن.
  2. استقرار الدماغ ضد الحركة عن طريق قطع العضلات التي تغطي السطح الأمامي للدماغ ( أي عضلة ضاغط الشدق).
    1. تحت المجهر تشريح، واستخدام مقص تشريح الصغرى أو مصغرة الفأس من صنع رقاقة الحلاقة لصقها لمسواك لفتح كبسولة الرأس من قبل ماكقطع صغيرة أقل بقليل من خرطوم ( الشكل 2A ، اليسار العلوي أقحم).
    2. استخدام الصغرى تشريح مقص لخفض عضلة ضاغط الشدق (للحصول على الرسوم التوضيحية انظر المرجع 25 ). كما العضلات ليست مرئية بسهولة، ويوصى الاختبار السلوكي التالية للتأكد من أنه قد تم قطع.
    3. تمييع السكروز في الماء المقطر لتحقيق حل 1 M.
    4. استخدام ماصة لتسليم حوالي 200 ميكرولتر من محلول السكروز إلى 2/3 البعيدة من خرطوم، ومراقبة خرطوم لمدة 5 دقائق. إذا تم قطع العضلات بشكل صحيح الحشرة لا ينبغي أن تكون قادرة على تمديد أو نقل خرطوم.
    5. تطبيق طبقة من الشمع الباتيك ذابت لختم افتتاح في الرأس كبسولة.
  3. الوجه الحشرة على هذا الجانب البطني من الرأس كبسولة تواجه الآن.
  4. لإذابة المالحة أثناء وبعد إجراء تشريح بناء كوب الشمع حول الجانب البطني للرئيس أوسينز الشمع الكهربائية: تحت المجهر تشريح، بدء بناء الكأس من خلال تطبيق الصف الأول من الشمع على طول الجزء الأمامي من الرأس، والانتقال نحو الجزء الخلفي. الحفاظ على خرطوم وأنابيب الهوائي داخل الكأس ( الشكل 2A الحق).
    1. مواصلة بناء الكأس إلى الخارج وإلى أعلى حتى يصل إلى مستوى العينين.
  5. استخدام ملقط لاتخاذ واحدة من اثنين بالبس شفوي، ثم ضعه على الجانب وتأمينه في كوب الشمع بإضافة المزيد من الشمع الذائب. تفعل الشيء نفسه مع الجانب العلوي ماكسيلاري ( الشكل 2A الحق).
  6. ختم أي فتحات في كوب الشمع والأنابيب.
    ملاحظة: في هذه الخطوة يستخدم الايبوكسي لأنه يساعد على سد الفجوات بسهولة في الشمع والأنابيب، ويتجنب أي ضرر ذات الصلة بالحرارة لهوائيات و خرطوم.
    1. استخدام مسواك لخلط الايبوكسي ثنائي في طبق خلط البلاستيك. احتفظ بطبق الخلط.
    2. استخدام مسواك لتطبيق رقيقةطبقة من الايبوكسي إلى الخارج وداخل الكأس ( الشكل 2B ).
    3. ملء مساحة فارغة في الأنابيب التي تحتوي على خرطوم والهوائيات مع الايبوكسي، وملء جزء من أنبوب البولي بروبلين المحيطة الرقبة مع ما يكفي من الايبوكسي لعقده بقوة في مكان ( الشكل 2B ).
    4. ترك الايبوكسي لتجف لمدة 20 دقيقة تقريبا. للتحقق من هذا، اختبار الايبوكسي المتبقية في طبق خلط البلاستيك لضمان أنها صلبة ولم تعد لزجة.
    5. ملء كوب الشمع مع ماندوكا المالحة الفسيولوجية 28 وانتظر بضع دقائق للتأكد من عدم وجود تسرب. إذا كان تسرب مرئيا، في محاولة لختم ذلك عن طريق تطبيق المزيد من الشمع الساخن و / أو الايبوكسي.

