Summary
Vi presenterar tre nya metoder för att studera gustatorisk kodning . Med hjälp av ett enkelt djur beskriver moth Manduca sexta ( Manduca ) ett dissektionsprotokoll, användningen av extracellulära tetroder för att registrera aktiviteten hos flera gustatoriska receptorneuroner och ett system för att leverera och övervaka exakt timade pulser av smakämnen.
Abstract
Smakens känsla gör det möjligt för djur att upptäcka kemikalier i miljön, vilket ger upphov till beteende som är kritiska för överlevnad. När gödningsreceptor Neurons (GRNs) detekterar smakämnesmolekyler kodar de information om identiteten och koncentrationen av smakämnet som mönster av elektrisk aktivitet som sedan sprids för att följa neuroner i hjärnan. Dessa mönster utgör interna representationer av smakaren, som då tillåter djuret att välja åtgärder och formminnen. Användningen av relativt enkla djurmodeller har varit ett kraftfullt verktyg för att studera grundläggande principer inom sensorisk kodning. Här föreslår vi tre nya metoder för att studera gustatorisk kodning med Moth Manduca Sexta . Först presenterar vi ett dissektionsförfarande för exponering av maxillary nerver och subesophageal zone (SEZ), vilket möjliggör inspelning av aktiviteten av GRNs från deras axoner. För det andra beskriver vi användningen av extracellulära elektroder för att registrera aktiviteten hos flera GRN genom att placera teTråden direkt i maxillärnerven. För det tredje presenterar vi ett nytt system för leverans och övervakning, med hög temporal precision, pulser av olika smakämnen. Dessa metoder möjliggör karaktärisering av neuronala svar in vivo direkt från GRNs före, under och efter att smakämnen levereras. Vi tillhandahåller exempel på spänningsspår registrerade från flera GRN, och presenterar ett exempel på hur en spikssorteringsteknik kan appliceras på data för att identifiera svaren hos enskilda neuroner. Slutligen, för att validera vår inspelning, jämför vi extracellulära inspelningar som erhållits från GRNs med tetroder till intracellulära inspelningar erhållna med skarpa glaselektroder.
Introduction
Gustatoriska och olfaktoriska system genererar interna representationer av kemikalier i miljön, vilket ger upphov till uppfattningar av smak och lukt. Dessa kemiska sinnen är viktiga för att framkalla många beteenden som är kritiska för organismens överlevnad, allt från att hitta kompisar och måltider för att undvika rovdjur och toxiner. Processen börjar när miljökemikalier interagerar med receptorer belägna i plasmamembranen hos sensoriska receptorceller; Dessa celler, direkt eller genom interaktioner med neuroner, omvandlar information om identitet och koncentration av kemikalier till elektriska signaler. Dessa signaler överförs sedan till högre ordningens neuroner och till andra hjärnstrukturer. Eftersom dessa steg fortskrider, genomgår ursprungssignalen alltid förändringar som främjar organismens förmåga att upptäcka, diskriminera, klassificera, jämföra och lagra den sensoriska informationen och välja en lämplig åtgärd. Förstå hur bhI omvandlar information om miljökemikalier för att bäst utföra en rad olika uppgifter är en grundläggande fråga i neurovetenskap.
Gustatkodning har ansetts vara relativt enkel: En allmänt hållen åsikt innebär att varje kemisk molekyl som framkallar en smak (en "smakämne") naturligt hör till en av de ungefär fem eller så grundläggande smakkvaliteterna ( dvs. söt, bitter, sur , Salt och umami) 1 . I denna "grundläggande smak" -vy är gustationssystemets jobb att bestämma vilken av dessa grundläggande smaker som finns. Vidare är de neurala mekanismerna som ligger bakom den grundläggande smaksrepresentationen i nervsystemet oklara och anses vara styrda av antingen en "märkt linje" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 eller en "över fibermönster" 7 , 8 kod. I en märkt linjekod svarar varje sensorisk cell och var och en av dess neurala följare på en enda smakkvalitet, som tillsammans bildar en direkt och oberoende kanal till högre behandlingscentraler i centrala nervsystemet dedikerade till den smaken. I motsats härtill kan varje sensorisk cell i en tvärgående fibermönsterkod svara på flera smakkvaliteter så att information om smakämnet representeras av det totala svaret hos populationen av sensoriska neuroner. Huruvida gustatorisk information representeras av grundläggande smaker, genom märkta linjer eller genom någon annan mekanism, är oklart och ligger i den senaste undersökningen 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Vårt eget senaste arbete tyder på att gustatory systemet använder en spatiotemporal befolkningskod för att genereraRepresentationer av enskilda smakämnen i stället för grundläggande smakkategorier 10 .
