Summary
여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.
Abstract
단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4 , 5.이 유전자의 대다수의 Orthologs 확인 되었습니다 및 그들의 세포질 기능6의 보존을 확인 하는 다양 한 유기 체에 연구. 지난 10 년간에서 연구 보여주었다 여러 autophagy 관련 단백질 복합물 및 단백질-단백질 상호 작용 및 그들은 복잡 하 고 제어 방식 autophagy 통로 지배. 교차로, 백업, 피드백, 피드 포워드 메커니즘 존재, 그리고 다른 관련된 이벤트 (예: 기공을 분 비, 리소좀 속, endosomal 정렬 및 전송7, 등)와 autophagy 조정 셀 수 미끼로 autophagy 단백질 ATG5를 사용 하 여 편견된 효 모 2 잡종 스크린에서 (ATG5는 기아에서 LC3 lipidation 중재 e 2와 같은 conjugating 시스템에 관련 된 주요 autophagy 단백질 유도 autophagy), 수용 체 활성화 확인 했습니다 C-키 1 (RACK1; GNB2L1) 강한 interactor 및 소설 autophagy 구성 요소8. 중요 한 것은, 화면이 보였다 ATG5 RACK1 상호 작용 autophagy 클래식 inducers (즉, 기아와 mTOR 억제)에 의해 autophagy 유도 불가결 이었다.
면역 형광 검사 기반 방법 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 주로 항 체 기반 하 고 상호 작용을 시각화 하 고 세포질 지 방화를 확인 하는 데 도움이. 이 기술에서는, 형광 태그 활용 된 항 체 관련 된 관심사의 단백질은 일반적으로 특정 얼룩에 사용 됩니다. 각 단백질 다른 형광 성 염료를 결합 하는 항 체와 함께 표시 될 수 있습니다. 단백질-특정 항 체를 사용 하 여 이미지 병합 되 면 신호에 겹치는 confocal 현미경 검사 법에서 단백질의 공동 지역화를 나타냅니다. 기술은 셀 이나 심지어 조직에 적용 됩니다. 면역 형광 검사 기술을 상호 역학에 대 한 단서를 제공 하 고 크기와 다른 조건9에서 세포 형태학에 있는 일반적인 변화를 추적 하는 동안 단백질 복합물의 분포를 식별 하는 데 도움이. Immunoprecipitation는 다른 일반적으로 사용 되 항 체 기반 기술 상호 작용의 분석에 대 한 수 사이 주어진 단백질10. 이 기술을 사용 하 여, 관심사의 단백질 격리 된 셀에서 또는 조직 추출 단백질 복잡 한 또는 관심사의 단백질 접촉의 강 수의 결과로 특정 항 체를 사용 하 여. 공동-immunoprecipitation, 단백질 및 그것의 공동 interactor는 검색 뿐만 아니라 두 개의 단백질 사이 상호 작용을 보여 하지만 다른 상황11에서 상호 작용의 그것의 힘을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확인 하 고 특성을 ATG5-RACK1 및 RACK1 LC3 상호 작용 하는 데 사용 된 세부 핵심 기술에 설명 합니다. 초점은 중요 한 단계 및 함정 autophagy 연구로 해결의 강조와 함께 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술에 있습니다.
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Protocol
1. 면역 형광
DMEM 높은 포도 당 매체,- 유지 HEK293T 인간 미 발달 신장 세포 및 N2A 마우스 neuroblast 셀 DMEM 낮은 포도 당 중간, 5% CO 2-37 ° c.에 습도 인큐베이터 10% 태아 소 열 비활성화 (FBS) 혈 청, 문화 미디어 보충 (50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스), 항생제 및 L-글루타민 (2mm).
- 는 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 먼저 세포 배양의 미디어 제거 다음 셀 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 되는 염 (PBS)을 세척 하 고, 트립 신 2 mL DMEM 매체를 추가 하 여 5 분 비활성화 트립 신에 대 한 37 ° C에서의 1 mL와 함께 품 어.
- Pipetting에 의해 잘 접시를 세척. 셀 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 10 µ L trypan 파랑의 혼합. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하. 그러나
- 모두 HEK293T와 N2A 부착 세포,, HEK293T 셀 쉽게 접시에서 분리. 따라서, 작동 HEK293T 셀 라인, 코트와 살 균 coverslides 필터링 0.01% 폴 리-L-리 신 셀을 뿌리기 전에.
- 10 cm 배양 접시에에서 장소 살 균 coverslides
- . 각 coverslide에 폴 리-L-리 신 솔루션의 적절 한 금액을 추가 합니다. 10 분에 대 한 폴 리-L-리 신 솔루션 coverslides를 품 어
- 폴 리-L-리 신 솔루션 제거.
참고: 폴 리-L-리 신은 재사용 가능한; 그것은 수집 하 여 추가 실험을 위해 재사용 옵션입니다. 폴 리-L-리 신 독성 때문에, 모두는 coverslides에 솔루션의 완전히 증발 될 때까지 기다립니다 그리고 폴 리-L-리 신 다음 복구. - 세척 살 균 PBS 가진 coverslides.
- RACK1-LC3
- 상호 작용 연구, Torin 1, rapamycin, 그리고 기아 autophagy inducers로 사용 되었다. 셀은 알을 품 Torin 1 3 h (250 nM 최종 농도 겠어요); rapamycin 16 h (200 nM 최종 농도 겠어요);에 대 한와 함께 그리고 얼 ' s 균형 소금 솔루션 (EBSS) 세포를 굶 어 하려면 2 h.
참고: 10 %FBS 제어 조건으로 사용 된 DMEM 부 화.
PFA 빛에 민감한 때문에, 계속 (중요 한) 접시 어둠 속에서 부 화 기간; 알루미늄 호 일 접시를 덮고 도울 수 있습니다. 또한, PFA 독성, 따라서, 증기 두건에서 셀을 수정 하는 동안 작업.
참고: 고정 단계 면역 형광 실험에서 유의 최적화 해야 합니다, 특정 항 체는 최고의 조건과 다른 고정 에이전트를 사용 하 여 작업 수 있습니다.
참고: 예를 들어 LC3 항 체 솔루션을 차단에 1: 100 희석에 사용 됩니다.
참고: 1 차적인 항 체 외피 시간 최적화 되어야 합니다. 항 체에 따라 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 바람직 있을 수 있습니다. 통에 품 어 부드럽게 하는 것이 좋습니다 (100 회전/분)는 coverslides에 항 체를 똑같이 배포.
- 샘플 통에 실 온에서 1 h를 위한 이차 항 체 해결책의 100 µ L 품 어. 이후 fluorophore 표시 된 이차 항 체는 빛에 민감한, (중요 한) 어둠 속에서 솔루션을 계속. 이차 항 체 외피 전후 동안 어둠 속에서 샘플을 배치.
참고: 사용 경험에 따라, 일부 항 체는 PBS에 의해 제거 될 수 없는 높은 배경 신호 세척. 같은 항 체, 단계 1.21, 후 처리 하는 경우 6 h 4 ° C에서 PBS에 샘플을 유지 도울 수 있습니다.
- 필요한 경우 얼룩 Hoechst, 핵 표시 같은 DNA 바인딩 염료와 셀.
- 확인
- 하나 이상의 항 체 (예, 사용 마우스와 토끼 항 체)로 얼룩을 수행할 때 항 체 사이 아무 종 반응이 다는 것.
참고: 여기에서, RACK1은 스테인드 두 번째 단백질으로 안티-RACK1 주 항 체와 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 Fluor 488 이차 항 체 위에서 언급 한 같은 농도 사용 하 여 사용 하 여.
- 분리 및 수로 셀 1.2와 1.3 단계에서 설명한.
- 는 HEK293T 셀을 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에서 각 조건에 대 한 4 백만 셀 씨. N2A 세포를 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에 5 백만 셀 씨. 37 ° C에서 CO 2 배양 기에서 세포 실험의 끝까지 품 어.
- 치료 관련 약물 또는 정의 된 기간에 대 한 조건 셀을 셀의 총 보육 시간 48 h.를 초과 하지 않는
참고:이 연구에서 immunoprecipitation 테스트에 대 한 세포 치료 Torin 1 3 h (250 nM), rapamycin 16 h (200 nM), 및 EBSS 가진 2 h. 10 %FBS 컨트롤로 셀에 추가 된 DMEM. - 후 48 h 총 보육 시간, 미디어를 제거 하 고 세포를 수확. HEK293T 셀 접시에서 쉽게 분리, 이후 얼음 접시 세척 차가운 PBS 수 있습니다 수확에 적합. 그러나, N2A 셀은 더 강한 분리; 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확 하는 데 도움이.
- Microcentrifuge 튜브에 있는 모든 셀을 수집.
- 4 ° C. 삭제는 상쾌한 세척 다시 pipetting으로 일시 중단 하 여 1 mL PBS 가진 펠 릿에서 15 분 동안 16000 x g에서 원심 분리기 샘플.
- 원심 분리기 단계를 반복 하지만 15 분에 4 ° C에서 높은 원심 분리기 속도에 상쾌한 삭제.
- 실험을 시작 하기 전에 준비 라디오 면역-강 수 분석 결과 (RIPA) 버퍼.
참고: RIPA 버퍼;의 3 종류가 있습니다. (아래 수식 참조) 하는 것을 조사 되 고 단백질의 상호 작용 강도 따라 선택 합니다.- 강한 단백질-단백질 상호 작용은, 정규 RIPA 버퍼를 선택 하십시오.
- 상호 작용은 약한 경우 가벼운 RIPA 또는 온화한 RIPA 선택.
참고: 이러한 버퍼 조리법 다음 단계에 있습니다. Immunoprecipitation 테스트에 사용 되는 모든 버퍼 protease 억제제와 함께 보충 해야 합니다.- 50 mM Tris pH 8에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염을 사용 하 여 일반 RIPA 버퍼 준비.
- 50 mM Tris pH 7.5에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 및 0.25% 나트륨 deoxycholate를 사용 하 여 가벼운 RIPA 버퍼 준비.
- 50 mM Tris pH 7.4에에서 1% 트리톤 X 100, 137 mM NaCl, 1% 글리세롤과 1mm 나트륨 orthovanadate를 사용 하 여 온화한 RIPA 버퍼 준비.
- 적절 한 RIPA 버퍼를 선택한 후 보충 protease 억제제 (RIPA +)와 버퍼. 다음, RIPA + 셀 펠 릿의 볼륨 x 3 세포를 lyse.
- 소용돌이 15에 대 한 서 스 펜 션 5 분 소용돌이 장식 5 번 반복 하 고 다음 15 분 동안 16000 x g에서 샘플 4 원심 s. 얼음에 그것을 계속 ° c.
- 깨끗 한 microcentrifuge 튜브와 나머지 세포 파편을 제거 하는 원심 분리기에는 상쾌한 전송. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 전송.
- 단백질 lysates 1시 50분을 희석 하 고 빈와 표준 96 잘 접시를 준비 합니다. 샘플 희석.
20:
- 브래드와 혼합 샘플 솔루션 1. 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.
- 595 nm 파장에서 광학 밀도 측정합니다. 각 샘플에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 단백질 농도 계산.
- 셀, 수확 전에 하루는 관심사의 단백질에 항 체와 단백질 A 플러스 구슬 커플.
- 커트가 위를 사용 하 여 200 µ L 팁의 가장자리 및 비드 슬러리에서 25 µ L를 사용 하 여 각 조건에 대 한.
- 1 mL PBS와 함께 한 번, 한 번 1 mL RIPA 버퍼와 함께 한 번 1 mL RIPA + 구슬 세척. 3300 x g, 1 분에 4 ° C에 세척 단계 수행
- 마지막 세척 후 구슬에 RIPA + 300 µ L을 추가 하 고 1.5 µ g 항 체에 내려 오게 될 단백질에 관련 된 추가.
- 품 어 회전 (20 회전/분)에 4 ° C에서 하룻밤 튜브.
참고: 여기에서, ATG5는 특정 안티-ATG5 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated.
- 항 체와 구슬의 하룻밤 배양 후 씻어 PBS와 한 번, 한 번 RIPA와 함께 한 번 RIPA + 구슬 2.12.2 단계에서 설명한 대로.
- 추가 2 mg 단백질 각 구슬에 lysate의 조건 하 고 총 볼륨 RIPA + 버퍼/튜브와 300 µ L. 4에는 회전자에 하룻밤 튜브를 품 어 ° c.
- 는 부 화 후 앞에서 설명한 구슬 (단계 2.12.2) 세척.
- 마지막 세척 후 사용 하 여 작은 피펫으로 팁 구슬 건드리지 않고 모든 상쾌한 제거.
- 염료 로드 x 3의 추가 10 µ L: 6 %SDS, 30% 글리세롤, 16% β-Mercaptoethanol, 및 1 M Tris HCl pH 6.8에서에서 0.1 %Bromophenol 블루.
- 각 조건에 대해 적어도 100 µ g 단백질 lysate를 사용 하 여 입력된 컨트롤을 준비. 물을 사용 하 여 샘플 볼륨을 균일화 하 고 염료를 로드 x 3의 적절 한 볼륨 추가.
- 10 분 동안 95 ° C에서 종 샘플
참고: 일반적으로 샘플을 끓는 때 튜브의 캡 수 저절로 열고 샘플 손실 됩니다. 특정 모자 차단제와 모자를 눌러이 문제를 방지. - 스핀 샘플 및 표준 프로토콜을 사용 하 여 그들의 크기에 따라 단백질을 SDS 페이지 젤에 부하.
참고:이 연구에서 RACK1 및 ATG5에, 샘플 12 %polyacrylamide 젤 80 V 30 분 그리고 약 90 분 동안 120 V에서 통해 실행 했다. 그러나, LC3 같은 작은 단백질에 대 한 15 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 더 적당 하다. - 젤 실행 완료 한 후 니트로 또는 PVDF 막 중 습식 또는 세미 드라이 전송 방법을 사용 하 여 단백질을 전송 합니다. 그런 다음 0.05%와 PBS에서 5% 비-지방 우유에 외피에 의해 세포 막 차단 트윈 20 (PBST) 1 h. 세척 세포 막에 대 한 실 온에서 3 시간 5 분에 대 한 PBST와
- 실 온에서 1 h에 대 한 작동 농도에서 1 차 항 체를 막 품 어. 1 차적인 항 체 희석에 대 한 사용 빨간 솔루션을 포함 하는 BSA (5% BSA Cohn V 분수, PBST, pH 7.5;에 0.02% 나트륨 아 지 드 페 놀 레드 산도 표식으로 추가 추가) 항 체의 재사용을 허용 하도록.
참고: 예를 들어 빨간색 솔루션에서 ATG5 항 체 2000 x 희석.- 보육 시간의 끝에, PBST와 3 번 막 세척.
- HRP 활용 된 이차 항 체 5% 비-지방 우유 솔루션에서 준비 했다와 막 품 어 (여기, 안티-토끼 IgG 1:10.000에서 사용 되었다). 다음 씻어 막 3 5 분에 대 한 PBST x
- 만들 ECL 솔루션: 25mm luminol, 9 mM coumaric 산, 70 mM Tris HCl pH 8.8에에서 3 x 10 -4% H 2 O 2. 각 실험에 대 한 신선한 H 2 O 2를 사용 하 여.
참고: 반응 시작 후 H 2 < /sub > O 2 추가 하 고 그것은 약 20 분 동안 계속.- 멤브레인을 품 어 고 ECL에 20 분에 대 한 영화를 x-선. 개발 하 고 어두운 방에 수정.
- 닫기 또는 중복 분자 무게 단백질의 co immunoprecipitation를 확인, 그것은 막 벗기는 버퍼에서 30 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 세포 막에서 항 체를 제거 해야 할 수 있습니다: (25mm Tris HCl pH 2와 1 %SDS).
- 반복 단계 2.20 2.23 공동-immunoprecipitation 다른 항 체를 사용 하 여 확인. 예를 들어 다음 ATG5 검출과 세포 막의 스트립, RACK1 단백질 안티-RACK1 1 차 항 체 (1:1, 000) 및 2 차 항 체 (1:10, 000)을 사용 하 여 동일한 막에 시험 되었다. Β-말라 로드 제어;로 사용 IgG 신호 immunoprecipitated 샘플 로드 제어로 사용 되었다.
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Representative Results
그림 1 공동 지역화의 예제에서에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 표시 됩니다. 우리의 최근 종이에서 그림8을표시 됩니다. 여기, 내 생 RACK1 단백질은 녹색, 스테인드 생 LC3 빨간색으로 얼룩진 했다 하는 동안. 병합 된 사진에서 관찰 되는 노란색 점 녹색과 적색 신호 사이 오버랩의 사이트를 나타냅니다. 따라서 노란색 점 들이 두 가지 단백질의 부분 공동 지역화를 나타냅니다.
그림 1 : 대표적인 면역 형광 검사 결과. HEK293T 셀 coverslides에 교양 있었다. 세포 치료 또는 rapamycin 치료 하지 않을 (Rapa, 200 nM, 16 h) Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h), 또는에 굶 어 EBSS (Stv, 2 h). 다음 내 생 단백질 안티-RACK1 및 안티 LC3 1 차 항 체를 사용 하 여 immunostained를 했다. 셀 confocal 현미경 분석 되었다. CNT, 치료 비 세포; 병합, greenand redsignals의 오버레이입니다. RACK1과 LC3 공동 지역화와 화이트 arrowsshow yellowcytoplasmic 점. 이 연구는 원래 한국측 외. 발행 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2, 내 생 immunoprecipitation 결과의 예가 표시 됩니다. 이 그림에서 ATG5 단백질 침전 했다 하 고 공동-immunoprecipitation RACK1 다른 조건 하에서 발견 되었다. 정상 토끼 혈 청 부정적인 제어로 사용 되었다.
그림 2: 대표 immunoprecipitation 결과. HEK293T 셀은 취급 하지 rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) 또는 Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h), 치료 또는 EBSS (2 시간)에 굶 어. 내 인 성 ATG5 단백질 단백질 A 플러스 구슬에 결합 되었다 안티-ATG5 항 체를 사용 하 여 셀 추출 물에서 immunoprecipitated 이었다. 안티-ATG5 및 안티-RACK1 항 체 immunoblotting 사용 되었다. 혈 청, 제어 토끼 혈 청입니다. 이 연구는 원래 한국측 외. 발행 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이러한 결과 RACK1 단백질 autophagy 경로에 관련 되어 나타냅니다. RACK1 단백질 공동 autophagy 유도 중 autophagosome 같은 구조에 LC3 단백질으로 지역화. 또한, 공동-immunoprecipitation 결과 RACK1 및 ATG5 단백질 기저 조건 에서도 작용 했다 autophagy 활성화 조건에서 상호 작용의 수준을 증가 했다. 우리는 이전 autophagic 플럭스8실험 조건 저해 하지는 lysosomal 억제제 (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin)의 유무에서 p62 저하 및 LC3 II 축적 테스트를 사용 하 여 확인 했다. 따라서, 결과 여기에 제시 하 고 다른 RACK1-ATG5 상호 작용 autophagy의 초기 단계에 대 한 중요 하다는 것을 보여주었다.
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Discussion
Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이성을 shRNA knockdowns 또는 녹아웃 셀을 사용 합니다. 또한, 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 또는 관심사의 단백질의 알려진된 유도 된 세포 치료. 항 체의 일괄 처리를 일괄 처리도 존재 합니다. 또한, 일부 polyclonal 항 체 또는 세라 높은 배경 및 일반적인 밴드 할 수도 있습니다. 이러한 밴드 중 일부는 관심사의 단백질의 다른 형태의 수 있습니다, 하지만 그들은 polyclonal 항 체 관련 된 단백질의 분에서 발생 하는 일반적 또는 그들은 일반적인 인터 있을 수 있습니다. 단일 클론 항 체 생성 된 신호는 약한 될 수 있지만 이러한 의미에서 일반적인 더 특정에 있습니다. 태그 단백질과 설립된 방지 태그 항 체와 항 체 특이성 확인 유용할 수 있습니다, 하지만 내 생 상호 작용은 아직도 더 소중 하 고 필수.
공동 지역화 또는 공동-immunoprecipitation 테스트는 결정적으로 단백질 단백질 상호 작용은 직접 설정 하지 않습니다. 추가 파트너 관찰 된 상호 작용을 중재 수 가능 하다. 실제로,에서 그림 1, RACK1 및 LC3 단백질의 부분 공동 지역화 관찰 되었다, 그들의 상호 작용;의 표시 될 수 있는 그러나, 직접 바인딩 테스트와 같은 생체 외에서 풀-다운 재조합 단백질을 사용 하 여 분석 실험 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 현미경 관찰 된 상호 작용 직접적 인지 여부를 설정 하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 한편으로, 젤 여과 같은 기술을 더 설득력 있는 방식으로 두 개 이상의 단백질을 포함 하는 복잡 한 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 도움이 됩니다. Autophagy 관점에서 면역 형광 검사 결과 대 한 더 엄격한 분석 LC3의 수의 증가 이후 모든 셀에서 LC3 autophagy 표식에 대 한 긍정적인는 점의 수를 계산 하 여 autophagy 유도 모니터링 하는 것 긍정적인 점 autophagosomes의 수와 상관 한다. Pearson의 계수, Li의 방법, 또는 Manders' 계수 검사의 사용 실험 결과의 더 나은 양적 및 비교 평가 제공 합니다.
또 다른 중요 한 점은 독립 기술 및 다른 세포를 사용 하 여 상호 작용의 유효성 검사입니다. 일부 상호 작용은 단백질 또는 단백질 overexpression의 끈 적 거 림에 관련 된 유물을 수 있습니다. 하지 신중 하 게 씻어, ATG5 단백질은 또한 immunoprecipitations (agarose 또는 sepharose 구슬)에 사용 되는 구슬에 집착 하는 경향이. 또한, 면역 형광 검사에서 단백질 overexpression autophagosomes 또는 autolysosomes 처럼 보이는 집계를 형성할 수 있다. 따라서, 일시적인 transfections 컨트롤로 transfection 효능, immunoblots, 공동 transfected 형광 단백질을 사용 하 여 수행 하는 동안 관심사의 단백질의 표정 수준은 비교 될 수 있다 형광 단백질 수준을 사용 하 여 추출 물에 특정 항, 정규화의 방법을 제공 하
이러한 모든 테스트 결과의 재현성에서는 매우 중요입니다. 우리가 얻은 결과의 확신 각 실험에 적어도 3-4 회 반복을 선호 합니다. 우리는 또한 우리의 관측 셀 형식 관련 되지 않습니다 증명 하기 위해 적어도 두 개의 다른 셀 라인에서 비슷한 실험을 수행 합니다. 또한, 올바른 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (예:, 구슬 혼자 또는 제어 항 체 및 immunoprecipitation 테스트에 대 한 혈 청) 올바른 결론에 도달을 계획 합니다. 면역 형광 검사 기술을 최적화 하는 동안 1 차적인 항 체를 생략 하면 이차 항 체만 제어 해야 유용 합니다. 이 컨트롤을 관찰, 관심사의 단백질을 기본 항 체 바인딩 및 이차 항 체의 비 특정 바인딩에서 발생 하는 신호 다는 것을 확인 하십시오.
Autophagy와 다른 생물 학적 이벤트 조절 하는 단백질 복합물의 수 발견, 증가 아직 연구 완전 한 그림을 데 까지입니다. 질량 분석 또는 생물 정보학 기반 예측 등 높은 처리 기술을 계속 여러 autophagy 관련 된 단백질, 클래식 생화학을 사용 하 여 이러한 상호 작용의 확인에 대 한 상호 작용의 네트워크를 공개 하 고 현미경 검사 법 방법이 기본적이 고 중요 한 세포질 통로의 기능 및 동적 속성을 밝히기 위해 중요 하다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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