الشكل 2
الشكل 2 : إعداد ماندوكا </ إم> لتشريح. ( A ) يتم حماية هوائيات و خرطوم داخل أنابيب صغيرة مصنوعة من نصائح ماصة مقطعة إلى ثلاث قطع من حوالي 0.5 سم في الطول. (اللوحة اليسرى، صورة كبيرة) يتم تأمين أنابيب مع شمع الباتيك ذاب تطبيقها حول الجزء الظهري من الرأس. (اللوحة اليسرى، أقحم) لإزالة العضلات ضاغط الشدق، يتم فتح الجانب الظهري من كبسولة الرأس عن طريق جعل قطع صغيرة كما هو مبين من قبل خط منقط في الصورة الكبيرة. (اللوحة اليمنى) بنيت كأس الشمع المحيطة الجانب البطني من الرأس كخزان للمالحة بيرفوسد خلال إجراء تشريح وتسجيل التجارب. ( ب ) يستخدم الايبوكسي لسد الفجوات بين قاعدة كأس الشمع والجزء الظهري من الرأس (اللوحة اليسرى)، وبين الشمع والأنابيب التي تحتوي على الهوائيات والاختبارات، بما في ذلك فتحات الأنابيب (اللوحة اليمنى ). الرجاء انقر هنا tس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحت المجهر تشريح، واستخدام مقص تشريح الجزئي لقطع بالس شفوي.
  2. استخدام مقص الصغرى تشريح أو مصغرة الفأس لفتح الجانب البطني من كبسولة الرأس عن طريق إجراء أربع تخفيضات: قطعتين على طول بشرة التي تحيط كل عين من الخلف إلى الأمام، وقطع واحدة على بشرة على طول الجزء الخلفي من الرأس، وقطع واحد على بشرة على طول الجزء الأمامي من الرأس بالقرب من خرطوم ( الشكل 3A ).
  3. سحب بلطف بعيدا بشرة باستخدام ملقط تشريح الجزئي لفضح الدماغ.
  4. باستخدام اثنين حاد ملقط تشريح الدقيقة ببطء وبعناية إزالة الأنسجة الدهنية والقصبة الهوائية التي تغطي المنطقة الاقتصادية الخاصة. تجنب أي ضرر في الدماغ أو الأعصاب (على سبيل المثال، العصب الفك العلوي، العصب البصري، عنق الرحم الضام). شطف الدماغ عن طريق استبدال كثير من الأحيان محلول ملحي، وضبط الضوء في كثير من الأحيان لتحسين الرؤية. ملاحظة: قد يكون هذا الجزء الأكثر أهمية من ديssection. فمن السهل أن تضر عن غير قصد العصب الفك العلوي عن طريق جر أو سحق.
    ملاحظة: عند هذه النقطة المنطقة الاقتصادية الخاصة والأعصاب الفك العلوي يجب أن تكون واضحة للعيان ( الشكل 3B -3C ). ومع ذلك، يتم تغطية الدماغ والأعصاب الفك العلوي غمد رقيقة.
  5. لإزالة غمد، استبدال المالحة في كوب الشمع مع 10٪ (ث / ت) كولاجيناز / ديسباس الذائبة في المياه المالحة وتركها في مكان لمدة 5 دقائق. ثم، بعد الشطف الدماغ عدة مرات مع المياه المالحة، وإزالة بلطف غمد مع ملقط تشريح الدقيقة فائقة غرامة عن طريق سحب غمد يصل من المنطقة الاقتصادية الخاصة من خلال الأعصاب الفك العلوي.
  6. تبدأ في إرواء كوب الشمع مع المالحة العذبة. وضع أنبوب من خط بالتنقيط المالحة في كوب الشمع وتأمين ذلك هناك مع الشمع الذائب.

الشكل 3
تينأور 3 : ماندوكا تشريح الإجراء. ( A ) إزالة لبس شفوي، يتم فتح كبسولة الرأس عن طريق إجراء أربع تخفيضات كما هو مبين من قبل خط منقط. ( B ) صورة مكبرة للدماغ بعد فتح كبسولة الرأس وإزالة الأنسجة الدهنية والقصبة الهوائية، مما يسمح التصور من الأعصاب الفك العلوي (مكسنز) ومنطقة تحت المريء (سيز، وهو مصطلح يشير إلى منطقة الدماغ تحت المريء). الأعصاب الفك العلوي تحمل محاور عصبية من الخلايا العصبية مستقبلات الذوق (غرس) في خرطوم إلى المنطقة الاقتصادية الخاصة. ( C ) التخطيطي للدماغ ماندوكا . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. مذاق تسليم نظام

  1. يتكون نظام التوصيل من أربعة عناصر رئيسية هي: مصدر المياه، مشعب المذاق، مستشعر الألوان، والموقع الذي يحتوي علىخرطوم، كل متصلا أنبوب بلاستيكي جامد ( الشكل 4A -4B ). لبناء هذا النظام اتبع الخطوات المبينة في الشكل 4B . استخدام أنبوب بلاستيكي جامد حوالي 6 سم في الطول (إد 0.3 سم).
  2. استخدام الحديد لحام لجعل ثقب صغير في الأنبوب حيث خرطوم هو الذهاب الى وضعها ( الشكل 4A -4B ).
  3. للتأكد من أن خراطيم الحيوانات المختلفة توضع دائما في نفس الموقع، إرفاق المواد البلاستيكية الفرز (شبكة، حجم ثقب حوالي 0.1 سم) في الأنبوب ( الشكل 4A -4B ). مع شفرة حلاقة أو أداة دوارة قطع أنبوب جامدة حوالي 5 ملم فوق ثقب خرطوم. وضع شبكة بين قطعتين من أنبوب. تأمين شبكة وإعادة توصيل الأنابيب من خلال تطبيق الايبوكسي على الخارج من الأنابيب. ترك الايبوكسي لتجف لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  4. لالمذاق تسليم استخدام الضغطنظام نضح مع العديد من أنابيب تذوق حسب الحاجة، انضم إلى مشعب (انظر أدناه). استخدام الحديد لحام لجعل ثقب صغير في أنبوب جامدة حوالي 1 سم فوق شبكة. إدراج أنبوب الإخراج من نظام نضح (إد 0.86 مم) في أنبوب جامدة وتأمين ذلك من خلال تطبيق الايبوكسي ( الشكل 4A -4B ).
  5. استخدام مضخة تحوي لتسليم تدفق مستمر (~ 40 مل / دقيقة) من الماء المقطر. توصيله مع أنابيب السيليكون إلى أنبوب جامدة ( الشكل 4A -4C ). ربط الجانب الآخر من أنبوب جامدة إلى أنبوب السيليكون آخر لتوجيه الإخراج إلى حاوية النفايات الكبيرة ( الشكل 4A -4C ).
  6. لتقديم المذاق، وضخ الهواء المضغوط في مشعب من نظام نضح. ويمكن تحقيق ذلك، على سبيل المثال، باستخدام مضخة تعمل بالهواء المضغوط (10 رطل لكل بوصة مربعة) يسيطر عليها مدخل نبض الجهد الموقت لحقن الهواء المضغوط في المنيفول د أنبوب يحتوي على المذاق المطلوب. نبض 1S يخرج حوالي 0.5 مل من مذاق.