Här erbjuder vi 3 nya verktyg som hjälper till vid studier av gustatorisk kodning. För det första föreslår vi användning av hawkmoth Manduca sexta som en relativt enkel modellorganisme som kan användas för elektrofysiologisk smakstudie och beskriver ett dissektionsförfarande. För det andra föreslår vi användning av extracellulära "tetroder" för att registrera aktiviteten hos individuella GRNs. För det tredje föreslår vi en ny apparat för att leverera och övervaka exakt tidsbestämda pulser av smakämnen till djuret. Dessa verktyg anpassades från tekniker som vårt lab och andra har använt för att studera olfaktoriska systemet.
Insekter som fruktflugan Drosophila melanogaster , johannesbrädet Schistocerca americana och moth Manduca sexta har under årtionden gett kraftfulla resurser för att förstå grundläggande principer om nerernVous system, inklusive sensorisk kodning ( t.ex. olfaction 13 ). I däggdjur är smakreceptorer specialiserade celler som kommunicerar med neuroner genom komplexa andra budbärarvägar 1 , 14 . Det är enklare i insekter: deras smak receptorer är neuroner. Vidare är däggdjurs smakvägar nära periferin relativt komplexa med flera parallella neurala vägar och viktiga komponenter är utmanande att komma åt, innehållna i små benformade strukturer 15 . Insektens smakvägar verkar vara enklare. I insekter finns GRNs i specialiserade strukturer som kallas sensilla, som ligger i antennen, munstyckena, vingarna och benen 16 , 17 . GRNs projektar direkt till subesophageal zone (SEZ), en struktur vars roll har ansetts vara huvudsakligen gustatory 17 , och som innehåller andra orderGustatoriska neuroner 10 . Därifrån reser informationen till kroppen för att driva reflexer och till högre hjärnområden att integreras, lagras och i slutändan driva beteendeval 16 .
Det är nödvändigt att karakterisera perifer smak svar för att förstå hur smaksinformationen förökas och omvandlas från punkt till punkt i hela nervsystemet. Den vanligaste metoden för att direkt övervaka den neurala aktiviteten hos GRNs i insekter är tippinspelningstekniken 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Detta innebär att en elektrod placeras direkt på en sensillum, varav många är relativt lättillgängliga. Smaken ingår i elektroden, vilket gör att man kan aktivera och extMäta racellulärt neuronalt svar av GRN i sensillumet. Men eftersom smakämnet finns i elektroden är det inte möjligt att mäta GRN-aktivitet innan smakgivaren levereras eller efter att den har tagits bort, eller att byta smakämnen utan att ersätta elektroden 20 . En annan metod, "sidovägg" inspelningsteknik, har också använts för att registrera GRNs aktivitet. Här införs en inspelningselektrod i basen av en smak sensillum 24 , och smakämnen levereras genom en separat glaskapillär på sensillumets spets. Båda teknikerna begränsar inspelning från GRN till en viss sensillum. Här föreslår vi en ny teknik: inspelning från slumpmässigt utvalda GRN-axoner från olika sensilar, medan de separat levererar sekvenser av smakämnen till proboscisen. Axoninspelningar uppnås genom att placera antingen skarpa glaselektroder eller extracellulära elektrodbuntar (tetroder) i nerven som bär axoner frånGRNs i proboscis till SEZ 10 . I Manduca passerar dessa axoner maxillärnerven, som är känd för att vara rent avferent, vilket möjliggör en entydig registrering av sensoriska responser 25 . Denna metod för inspelning från axoner möjliggör, i mer än två timmar, stabil mätning av GRN-svar före, under och efter en serie provsmakningspresentationer.
Här beskriver vi ett dissektionsförfarande för exponering av maxillärnerven tillsammans med SEZ, vilket kan tillåta att man samtidigt registrerar svaren på flera GRN och neuroner i SEZ 10 . Vi beskriver också användningen av extracellulära inspelningar av GRNs med hjälp av en skräddarsydd 4-kanals twisted wire tetrode som i kombination med en spikesorteringsmetod tillåter analys av flera (i våra händer upp till sex) GRNs samtidigt. Vi jämför ytterligare inspelningar gjorda med tetroder till inspelningar gjorda med skarp intracellulärelektroder. Slutligen beskriver vi en ny apparat för att leverera smakstimuli. Vår nya apparat anpassas från utrustning som många forskare använde för att leverera luktämnen i olfaction-studier, och erbjuder nya fördelar för att studera gustation: Förbättring av tidigare system för flerkanalförsörjning, såsom de som utvecklats av Stürckow och kollegor (se referenser 26 , 27 ), uppnår vår apparat exakt Kontroll över tidpunkten för smakleveransen medan en spänningsavläsning av denna tidpunkt tillhandahålls; Och det möjliggör snabb, sekventiell leverans av flera smakstimuli 10 . Apparaten badar proboscisen i ett konstant flöde av rent vatten i vilket kontrollerade pulser av smakämnet kan levereras. Varje smakpuls passerar över proboscisen och tvättas sedan bort. Tastanter innehåller en liten mängd smaklös matfärgning, så att en färgsensor kan övervaka, med exakt timing, passagen av smakämnet ovÄr proboscisen.
Protocol
Varning: Fin, pulverformiga vågar som frigjorts av Manduca kan vara allergiframkallande, så användningen av laboratoriesäkerhetshandskar och ansiktsmask rekommenderas.
1. Dissektion av Manduca sexta för att avslöja Maxillary Nerves och SEZ
- Välj en lämplig mod av båda könen baserat på följande egenskaper: Tre dagar efter eclosion med ett generellt hälsosamt utseende (vingarna ska vara helt utsträckta och proboscis och antenner ska vara intakta).
- Placera mothen individuellt i en plastkopp för transport.
- Sätt motet i ett polypropenrör.
Varning: Vi rekommenderar att du utför detta steg i en spishäll för att förhindra att malens pulverformiga skalor sprids.- Röret ska vara något längre än moths kropp ( Figur 1A ). Röret kan tillverkas genom att skära ett 15 ml polypropenrör. <Li> Skjut moten tills huvudet exponeras och sätt ihop uppväxat tissuepapper i den andra änden av röret för att hålla motet immobilt ( Figur 1A ).
- En luftstråle kan tillverkas genom att ansluta en spruta (1 ml med en nål, ID omkring 1,4 mm, med en skarp spets borttagen) till en tryckluftkälla.
Obs! Efter avlägsnande av håret kan alla följande steg utföras utanför avloppsugan.
- På en petriskål använder du modelleringslera för att bygga en triangulär bas ca 7 cm lång, 2,5 cm hög ( Figur 1B ).
Figur 1 : Framställning av Dissektionskammaren för Manduca . ( A ) En moth är fasthållen i ett rör. Huvudet är exponerat i ena änden, medan den andra änden är inkopplad med tissuepapper. ( B ) En dissektionskammare gjord av en petriskål och modelleringslera visas. Den bakre delen av huvudet är vänd uppåt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Skydda antenn och proboscis.
- Förbered 3 små rör genom att skära en pipettspets (gula tips, 1-200 μL) med ett rakblad i 3 delar på ca 0,5 cm. Den inre diametern ska vara tillräckligt stor så att antennen och proboscisen kan passa snyggt.
- Förbered en krok avBöja en tråd (22 AWG, ca 7 cm lång). Förläng moths proboscis och sätt sedan in den i ett av de små rören genom att dra den igenom med trådkroken tills röret når den proximala delen av proboscisen.
- Säkra det lilla röret med fast batikvax (använd t ex en dental elektrisk vaxare för att smälta och rikta vaxet) till den dorsala delen av moths huvudkapsel ( Figur 2A till vänster).
- Placera varje antenn i ett rör och säkra rören med batikvax som visas i Figur 2A (vänster). Var försiktig så att du inte skadar antennerna med det heta vaxet.
- Stabilisera hjärnan mot rörelse genom att klippa muskler som täcker den främre ytan av hjärnan ( dvs bukkal kompressormuskel).
- Under dissektionsmikroskopet, använd micro-dissektion sax eller en mini-axa utformad från ett rakhyvelklip limmat till en tandpetare för att öppna huvudkapseln av makSätt ett litet snitt strax under proboscisen ( Figur 2A , vänster övre insats).
- Använd micro-dissektion sax för att skära buccal kompressormuskeln (för illustrationer se referens 25 ). Eftersom muskeln inte är lätt synlig rekommenderas följande beteendestest för att bekräfta att det har skurits.
- Torka sackaros i destillerat vatten för att uppnå en 1 M lösning.
- Använd en pipett för att ge ca 200 μl sackaroslösning till distans 2/3 av proboscisen och observera proboscisen i 5 min. Om muskeln var ordentligt skuren skulle insekten inte kunna förlänga eller flytta proboscisen.
- Applicera ett lager av smält batikvax för att täta öppningen i huvudkapseln.
- Vänd insekten över så den ventrala sidan av huvudkapseln är nu vänd uppåt.
- För att perfusera saltlösning under och efter dissektionsproceduren bygga upp en vaxkopp runt den ventrala sidan av huvudet usinG elektrisk waxer: Under ett dissektionsmikroskop ska du börja bygga koppen genom att applicera den första raden av vax längs framsidan av huvudet och röra sig mot baksidan. Håll proboscisen och antennrören inuti koppen ( Figur 2A höger).
- Fortsätt bygga koppen utåt och uppåt tills den når nivån på ögonen.
- Använd tång för att ta en av de två labiala palpsna, placera den på sidan och säkra den i vaxkoppen genom att tillsätta mer smält vax. Gör detsamma med den andra maxillary palp ( Figur 2A höger).
- Tät eventuella öppningar i vaxkoppen och rören.
Obs! I detta steg används epoxi eftersom det hjälper till att lätt täta luckor i vaxet och rören och undviker eventuella värmeskador på antenn och proboscis.- Använd en tandpetare för att blanda binär epoxi i en plastblandare. Håll blandningsrätten kvar.
- Använd tandpetare för att applicera en tunnSkikt av epoxi till utsidan och insidan av koppen ( figur 2B ).
- Fyll det tomma utrymmet i rören som innehåller proboscis och antenner med epoxi och fyll den del av polypropenröret som omger halsen med tillräckligt med epoxi för att hålla den ordentligt fast ( bild 2B ).
- Låt epoxiden torka i ca 20 min. För att kontrollera detta, testa epoxinen kvar i plastblandaren för att säkerställa att den är fast och inte längre klibbig.
- Fyll vaxkoppen med Manduca fysiologisk saltlösning 28 och vänta ett par minuter för att se till att det inte finns några läckor. Om en läcka är synlig, försök försegla den genom att applicera mer varmt vax och / eller epoxi.
Figur 2 : Förbereda Manduca </ Em> för Dissection. ( A ) Antenn och proboscis är skyddade inuti små rör av pipettspetsar skuren i tre bitar av ca 0,5 cm i längd. (Vänster panel, stor bild) Rören är säkrade med smält batik vax applicerat runt huvudets dorsala del. (Vänster panel, insats) För att ta bort buccal kompressormuskel öppnas huvudkapsulens dorsala sida genom att göra ett litet snitt som indikeras av den streckade linjen i den stora bilden. (Höger panel) En vaxkopp byggs kring den ventrala sidan av huvudet som en reservoar för perfuserad saltlösning under dissektionsproceduren och inspelningsförsök. ( B ) Epoxi används för att täta mellanrum mellan waxbägarens botten och huvudets bakre del (vänster panel) och mellan vaxet och rören som innehåller antenn och proboscis, inklusive rörens öppningar (höger panel ). Vänligen klicka här tO visa en större version av denna figur
- Under dissektionsmikroskopet, använd mikrodissektion sax för att skära av labial palps.
- Använd micro-dissektion sax eller en mini-axel för att öppna ventral sidan av huvudkapseln genom att göra fyra stycken: två stycken längs nagelbandet som omger varje öga från baksida till framsida, en klippa på nagelbandet längs huvudets baksida, Och en klippa på nagelbandet längs huvudets framsida nära proboscisen ( figur 3A ).
- Dra försiktigt bort nagelbandet med hjälp av mikrodissektionspincett för att exponera hjärnan.
- Genom att använda två skarpa mikro-dissektionstångar sakta och försiktigt avlägsna fettvävnad och luftröret som täcker SEZ. Undvik skador på hjärnan eller nerverna (t.ex. maxillärnerven, optisk nerv, cervikalbindning). Skölj hjärnan genom att ofta ersätta saltlösningen och justera ljuset ofta för att förbättra synligheten. Obs! Det här kan vara den mest kritiska delen av dissection; Det är lätt att oavsiktligt skada maxillärnerven genom att dra på eller krossa den.
Obs! Vid denna punkt bör SEZ och maxillärnerven vara tydligt synliga ( Figur 3B -3C ). Dock är hjärnan och maxillärnerven täckta av en tunn skida. - För att avlägsna manteln ska du ersätta saltlösningen i vaxkoppen med 10% (vikt / volym) kollagenas / dispergas upplöst i saltlösning och låt den vara på plats i 5 minuter. Sedan, efter att ha spolat hjärnan flera gånger med saltlösning, ta försiktigt ut manteln med superfina mikrodissektionspincett genom att dra manteln upp från SEZ genom maxillärnerven.
- Börja perfekta vaxkoppen med färsk saltlösning. Placera röret från en saltlösningsledning i vaxkoppen och säkra den där med smält vax.
FikonUre 3 : Manduca Dissection Procedure. ( A ) De labiella palpsen avlägsnades, huvudkapseln öppnas genom att göra fyra stycken som indikeras av den streckade linjen. ( B ) En förstorad bild av hjärnan efter att ha öppnat huvudkapseln och avlägsnat fettvävnad och luftrör, vilket möjliggör visualisering av maxillärnerven (MxNs) och den subesofagala zonen (SEZ, en term som hänvisar till hjärnans område under matstrupe). De maxillära nerverna bär axoner från gustatoriska receptorneuroner (GRNs) i proboscisen till SEZ. ( C ) En schematisk av en Manduca hjärna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Tastant Delivery System
- Det smakfulla leveranssystemet består av fyra huvuddelar: vattenkällan, smakspridaren, färgsensorn och den plats som innehållerProboscis, alla anslutna till ett styvt plaströr ( Figur 4A -4B ). För att bygga detta system följ stegen som visas i Figur 4B . Använd ett styvt plaströr ca 6 cm i längd (ID 0,3 cm).
- Använd ett lödstryk för att göra ett litet hål i röret där proboscisen kommer att placeras ( Figur 4A -4B ).
- För att säkerställa att probosciserna av olika djur alltid placeras på samma plats, fäst plastskärmningsmaterial (mesh, hålstorlek ca 0,1 cm) i röret ( Figur 4A -4B ). Med ett rakblad eller ett roterande verktyg skär det styva röret ca 5 mm över proboscishålet. Placera nätet mellan de två rörstyckena. Säkra nätet och koppla ihop rören genom att applicera epoxi på utsidan av rören. Låt epoxiden torka i ca 20 min.
- För smaksättning levereras trycksattPerfusionssystem med så många smakrör som behövs, förenade med en grenrör (se nedan). Använd lödstången för att göra ett litet hål i det styva röret ca 1 cm över nätet. Sätt ut röret från perfusionssystemet (ID 0.86 mm) i det styva röret och säkra det där genom att applicera epoxi ( Figur 4A -4B ).
- Använd en peristaltisk pump för att leverera ett konstant flöde (~ 40 ml / min) destillerat vatten. Anslut den med silikonrör till det styva röret ( Figur 4A -4C ). Anslut den andra sidan av det styva röret till ett annat kiselrör för att rikta utmatningen i en stor avfallsbehållare ( Figur 4A -4C ).
- För att leverera smakämnet, injicera tryckluft i perfusionssystemets manifold. Detta kan åstadkommas, exempelvis genom att använda en pneumatisk pump (10 psi) styrd av en tidsinställd spänningsimpulsingång för att injicera tryckluft i manifolen D-röret innehållande det önskade smakämnet. En 1s puls matar ut cirka 0,5 ml smakämne.
3. Tastantberedning och övervakning Tastantleverans
- Torka smakämnet i destillerat vatten till önskad koncentration. Vara medveten om att smakämnet kommer att spädas ytterligare av vattenströmmen. Vi mätta den slutliga koncentrationen som når proboscisen som 77% av den ursprungliga koncentrationen (se referenser 10 , 29 ).
- Lägg till en konstgjord matfärg till varje smaklösning för att bestämma den exakta tidpunkten med vilken smakämnet passerar över proboscisen. Vi fann att det gröna färgämnet (se Materiallista ) vid 0,05% w / v inte aktiverar Manduca GRNs.
- Använd en färggivare (se tabell 1) för att upptäcka färgfärgen i smaklösningarna. Använd ett lödjärn för att göra ett hål intill nätet och 0,5 cm under perfusionssystemets utloppsrör ( S = "xfig"> Figur 4A -4B). Anslut sensorn till det styva röret och säkra det där med epoxi på utsidan.
- Spela in färgsensorns spänningsutgång som en analog signal tillsammans med fysiologiska signaler (se avsnitt 4). Färggivarens spänningssignal kan förstärkas med en DC-förstärkare ansluten till sensorn ( Figur 4A ).
- Se till att färgsensorn arbetar genom att leverera smaken och registrera sensorns spänningsutgång. Den signal som framkallas av färgämnet bör överstiga ljudnivån.
- Justera konstant vattenflöde för att få signalen så nära kvadraten som möjligt.
Obs! När du levererar flera smakämnen i följd, notera den första provet med en ny smakämne kommer att bestå av en blandning av den nya och tidigare smakaren. Av denna anledning analyserade vi inte dessa första försök.
- Justera konstant vattenflöde för att få signalen så nära kvadraten som möjligt.
Figur 4 : Tastant Delivery System. ( A ) En schematisk av apparaten som användes för att leverera och övervaka tidsbestämda pulser av smakämnen till djurets proboscis. Huvudkomponenterna i systemet är betecknade med röda siffror. Ett konstant flöde av destillerat vatten hålls över proboscisen genom en peristaltisk pump ansluten till silikonröret till det styva plaströret (1) där proboscisen ska placeras (6). Tastanter som innehåller en liten mängd smakfri färgämne levereras med ett trycksatt 16-kanaligt perfusionssystem. Reservoarerna som innehåller smakämnena är anslutna till ett grenrör (2) som är fäst vid det styva röret ovanför hålet där proboscissen ska placeras (5). Tryckluft från en pneumatisk pump sprutas in i perfusionssystemet för att snabbt leverera en smakämne, med tidsstyrning kontrollerad av anpassad programvara. enFärggivare (3) används för att övervaka smakleverans. Sensorn är ansluten till det styva röret intill proboscisen och under det perfekta systemets smak. Färgsensorns spänningssignal förstärks av en likströmsförstärkare. Det röda spåret på insatsen intill förstärkaren illustrerar en färgsignal inspelad med hjälp av anpassad datainsamlingsprogramvara; Den snabba ökningen och minskningen i signalen speglar ankomst och utspädning av smakämnet. Moths proboscis placeras i ett hål (5) som ligger strax under färgsensorn. Ett nät (4) placeras ovanför hålet för att säkerställa att proboscisserna av olika djur alltid är placerade på samma plats. Den andra sidan av det styva röret är anslutet till ett annat kiselrör för att rikta utmatningen i en avfallsbehållare (7). ( B ) Bild som visar de viktigaste delarna i smaksättningssystemet som är anslutet till det styva plaströret, som betecknas med de röda siffrorna som visas i panel A: vattnetKälla (6), provmatningsutgångsslangen (2), färgsensorn (3), nätet (4) och hålet där proboscisen ska sättas in (5) alla anslutna till ett styvt plaströr (1) . ( C ) Placeringen av Manduca- preparatet i uppsättningen visas. Den distala t2 / 3 av moths proboscis införs i hålet (5) vid det styva plaströret (1). Proboscisen är fastsatt på plats med tandvax och epoxi, vilket visas av insatsen. Vattentillförseln till det styva röret och dess utmatning till en avfallsbehållare indikeras med siffrorna 6 respektive 7. Antalet 2 anger utmatningsröret för smältröret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Extracellulär Tetrode-inspelning för att övervaka Tastant-framkallad aktivitet från GRNs
- Placera motberedning på en plattform under ett stereomikroskop på en vibrationIsolationsbordet ( Figur 4C ).
- Sätt de distala två tredjedelarna av moths proboscis i det stela röret i smakleveranssystemet ( Figur 2B ). För att göra detta, förlänga moths proboscis och sätt sedan in det i det styva rörets hål genom att försiktigt trycka på det med hjälp av dressingpincett. Försegla proboscisen på plats med mjukt tandvax och sedan ett skikt epoxi för att undvika läckage ( Figur 4C , inlopp).
- Anslut salinperfusionslinjen till huvudkapseln och sätt perfusionsflödet till en konstant hastighet av ca 0,04 L / h.
- Fördjupa en jordelektrod ( dvs en klorad silvertråd) i saltlösningsbadet ( Figur 5A ).
- Använd en skräddarsydd twisted wire tetrode byggd enligt tillverkningsförfarandet beskrivet i 30 (4 elektroder trådar föreslås för att uppnå väl isolerade enheter och att passa in inerven). Före experimentet elektroplastar elektroden efter de steg som beskrivs i 30 .
- Använd en manuell micromanipulator för att placera tetroden nära maxillärnerven. Förflytta tetroden tills det börjar gå in i nerven ( Figur 5 ).
- Vänta i minst 10 minuter efter att du har satt tetroden så att den stabiliseras i nerven innan du spelar in.
- Förstärka signalen (3000x) och använd ett bandpassfilter mellan 0,3-6 kHz. Ta emot signalen med en samplingshastighet på 40 kHz med hjälp av datainsamlingsprogram.
- Efter avslutat försök placera malberedningen i frysen.
Figur 5 : Tetrode-inspelning från GRNs. ( A , stor bild) En mikromanipulator används till pSpetsa den snodda tråden tetrode i maxillärnerven (MxN) för att registrera aktiviteten hos GRNs. En klorid-silverjordelektrod placeras i saltlösningsbadet såsom visas. ( A , inset) En förstorad bild av hjärnan som visar tetroden i maxillärnerven. Den subesofageala zonen (SEZ) anges också. ( B ) En schematisk av en Manduca hjärna orienterad som i A. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Aktiviteten av GRNs kan registreras med användning av en extracellulär tetrodeelektrod före, under och efter provning av smak ( Figur 6A och 6C ). Figur 6A (mitten och bottenpanelen) visar filtrerade spänningsspår (300-6000 Hz) inspelade av var och en av de fyra trådarna placerade i maxillärnerven, där signaler med olika amplituder som reflekterar åtgärdspotentialer (pilar) kan observeras. En 1 s puls av smakämne (1 M sackaros) levererades 2s efter experimentets början; Stimulans start och offset övervakades av färggivaren ( figur 6A , övre panelen). De smakande inducerade spikarna som kan observeras i var och en av de fyra kanalerna ( Figur 6A , mittpanelen). GRNs kan identifieras och särskiljas från mekanosensorer (ingen som visas här) när de svarar på vissa smakämnen och inte andra För att identifiera och isolera enkla neuronresponser från tetrode-inspelningarna utförde vi off-line spikesortering med hjälp av en uppsättning anpassade funktioner baserade på Pouzats 31 och Kleinfelds 32 , 33 metoder (dessa metoder beskrivs i dessa citat: 10 , 29 ). Figur 6B visar ett exempel på spik sortering applicerad på data som visas i figur 6A , i vilken tre väl isolerade enheter hittades. Rasterplottar från Figur 6C avbildar svaren från de tre isolerade enheterna i figur 6B till sex olika smakämnen (1 M sackaros, maltos och NaCl, 100 mM koffein och 10 mM berberin och lobelin) levereras i följd (4 försökS / smakämne visas). Såsom visas i Figur 6C har de inspelade GRN: erna olika nivåer av baslinjeaktivitet, allt från tyst (GRNs 1) till lågt eller måttligt (GRN 2 och 3). Efter smakuppträdande visar GRNs olika aktivitetsmönster och uppvisar olika selektivitet för smakämnena. Till exempel svarade GRN 1 endast på sackaros, medan GRN 2 svarade på maltos och NaCl med spetsbyxor och lobeline med spiking endast vid stimulans start. Dessutom låses några svar till stimulans tidpunkt ( t.ex. GRN 1-respons på sackaros), medan andra svar sträcker sig längre från stimulans varaktighet ( t.ex. GRN 3-svar på berberin) eller innehåller både excitatoriska och hämmande komponenter ( t.ex. Figur 7 GRN 2-svar på NaCl och sackaros). För mer information om GRNs olika känsligheter och aktivitetsmönster, se referens 10 . Figur 7 ). Spänningsspåren i den gröna lådan i panel A registrerades intracellulärt från GRN 1 under 5 på varandra följande försök med sackarospresentation, och samma svar visas som rasterplottar i panel B. (Observera att denna typ av svar matchar det som erhållits med tetroder och Visas i figur 6C .) GRN 2, inspelad med skarpa intracellulära elektroder, visar ett bredare responsmönster. 
Figur 6: Representativa resultat från maxillära nervinspelningar med extracellulära tetroder. ( A ) Spänningsspårfiltrerade (300-6000 Hz) inspelade av var och en av de fyra trådarna vid maxillärnerven visas (mittpanel). En 1 s puls av smakämne applicerades under den tidsperiod som indikeras av röd skuggning i mittpanelen. Stimulans start och offset övervakades av färgsensorn som indikeras av det röda spänningsspåret på överpanelen och betecknas på mellansidan av det röda skuggade området. De prickade horisontella linjerna betecknar +50 (topp), 0 (mitten) och -50 (botten) μV. En förstoring av de råspänningsspår som motsvarar området inuti de vertikala streckade linjerna visas (bottenpanel). Exempel på spikar indikeras med pilarna. ( B ) Ett exempel på spik sortering applicerad på de data som visas i panel A. De vågformer som registreras vid var och en av de fyra extracellulära trådarna (1-4) arE identifierad med tre olika GRNs (enheter 1-3) som bidrar till de inspelade signalerna. Individuella händelser (färgade tunna linjer) och medelvärdet (tjock svart linje) visas för de tre enheterna. Ett antal statistiska kriterier måste övervägas för att på ett tillförlitligt sätt kunna identifiera oberoende enheter med hjälp av spik-sorteringsmetoden (se referenser 10 , 29 ). ( C ) Raster-diagram som representerar svaren från de tre isolerade enheterna till en sekvens av sex olika smakämnen (4 försök / smakämnen visas). Tidsperioden för smakleverans (1 s) indikeras av det röda skuggade området. Koncentrationerna av smakämnen var antingen 1 M (sackaros, maltos, NaCl), 100 mM (koffein) och 10 mM (berberin och lobelin). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figur 7 : Intracellulära inspelningar från GRN Axons. ( A , green box panel) Spänningsspår registrerade från en GRN med skarpa glas intracellulära elektroder (resistans 80-120 MΩ) placerad i maxillarynerven, framkallad av 5 på varandra följande stimuleringar med 1 M sackaros (Suc). ( B ) Rasterposter av svaren på två GRN, inklusive svar som visas i panel A (grön boxpanel), till två olika smakämnen som levereras i följd (100 mM grå teckensfärg, 1 M svart teckensfärg) inspelad med skarpa glas intracellulära elektroder Placerad i maxillärnerven (7 prov / smakämne och 3 försök / vatten visas). Tastant leveranstid indikeras med röda skuggade områden i båda paneler. Stimulans start och offset övervakades av färggivaren, vilket indikeras av de röda spänningsspåren längst ned på varje panel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Metoderna som beskrivs här tillåter in vivo inspelningar från ett relativt enkelt djur, Manduca sexta , för att karakterisera aktiviteten hos flera slumpmässigt utvalda GRNs under långa varaktigheter (i mer än 2 timmar) före, under och efter provning av smak. Dessa metoder tillåter också den snabba, sekventiella tillförseln av multipla smakstimuli med exakt temporal kontroll, fördelar som är användbara för att studera neurala mekanismer som ligger till grund för smakrepresentationen. Detta protokoll har använts för att studera hur svaren från GRN till smakämnen omvandlas när de överförs till sina postsynaptiska målneuroner ( t.ex. i SEZ) genom att övervaka GRNs samtidigt med monosynaptiskt anslutna interneuroner 10 . Dessutom kan dessa metoder anpassas till experimenternas behov, vilket gör det möjligt att genomföra komplexa paradigmer att studera grundläggande aspekter av gustatorisk kodning.
När börjarG våra studier, ett tekniskt problem som vi ibland var tvungna att felsöka var oförmågan att upptäcka spiking signaler från maxillary nerv med tetrode trådarna. Möjliga orsaker till detta är olika, eftersom dissektionsprotokollet är utmanande, och en viss övning är nödvändig för att få en bra förberedelse. Först under mothissektion är de maximala nerverna lättskada, speciellt under avlägsnandet av manteln som omger nervvävnaden. För det andra, om manteln inte är helt avlägsnat, kan tetrode-trådarna inte ha tillgång till nerven. I båda fallen är det ofta det enklaste sättet att lösa dessa problem med att starta en ny förberedelse. För det tredje kan det finnas ett problem med tetrode trådarna. Detta kan kontrolleras genom mätning av trådens impedans som ska vara ~ 270 kΩ vid 1 kHz. Om impedansvärdet överstiger ~ 300 kΩ, elektroplastar trådarna med guld för att uppnå önskad impedans (se referens 30 ). För det fjärde kan en utrustningsutrustning vara ouppkoppladEller misshandlar.
Ett annat möjligt problem är att spikningssignaler registreras men neuronen (n) verkar inte reagera på smakämnena. Detta kan bero på att de inspelade neuronerna är okänsliga för den uppsatta smakämnen som levereras. Det är också viktigt att komma ihåg att förutom axons av GRNs bär maxillärnerven också mekanosensoriska fibrer. Således är det möjligt att spela in från mekanosensoriska neuroner i stället för eller i tillägg till GRNs. Det smakande leveranssystemet är emellertid utformat för att ge en konstant mekanisk ingång under hela experimentet, vilket gör det osannolikt att svar på en smakämne kommer att förvirras av svar på den mekaniska komponenten av dess leverans. Neuroner som svarar på vissa men inte andra smakämnen eller på olika sätt till olika smakämnen kan klassificeras entydigt som GRN. Vi rekommenderar att du använder nyligen utspädda smakämnen för att undvika variationer i smakkoncentration eller sammansättning på grund av föreningens nedbrytning eller avdunstningAv lösningsmedlet. Vi rekommenderar också att du rengör systemet regelbundet för att undvika rörföroreningar och / eller hinder.
Ett annat möjligt tekniskt problem är ett nackdeligt signal-brusförhållande. Detta problem kan ofta lösas genom reklorering eller justering av badjordelektrodens position. Andra lösningar kan kräva skärmning och minimera längden på varje elektrisk anslutning i apparaten.
Slutligen är det viktigt att notera att korrekt analys av data som erhållits med hjälp av tetrodeinspelningar kräver noggrann spik sortering. Vi fann att helautomatiserade metoder är generellt otillräckliga. Vi rekommenderar att du är bekant med spikssorteringslitteraturen innan du analyserar tetrode-data 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .
Alternativ till vår dissektion proTokol kan användas. Här beskrev vi en dissektion genom den ventrala delen av moth head, vilket ger tillgång till maxillary nerver och SEZ, men det är också möjligt att komma åt dessa strukturer genom att dissekera genom dorsala sidan. Vi fann att dorsalberedningen inte är optimal för att göra inspelningar från dessa gustatoriska strukturer på grund av deras djupa läge, men denna förberedelse erbjuder fördelen att möjliggöra inspelningar från högre orderstrukturer såsom svampkroppen, ett område som har associerats med flera -sensorisk integration, associativ inlärning och minnesbehandling 34 . Vi har fokuserat på användningen av tetrodeelektroder för att spela in från maxillarynerven, men som vi illustrerat kan standard intracellulära skarpa elektroder också användas för detta ändamål. Dessutom kan båda teknikerna kombineras för att utföra samtidiga inspelningar från flera hjärnområden 10 . Neurovetenskapslitteraturen erbjuder många exempel på jagNvertebratmodeller som har visat sig vara kraftfulla verktyg för att avslöja grundläggande principer för sensorisk bearbetning, såsom olfaktorisk kodning, som gäller både insekter och ryggradsdjur 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Vi hoppas att våra metoder leder till grundläggande nya insikter om gustatorisk kodning.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett intramuralt bidrag från NIH-NICHD till MS Vi tackar G. Dold och T. Talbot för NIH-NIMH-instrumentets kärnfacilitet för hjälp vid utformningen av smakgivande leveranssystemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
References
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
- Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
- Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
- Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
- Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
- Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
- Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
- Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
- Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
- Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
- Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
- Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
- Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
- Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
- Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
- Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
- Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
- Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
- Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
- Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).
