Summary
여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.
Abstract
수많은 세포 단백질이 막 표면과 상호 작용하여 필수 세포 과정에 영향을줍니다. 이러한 상호 작용은 phosphoinositides (PIPs)의 경우처럼 특정 세포 내 지방화 및 / 또는 활성화를 보장하기 위해 멤브레인 내의 특정 지질 성분을 향하게 할 수 있습니다. PIP와 세포질 PIP 결합 도메인은 세포 생리학에서 그들의 역할을 더 잘 이해하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다. 우리는 protein-PIP 상호 작용을 연구하기위한 도구로서지지 된 지질 이중층 (SLBs)에 pH 조절 분석을 적용했습니다. 이 연구에서, pH 민감성 ortho- sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine은 protein-PIP 상호 작용을 검출하는 데 사용됩니다. 단백질이 PIP 함유 멤브레인 표면에 결합하면, 계면 전위가 조절되어 ( 즉 , 국소 pH 변화), 프로브의 양성자 화 상태가 변하게됩니다. pH 조절 분석의 성공적인 사용에 대한 사례 연구는 phospholipase C delta1 Pleckstr상동 (PLC-δ1의 PH) 도메인 및 예로서, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)의 상호 작용이다. 이 상호 작용에 대한 겉보기 해리 상수 ( K d, app )는 0.39 ± 0.05 μM이었고 , 다른 것들에 의해 얻어진 K d 값과 유사했다. 이전에 관찰 된 바와 같이, PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 특이 적이며, 포스파티딜 이노시톨 4- 인산염에 대한 약한 결합을 나타내며, 순수한 포스파티딜콜린 SLB에 대한 결합은 보이지 않는다. PIP-on-a-chip 분석은 낮은 샘플 부피 및 리간드 / 수용체 표지 요구 사항이 없지만 작은 및 낮은 친화도 막 상호 작용을 테스트 할 수있는 능력을 포함하되 이에 국한되지 않는 전통적인 PIP 결합 분석보다 유리합니다. 큰 분자 및 개선 된 신호 대 잡음비. 따라서, PIP-on-a-chip 접근법의 사용은 광범위한 막 상호 작용 메커니즘의 해명을 용이하게 할 것이다. 또한이 방법은 잠재적으로세포막과 상호 작용할 수있는 단백질의 능력을 조절하는 치료제를 확인하는데있어
Introduction
무수한 상호 작용과 생화학 적 과정은 2 차원 유체 막 표면에서 일어난다. 진핵 세포의 멤브레인 - 둘러싸인 세포 기관은 생화학 적 과정과 관련 프로테옴뿐만 아니라 지질 조성에서도 독특합니다. 예외적으로 인지질의 한 종류는 phosphoinositides (PIPs)입니다. 이들이 세포질 리피도미스의 1 %만을 차지한다고 할지라도, 이들은 신호 변환,자가 식욕 (autophagy), 막 인신 매매 (membrane trafficking)에서 중요한 역할을한다. 그 중에서도 1 , 2 , 3 , 4 가 중요하다. 셀룰러 PIP 키나제하여 이노시톨 헤드 그룹의 동적 인산화 일곱 PIP 모노있다 headgroups, 비스 -, 또는 트리스 - (5)의 인산화를 일으킨다. 또한, PIP는 세포막의 세포 내 신원을 정의하고 하나 이상의 포스 포이 노를 함유하는 단백질 / 효소에 대한 특화된 막 도킹 사이트로서 작용한다예를 들어, 도메인을 itide 결합, 플렉스 트린 상 동성 (PH) Phox 동성 (PX)과 epsin N 말단 동성 (ENTH) 6,7. 가장 많이 연구 된 PIP 결합 도메인 중 하나는 특히 높은 나노 몰 낮은 마이크로 몰 범위의 친 화성 8에서 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)과 상호 작용하는 포스 포 리파제 C (PLC) -δ1의 PH 도메인이고 , 9 , 10 , 11 .
다양한 정성 및 정량 시험관 방법이 개발되어 이러한 상호 작용의 메커니즘, 열역학 및 특이성을 연구합니다. 가장 일반적으로 사용되는 PIP 결합 분석에는 표면 플라스 몬 공명 (SPR), 등온 열량계 (ITC), 핵 자기 공명 (NMR) 분광기, 리포좀 부유 / 침강 분석법 및 지질 블롯 (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . 이것들이 광범위하게 이용 되더라도 그들은 모두 많은 단점을 가지고 있습니다. 예를 들어, SPR, ITC 및 NMR은 많은 양의 시료, 값 비싼 계측 및 / 또는 숙련 된 인원 12 , 13을 필요로 합니다. 항체 기반 lipid-blots와 같은 일부 분석 형식은 PIP의 수용성 형태를 사용하고 비 생리 학적 방식으로 12 , 14 , 15 , 16로 표시 합니다. 또한, 지질 블롯은 신뢰할 수있게 정량 될 수 없으며 종종 가양 성 / 음성 관찰 12 , 17 , 18을 초래합니다. 이러한 어려움을 극복하고 현재 도구 세트를 개선하기 위해 지원되는 지질 이중층 (lipid bilayer, SLB)을 기반으로 새로운 라벨없는 방법이 am ( 그림 1 ) 19 단백질 - PIP 상호 작용의 연구에 성공적으로 적용된 마이크로 유체 플랫폼.
단백질 -PIP 상호 작용을 검출하기 위해 사용 된 전략은 pH 변조 감지에 기초한다. 이것은 phosphatidylethanolamine lipid head group 20에 직접 conjugated ortho -sulforhodamine B ( o SRB)가있는 pH 민감성 염료를 포함합니다. 오의 SRB-POPE 프로브 (도 2a)는 낮은 pH에서 높은 형광 및 7.5 몰 %의 PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 (도 5b)에서 약 6.7의 pKa 높은 pH에서 켄칭된다. PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 ( 도 5A )에 대한 높은 특이성으로 인해 단백질 -IP 결합 방법의 유효성 확인에 광범위하게 사용되어왔다 ( 도 5A ) 21 , 22 ,"> 23, 24, 25 .Hence, 우리는 PLC-δ1의 PH 도메인은 그것의 PI 결합 테스트하는데 사용될 수 있다는 추론 (4,5)가 PIP 온 칩 분석을 통해 P 2. 산도 도메인 구조 본 연구에서 사용은 순 양전하 PI (8.4)을 가지며, 따라서 OH 유치 -.받는 이온 - PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 결합시 이온 (도 5c)를 상기 PH 도메인은 OH를 가져온다 결과적으로 계면 전위를 변조하여 O SRB-POPE (도 5C) 26. 산도 도메인 농도의 함수로서, 형광 켄칭된다 (도 6A)의 양성자 화 된 상태를 시프트 막 표면. 최종적으로, 정규화 된 데이터는 산도 도메인 PI (4,5) P (2)의 상호 작용 (도 6b,도 6c).의 친 화성을 결정하기 위해 결합 등온선에 맞게 </ p>
이 연구에서는 미세 유체 플랫폼 내에서 PIP를 함유 한 SLB에 단백질 결합을 수행하기위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 독자가 microfluidic 장치와 소낭 준비를 SLB 형성과 단백질 바인딩으로 조립하는 것을 필요로합니다. 또한, 데이터 분석을위한 지시는 PLC-δ1의 PH 도메인-PI (4,5) P (2)의 상호 작용이 제공되는 선호도에 대한 정보를 추출한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 유리 커버 슬립 청소
- 7x 세척액을 희석하십시오 ( 재료 표 참조) 바닥이 평평한 100mm 붕규산 유리 접시에 탈 이온수로 7 배 희석하고 20 분 동안 레벨 핫 플레이트에서 95 ℃까지 가열하거나 흐린 용액이 투명해질 때까지 .
참고 : 솔루션이 뜨거울 수 있으므로 신체 상해를 피하려면주의하십시오. 7x 세척액은 헥사 나트륨 [산화 - [산화 (포스 포 네이 토 옥시) 포스 포릴] 옥시 포스 포릴] 포스페이트, 2- (부 톡시에 톡시) 에탄올, 소듐 1,4- 비스 (2- 에틸 헥 옥시) -1,4- 디 옥소 부탄 -2-sulfonate 및 위험하지 않은 첨가물. - 핀셋을 사용하여 알루미늄 염색약에 coverslips (길이 40mm x 너비 22mm x 높이 0.16-0.19mm)를 번갈아 가며 배열하십시오. 서로 닿지 않도록 각 coverslip 사이에 빈 자리를 유지하십시오.
- 세척 용액에 커버 슬립을 묻힌 얼룩 랙을 완전히 담그십시오. 커버 슬립을용액을 1 시간 동안 처리 하였다.
참고 : 물이 증발함에 따라 용액 농도가 변하지 않도록 신선한 탈 이온수를 계속 추가하십시오. - 얼룩 선반을 세척 용액에서 꺼내고 충분한 양의 탈 이온수로 커버 슬립을 씻어서 세제를 제거합니다.
- coverslips를 질소 가스 (얼룩 랙 당 약 5 분)로 건조시킨 다음 어닐링을 위해 550 ° C에서 6 시간 동안 커버 슬립을 킬른에 놓습니다.
참고 : 이것은 유리 표면의 거친 피쳐를 부드럽게하는 중요한 단계입니다. - 커버 슬립을 플라스틱 용기에 넣고 먼지로부터 멀리하십시오.
2. 미세 패턴이있는 PDMS 블록 제작
- 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 프리폴리머와 경화제를 대형 플라스틱 계량 보트에서 10 : 1 (w / w) 비율로 혼합하고 진공도가 500 Torr 이하인 진공에서 1 시간 동안 탈기합니다.
참고 : PDMS는 투명하고 비활성 인 실리콘 중합체입니다. 원하는 PDMS 블록을 얻으려면 thickness (0.5 cm)를 가하고 55 g의 예비 중합체와 5.5 g의 경화제를 섞는다. - 큰 (10cm 기본 직경) 플라스틱 무게 보트에 같은 SU - 8 마이크로 패턴의 여러 복제가 들어있는 실리콘 마스터를 놓고 가스가 제거 된 PDMS에 부어 넣습니다. 그런 다음 60 ° C의 건조 오븐에서 밤새 치료하십시오.
참고 : 미세 패턴은 육안으로 볼 수있을 정도로 큽니다. 각 패턴에는 간격이 40 μm 인 8 개의 마이크로 채널 (폭 100 μm x 높이 40 cm x 길이 1 cm)이 있습니다 ( 그림 1A , 1B ). 하드 베이킹 된 SU-8 포토 레지스트로 구성된 실리콘 웨이퍼 몰드가 나노 제작 설비 ( 27) 에서 제조되었다. 마스터 준비를위한 다른 접근법으로는 HF (HF) 에칭, 고온 수 에칭, Xurography 및 3D 인쇄 28 , 29 , 30 , 31이 있습니다. Commerc실리콘 마스터 준비를위한 소스도 사용할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치의 패턴은 제도 소프트웨어로 설계되었습니다 (재료 표 참조). 패턴 디자인이 포함 된 원본 파일은 제조업체에 직접 제공 할 수있는 보충 파일 "Pattern Design.dwg"로 제공됩니다. - 부드럽게 PDMS를 실리콘 마스터에서 손으로 떼어냅니다. 수술 용 메스와 룰러를 사용하여 각 마이크로 패턴의 경계를 직사각형으로 표시하십시오. 그런 다음 PDMS를 차단하십시오.
- 그림 3B에 표시된대로 생검 펀치 (1.0mm 구멍 직경)로 각 마이크로 채널의 양쪽 끝에 16 개의 구멍 (블록 당 8 개의 입구와 8 개의 출구)을 펀치하십시오.
- 손상 및 먼지로부터 마이크로 패턴을 보호하기 위해 각 PDMS 블록 위에 테이프를 붙입니다. 플라스틱 용기에 보관하십시오.
3. 소형 Unilamellar Vesicles (SUVs) 준비
참고 : 음성 대조 이중층 구성99.5 몰 %의 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -Sn- 글리세 로 -3- 포스 포 콜린 (POPC) 및 0.5 몰 % 오르토 설포로라도 아민 B-1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 -Sn- 글리세 로 -3- 포스 포 에탄올 아민 ( o SRB- 로마 교황). 시험 이중층 조성물 92.0 몰 %의 POPC, 0.5 몰 %의 O SRB-포프 및 중 L-α-포스파티딜 -4- 포스페이트 7.5 몰 % (PI4P) 또는 L-α-포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI ( 4,5) P 2 ). 이하, 0.5 몰 %의 O를 SRB-포프 및 7.5 몰 %의 PI (4,5) P (2) 함유 SUV의 92.0 몰 %의 POPC를 제조하는 과정이다. 본 연구에 사용 된 SRB O-POPE의 합성은 이전에 기재되었다 (20).
- 혼합 할 필요가있는 POPC, PI (4,5) P 2 및 o SRB-POPE의 부피를 계산합니다 : 총 POPC 2.22 mg, PI (4,5) P 2 0.26 mg, 및 오 - SRB POPE 2.1 X 10-5 밀리그램.
- 계산 된 부피의 POPC, PI (4,5) P 2 ,em> O SRB-POPE를 하나의 20 mL 유리 섬광 바이알에 넣으십시오.
참고 : PI (4,5) P 2 (및 기타 포스 포이 노 시드) 스톡은 클로로포름 : 메탄올 : 물 (20 : 9 : 1) 용매 혼합물에 들어 있지만 POPC 및 O SRB-POPE 스톡 용액은 클로로포름 용액으로 제공됩니다. 정확성을 위해 사용하기 전에 클로로포름으로 피펫 팁을 적시십시오. 안전을 위해이 단계는 화학 흄 후드 내부에서 이루어져야합니다. - 혼합물을 10 분 동안 또는 용매가 증발하고 바이알의 바닥에 얇은 지질막이 형성 될 때까지 화학 흄 후드 내부의 질소 가스 스트림에서 건조시킨다.
- 혼합물을 잔류 유기 용매를 제거하기 위해 10mTorr의 진공 강도에서 3 시간 이상 동안 진공하에 건조시킨다.
참고 : 3 시간의 건조 시간은이 프로토콜에 설명 된 SUV 준비의 규모에 충분하며 50 회의 실험에 적합합니다. 더 큰 규모의 SUV 준비가 필요한 경우, 밤새도록 건조가 수행 될 수 있습니다. - 닥터를 다시 보자.5 mL의 런닝 버퍼 (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0)로 희석 한 지질 필름을 넣고 35 kHz의 작동 주파수에서 30 분 동안 실온에서 초음파 욕조에 놓습니다.
참고 : 단계 3.1에서 명시된 지질의 양을 혼합하고 단계 3.5에서 5 mL의 러닝 버퍼를 첨가하여 0.5 mg / mL에서 소포 현탁액을 산출한다. 이 단계에서 소포 현탁액은 단층 및 다중 층 소포 ( 그림 2B )의 혼합입니다. 솔루션은 분홍색 / 자주색으로 표시되며 상대적으로 혼탁합니다. - 40 ° C에서 액체 질소와 수욕으로 소포를 동결 - 해동시켜 단층의 소포를 얻습니다. 동결 융해를 10 번 반복하십시오.
참고 : (선택 사항) 현탁액에 비 - 단일 라멜라 소포가 없도록 원심 분리 단계를 적용 할 수 있습니다 ( 32 , 33) . - 지질 압출기를 사용하여 0.10 μm의 트랙 에칭 폴리 카보 네이트 멤브레인을 통해 소포 현탁액을 밀어 낸다 (참조재료 표) SUV를 풍성하게합니다. 압출을 10 번 반복하십시오.
참고 : 15 mL 원추형 튜브를 사용하여 압출 된 소포를 수집 할 수 있습니다. 용액은이 단계에서 탁도가 없어야한다. SUV 직경은 동적 광 산란 (DLS)을 통해 확인할 수 있습니다 ( 그림 2C ). SUV는 SLB를 형성하는 데 가장 적합합니다 34 . - 원추형 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 4 ° C에서 보관할 때까지 보관하십시오.
4. 미세 유체 장치 조립
- 물 세척 병을 사용하여 구멍을 통해 탈 이온수를 분사하여 막힘에 대한 PDMS 블록의 입구와 출구를 시험하십시오. 그런 다음 PDMS 블록을 질소 가스로 건조시킵니다.
참고 :이 단계는 채널 내부 및 / 또는 채널 사이에 끼어있는 먼지 입자도 제거합니다. 필요하다면, 먼지 먼지를 제거하기 위해 먼지 가스를 질소 가스로 미리 클리닝 한 커버 슬립으로 제거하십시오. - PDMS 블록과 사전 청소 된커버 슬립은 10cm 3 / min으로 75 와트의 산소 흐름 속도에서의 전력 설정에 45 초 동안 산소 플라즈마에 노출시키기 위해 산소 플라즈마 시스템 (재료 표 참조) 샘플 챔버 내부 (제 1 참조), 200 mTorr 이하의 진공 강도 .
- 산소 플라즈마 처리 후 즉시 coverslip과 접촉 PDMS 블록의 패턴 화 된 표면을 놓으십시오. 접촉 부위에서 공기 방울을 부드럽게 눌러 제거하십시오.
- 본딩을 향상시키기 위해 3 분 동안 100 ° C에서 레벨 핫 플레이트에 장치를 놓습니다.
- 100 % 에탄올로 보풀이없는 젖은 천 ( 예 : kimwipe)을 사용하여 장치의 상단 (PDMS) 및 하단 (유리)에서 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 장치를 유리 현미경 슬라이드 위에 테이프로 붙입니다.
참고 : 과량의 에탄올을 사용하지 말고 에탄올이 입구 및 출구 채널로 들어 가지 않도록하십시오. 에탄올이 즉시 증발되도록하려면 장치가 뜨거울 때이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 유리 microscopy 슬라이드는 먼지 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 100 % 에탄올 용액에 저장할 수 있습니다.
5. 지원 지질 이중층 (SLBs) 형성
- 단계 3.8의 PI (4,5) P 2 함유 SUV 100 μL를 0.65 mL 미세 원심 분리 튜브에 옮긴다. 0.2 N 염산 6.4 μL를 첨가하여 ~ 3.2로 용액의 pH를 조절한다.
참고 : 마이크로 pH 프로브가 장착 된 pH 미터로 용액의 pH를 확인하십시오 (재료 표 참조). - pH 조정 SUV 용액 10 μL를 주입구를 통해 각 채널에 넣고 용액이 배출구에 도달 할 때까지 피펫을 통해 압력을가합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착 된 채로 두십시오.
- 각 채널에 대해 위의 단계를 반복 한 다음 장치를 RT에서 10 분 동안 품어 두십시오.
참고 : 미세 채널로의 소포 주입은 장치 조립 직후에 수행해야합니다. - 입구 및 출구 튜빙 세트를 자르고채널 60cm (입구 튜빙) 및 8cm (출구 튜빙) 길이.
참고 : 튜브를 대각선으로 절단하고 날카로운 모서리를 만들면 튜빙을 입구와 출구에 쉽게 삽입 할 수 있습니다. 출구 튜빙은 원호 모양이어야합니다. 입구 튜빙의 길이는 현미경 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 튜빙의 내부 직경은 0.05cm입니다. - 핀셋을 사용하여 콘센트 튜브 세트를 장치에 연결 한 다음 장치를 현미경 스테이지에 테이프로 고정합니다.
- 원추형 튜브에 담긴 25 mL의 흐르는 완충액에 넣은 입구 튜빙의 한쪽 끝을 물에 담그고 튜브에 담아서 고정하십시오.
- 중력 흐름을 통해 마이크로 채널을 통해 용액을 밀어 올리려면 장치보다 높은 바닥 (~ 20cm)에 원뿔형 튜브를 놓습니다. 랩 잭을 사용하여이를 수행 할 수 있습니다.
- 각 주입 튜브에 대해 주사기를 사용하여 튜브의 자유 단부에서 1 mL의 버퍼를 채 웁니다. 입구에서 피펫 팁을 꺼내고입구 튜브의 자유 단부를 장치 안으로 넣습니다.
참고 :이 단계에서 공기 방울이 채널로 유입 될 가능성을 줄이려면 주입구에 버퍼를 떨어 뜨리십시오. 인입 튜브가 장치에 부착 된 후 보푸라기가없는 와이프로 과도한 완충액을 제거하십시오. - 위의 단계를 반복하여 모든 입구 튜브 부품을 장치에 연결하십시오.
참고 : 채널을 흐르는 흐르는 버퍼는 과도한 소포를 제거하고 이중층을 실험 조건에 평형시키는 데 도움이됩니다. - 현미경 제어 소프트웨어를 엽니 다 (재료 표 참조). 왼쪽 패널에서 "현미경"탭을 클릭하고 "10X"목표를 선택하십시오.
- 도구 모음에서 "라이브"및 "Alexa 568"이미지 아이콘을 클릭하십시오. 미세 조정 및 코스 조정 손잡이를 사용하여 마이크로 채널에 초점을 맞 춥니 다.
- 장치를 스캔하여 SLB 및 채널의 품질을 확인하십시오 ( 그림 8 ). 그때,툴바에서 "FL Shutter Closed"이미지 아이콘을 클릭하십시오.
- '획득'탭을 클릭하고 '기본 조정'에서 '노출 시간'을 선택하십시오. 노출 시간을 "200ms"로 설정하십시오.
- 왼쪽 패널에서 "Multidimensional Acquisition"을 클릭하고 필터 메뉴에서 "Alexa 568"이라고 표시된 빨간색 채널을 선택하십시오. 그런 다음 "시간 경과"메뉴를 클릭하고 시간 간격을 5 분, 지속 시간을 30 분으로 설정 한 다음 "시작"을 클릭하십시오.
참고 : 지속 시간 (30 분)과 유속 (~ 1.0 μL / min)을 기준으로 실행 버퍼 30 μL를 사용하여 채널 내 SLB를 평형화합니다. 즉 , 실행 버퍼 240 μL가 모든 8 개 채널에 사용됩니다. - "측정"탭에서 "원"도구를 선택하고 모든 채널에 원을 그립니다. 원이 선택되어있는 동안 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 "속성"을 선택하십시오. '프로필'탭에서 '전체 T'를 선택하여시간의 함수로서의 형광 강도.
- 다음 단계로 진행하기 전에이 곡선이 평형을 나타내는 고원에 도달하는지 확인하십시오.
- 버퍼 용액을 장치와 같은 높이로 낮추어 흐르지 않게하십시오.
- 시간 경과 파일을 저장하십시오.
6. PI (4,5) P 2 함유 SLB와의 PLC-δ1 PH 도메인 상호 작용의 시험
- 실행 버퍼를 희석제로 사용하여 PH 도메인의 희석을 준비합니다.
참고 : 장치에는 8 개의 채널이 있으므로 두 개 이상의 빈 채널을 사용하십시오. 각 측면의 먼 끝을 선택하고 단백질 희석을 위해 나머지 채널을 사용하십시오. 다음의 PH 도메인 농도를 시험 하였다 : 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 및 2.50 μM. 각 희석액의 약 200 μL가 30 분 이내에 평형에 도달하기에 충분했습니다. - 한 번에 하나씩 각 콘센트 튜빙을 분리하고 각 단백질 희석액 200 μL를콘센트 채널은 피펫을 사용합니다. 압력을 가하지 마십시오. 중력이 작용합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 microfluidic 장치에 첨부 된 상태로 둡니다.
- 각 채널에 대해 위의 단계를 반복하고이 과정에서 기포가 채널로 유입되지 않는지 확인하십시오.
- 유입구 튜빙을 마이크로 유체 장치 아래의지면으로 낮추어 마이크로 채널을 통해 단백질을 흐르게하십시오. 튜브의 자유 단부를 폐기물 용기에 테이프로 붙이십시오. 단백질 희석액을 30 분 동안 흐르게하십시오.
참고 : 이것은 흐름을 바꾸어 단백질이 채널로 유입되도록합니다. 평형화에 필요한 시간과 필요한 단백질 희석 물의 양은 상호 작용의 친 화성에 따라 달라집니다. - 소프트웨어의 왼쪽 패널에서 "시간 경과"탭 아래의 "시작"을 클릭하여 이미징을 다시 시작하십시오.
- 평형 상태에 도달하도록 단계 5.15를 반복하십시오. 실험이 완료되면 시간을 절약하십시오.파일.
7. 멤브레인 유동성 평가
참고 : SLB가 유동적임을 확인하기 위해 SUV 및 청소 유리 커버 슬립의 새로운 배치마다 FRB (Fluorescence Recover After Photobleaching) 실험을 수행해야합니다.
- 유리 커버 슬립 (1.1-1.6) 청소, 마이크로 패턴 PDMS 블록 제작 (2.1-2.5), SUV 준비 (3.1-3.8), 마이크로 유체 장치 (4.1-4.5) 조립 및 SLB 형성 (5.1-5.17) 설명했다.
- 현미경을 이중층에 맞추고 노출 시간을 200ms로 설정하고 비닝을 1로 설정합니다.
- 532 nm, 2 mW 레이저 빔 (13 μm 반경)을 사용하여 원형 표백을 사진 표백합니다. Photobleaching 직후 첫 번째 45 초 동안 3 초마다 일련의 이미지 캡처를 시작한 다음 나머지 시간 (총 지속 시간 15 분) 동안 30 초 간격으로 캡처를 시작합니다. 데이터 수집이 완료되면 시간 경과 파일을 저장하십시오.
- 표백 한 것을 선택하십시오.시간의 함수로 형광 강도 값을 추출하는 원형 그리기 도구를 사용합니다. 또한 근처에 두 개의 다른 영역을 선택하십시오. 하나는 표백되지 않은 영역에 해당하고 다른 하나는 SLB가없는 영역에 해당합니다.
- 다음 식을 사용하여 형광성 회수율 ( y )을 계산합니다 :
참고 : 여기에서 F t 는 표백 된 영역의 강도를 시간의 함수로 나타내고 F i 는 표백 전의 형광 강도를 나타냅니다 (이 경우 정규화 된 값으로 "1"을 사용). F 0 은 배경 강도입니다. - FRAP 곡선을 생성하기 위해 시간 (x 축)의 함수로 형광 복구 (y 축)를 플롯합니다. 그런 다음 다음과 같이 단일 지수 함수에 데이터를 맞 춥니 다.
참고 : 여기서 A 는 모바일 분수를 나타내고
- t 1/2 를 사용하여 확산 상수 ( D )를 계산합니다 :
참고 : 여기서 R 은 레이저 빔 반경 (13 μm)을 나타냅니다. 유체 이중층에 대한 확산 상수는 1.0 μm 2 / s 이상이어야합니다.
8. 데이터 처리
참고 : 데이터 분석 루틴은 현미경, 이미지 처리 소프트웨어 및 사용중인 커브 피팅 소프트웨어에 따라 달라집니다.
- PH 도메인을 적정하기 이전 (단계 5.17에서)과 후 (단계 6.6에서)의 시간 경과 파일을 엽니 다. 각 시간 경과 파일의 마지막 프레임으로 이동하여 모든 마이크로 채널을 가로 지르는 라인 스캔을 수행하여 형광을 얻습니다픽셀 단위의 거리의 함수로서 세기 데이터를 제공한다 ( 도 6A ). 데이터를 스프레드 시트 소프트웨어로 전송하십시오.
- 각 마이크로 채널 (PH 도메인 추가 전과 후에)에서, 채널과베이스 라인을 나타내는 채널의 양쪽면에서 일부 데이터를 샘플링합니다 ( 그림 7A ).
참고 : 빈 채널의 형광 강도는 변경되지 않아야합니다. 다른 모든 채널은 빈 채널로 표준화되어 있으므로 두 개의 빈 채널이 있어야하며 형광 세기가 서로 일치해야합니다. - 아래 수식을 적용하여 데이터를 빈 채널로 정규화하십시오. 샘플 계산이 도 7B에 제공된다.
참고 : 여기서 ΔF 단백질 은 단백질 채널의 백그라운드 감산 형광 강도를 나타냅니다. Δ; F 블랭크 배경이 빈 채널의 형광 강도를 감산 나타내고, [(전후 이전에 단백질 적정 단계 이후를 참조하고, α 단백질 채널 및 빈 채널의 형광 강도의 비율 보정 계수를 나타낸다 F 단백질 / F blank ] pre )를 사용하여 측정 하였다. 형광 강도는 PH 도메인 농도의 함수로서 감소하기 때문에, 정규화 된 데이터는 음의 값을 가질 것이다. - 커브 피팅 소프트웨어 ( 재료 표 참조)를 사용하여 표준화 된 형광을 PH 도메인 농도의 함수로 플롯하고 Langmuir 등온선에 맞추십시오 ( 그림 6C ).
참고 : 여기서 ΔF 는 형광 강도의 최대 변화에 대한 형광 강도의 변화를 나타냅니다단백질의 포화 농도 ( ΔF max )가 존재할 때의 발광 강도, K d, app 는 겉보기 해리 상수를 나타내며 50 % 적용 범위의 벌크 단백질 농도 ( [PLC-δ1 PH] 막 결합 복합체)가 달성된다. 이것은 평형 기반 결합 측정이므로 정규화 된 데이터는 단순한 Langmuir 등온선에 적합하여 겉보기 실험 파라미터 Kd , app 를 추출합니다. 피팅 소프트웨어를 기반으로 PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 상호 작용에 대한 K d app 는 0.39 ± 0.05 μM입니다 ( 그림 6B ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 PIP-on-a-chip 마이크로 디바이스 ( 그림 1 ) 내에서 PLC-δ1 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 상호 작용을 연구하기 위해 pH 변조 분석을 사용했습니다. 상세한 프로토콜을 통해 마이크로 유체 소자 구성 요소를 준비 및 조립하고 소형 단층 소포 (SUV)를 만들고 ( 그림 2 ) 장치 내 SLB를 형성하고 ( 그림 3 ) PIP를 함유 한 SLB에 대한 단백질 결합을 테스트하는 방법을 시연했습니다. 일반적인 SLB 바인딩 실험의 흐름도가 그림 4에 묘사되어 있습니다. pH 조절 분석의 원리는 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 결합을 예로 들어 그림 5에 예시되어있다. 이 연구에서 얻은 결과는 PH 도메인이 PI (4,5) P 2 함유 SLB에 결합 함을 시사한다. 보다 구체적으로, 우리는 결합시에 국부적 인 pH가보다 기본이된다는 것을 관찰했다. 이 로컬 pH 변화는 그에 따라 (도 6A, 6C)를 켄칭시켰다 SLB 수 내의 입출력 SRB-POPE 형광 프로브의 존재에 의해 감지되었다. 담금질은 농도에 따라 다르며 포화 가능하므로 Langmuir 등온선에 데이터를 맞추면 0.39 ± 0.05 μM의 Kd app 가 생성됩니다 ( 그림 6B , 6D ). 산도 도메인 이후 PI (4,5) P (2)를 향해 선택성을 보였다 (도 6B) 아니오 POPC (양쪽이 온성 리피드)으로 관찰 한 결합 및 약한 (= K D의 앱 1.02 ± 0.20 μM)를 PI4P 함유 SLB 수 향해 결합. 형광 데이터가 처리되는 방법을 보여주는 샘플 계산이 포함됩니다 ( 그림 7 ). 그림 8 에서 일련의 마이크로 채널 이미지는 SLB와 마이크로 채널의 품질을 결정하는 시각적 단서를 제공합니다.
_content "fo : keep-together.within-page ="1 ">
그림 1 : 단백질 -IP 상호 작용을 연구하기위한 PIP-on-a-chip 미세 유체 장치. ( A ) 마이크로 유체 장치는 8 개의 입구와 8 개의 출구가있는 8 개의 마이크로 채널을 가지고 있습니다. 컬러 솔루션을 통해이 이미지에서 채널을 볼 수있게되었습니다. 장치는 폭 (x) 2.0cm, 높이 0.5cm (y), 길이 3.0cm (z)입니다. ( B ) 마이크로 채널의 바닥은 유리이고 반면에 벽과 천장은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)으로 구성된다. 각 마이크로 채널의 폭은 100 μm, 높이는 40 μm, 길이는 1 cm입니다. 인접한 두 마이크로 채널 사이의 간격은 40μm입니다. 지원되는 지질 이중층 (lipid bilayers, SLBs)은 유리 표면 위에 형성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 소형 단층 소포 (SUV) 준비 및 품질 관리 연구. (SRB POPE-O) 오르토 -Sulforhodamine B-포프 L-α-포스파티딜 -4- 포스페이트 (PI4P), L-α-포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 ((A) 성분은 지질 소포의 제작에 사용 PI (4,5) P (2)), 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (POPC). ( B ) 지질 vesicles의 종류 : SUV, 대형 unilamellar 소포 (LUV), 거대한 unilamellar 소포 (GUV) 및 multilamellar 소포 (MLV). SUV는 SLB 34의 준비에 가장 적합합니다. ( C ) 0.1 μm 필터를 통한 소포 후 지질 압출의 크기에 대한 동적 광 산란 (DLS) 기반 확인. 53.9 nm의 유체 역학 반경 (Rh)은 m 소포 크기 분포의 ~ 100 nm. 결과는 PI (4,5) P 2 함유 SUV의 측정 값입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 유리 지지체상의 SLB 형성. ( A ) 원하는 지질 조성의 소포를 준비하고 마이크로 채널을 통해 흐르게한다. 소포는 유리 표면에 흡착되어 변형됩니다. 임계 표면 커버리지가 달성되면, 소포가 자연적으로 파열되어 SLB를 형성한다. 참고 문헌 35 , 36 에서 채택. ( B ) 10 배 목적하에 장치 내의 SLB가 표시됩니다. Alexa 568 필터 세트 (576/603 nm에서 여기 / 방출)가 사용됩니다.ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 일반적인 SLB 바인딩 실험의 흐름도 Microfluidic 장치 구성 요소 즉, 패턴 화 PDMS 블록 및 청소 coverslips는 표면을 친수성으로 만들고 조립하기 위해 산소 플라즈마로 처리됩니다. SUV는 마이크로 채널을 통해 유입되어 SLB를 형성합니다. 과도한 소포를 제거하고 SLBs는 실행 버퍼 솔루션을 흐르는하여 실험 조건에 평형입니다. 그런 다음 단백질 희석액을 마이크로 채널을 통해 흘려 보냅니다. 마지막으로, 형광 강도 데이터는 분석, 표준화, 그리고 단백질 농도의 함수로 꾸몄다. 정규화 된 데이터는 겉보기 해리 상수 ( K d, app ) va를 추출하는 함수에 적합합니다lue. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : pH 변조 기반 감지의 원리. ( A ) PI (4,5) P 2 헤드 그룹 이노시톨 1,4,5- 트리스 포스페이트 (Ins (1,4,5) P 3 )와의 복합체에서 PLC-δ1 PH 도메인의 X 선 결정 구조 (PDB ID : 1MAI) 37 . ( B ) o SRB-POPE 탐침은 낮은 pH에서는 높은 형광성을 나타내고 pH 적정 곡선에 표시된대로 7.5 mol % PI (4,5) P 2 함유 SLB 내에서 6.7의 pKa로 높은 pH에서 급냉된다. ( C )이 연구에서 사용 된 PH 도메인은 등전점 (pI)이 8.4이므로, 실험용 pH (7.0)에서 단백질은 양전하를 띤다. 그물 긍정적 인 c를 품기단백질은 OH - 이온을 끌어 당긴다. PH 도메인이 PI (4,5) P 2 - 함유 SLB에 결합 할 때 OH - 이온을 막 표면으로 가져오고, 계면 전위가 조절되어 o SRB-POPE의 양성자 화 상태와 형광을 교대로 이동시킨다 PH 도메인 농도 의존적 방식으로 퀸치된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 : pH 조절을 통해 모니터링 된 PLC-δ1 PH- 막 결합. ( A ) 표시된 농도로 PH 도메인을 추가하기 전후의 마이크로 채널보기. ( B ) POPC, PI4P 및 PI (4,5) P 2 함유 SLB에 대한 친 화성의 비교. PH 도메인 바인딩 ~ 7.5 몰 %의 PI (4,5) P 2 함유 SLB는 0.39 ± 0.05 μM의 K d app 를 산출 하였다. 보다 약한 결합이 7.5 mol % PI4P- 함유 SLB (Kd , 1.02 ± 0.20 μM)에 대해 관찰되었으며, 순수한 POPC SLB에 대해서는 결합이 관찰되지 않았다. 오차 막대는 SEM (n = 3)을 나타낸다. 양측 t 테스트를 사용하여 PI4P와 PI (4,5) P 2 결합 (* p = 0.0396) 사이의 친 화성을 비교 하였다. ( C ) POPC, PI4P 및 PI (4,5) P 2 결합 실험에서 마이크로 채널을 가로 지르는 라인 스캔의 형광 강도를 픽셀 단위의 거리의 함수로 플롯합니다. ( D ) 표준화되고 평균화 된 POPC, PI4P, 및 PI (4,5) P 2 결합 데이터는 PLC-δ1 PH 도메인 농도의 함수로서 플롯되고 그 다음에 랭 뮤어 등온선에 적합하여 Kd , app 를 추출한다. 자세한 내용은 8.4 단계의 수식을 참조하십시오."target ="_ blank ">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 데이터 처리를위한 샘플 계산. ( A ) 빈 (단백질 없음) 및 단백질 채널에 대한 단백질 적정 라인 스캔 데이터 (형광 강도 데이터가 픽셀 단위의 거리 함수로서 제시되는) 전 (검정) 및 후 (적색). 음영 영역은 계산을 위해 데이터를 추출하는 데 사용 된 영역을 나타냅니다. 기준 형광 강도 데이터는 각 채널의 직전 및 직후에 추출됩니다. ( B ) 단백질 적정 전후의 빈 채널 및 단백질 채널에 대한 데이터가 추출됩니다. 평균은 채널 기준 및 형광 데이터 내에서 측정됩니다. 기준선 뺄셈 후, 형광 데이터는 공백 채널로 정규화된다. 자세한 내용은 8.3 단계의 수식을 참조하십시오.
도표 8 : SLBs와 microchannels의 완전성 사정. ( A ) 고품질의 SLB와 마이크로 채널을 보여주는 이미지. ( B ) 불완전 융합. ( C ) 융합 된 마이크로 채널. ( D ) 마이크로 채널 내에 갇힌 먼지 입자. ( E ) 마이크로 채널 내에 포집 된 기포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : Pattern_Design.dwgblank "> 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
각각의 PIP 변이체는 저농도 임에도 불구하고 특정 세포 소기관의 세포질 표면에 존재하며, 세포막 고유의 물리적 구성과 기능적 특이성의 형성에 기여합니다 1 . PIP를의 가장 중요한 용도 중 하나는 특정 세포 내 현지화 및 / 또는 활성화 6, 7을 필요로하는 단백질의 다수에 대한 특정 도킹 플랫폼이다. 세포 생리학 및 질병에서의 역할로 인해, 생체 관련 분야 에서 in vitro에서 protein-PIP 상호 작용을 연구하는 능력이 중요합니다. 본원에 기재된 분석 포맷은 인지질의 혼합물의 존재 하에서, 극성 머리 그룹 및 자연 길이 지방 아실 사슬의 정상적인 제시와 함께, 유체 지질 이중층의 환경에서 단백질 -PIP 상호 작용을 고려할 수있게한다.
이 분석법을 결합하여pH 시스템을 검출 시스템으로 사용하고, SLB를 마이크로 유체 플랫폼에 설정된 모델 멤브레인 시스템으로 사용하면 다른 멤브레인 바인딩 기술에 비해 고유 한 이점을 제공합니다. 우선, 마이크로 유체 플랫폼은 사용 된 단백질 및 지질 (40 nL 전체 채널 용적, 1.0 mm 2 SLB 표면적)에 대한 낮은 용적 요구 때문에 재료를 절약합니다. 또한 2 차원 멤브레인 유동성 (≥ 1.0 μm 2 / s)을 유지하면서 생리적으로 중요한 지질 조성을 사용할 수 있습니다 28 , 38 . 검출 시스템은 단백질 - 막 상호 작용뿐만 아니라 이온, 소분자, 펩타이드 - 멤브레인 상호 작용을 시험 할 수있는 ITC, SPR 및 소산 (QCM-D) 모니터링과 비교 된 개선 된 신호 대 잡음비를 제공합니다. 웰 19 , 20 , 39 , 40 세 . 또한, pH 민감 형광 프로브는 매우 안정적이며 실험 조건 19 , 20 , 41에서 광 침착하지 않습니다. 이 플랫폼의 또 다른 장점은 멤브레인 표면을 시각적으로 관찰 할 수 있다는 것입니다. 특정 상호 작용은 지질 microdomain 형성을 유도하고 및 / 또는 photobleaching (FRAP) 후 형광 복구 (각각 42 )를 통해 직접 시각화 및 / 또는 테스트 할 수있는 막 유동성에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 설명 된 분석은 형광 현미경 이상의 값 비싼 계측을 필요로하지 않습니다. 마지막으로 가장 중요하게는 리간드 / 수용체 표지가없는 막 상호 작용을 평가하면 PIP-on-a-chip 분석이 전통적인 방법보다 선호되는 방법입니다.
PIP-on-a-chip 분석은 강력한 기술이지만, 주변 막 단백질은 다를 수 있습니다양이온 및 음이온 성 잔기의 전체 조성 및 결합 부위 내 / 주위에서의 분포가 일정한 문제점을 야기한다. 일부 단백질은 PIP 결합 사이트가 많은 염기성 잔기로 구성되어있는 반면, 일부 단백질은 소수만 있습니다. 그러므로, 결합 부위에서의 H + / OH - 비율은 달라질 것이며, 결합시 국부적 인 pH의 변화의 크기도 달라질 것이다. 상호 작용의 화학 양롞 및 PIP- 결합이 다른 지질과의 상호 작용에 의해 안정화되는지 아닌지는 경우를 더 복잡하게합니다. 따라서 단백질의 pI, 특히 큰 단백질의 pI는 예상되는 형광 변화의 유일한 지표가 아닐 수도 있습니다. 일부 단백질 -IPP 상호 작용은 큰 형광 변화를 초래하지만, 나머지는 작은 형광 변화를 초래할 수 있습니다. 후자의 경우, 신호 대 잡음비를 높이기 위해 적어도 두 가지 조치를 취할 수 있습니다. 1) 이중층에서 더 큰 PIP 수준을 사용하여 단백질의 수를 늘림 r모집 OH 수가 증가하는 표면, 예를 ecruited - 이온 켄칭 O-SRB POPE 분자의 수; 2) 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 O-SRB POPE 수준을 증가시킨다.
현재의 플랫폼은 말초 막 단백질을 연구하는데 많은 이점을 제공하지만, 막 막 단백질 연구에는 몇 가지 어려움이있다. SLB- 유리지지 근접 (물 층은 지질 조성에 따라 약 1 ~ 2nm 임)로 인해, 막 횡단 단백질 - 유리지지 상호 작용은 단백질 변성을 촉진하여 기능 상실을 초래하고, 고정화 34 , 43 , 44 , 45 . 이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 방법이 개발되었는데, 예를 들어 폴리머 쿠션을 제공하기위한 유리 지지체의 표면 개질 또는 리포 폴리엔 포함SLB 유리지지 거리 34 , 46 , 47 , 48 을 증가시키기 위해 이중층 내에서 (예를 들어, PEG화된 지질) 테더를 제거한다.
고품질의 SLB를 형성하는 것은 PIP-on-a-chip 분석에서 가장 중요한 측면입니다 ( 그림 8A ). 재현성을 보장하려면 깨끗한 커버 슬립과 신선한 SUV를 사용하는 것이 좋습니다. 이로 인해 PI (4,5) P (2) 음이온 성 지질의 존재, SUV 차량은 부정적인 SUV 파열 효율을 낮추는 충전 및 막 유동성 (도 8b)에 영향된다. 따라서 SUV 용액의 pH 조절은 PI (4,5) P 2 머리말기 인산염을 양성자 화하고 파열 효율을 증가시키기 위해 유리와의 정전 기적 반발력을 감소시키는 데 중요합니다 49 , 50 . 음이온을 함유하지 않는 SUVipids, 어떤 pH 조정도 필요하지 않습니다. 또한 SUV는 산소 플라즈마 처리 및 결합 직후 채널에 주입해야하며 유리 커버 슬립 표면은 SLB 형성에 필요한 친수성을 유지해야합니다. SLB 품질 외에도 먼지 입자는 또 다른 문제를 나타냅니다. 장치 제조 과정에서 채널 사이에 갇혀있는 먼지 입자는 채널 융합을 일으킬 수있는 반면 채널 내에 갇혀있는 먼지 입자는 SLB를 손상시키고 용액 흐름 속도를 저하시킬 수 있습니다 ( 그림 8C, 8D ). 작업장을 정기적으로 청소하여 먼지를 제거해야합니다. 유사하게 채널로의 기포 노출은 어떤 단계에서나 피해야하며, 그렇지 않으면 SLB가 비가 역적으로 손상됩니다 ( 그림 8E ).
PIP-on-a-chip 분석을 계획 할 때 고려해야 할 또 다른 변수는 단백질 저장 버퍼입니다. 고농도에서 사용되는 경우, 개별 성분 (환원제, 염, 항균제, 킬레이트 시약 등 )은 형광 및 / 또는 SLB 완전성에 영향을 줄 수있다. 따라서 저장소 버퍼는 그 효과를 테스트하기 위해 적정되어야합니다. 효과가 관찰되는 경우 SLB는 형광 표류를 방지하기 위해 단백질을 적정하기 전에 저장 버퍼 조건과 평형을 유지해야합니다. 이것은 pH 변조 기반 분석법을 고려할 때, 가능한 경우 정제 된 단백질은 버퍼 불일치로 인한 형광의 표류를 최소화하기 위해 실행 버퍼 (이 경우에는 pH 7.0에서 20 mM HEPES)와 동일한 완충 성분을 함유해야합니다.
결론적으로, 우리는 pH 조절 분석이 protein-PIP 상호 작용을 조사하는데 성공적으로 사용될 수 있음을 보여 주었다. 비록 PIPs에 중점을 두었음에도 불구하고,이 플랫폼은 포스파티딜 세리와 같은 다른 생리적으로 관련된 지질을 포함하는보다 복잡한 멤브레인 시스템과의 상호 작용을 시험하는데 사용될 수 있습니다포스파티딜 에시드 (phosphatidic acid), 콜레스테롤 (cholesterol) 등 28 , 39 , 42 , 51 등이있다 . 세포 단백질 이외에도,이 분석 플랫폼은 인간의 병원균을 연구하는 사람들에게 유익 할 수 있습니다. 예를 들어, 바이러스와 박테리아에 의해 암호화 된 단백질은 세포막과 상호 작용하는 것으로 밝혀졌으며 일부는 특히 PIP 52 , 53 , 54 , 55 , 56 과 상호 작용하는 것으로 나타났습니다. 따라서, PIP-on-a-chip 분석은 단백질 -IPP 상호 작용의 저분자 억제제를 발견하고 특성화하는 수단을 제공 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
DS 및 CEC는 부분적으로는 보조금 AI053531 (NIAID, NIH)에 의해 지원되었다. SS 및 PSC는 보조금 N00014-14-1-0792 (ONR)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K.
- Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
- Lystad, A. H., Simonsen, A.
- Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
- Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
- Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
- Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
- Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
- Narayan, K., Lemmon, M. A.
- Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
- Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
- He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
- Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
- Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
- Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
- Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
- Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
- Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
- Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
- Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
- Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
- Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
- Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
- Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
- Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
- Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
- Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
- Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
- Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
- Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
- Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
- Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
- Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
- Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
- Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
- Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
- Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
- Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
- Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
- Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
- Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
- Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
- Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
- Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
- Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
- Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).