3. إعداد مذاق ورصد مذاق التسليم

  1. تمييع مذاق في الماء المقطر إلى التركيز المطلوب. كن على علم بأن المذاق سوف يضعف أكثر من تيار المياه. قمنا بقياس التركيز النهائي للوصول إلى خرطوم كما 77٪ من التركيز الأولي (انظر المراجع 10 ، 29 ).
  2. إضافة صبغ الغذاء الاصطناعي لكل حل تذوق للسماح بتحديد التوقيت الدقيق الذي يمر مذاق فوق خرطوم. وجدنا أن الصبغة الخضراء (انظر قائمة المواد ) عند 0.05٪ ث / الخامس لا تنشيط ماندوكا غن.
  3. استخدام جهاز استشعار الألوان (انظر الجدول 1) للكشف عن تلوين الطعام في حلول مذاق. استخدام الحديد لحام لجعل حفرة المتاخمة للشبكة و 0.5 سم تحت أنبوب الإخراج من نظام نضح ( s = "زفيغ"> الشكل 4A -4B). توصيل الاستشعار إلى أنبوب جامدة وتأمين ذلك هناك تطبيق الايبوكسي على الخارج.
    1. تسجيل الناتج الجهد استشعار اللون كإشارة التناظرية جنبا إلى جنب مع الإشارات الفسيولوجية (انظر القسم 4). يمكن تضخيم إشارة الجهد استشعار اللون باستخدام مكبر للصوت دس متصلة استشعار ( الشكل 4A ).
  4. تأكد من أن جهاز استشعار الألوان يعمل من خلال تقديم المذاق وتسجيل الناتج الجهد الاستشعار. يجب أن تتجاوز الإشارة التي أثارتها الصبغة مستوى الضوضاء.
    1. ضبط معدل تدفق المياه المستمر لجعل إشارة أقرب إلى مربع ممكن.
      ملاحظة: عند تقديم مذاق متعددة في تسلسل، لاحظ المحاكمة الأولى مع مذاق جديد سيتكون من مزيج من المذاق الجديد والسابق. لهذا السبب، لم نحلل هذه التجارب الأولى.
"> الشكل 4
الشكل 4 : نظام تسليم مذاق. ( A ) التخطيطي للجهاز يستخدم لتقديم ورصد نبضات توقيت توقيت من المذاق إلى خرطوم الحيوان. ويشار إلى المكونات الرئيسية للنظام بأرقام حمراء. يتم الحفاظ على تدفق مستمر من الماء المقطر عبر خرطوم بواسطة مضخة تحوي متصلة أنابيب السيليكون إلى أنبوب بلاستيكي جامد (1) حيث يتم وضع خرطوم (6). يتم تسليم المذاق التي تحتوي على كمية صغيرة من الصبغة خالية من الذوق باستخدام نظام ضغط نضح 16 قناة. ترتبط الخزانات التي تحتوي على المذاق بمجموعة متعددة (2) تعلق على الأنبوب الجامد، فوق الحفرة التي يتم فيها وضع الخرطوم (5). يتم حقن الهواء المضغوط من مضخة تعمل بالهواء المضغوط إلى نظام نضح لتقديم بسرعة مذاق، مع توقيت تسيطر عليها البرامج المخصصة. الون الاستشعار (3) يستخدم لمراقبة مذاق التسليم. يتم توصيل جهاز استشعار إلى أنبوب جامدة المتاخمة للخلل وتحت مخرج نظام نضح مذاق. يتم تضخيم إشارة الجهد استشعار اللون من قبل مكبر للصوت دس. ويوضح التتبع الأحمر الموجود على اللوحة المجاور للمكبر إشارة اللون المسجلة باستخدام برمجيات الحصول على البيانات المخصصة؛ والزيادة السريعة وانخفاض في إشارة تعكس وصول وتغسل من تذوق، على التوالي. يتم وضع خرطوم العثة في حفرة (5) تقع فقط تحت مستشعر اللون. يتم وضع شبكة (4) فوق الحفرة للتأكد من أن خراطيم الحيوانات المختلفة يتم وضع دائما في نفس الموقع. الجانب الآخر من الأنبوب الجامد متصل بأنبوب سليكون آخر لتوجيه الإخراج إلى حاوية النفايات (7). ( B ) صورة تظهر العناصر الرئيسية لنظام تسليم مذاق متصلا أنبوب البلاستيك جامدة، والتي تشير إليها الأرقام الحمراء كما هو مبين في لوحة A: المياهمصدر (6)، وأنبوب الإخراج المشعب الذوق (2)، ومستشعر اللون (3)، وشبكة (4)، وحفرة حيث يتم إدراج خرطوم (5) كل متصلا أنبوب بلاستيكي جامد (1) . ( C ) يظهر وضع إعداد ماندوكا في الإعداد. يتم إدخال T2 البعيدة / 3 من خرطوم العثة في حفرة (5) في أنبوب بلاستيكي جامد (1). يتم تأمين خرطوم في مكان مع الشمع الأسنان والإيبوكسي كما هو مبين من قبل أقحم. ويشير الرقمان 6 و 7 على التوالي إلى مدخل المياه إلى الأنبوب الصلب وإخراجه إلى حاوية النفايات. يشير الرقم 2 إلى أنبوب إخراج المنوع المتذوق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. خارج الخلية تيترود تسجيل لمراقبة مذاق أثار النشاط من غن

  1. وضع إعداد العثة على منصة تحت ستيريوميكروسكوب على اهتزازأونيون عزل الجدول ( الشكل 4C ).
  2. وضع البعيدة الثلثين من خرطوم العثة في أنبوب جامدة من نظام تسليم مذاق ( الشكل 2B ). للقيام بذلك، تمديد خرطوم العثة وثم إدراجه في حفرة من أنبوب جامدة عن طريق دفع بلطف من خلال مساعدة ملقط خلع الملابس. ختم خرطوم في مكان مع لينة الأسنان الشمع ثم طبقة من الايبوكسي لتجنب تسرب ( الشكل 4C ، مدخل).
  3. ربط خط نضح المالحة إلى كبسولة الرأس وتعيين تدفق نضح إلى معدل ثابت من حوالي 0.04 لتر / ساعة.
  4. تزج قطب الأرض ( أي سلك الفضة كلورايد) في حمام المالحة ( الشكل 5A ).
  5. استخدام مخصصة الملتوية سلك تيترود بنيت بعد إجراء تلفيق وصفها في 30 (4 الأسلاك الكهربائية واقترح لتحقيق وحدات معزولة جيدا وتناسب فيالعصب). قبل التجربة، بالكهرباء القطب التالية الخطوات الموضحة في 30 .
  6. استخدام ميكرومانيبولاتور دليل لوضع تيترود قريبة من العصب الفك العلوي. دفع تيترود حتى يبدأ في دخول العصب ( الشكل 5 ).
  7. انتظر لمدة 10 دقيقة على الأقل بعد وضع تيترود للسماح لها لتحقيق الاستقرار داخل العصب قبل التسجيل.
  8. تضخيم إشارة (3000X) واستخدام فلتر تمرير الفرقة تعيين بين 0.3-6 كيلو هرتز. الحصول على إشارة بمعدل 40 كيلوهرتز أخذ العينات باستخدام برامج الحصول على البيانات.
  9. بعد الانتهاء من التجربة وضع إعداد العثة في الثلاجة.

الشكل 5
الشكل 5 : تسجيل تيترود من غن. ( A ، صورة كبيرة) ويستخدم ميكرومانيبولاتور ل pالدانتيل الأسلاك الملتوية تيترود في العصب الفك العلوي (مسن) لتسجيل نشاط غن. يتم وضع القطب الفضة الفضة كلوريد في حمام المالحة كما هو مبين. ( A ، إنزيت) صورة مكبرة للدماغ تظهر تيترود في العصب الفك العلوي. يشار أيضا إلى منطقة تحت المريء (سيز). ( B ) التخطيطي للدماغ ماندوكا المنحى كما هو الحال في A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

نشاط غن يمكن تسجيلها باستخدام خارج تيترود القطب قبل وأثناء وبعد تسليم مذاق ( الشكل 6A و 6 C ). الشكل 6A (لوحات الأوسط والسفلي) يظهر تصفية (300-6،000 هرتز) آثار الجهد التي سجلتها كل من الأسلاك الأربعة وضعت في العصب الفك العلوي، حيث يمكن ملاحظة إشارات من اتساعات مختلفة تعكس إمكانات العمل (السهام). تم تسليم نبضة 1 ثانية من مذاق (1 M السكروز) 2S بعد بداية التجربة. تم رصد بداية وإزاحة التحفيز من قبل استشعار اللون ( الشكل 6A ، لوحة العلوي). المذاق الناجم عن المذاق التي يمكن ملاحظتها في كل من القنوات الأربع ( الشكل 6A ، لوحة الوسطى). يمكن التعرف على غن وتمييزها عن ميكانوسنسورس (لا شيء هو موضح هنا) عندما تستجيب لبعض المذاق وليس الآخرين

لتحديد وعزل ردود الخلايا العصبية واحدة من التسجيلات تيترود، أجرينا خارج الخط فرز الفرز باستخدام مجموعة من الوظائف المخصصة على أساس بوزات 31 و 32 ، 33 أساليب كلينفيلد (يتم وصف هذه الأساليب في هذه الاستشهادات: 10 ، 29 ). ويبين الشكل 6B مثال على الفرز ارتفاع تطبيقها على البيانات هو مبين في الشكل 6A ، والتي تم العثور على ثلاث وحدات معزولة جيدا.

مخطط النقطية من الشكل 6C تصور ردود الوحدات المعزولة الثلاث في الشكل 6B إلى ستة مذاق مختلفة (1 M السكروز، مالتوز و كلوريد الصوديوم، 100 ملي الكافيين و 10 ملي بربارين و لوبيلين) تسليمها في تسلسل (4 محاكمة s / مذاق). كما هو مبين في الشكل 6C ، فإن غن المسجلة لها مستويات مختلفة من النشاط الأساسي، بدءا من الصمت (غن 1) إلى منخفضة أو معتدلة (غن 2 و 3). بعد ظهور مذاق، تظهر غنز أنماط النشاط المتنوعة ويظهر الانتقائية المختلفة إلى المذاق. على سبيل المثال، ردت غن 1 فقط على السكروز، في حين ردت غن 2 إلى مالتوز و كلوريد الصوديوم مع انفجار من المسامير و لوبيلين مع التساقط فقط في بداية التحفيز. بالإضافة إلى ذلك، يتم تأمين بعض الردود على توقيت التحفيز (على سبيل المثال استجابة غن 1 إلى السكروز)، في حين أن استجابات أخرى تدوم مدة التحفيز (على سبيل المثال استجابة غن 3 لبربارين) أو تحتوي على كل من مكونات مثيرة ومثبطة (على سبيل المثال الشكل 7 غن 2 الردود على كلوريد الصوديوم والسكروز). لمزيد من المعلومات حول الحساسيات المتنوعة وأنماط نشاط غنز انظر المرجع 10 .

= "1"> للتحقق من استخدام تقنيات تيترود و سبايك الفرز لتسجيل غنز من العصب الفك العلوي، أجرينا تسجيلات داخل الخلايا من محاور غن في حيوانات أخرى باستخدام أقطاب زجاجية حادة تقليدية (مقاومة 80-120 MΩ). وجدنا أن أنماط النشاط التي تم الحصول عليها عن طريق استخدام تسجيلات داخل الخلايا كانت مماثلة للاستجابات التي لوحظت باستخدام تقنية تيترود ( الشكل 7 ). تم تسجيل آثار الجهد في المربع الأخضر في لوحة A سجلت داخل الخلايا من غن 1 خلال 5 محاكمات متتالية من عرض السكروز، وتظهر نفس الردود كما المؤامرات النقطية في لوحة B. (لاحظ أن هذا النوع من الاستجابة يطابق التي تم الحصول عليها مع تيتروديس و هو مبين في الشكل 6C .) غن 2، مسجلة مع أقطاب حادة داخل الخلايا، ويظهر نمط استجابة أوسع.

الشكل 6 الشكل 6: ممثل النتائج من تسجيلات العصب الفك العلوي مع تيتروديس خارج الخلية. ( A ) تصفيتها (300-6،000 هرتز) آثار الجهد المسجلة من قبل كل من الأسلاك الأربعة في العصب الفكي يظهر (لوحة الأوسط). تم تطبيق نبض 1 s من المذاق خلال الفترة الزمنية المشار إليها بالتظليل الأحمر في اللوحة الوسطى. تم رصد بداية وإزاحة التحفيز من قبل مستشعر اللون كما هو مبين من تتبع الجهد الأحمر على اللوحة العليا، ويرمز على لوحة الأوسط من قبل المنطقة المظللة الحمراء. الخطوط الأفقية المنقطة تدل على +50 (أعلى)، 0 (وسط) و -50 (أسفل) μV. ويظهر توسيع الجهد الجهد الخام يتطابق مع المنطقة داخل خطوط منقط العمودي (اللوحة السفلية). يشار إلى أمثلة من طفرات من قبل الأسهم. ( B ) مثال على الفرز ارتفاع تطبيقها على البيانات المعروضة في لوحة A. وشكلت الموجات في كل من الأسلاك خارج الخلية الأربعة (1-4) أر(ه) مع ثلاث وحدات غن مختلفة (وحدات 1-3) تساهم في الإشارات المسجلة. يتم عرض الأحداث الفردية (خطوط رقيقة ملونة) ومتوسط ​​(خط أسود سميك) للوحدات الثلاث. ويجب النظر في عدد من المعايير الإحصائية لتحديد الوحدات المستقلة بطريقة موثوقة باستخدام طريقة الفرز المرتفع (انظر المراجع 10 و 29 ). ( C ) المؤامرات النقطية التي تمثل ردود من وحدات معزولة ثلاث إلى سلسلة من ستة مذاق مختلفة (4 تجارب / مذاق وتظهر). يشار إلى الفترة الزمنية للتسليم الذوق (1 ق) من المنطقة المظللة الحمراء. وكانت تركيزات المذاق إما 1 M (السكروز، المالتوز، كلوريد الصوديوم)، 100 ملي (الكافيين) و 10 ملم (بربارين ولوبيلين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7 لاس = "زفيجيمغ" سرك = "/ فيليز / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
الشكل 7 : تسجيلات داخل الخلايا من محاور غن. ( A ، لوحة مربع الخضراء) آثار الجهد سجلت من غن مع الزجاج الحادة أقطاب الخلايا (المقاومة من 80-120 MΩ) وضعت في العصب الفك العلوي، أثاره 5 التحفيز على التوالي مع 1 M السكروز (سوك). ( B ) المؤامرات النقطية من ردود اثنين من غن، بما في ذلك الردود المبينة في لوحة A (لوحة مربع الأخضر)، إلى اثنين من مذاقات مختلفة تسليمها في تسلسل (100 ملم لون الخط الرمادي، 1 M لون الخط الأسود) سجلت مع الزجاج الحادة أقطاب الخلايا وضعت في العصب الفك العلوي (7 تجارب / مذاق و 3 تجارب / المياه مبينة). يشار إلى مذاق وقت التسليم من خلال المناطق المظللة باللون الأحمر في كلا الفريقين. تم رصد بداية وإزاحة التحفيز من قبل جهاز استشعار الألوان، كما هو مبين من آثار الجهد الأحمر في الجزء السفلي من كل لوحة.إس / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الطرق الموصوفة هنا تسمح في تسجيلات الجسم الحي من حيوان بسيط نسبيا، ماندوكا سيكستا ، لتوصيف نشاط متعددة، غنز تم اختيارها عشوائيا على مدى فترات طويلة (لأكثر من 2 ساعة)، قبل وأثناء وبعد تسليم مذاق. هذه الطرق تسمح أيضا تسليم سريع ومتسلسل من المحفزات تذوق متعددة مع مراقبة زمنية دقيقة، والمزايا التي هي مفيدة لدراسة الآليات العصبية الكامنة وراء تمثيل الذوق. وقد تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة كيفية تحويل ردود غن إلى المذاق عندما تنتقل إلى الخلايا العصبية المستهدفة بعد المشبكي (على سبيل المثال، في المنطقة الاقتصادية الخاصة) عن طريق رصد غنز في وقت واحد مع إنتيرنيورونس مونوسينابتيكالي 10 . بالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب يمكن تكييفها لاحتياجات المجرب، مما يسمح بتنفيذ نماذج معقدة لدراسة الجوانب الأساسية من الترميز الذوقية.

عندما تبدأز دراساتنا، مشكلة فنية واحدة كنا في بعض الأحيان لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها كان عدم القدرة على الكشف عن إشارات التساقط من العصب الفك العلوي مع الأسلاك تيترود. الأسباب المحتملة لهذا هي متنوعة، والبروتوكول تشريح تحديا، وبعض الممارسات ضرورية للحصول على إعداد جيد. أولا، خلال تشريح العثة والأعصاب الفك العلوي من السهل أن تتلف، وخصوصا خلال إزالة غمد المحيطة الأنسجة العصبية. ثانيا، إذا لم يتم إزالة غمد بالكامل، قد لا تكون أسلاك تيترود قادرة على الوصول إلى العصب. في كلتا الحالتين، بدء إعداد جديد هو في كثير من الأحيان أسهل طريقة لحل هذه القضايا. ثالثا، قد يكون هناك مشكلة مع أسلاك تيترود. ويمكن التحقق من هذا عن طريق قياس مقاومة الأسلاك التي ينبغي أن يكون ~ 270 كيلوواط في 1 كيلو هرتز. إذا كانت قيمة مقاومة أعلى من ~ 300 k elect، بالكهرباء الأسلاك مع الذهب لتحقيق مقاومة المطلوب (انظر المرجع 30 ). رابعا، قد يكون من الخطأ ربط قطعة من المعداتأو سوء التصرف.

وهناك مشكلة أخرى محتملة هي أن الإشارات المتساقطة تسجل ولكن الخلايا العصبية تظهر لا تستجيب للمذاق. هذا يمكن أن يكون لأن الخلايا العصبية المسجلة غير حساسة لمجموعة من المذاق تسليمها. أيضا، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه بالإضافة إلى محاور عصبية غن، العصب الفك العلوي كما يحمل الألياف الحسية. وهكذا، فمن الممكن أن تسجل من الخلايا العصبية الحسية الميكانيكية بدلا من، أو بالإضافة إلى، غنز. ومع ذلك، تم تصميم نظام تسليم مذاق لتوفير مدخلات ميكانيكية ثابتة في جميع أنحاء التجربة مما يجعل من غير المحتمل أن الردود على مذاق سيتم الخلط من خلال الردود على العنصر الميكانيكي من تسليمها. الخلايا العصبية التي تستجيب لبعض ولكن ليس مذاق آخر، أو بطرق مختلفة لمذاق مختلفة، يمكن تصنيفها بشكل لا لبس فيه كما غنز. نوصي باستخدام طعم المخفف طازجة لتجنب الاختلافات في تركيز مذاق أو تكوين بسبب تدهور مركب أو التبخرمن المذيب. كما نوصي بتنظيف النظام بانتظام لتجنب تلوث الأنابيب و / أو العوائق.

وهناك مشكلة تقنية أخرى محتملة هي نسبة الإشارة إلى الضوضاء غير المؤاتية. يمكن حل هذه المشكلة في كثير من الأحيان عن طريق إعادة الكلور أو تعديل موقف القطب الأرض حمام. قد تتطلب حلول أخرى التدريع وتقليل طول كل اتصال كهربائي في الجهاز.

وأخيرا، من المهم أن نلاحظ أن التحليل الصحيح للبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام التسجيلات تيترود يتطلب دقيق الفرز الفرز. وجدنا أن الطرق المؤتمتة بالكامل غير كافية بشكل عام. نوصي أن تصبح مألوفة مع ارتفاع الأدب فرز قبل تحليل البيانات تيترود 10 ، 29 ، 31 ، 32 ، 33 .

بدائل لدينا تشريح للمحترفينتوكول يمكن استخدامها. هنا، وصفنا تشريح من خلال الجزء البطني من رأس العثة، وتوفير الوصول إلى الأعصاب الفك العلوي والمنطقة الاقتصادية الخاصة، ولكن من الممكن أيضا للوصول إلى هذه الهياكل عن طريق تشريح من خلال الجانب الظهري. وجدنا أن إعداد الجانب الظهري ليس الأمثل لإجراء تسجيلات من هذه الهياكل الذوقية بسبب موقعها العميق، ولكن هذا التحضير لا تقدم ميزة تمكين التسجيلات من هياكل ترتيب أعلى مثل الجسم الفطر، وهي المنطقة التي ارتبطت مع متعددة والتكامل الإلزامي، والتعلم التشاركي ومعالجة الذاكرة 34 . لقد ركزنا على استخدام أقطاب تيترود لتسجيل من العصب الفك العلوي، ولكن، كما هو موضح، ويمكن أيضا أن تستخدم أقطاب حادة داخل الخلايا القياسية لهذا الغرض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين كل من التقنيات لإجراء تسجيلات في وقت واحد من مناطق الدماغ متعددة 10 . يقدم الأدب علم الأعصاب أمثلة كثيرة من طالتي أثبتت أنها أدوات قوية للكشف عن المبادئ الأساسية للمعالجة الحسية، مثل الترميز الشمي، التي تنطبق على كل من الحشرات والفقاريات 35 ، 36 ، 37 ، 38 ، 39 . نأمل أن تؤدي أساليبنا إلى رؤى جديدة أساسية حول الترميز الذوقي.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة داخلية من المعاهد الوطنية للصحة - نيشد إلى مس نشكر G. دولد و T. تالبوت من المعاهد الوطنية للصحة نيمة الأجهزة الأساسية مرفق للمساعدة في تصميم نظام تسليم مذاق.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  2. Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
  3. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  4. Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
  5. Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
  6. Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
  7. Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
  8. Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
  9. Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  10. Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
  11. Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
  12. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
  13. Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
  16. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
  17. Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
  18. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  19. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  20. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  21. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  22. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
  23. Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
  24. Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
  25. Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
  26. Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
  27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
  28. Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
  29. Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
  31. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
  32. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
  33. Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
  34. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  35. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
  36. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
  37. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  38. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  39. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).

Tags

علم الأعصاب، العدد 124، والترميز الحسي، والإمالة، والخلايا العصبية مستقبلات الذوقية، العصب الفكي، منطقة المريء الفرعي، الكهربية، والتسجيلات متعددة الوحدات،
طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boronat-García, A., Reiter, S., … More

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter