Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri

doi: 10.3791/55868 Published: June 29, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Tatlandırıcı kodlamayı incelemek için üç yeni yöntem sunuyoruz . Basit bir hayvan olan Manduca güvesi Mandka'yı kullanarak, diseksiyon protokolünü, çoklu tatlılık reseptör nöronlarının aktivitesini kaydetmek için hücre dışı tetrodeslerin kullanımını ve tat vericilerin kesin zamanlı nabızlarını iletmek ve izlemek için bir sistemi tarif ediyoruz.

Abstract

Tat duygusu, hayvanlara hayatta kalabilmek için kritik davranışlar yaratan çevredeki kimyasalları tespit etmelerini sağlar. Gustatory Reseptör Nöronlar (GRN), tastant molekülleri tespit ettiğinde, tastantın kimliğini ve konsantrasyonunu, beyindeki takip eden nörona ileten elektriksel aktivite kalıpları olarak kodlarlar. Bu desenler, hayvanın eylemleri seçip anıları oluşturmalarına izin veren, tadıcının içsel temsillerini oluşturur. Nispeten basit hayvan modelleri kullanımı, duyusal kodlamanın temel ilkelerini incelemek için güçlü bir araçtır. Burada Manduca cinsiyet kelası kullanılarak tatlılık kodlamasını incelemek için üç yeni yöntem önermekteyiz. İlk olarak maksiller sinirleri ve subesophageal bölgeyi (SEZ) açığa çıkartmak için diseksiyon prosedürü sunarak, aksonlarından GRN aktivitesinin kayıt altına alınmasını sağlarız. İkincisi, çoklu GRN'lerin aktivitesini te kaydettirerek hücre dışı elektrotların kullanımını açıklıyoruz.Direkt olarak maksiller sinir içine trode telleri. Üçüncüsü, yüksek zamansal hassasiyetle, farklı tatların atışlarını sunmak ve izlemek için yeni bir sistem sunuyoruz. Bu yöntemler, nevresel yanıtların in vitro olarak , tatlandırıcılar verilmeden önce, sırasında ve sonrasında doğrudan GRN'lerden karakterize edilmesine izin verir. Birden fazla GRN'den kaydedilen gerilim izlerinin örneklerini veriyoruz ve bireysel nöronların tepkilerini tanımlamak için verilere bir başak sıralama tekniğinin nasıl uygulanabileceğinin bir örneğini sunuyoruz. Son olarak, kayıt yaklaşımımızı doğrulamak için, tetrodesli GRN'lerden elde edilen hücre dışı kayıtları keskin cam elektrotlarla elde edilen hücre içi kayıtlarla karşılaştırdık.

Introduction

Tatlılık ve koku alma sistemleri, sırasıyla, tat ve koku algılamalarına neden olarak, çevredeki kimyasalların içsel temsillerini üretirler. Bu kimyasal duyu, organizmanın hayatta kalması için kritik olan sayısız davranışları ortaya çıkarmak için, arkadaşları ve yemekleri bulmaya, yırtıcı hayvanlardan ve toksinlerden kaçınmaya kadar çok önemli. Bu süreç, çevresel kimyasallar, duyusal reseptör hücrelerinin plazma membranlarında bulunan reseptörlerle etkileşime girdiğinde başlar; Doğrudan ya da nöronlarla olan etkileşimler yoluyla bu hücreler, kimyasalların kimliği ve konsantrasyonu hakkında elektrik sinyallerine dönüştürürler. Bu sinyaller daha sonra daha üst düzey nöronlara ve diğer beyin yapılarına iletilir. Bu adımlar ilerledikçe, orijinal sinyal her zaman organizmanın duyu bilgisini algılama, ayırma, sınıflandırma, karşılaştırma ve saklama yeteneğini teşvik eden ve uygun bir eylemi seçmek için değişikliklere uğrar. Sutyenin nasıl olduğunu anlamaÇeşitli görevleri en iyi gerçekleştirmek için çevresel kimyasallar hakkında bilgi dönüştürürken, nörobilimdeki temel bir sorundur.

Tatlı kodlamanın nispeten basit olduğu düşünülmektedir: yaygın olarak kabul edilen bir görüş, bir tadı ortaya çıkaran her kimyasal molekülün ("tastant") doğal olarak yaklaşık beş veya çok temel lezzet kalitesinden birine ( yani tatlı, acı, ekşi) ait olduğunu göstermektedir , Tuzlu ve umami) 1 . Bu "temel lezzet" görünümünde, tatlı sisteminin görevi, bu temel zevklerin hangisinin bulunduğunu belirlemektir. Ayrıca, sinir sisteminde temel tadı göstermenin altında yatan sinirsel mekanizmalar belirsizdir ve "etiketli bir çizgi" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 veya "çapraz lif deseni" 7 tarafından yönetildiği düşünülmektedir , 8 kod. Etiketli bir satır kodunda, her bir duyumsal hücre ve her bir sinirsel takipçisi, tek bir tat kalitesine tepki verir ve merkezi sinir sistemindeki yüksek işleme merkezlerine bu tada adanmış doğrudan ve bağımsız bir kanal oluştururlar. Aksine, bir lif boyunca desen kodunda, her bir duyumsal hücre, birden fazla tat kalitesine tepki verebilir; böylece, tatma maddesi hakkındaki bilgi, duyusal nöron popülasyonunun genel tepkisi ile temsil edilir. Tatlı bilgi, temel beğenilerle, etiketli çizgilerle veya başka bir mekanizma ile temsil edilip edilmediği belli değildir ve son araştırmanın odağı 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12'dir . Yaptığımız son çalışmamız, tatlı sistemin, üretmek için spatiotemporal bir nüfus kodu kullandığını düşündürmektedirTemel lezzet kategorilerinden ziyade kişilerin zevklerini temsil etme 10 .

Burada, tatlılık kodlaması çalışmasına yardımcı olacak 3 yeni araç sunuyoruz. İlk olarak, hawkmoth Manduca sexta'nın, tadı elektrofizyolojik olarak incelenmesi için nispeten basit bir model organizma olarak kullanılmasını ve bir diseksiyon prosedürünü tarif etmesini öneriyoruz. İkinci olarak, bireysel GRN'lerin aktivitesini kaydetmek için hücre dışı "tetrodes" kullanımını öneriyoruz. Ve üçüncü olarak, hayvan için tat vericinin kesin zamanlı atımlarını sağlamak ve izlemek için yeni bir cihaz önermekteyiz. Bu araçlar laboratuvarımızın ve diğerlerinin koku sistemini incelemek için kullandıkları tekniklerden uyarlanmıştır.

Meyve sinek Drosophila melanogaster , çekirge Schistocerca americana ve Manduca cinsiyeti kelebekleri gibi böcekler onlarca yıldır neredeyse tüm dünyadaki temel prensipleri anlamak için güçlü kaynaklar sağlamıştır.( Örneğin, olfaksiyon 13 ). Memelilerde, tat alıcıları karmaşık ikinci elçi haberci yolları 1 , 14 aracılığıyla nöronlarla iletişim kuran uzmanlaşmış hücrelerdir. Böceklerde daha basit: tat alıcıları nöronlardır. Dahası, çevredeki memelilerin tat yolakları nispeten daha karmaşıktır, çok sayıda paralel sinir yolları vardır ve önemli bileşenler, küçük kemikli yapılarda bulunan erişilmesi zor 15 . Böcek tadı yolları daha basit gözükmektedir. Böceklerde, GRN'ler, anten, ağız parçaları, kanat ve bacaklarda bulunan sensilla olarak bilinen özel yapılarda bulunur 16,17. GRN'ler direk olarak tatlısı 17 olduğu düşünülen ve ikinci mertebe içeren alt ekzofajiyal bölgeye (SEZ) doğrudan yansırTatlı nöronlar 10 . Buradan bilgi refleksleri sürmek için vücuda gider ve davranışsal tercihleri ​​yönlendirmek için entegre edilmek, depolanmak ve nihayetinde yüksek beyin bölgelerine ilerlemektedir 16 .

Tadı bilgisinin sinir sistemi boyunca noktadan noktaya nasıl aktarıldığını ve dönüştürdüğünü anlamak için çevresel tat tepkilerini karakterize etmek gereklidir. Böceklerde GRN'lerin sinirsel aktivitesini doğrudan izlemek için en yaygın kullanılan yöntem ucu kayıt tekniği 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23'dur. Bu, birçoğunun, erişilebilirliği nispeten kolay olan bir elektrodun doğrudan bir sensillum üzerine yerleştirilmesini içerir. Tadı, elektrot içine dahil edilir ve aktif hale getirilip extRasemiküler olarak sensillumdaki GRN'lerin nöronal yanıtlarını ölçer. Ancak, tat maddesi elektrot içinde bulunduğu için, tat verici madde verilmeden önce veya çıkarıldıktan sonra GRN aktivitesinin ölçülmesi veya elektrodun 20 değiştirilmeden tatların değiştirilmesi mümkün değildir. Bir başka yöntem olan "yan duvar" kayıt tekniği, GRN aktivitelerini kaydetmek için kullanılmıştır. Burada, bir tat elektroniğinin ( 24) tabanına bir kayıt elektrodu yerleştirilir ve tatlar, sensillumun ucundaki ayrı bir cam kılcaldan geçirilir. Her iki teknik de GRN'lerden belirli bir sensilluma kaydı sınırlar. Burada, yeni bir teknik öneriyoruz: rastgele seçilen GRN aksonlarından farklı sensilla'dan kayıt yaparken, burun burunlarına da ayrı ayrı tat veriyoruz. Akson kayıtları, keskin cam elektrotlar veya hücre dışı elektrot demetleri (tetrodes), aksonları taşıyan sinire yerleştirerek elde edilirSEZ 10'da püsküren GRN'ler. Manduca'da , bu aksonlar, tamamen aktive olduğu bilinen maksiller siniri dolaşarak, duyusal yanıtların kesin bir şekilde kaydedilmesine imkân sağlar. Aksonlardan kayıt yöntemi, iki saatten fazla bir süre boyunca, bir dizi tat verici sunumundan önce, sırasında ve sonrasında GRN yanıtlarının istikrarlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.

Burada, maksiller sinirleri SEZ ile birlikte sunmak için diseksiyon prosedürünü açıklıyoruz ve SEZ 10'daki birden fazla GRN ve nöronun yanıtlarını aynı anda kaydetmeliyiz. Aynı zamanda, bir sivri sıralama yöntemi ile kombine edildiğinde, aynı anda birden fazla (ellerimizde, altıya kadar) GRN'lerin analizine izin veren, ısmarlama 4 kanal bükülmüş tel tetrode kullanarak GRN'lerin hücre dışı kayıtlarının kullanımını tanımlıyoruz. Tetrozlarla yapılan kayıtları, keskin hücre içi kayıtlarlaelektrotlar. Sonunda, tat arttırıcı uyaranlara yönelik yeni bir aparat tanımlıyoruz. Olumsuzluk araştırmalarında odorantlar sunmak için birçok araştırmacı tarafından uzun süre kullanılan ekipmanlardan uyarlanan yeni cihazımız, gustation çalışması için avantajlar sunar: Stürckow ve meslektaşları tarafından geliştirilen (bkz. Referanslar 26 , 27 ) önceki çok kanallı dağıtım sistemini geliştirerek aparatımız hassas hale getirir Bu zamanlamanın gerilim okumasını sağlarken, tat üreticisinin zamanlamasını kontrol etme; Ve çok sayıda tat arttırıcı uyaranın hızlı ve sıralı iletilmesini sağlar 10 . Cihaz, kontrollü nevresim verici içeceklerin verilebileceği düzenli bir temiz su akışı ile burun tıkanır. Her tastant nabzı, burun deliğinden geçer ve sonra yıkanır. Tatlar, az miktarda tatsız gıda boyası içerir; renk sensörünün, hassas zamanlamayla, tastant ovun geçişini izlemesine olanak tanırAmeliyatı.

Protocol

Dikkat: Manduca tarafından salınan ince, toz halindeki teraziler alerjik olabilir, bu nedenle laboratuvar güvenlik eldivenleri ve bir yüz maskesi kullanılması önerilir.

1. Maksiller sinirleri ve SEZ'yi ortaya çıkarmak için Manduca sexta'nın diseksiyonu

  1. Aşağıdaki özelliklere dayalı olarak her iki cinsiyetten de uygun bir güve seçin: Genel olarak sağlıklı bir görünüme sahip eklosiyondan üç gün sonra (kanatlar tamamen uzatılmalı ve burun ve antenler sağlam olmalıdır).
    1. Güveleri nakliye için ayrı bir plastik kapa koyun.
  2. Güveyi bir polipropilen tüpüne yerleştirin.
    Dikkat: Güvelerin pul pullarının yayılmasını önlemek için bu adımı bir duman kaputunda yapmanızı öneririz.
    1. Tüp, güve gövdesinden biraz daha uzun olmalıdır ( Şekil 1A ). Tüp, 15 mL'lik bir polipropilen tüpü keserek yapılabilir.
    2. <Li> Güveleri baş açık olana kadar itin ve kelebeğin hareket ettirilmesine yardımcı olmak için tübün diğer ucuna bükülmüş kağıt mendilleri yerleştirin ( Şekil 1A ).
  3. Üzerine basınçlı hava üfleyerek kuyruğun maruz kaldığı kafadan (ventral ve dorsal) saçları alın.
    1. Basınçlı bir hava kaynağına bir şırınga (1 mL, iğne ile 1.4 mm civarı, keskin uç çıkarılarak ID) bağlanarak hava püskürtülebilir.
      Not: Saçları çıkardıktan sonra duman kulübesinin dışında aşağıdaki adımları yapabilirsiniz.
  4. Bir kere saçın çıkarıldıktan sonra, tüpü, Şekil 1B'de gösterildiği gibi başın dorsal kısmı yukarı bakacak şekilde bir tutma bölmesine yerleştirin.
    1. Bir petri kabı üzerinde, modelleme kilini kullanarak yaklaşık 7 cm uzunluğunda, 2.5 cm yüksekliğinde üçgen bir taban oluşturun ( Şekil 1B ).


Şekil 1 : Manduca için Disseksiyon Odasının Hazırlanması. ( A ) Güve bir tüpe konmuştur. Kafa bir ucunda, diğer ucu doku kağıdı ile kapatılmıştır. ( B ) Petri kabı ve modelleme kilinden yapılmış bir diseksiyon odası gösterilmiştir. Kafanın sırt kısmı yukarı bakıyor. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

  1. Antenleri ve kene koruyun.
    1. Bir tıraş bıçağı ile bir pipet ucu (sarı ipuçları, 1-200 μL) keserek 3 küçük tüp hazırlayın; bunları yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda 3 parça halinde tutun. İç çap, anten ve burunların rahatça yerleşebilmesi için yeterince büyük olmalıdır.
    2. Tarafından kanca hazırlaBir telin bükülmesi (22 AWG, yaklaşık 7 cm uzunluğunda). Güvesi burnunu uzatın ve tüp memenin proksimal kısmına gelene kadar kablo kancasıyla içeri çekerek küçük tüplerden birine sokun.
    3. Küçük tüpü sağlam batik mumu (örneğin balmumu eritmek ve yönlendirmek için bir diş elektrikli balmumu kullanarak) güvelerin baş-kapsülünün sırt kısmına sabitleyin ( Şekil 2A solda).
    4. Her bir anteni bir tüp içine yerleştirin ve tüpleri batik mum ile, Şekil 2A'da gösterildiği gibi sabitleyin (sol). Sıcak mumla antenlerin zarar görmesini önlemek için dikkatli olun.
  2. Beynin ön yüzeyini kaplayan kasları ( yani bukkal kompresör kası) keserek harekete karşı beyne stabilize edin.
    1. Diseksiyon mikroskopu altında mak için baş kapsülünü açmak için bir kürdan yapıştırılmış tıraş ızgarasından yapılmış bir mikro-diseksiyon makası veya mini bir balta kullanın.Burun deliğinin hemen altındaki küçük bir kesim ( Şekil 2A , sol üst yerleştirme).
    2. Bukkal kompresör kasını kesmek için mikro-diseksiyon makas kullanın (çizimler için referans 25'e bakın). Kas kolayca görülemediğinden, aşağıdaki davranış testinin kesildiğini teyit etmesi önerilir.
    3. 1 M çözelti elde etmek için sakarozu damıtılmış suda seyreltin.
    4. Prokositer distal 2 / 3'e yaklaşık 200 mcL sükroz çözeltisi vermek için bir pipet kullanın ve 5 dakika boyunca burun izleyebilirsiniz. Kas düzgün şekilde kesilmişse, böcek uzantısı veya kene hareket ettirmemelidir.
    5. Kafa kapsülündeki açıklığı kapatmak için erimiş batik mum katmanını uygulayın.
  3. Kafa kapsülünün ventral yüzü yukarı gelecek şekilde böcekleri ters çevirin.
  4. Diseksiyon prosedürü sırasında ve sonrasında tuzu perfüze etmek için başın ventral tarafı etrafında bir mum fincan oluşturunElektrikli balmumu: Bir diseksiyon mikroskopu altında başın önüne balmumun ilk sırasını uygulayarak fincan oluşturmaya başlayın ve arkaya doğru hareket edin. Sondayı ve anten tüplerini fincanda tutun ( Şekil 2A sağ).
    1. Kapları gözlerin seviyesine gelene kadar dışarı doğru ve yukarı doğru inşa etmeye devam edin.
  5. İki labiyal palpozardan birini almak için forseps kullanın, daha sonra yan tarafına yerleştirin ve daha erimiş bal mumu ekleyerek mum bardağına sabitleyin. Aynı şeyi diğer maksiller palpasıyla yapın ( Şekil 2A sağ).
  6. Balmumu kabındaki ve tüplerdeki açıklıkları kapatın.
    Not: Bu aşamada epoksi kullanılır çünkü mumdaki ve borulardaki boşlukları kolayca kapatır ve ısıya bağlı anten ve burun hasarını önler.
    1. İkili epoksiyi plastik bir karıştırma kabı içine karıştırmak için bir kürdan kullanın. Karıştırma kabını saklayın.
    2. Bir kese uygulamak için kürdan kullanınEpoksi tabakasını kabın içine ve içerisine yerleştirin ( Şekil 2B ).
    3. Hortum ve antenleri içeren tüplerin içindeki boşlukları epoksi ile doldurun ve boyayı çevreleyen polipropilen tübün bir kısmını yeterli miktarda epoksi ile doldurarak sıkıca yerine oturtun ( Şekil 2B ).
    4. Epoksiyi yaklaşık 20 dakika kurumaya bırakın. Bunu kontrol etmek için plastik karıştırma kabında kalan epoksiyi sağlam ve artık yapışkan olmadığından emin olmak için test edin.
    5. Balmumu su bardağını Manduca fizyolojik salin 28 ile doldurun ve kaçak olmadığından emin olmak için birkaç dakika bekleyin. Bir sızıntı görünüyorsa, daha sıcak mum ve / veya epoksi uygulayarak sızdırmazlığı sağlamaya çalışın.

şekil 2
Şekil 2 : Manduca </ Em> Disseksiyon için. ( A ) Anten ve burun deliği, yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda üç parçaya kesilmiş pipet uçlarından yapılmış küçük tüplerin içinde korunmaktadır. (Sol panel, geniş görüntü) Tüpler başın dorsal kısmı etrafına uygulanmış eriyik batik balmumu ile sabitlenmiştir. (Sol panel, inset) Bukkal kompresör kasını çıkarmak için, kafa kapsülünün sırt kısmı, büyük resimdeki noktalı çizgiyle gösterildiği gibi küçük bir kesik açarak açılır. (Sağ panel) Diseksiyon prosedürü ve kayıt deneyleri sırasında perfüze edilmiş salin için bir rezervuar olarak kafanın ventral yanını çevreleyen bir balmumu fincan oluşturulmuştur. ( B ) Epoksi, balmumu kabının tabanı ile başın dorsal kısmı (sol panel) arasındaki boşlukları ve tüplerin açıklıkları da dahil olmak üzere, antenleri ve burunları içeren tüpler arasındaki boşlukları kapatmak için kullanılır (sağ panel ). Lütfen tıklayınız tO bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin.

  1. Diseksiyon mikroskopu altında, labial palpları kesmek için mikro-diseksiyon makası kullanın.
  2. Dört kesim yaparak baş kapsülünün ventral yanını açmak için mikro-diseksiyon makası veya bir mini-baltı kullanın: her gözü sırtından öne doğru çevreleyen iki adet kesikli parça, kafanın arka tarafındaki manikürde bir kesim, Ve başın ön tarafı boyunca makasın yanında bir tane kesik ( Şekil 3A ).
  3. Beyni açığa çıkarmak için mikro diseksiyon forseps kullanarak nazikçe manikürden çekin.
  4. İki keskin mikro-diseksiyon forseps kullanarak, yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde yağ dokusunu ve SEZ'yi kaplayan trakeayı çıkarın. Beyindeki veya sinirlerde herhangi bir hasar (örn., Maksiller sinir, optik sinir, servikal bağlayıcı) kaçının. Beyni sık sık tuz çözeltisini değiştirerek durulayın ve görünürlüğü artırmak için ışığı sık sık ayarlayın. Not: Bu, Di'nin en kritik parçası olabilir.ssection; Maksiller siniri çekerek ya da ezerek yanlışlıkla hasar etmek kolaydır.
    Not: Bu noktada SEZ ve maksiller sinirler açıkça görülmelidir ( Şekil 3B -3C ). Bununla birlikte beyin ve maksiller sinirler ince bir kılıfla kaplıdır.
  5. Kılıfı çıkarmak için, balmumu kabındaki tuzlu suyun, salin içinde çözülmüş% 10 (w / v) kollajenaz / dispaz ile değiştirin ve 5 dakika boyunca yerinde bırakın. Daha sonra, beyin salinle birkaç kez durulandıktan sonra, maksiller sinirler yoluyla SEZ'den kılıfı çekerek süper ince mikro-diseksiyon forsepsiyle kılıfı hafifçe çıkarın.
  6. Balmumu fincanı taze tuzlu suyla karıştırmaya başlayın. Tüp bir salin damla hattından balmumu kabına yerleştirin ve eritilmiş mum ile orada sabitleyin.

Şekil 3
incirUre 3 : Manduca Diseksiyon Prosedürü. ( A ) Labial palpları çıkarıldı, baş kapsülü noktalı çizgi ile gösterildiği gibi dört kesik yaparak açıldı. ( B ) Baş kapsülü açtıktan ve maksiller sinirlerin (MxNs) ve alt özofagus zonunun (SEZ, beyindeki bölgeye atıf yapan bir terim görselleştirme sağlayan, yağ dokusu ve trakeayı çıkardıktan sonra beynin büyütülmüş bir görüntüsü. yemek borusu). Maksiller sinirler, burun burunundaki tatlılık reseptör nöronlarından (SEB) akson taşırlar. ( C ) Bir Manduca beyin şeması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

2. Tatlandırıcı Teslim Sistemi

  1. Tat verici dağıtım sistemi dört ana unsurdan oluşur: su kaynağı, tat verici manifold, renk sensörü veTümü sert bir plastik boruya bağlanmış ( Şekil 4A- 4B ). Bu sistemi oluşturmak için Şekil 4B'de gösterilen adımları izleyin. Yaklaşık 6 cm uzunluğunda (KİMLİĞİ 0,3 cm) sert bir plastik tüp kullanın.
  2. Hortumun yerleştirileceği tüpte küçük bir delik açmak için havyayı kullanın ( Şekil 4A- B ).
  3. Farklı hayvanların sünnetlerinin daima aynı yere yerleştirilmesini sağlamak için plastik tarama malzemesi (örgü, yaklaşık 0.1 cm'lik delik boyutu) tüp içine takın ( Şekil 4A- 4B ). Tıraş âleti veya döner bir alet ile sert boru, burun deliğinin yaklaşık 5 mm üzerinde kesilir. Örgüyü iki tüp parçası arasına yerleştirin. Örgüyü sabitleyin ve tüplerin dışına epoksi uygulayarak boruları yeniden bağlayın. Epoksiyi yaklaşık 20 dakika kurumaya bırakın.
  4. Tastant verimi için basınçlıGerektiği kadar çok tastant tüpü olan bir perfüzyon sistemi, bir manifolda bağlandı (aşağıya bakın). Örgü üzerinde yaklaşık 1 cm yüksekliğindeki boruya küçük bir delik açmak için havyayı kullanın. Çıktı tüpünü perfüzyon sisteminden (ID 0.86 mm) sert boruya yerleştirin ve epoksi uygulayarak ( Şekil 4A- 4B ) sabitleyin .
  5. Sabit bir akış (~ 40 mL / dakika) damıtılmış su sağlamak için peristaltik pompa kullanın. Sert boruya silikon boru ile bağlayın ( Şekil 4A -4C ). Rijit tüpün diğer tarafını, büyük bir atık kabına yönlendirmek için başka bir silikon boruya bağlayın ( Şekil 4A -4C ).
  6. Tatlandırıcıyı vermek için sıkıştırılmış hava perfüzyon sisteminin manifolduna enjekte edilmelidir. Bu, örneğin, manifolda sıkıştırılmış havayı enjekte etmek için zamanlanmış voltaj puls girişi ile kontrol edilen bir pnömatik pompa (10 psi) kullanılarak başarılabilir D tüpü ile yıkandı. Bir 1s darbe yaklaşık 0.5 mL tastant atar.

3. Tastant Hazırlama ve İzleme Tadantı Teslimatı

  1. Tastant'ı istenilen konsantrasyona kadar damıtılmış suda inceltin. Tatlandırıcının su akışı ile daha da seyreltileceğini unutmayın. İlk konsantrasyonun% 77'si olarak burun deliğine ulaşan nihai konsantrasyonu ölçtük (bkz. Referanslar 10 , 29 ).
  2. Her bir tastant solüsyonuna suni bir gıda boyası ekleyin ve tadının patronun üzerinden geçen kesin zamanlamasını belirleyin. % 0.05 w / v'de yeşil boya ( Madde Listesine bakın) Manduca GRN'leri aktive etmediğini bulduk.
  3. Tostantı solüsyonlarındaki gıda boyalarını tespit etmek için bir renk sensörü (bkz. Tablo 1) kullanın. Örgüye komşu bir delik açmak ve perfüzyon sisteminin çıkış tüpünün 0,5 cm altında bir delik açmak için lehimleme aleti kullanın ( S = "xfig"> Şekil 4A-4B). Sensörü sert boruya bağlayın ve dışarıda epoksi uygulayarak orada sabitleyin.
    1. Renk sensörü voltaj çıkışını, fizyolojik sinyaller ile birlikte bir analog sinyal olarak kaydedin (bkz. Bölüm 4). Renk sensörü voltaj sinyali, sensöre bağlı bir DC amplifikatörü kullanılarak yükseltilebilir ( Şekil 4A ).
  4. Renk sensörünün, tadı vererek ve sensörün voltaj çıktısını kaydettirerek çalıştığından emin olun. Boya tarafından üretilen sinyal gürültü seviyesini aşmalıdır.
    1. Sinyali olabildiğince kareye yakın hale getirmek için sabit su akış oranını ayarlayın.
      Not: Birden fazla tat vericisini sırayla vererken, yeni deneme yanıcıya sahip ilk denemenin yeni ve önceki tat vericisinin bir karışımından oluşacağına dikkat edin. Bu nedenle, bu ilk denemeleri analiz etmedik.
"> Şekil 4
Şekil 4 : Tatlandırıcı Teslimat Sistemi. ( A ) Zamanlamalı atıştırmalık hayvanların burunlarına iletilmesi ve izlenmesi için kullanılan cihazın şeması. Sistemin ana bileşenleri kırmızı rakamlarla gösterilir. Damla suyunun sabit bir akışı, burun deliğinin bulunduğu yerdeki sert plastik boruya (1) silikon boru ile bağlanmış bir peristaltik pompa ile korundu (6). Az miktarda tat içermeyen boya içeren tatlar basınçlı 16 kanallı perfüzyon sistemi kullanılarak verilir. Tatları içeren rezervuarlar, burun deliğinin (5) yerleştirileceği deliğin üstündeki sert boruya tutturulmuş bir manifolda (2) bağlıdır. Pnömatik bir pompadan alınan sıkıştırılmış hava perfüzyon sistemine püskürtülür ve zamanlama özel yazılım ile kontrol edilir. birRenk sensörü (3), tat vericinin doğumunu izlemek için kullanılır. Sensör, burun deliğine bitişik rijit boruya ve tat yoğunluğu perfüzyon sisteminin çıkışının altına bağlanır. Renk sensörü voltaj sinyali bir DC amplifikatörü ile güçlendirilir. Amplifikatörün bitişiğindeki kırmızı iz, özel veri toplama yazılımı kullanılarak kaydedilen bir renk sinyalini gösterir; Sinyaldeki hızlı artış ve azalış, sırasıyla, tadının varış ve yıkamasını yansıtır. Güvenin burnu renk sensörünün hemen altında bulunan bir deliğe (5) yerleştirilir. Farklı hayvanların sarmallarının daima aynı yere yerleştirilmesini sağlamak için deliğin üzerine bir ağ (4) yerleştirilir. Sert tübün diğer tarafı, çıktıyı bir atık kabına (7) yönlendirmek için başka bir silikon tüpüne bağlanır. ( B ) Panel A'da gösterildiği gibi kırmızı sayılarla gösterilen sert plastik boruya bağlanan tat verici dağıtım sisteminin ana unsurlarını gösteren resim: suRenk sensörü (3), ağ (4) ve burun iletim hattının (5) tümü sert bir plastik boruya (1) bağlanan delik (6), kaynak sensörü (6) . ( C ) Manduca preparatının kuruluma yerleştirilmesi gösterilir. Güve burnu distal t2 / 3 sert plastik boru (1) deliğine (5) sokulur. İğne ile gösterildiği gibi burun diş mumu ve epoksi ile yerine sabitlenir. Rijit tüpün su girişi ve atık kabına çıkışı sırasıyla 6 ve 7 rakamları ile gösterilir. 2 sayısı, tastant manifold çıkış tüpünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

4. GRN'lerden Tastant Uyandıran Aktiviteyi İzlemek İçin Ekstraselüler Tetrode Kaydı

  1. Güve preparatını vibrasyonlu bir stereomikroskop altında platforma yerleştirinAtion İzolasyon Tablosu ( Şekil 4C ).
  2. Güvenin sağkalımının distal üçte ikisini tastant uygulama sisteminin sert tüpüne koyun ( Şekil 2B ). Bunu yapmak için, kelebeğin burnunu uzatın ve sonra yumuşak tüpün deliğine pansuman pensesi yardımı ile hafifçe iterek sokun. Sızıntıları önlemek için burun deliğini yumuşak diş mumu ve daha sonra epoksi bir kat ile sızdırmaz kılın ( Şekil 4C , giriş).
  3. Salin perfüzyon hattını baş kapsülüne bağlayın ve perfüzyon akışını 0.04 L / s'lik sabit bir hıza ayarlayın.
  4. Salin banyosuna bir toprak elektrotu ( yani, bir klorlu gümüş tel) sokun ( Şekil 5A ).
  5. 30'da açıklanan üretim prosedürünü takiben inşa edilmiş, ısmarlama bükülmüş tel tetrode kullanın (4 elektrot telinin, iyi izole edilmiş birimleri elde etmesi ve içine sığması önerilirsinir). Deneyden önce, 30'da açıklanan adımları izleyerek elektrotu elektroplama yapın.
  6. Tetroyu maksiller sinire yakın konumlandırmak için manuel mikromanipülatör kullanın. Sinir girmeye başlayıncaya kadar tetrode ilerletin ( Şekil 5 ).
  7. Kayda başlamadan önce sinirin içinde stabilize olmasını sağlamak için tetrode yerleştirdikten sonra en az 10 dakika bekleyin.
  8. Sinyali (3000x) genişletin ve 0,3-6 kHz arasında bir bant geçiren filtre kullanın. Veri toplama yazılımı kullanarak 40 kHz örnekleme hızında sinyal elde edin.
  9. Deney bittikten sonra güve preparatını dondurucuya yerleştirin.

Şekil 5
Şekil 5 : GRNlerden Tetrode Kaydı. ( A , büyük görüntü) Bir mikromanipulatör pGRNlerin aktivitesini kaydetmek için bükülmüş tel tetrode maksiller sinire (MxN) dantel. Bir klorür gümüş toprak elektrodu, gösterildiği gibi salin banyosuna yerleştirilir. ( A , inset) Maksiller sinirde tetrode gösteren beynin büyütülmüş bir görüntüsü. Alt ekzofageal bölge (SEZ) de endikedir. ( B ) A.'da olduğu gibi Manduca beyninin şematik görünümü. Bu rakamın daha büyük versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Representative Results

GRN'lerin aktivitesi, tat vericinin verilmesinden önce, sırasında ve sonrasında bir hücre dışı tetrode elektrot kullanılarak kaydedilebilir ( Şekil 6A ve 6C ). Şekil 6A (orta ve alt paneller), hareket potansiyellerini (oklar) yansıtan farklı amplitüdlerin sinyallerinin görülebildiği maksiller sinire yerleştirilen dört telin her biri tarafından kaydedilen süzülmüş (300-6,000 Hz) voltaj izlerini göstermektedir. Deneyin başlangıcından 2 saniye sonra bir 1 nabız tadı (1 M sukroz) verildi; Uyarıcının başlangıcı ve kayması renk sensörü ( Şekil 6A , üst panel) tarafından izlendi. Dört kanalın her birinde görülen tastant uyarısı ( Şekil 6A , orta panel). GRN'ler mekanik sensörlerden (burada gösterilmemektedir) tespit edilebilmekte ve ayırt edilebilmektedir.

Tetrode kayıtlarından tek nöron yanıtlarını tanımlamak ve izole etmek için, Pouzat'ın 31 ve Kleinfeld'in 32,33 yöntemlerine dayanan bir dizi özel işlev kullanarak off-line spike sıralama gerçekleştirdik (bu yöntemler bu atıflarda açıklanmıştır: 10 , 29 ). Şekil 6B , Şekil 6A'da gösterilen verilere uygulanan ve iyi izole edilmiş üç ünitenin bulunduğu bir sivri uçlu sıralama örneğini göstermektedir.

Şekil 6C'den alınan çizgiler, Şekil 6B'deki üç izole edilmiş ünitenin sırayla verilen dört farklı deneme maddesi (1 M sükroz, maltoz ve NaCl; 100 mM kafein ve 10 mM berberin ve lobeline) üzerindeki tepkilerini göstermektedir (4 denemeS / tastant gösterilmektedir). Şekil 6C'de gösterildiği gibi, kaydedilen GRN'ler, sessiz (GRN'ler 1) ila düşük veya orta dereceli (GRN 2 ve 3) arasında değişen farklı baz seviye aktivitelerine sahiptir. Tastant başlangıcından sonra, GRN'ler çeşitli aktivite modelleri gösterir ve tat arttırıcılara farklı seçicilik gösterir. Örneğin, GRN 1 sadece sükroza tepki verirken, GRN 2, sivri patlama ile maltoz ve NaCl'ye ve sadece stimulusun başlamasında spike ile lobeline yanıt verdi. Buna ek olarak, bazı tepkiler uyaranın zamanlamasına ( örn., Sakroza GRN 1 yanıtı) kilitlenirken, diğer yanıtlar uyarı süresinden daha uzun sürer ( örn., Berberine GRN 3 yanıtı) ya da hem eksitatör hem de inhibitör bileşenleri içerir ( örn. Şekil 7 GRN 2, NaCl ve sükroza yanıtlar). GRN'lerin farklı hassasiyetleri ve etkinlik kalıpları hakkında daha fazla bilgi için bkz. Referans 10 .

Şekil 7 ). Panel A'daki yeşil kutudaki voltaj izleri, sükroz sunumunun ardışık 5 denemesi sırasında GRN 1'den hücre içi olarak kaydedildi ve aynı yanıtlar, panel B'de raster çizimler olarak gösterildi. (Bu tip tepki tetrodes ve Şekil 6C'de gösterilmiştir.) Keskin hücre içi elektrotlarla kaydedilen GRN 2, daha geniş bir tepki modeli gösterir.

Şekil 6 Şekil 6: Ekstraselüler Tetrode ile Maksiller Sinir Kayıtlarından Temsilci Sonuçlar. ( A ) Maksiller sinirdeki dört telin her biri tarafından kaydedilen filtrelenmiş (300-6,000 Hz) voltaj izleri gösterilmiştir (orta panel). Orta paneldeki kırmızı gölgelendirme ile belirtilen süre boyunca 1 sn'lik bir nasır tat verildi. Uyarıcının başlangıcı ve ofset değeri, üst paneldeki kırmızı voltaj izi ile gösterildiği gibi renk sensörü tarafından izlendi ve kırmızı paneli ile orta panelden belirtildi. Noktalı yatay çizgiler, +50 (üst), 0 (orta) ve -50 (alt) μV'yi ifade eder. Dikey noktalı çizgilerdeki alana karşılık gelen ham gerilim izlerinin genişlemesi gösterilmektedir (alt panel). Sivri uçlara örnekler oklarla gösterilir. ( B ) Panel A'da gösterilen verilere uygulanan sivri uçlu sıralama örneği. Dört hücre dışı telin (1-4) her birinde kaydedilen dalga formlarıKaydedilen sinyallere katkıda bulunan üç farklı GRN (birimler 1-3) ile tanımlandı. Bireysel olaylar (renkli ince çizgiler) ve ortalama (kalın siyah çizgi) üç ünite için gösterilir. Başak birleştirme yöntemini kullanarak bağımsız birimleri güvenilir bir şekilde tanımlamak için birkaç istatistiksel kriter dikkate alınmalıdır (bkz. Referanslar 10 , 29 ). ( C ) Üç izole edilmiş ünitenin altı farklı tat sahibinden oluşan bir sıraya karşılık gelen raster çizimleri (4 deneme / tat verici gösterilmiştir). Tastant verilme süresi (1 s) kırmızı-gölgeli alanla gösterilir. Tatların konsantrasyonları 1 M (sükroz, maltoz, NaCl), 100 mM (kafein) ve 10 mM idi (berberin ve lobeline). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7 Lass = "xfigimg" src = "/ dosyalar / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Şekil 7 : GRN Aksonlardan Hücre içi Kayıtlar. ( A , yeşil kutu paneli) Maksiller sinire yerleştirilen keskin cam hücre içi elektrotlarla (80-120 MΩ dirençli) bir GRN'den kaydedilen voltaj izleri, 1 M sükrozla (Suc) ardışık olarak 5 uyarı ile ortaya çıkmıştır. ( B ) Panel A'da (yeşil kutu paneli) gösterilen yanıtlar da dahil olmak üzere, iki GRN yanıtının, keskin cam intraselüler elektrotlarla kaydedilen sırayla (100 mM gri font rengi; 1 M siyah font rengi) verilen iki farklı tat grubuna rastgele örnekleri Maksiller sinire yerleştirilir (7 deneme / tastant ve 3 deneme / su gösterilmiştir). Tatlandırıcı doğum zamanı, her iki panelde de kırmızı gölgeli alanlarla gösterilir. Uyarıcının başlangıcı ve ofset değeri, her panelin altındaki kırmızı voltaj izleriyle gösterildiği gibi renk sensörü tarafından izlendi.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan yöntemler, nispeten basit bir hayvandan Manduca sexta'nın, tat verici doğum öncesi, sırasında ve sonrasındaki çoklu, rasgele seçilmiş GRN'lerin aktivitelerini (2 saatten fazla) uzun süreler boyunca karakterize etmesine izin verir. Bu yöntemler, aynı zamanda, hassas tatlısı kontrollü, çoklu tat arttırıcı uyarıcıların hızlı ve sıralı olarak verilmesine, tatların gösterilmesinin altında yatan sinirsel mekanizmaların incelenmesine yarayan avantajlara izin verir. Bu protokol, monosinaptik olarak bağlı olan internöronlarla 10 aynı anda GRN'leri izleyerek , postsinaptik hedef nöronlarına ( örn., SEZ'de) gönderildiklerinde, tatlara karşı GRN'lerin yanıtlarının nasıl dönüştürüldüğünü incelemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yöntemler tatmin edici kodlamanın temel özelliklerini incelemek için karmaşık paradigmaların yürütülmesine izin vererek deneycinin ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir.

BaşlarkenÇalışmalarımız, bazen gidermek zorunda olduğumuz bir teknik problem, maksiller sinirden tetrode telleri ile sızdırma sinyalleri bulamamamızdı. Bunun olası sebepleri diseksiyon protokolü zor olduğu için çeşitlidir ve iyi bir hazırlık elde etmek için bazı uygulamalar gereklidir. İlk olarak, güve disseksiyonu esnasında, maksiller sinirler, özellikle sinir dokusunu çevreleyen kılıfın çıkartılması sırasında zarar görürler. İkincisi, eğer kılıf tamamen kaldırılmazsa, tetrode teller sinire erişemeyebilir. Her iki durumda da, genellikle yeni bir hazırlık başlatmak, bu sorunları çözmenin en kolay yoludur. Üçüncüsü, tetrode telleri ile ilgili bir problem olabilir. Bu, 1kHz'de ~ 270 kΩ olmalı tellerin empedansının ölçülmesi ile kontrol edilebilir. Empedans değeri ~ 300 kΩ'un üzerindeyse, istenilen empedansı elde etmek için telleri altın ile elektroplozlayın (bkz. Referans 30 ). Dördüncüsü, bir parça ekipman yanlış bağlanabilirYa da yanlış davranan.

Bir diğer olası problem, sızdırma sinyallerinin kaydedilmesidir ancak nöronlar, tat arttırıcılara tepkisiz görünmektedir. Kayıtlı nöronlar, teslim edilen tat sahiplerine karşı duyarsız oldukları için olabilir. Ayrıca, GRN'lerin aksonlarının yanı sıra maksiller sinirin de makro duyusal lifleri taşıdığını akılda tutmak önemlidir. Böylece, GRN'ler yerine ya da GRN'lere ilaveten mekanosensör nöronlardan kayıt yapmak mümkündür. Bununla birlikte, tastant uygulama sistemi, deney boyunca sabit bir mekanik girdi sağlayacak şekilde tasarlanmıştır, çünkü bir tat vericisine verilen yanıtların, teslimatının mekanik bileşenine verilen tepkilerle karıştırılması olası değildir. Bazılarına, diğerlerine değil çeşitli lezzetçilere cevap veren nöronlar, açıkça GRN'ler olarak sınıflandırılabilir. Bileşik bozulması veya buharlaştırma nedeniyle tastant konsantrasyonunda veya bileşimde değişiklik yapılmasını önlemek için yeni seyreltilmiş tat vericilerini kullanmanızı öneririzÇözücü. Hortumun kirlenmesini ve / veya tıkanmasını önlemek için sistemi düzenli olarak temizlemenizi öneririz.

Olas bir teknik problem, dezavantajlı bir sinyal / gürültü oranıdır. Bu problem çoğunlukla banyo zemin elektrodunun pozisyonunun yeniden kristalleştirilmesi veya ayarlanması ile çözülebilir. Diğer çözümler, cihazdaki her bir elektrik bağlantısının korunması ve minimum tutulması gerektirebilir.

Son olarak, tetrode kayıtları kullanılarak elde edilen verilerin doğru analizinin dikkatli bir şekilde sivri uçlu sıralama yapılmasını gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Tam otomatik yöntemlerin genellikle yetersiz olduğunu tespit ettik. Tetrode verilerini analiz etmeden önce 10 , 29 , 31 , 32 , 33 numaralı virüslü virüs türlerinin incelenmesini öğrenmenizi öneririz.

Diseksiyon proğimize alternatiflerTocol kullanılabilir. Burada, maksilanın kafasının ventral kısmı boyunca maksiller sinirlere ve SEZ'e erişim sağlayan bir diseksiyon tarif ettik, ancak bu yapılara dorsal taraftan diseke ederek erişmek de mümkündür. Dorsal yan hazırlığın, bu tatlı yapılardan derinliklerine bağlı olarak kayıt yapmak için uygun olmadığını tespit ettik, ancak bu hazırlama, mantar cismi gibi yüksek dereceli yapılardaki kayıtları etkinleştirme imkânı sağlıyor, bu alan çoklu -Sensör entegrasyonu, birleştirici öğrenme ve bellek işleme 34 . Maksiller sinirden kayıt yapmak için tetrode elektrodların kullanımına odaklandık, ancak resimde olduğu gibi standart hücre içi keskin elektrotlar da bu amaçla kullanılabilir. Buna ek olarak, her iki teknik birden fazla beyin bölgesinden ( 10) eşzamanlı kayıt yapmak için birleştirilebilir. Sinirbilimi literatürü i35 , 36 , 37 , 38 , 39 böcekler ve omurgalılara uygulanan olfaktör kodlama gibi duyusal işlemenin temel ilkelerini ortaya koymak için güçlü araçlar olduğu kanıtlanmış omurgasız modeller. Umarız yöntemlerimiz, tatlılık kodlamasıyla ilgili temel yeni anlayışlara götürecektir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH-NICHD'den MS'e intramural hibe ile desteklenmiştir. Tatlandırıcı madde dağıtım sisteminin tasarımı ile ilgili yardım için NIH-NIMH Enstrümantasyon Çekirdeği Tesisinin G. Dold ve T. Talbot'a teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444, (7117), 288-294 (2006).
  2. Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333, (6047), (2011).
  3. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139, (2), 234-244 (2009).
  4. Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434, (7030), 225-229 (2005).
  5. Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115, (3), 255-266 (2003).
  6. Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442, (7105), 934-938 (2006).
  7. Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14, (5), 226-232 (1959).
  8. Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8, (Suppl 3), (2007).
  9. Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, (7534), 373-376 (2015).
  10. Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35, (35), 12309-12321 (2015).
  11. Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7, (7), e41597 (2012).
  12. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22, (16), 7281-7287 (2002).
  13. Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17, (4), 433-442 (2006).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81, (5), 984-1000 (2014).
  15. Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33, (7), 326-334 (2010).
  16. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275, (1), 3-26 (1994).
  17. Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47, (6), 401-415 (1999).
  18. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150, (2), 327-341 (1976).
  19. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  20. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  21. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69, (2), 258-272 (2011).
  22. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, (10), 871-876 (1999).
  23. Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199, (5), 403-416 (2013).
  24. Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130, (3380), 922 (1959).
  25. Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35, (1), 15-33 (2006).
  26. Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
  27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3, (8), 102-104 (1963).
  28. Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
  29. Reiter, S. Gustatory Information Processing. https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
  31. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122, (1), 43-57 (2002).
  32. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31, (24), 8699-8705 (2011).
  33. Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69, (2), 175-188 (1996).
  34. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4, (4), 266-275 (2003).
  35. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
  36. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
  37. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  38. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  39. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).
Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).More

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter