المعروضة هنا تقنيات بحوث التفاعل القائم على جسم البروتين-بروتين اثنين: الفلورة وإيمونوبريسيبيتيشن. وتصلح هذه التقنيات لدراسة التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات لاكتشاف عناصر جديدة من مسارات الإشارات الخلوية وفهم ديناميات البروتين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دراسة لتفاعلات البروتين البروتين في البحوث أوتوفاجي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تفاعلات البروتين البروتين مهمان للشلالات فهم الإشارات الخلوية وتحديد مسار الرواية عناصر وديناميات البروتين. تتطلب معظم الأنشطة الخلوية التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات. لتحليل ورسم خريطة لهذه التفاعلات، وضعت مختلف التقنيات التجريبية، فضلا عن أدوات المعلوماتية الحيوية. أوتوفاجي هو هاتف خلوي إعادة تدوير إليه تسمح للخلايا للتعامل مع الضغوطات المختلفة، بما في ذلك الحرمان المغذيات والمواد الكيميائية، ونقص. من أجل فهم أفضل لإحداث إشارات متعلقة أوتوفاجي واكتشاف العوامل الرواية التي تنظم البروتين المجمعات في أوتوفاجي، نحن أداء شاشات التفاعل البروتين-بروتين. التحقق من هذه النتائج الفرز يتطلب استخدام الفلورة والتقنيات إيمونوبريسيبيتيشن. في هذا النظام، تم اختبار محددة تتعلق أوتوفاجي البروتين-بروتين التفاعلات التي اكتشفنا في Neuro2A (N2A) وخطوط الخلايا HEK293T. وأوضح تفاصيل الإجراءات التقنية المستخدمة في هذه الورقة تجربة تصور.
المقدمة
ماكرووتوفاجي (أوتوفاجي، هنا) هو إليه إجهاد خلوية التي تتميز بعزل معظم السيتوبلازم والبروتينات والعضيات في غشاء مزدوج حويصلات تسمى الحويصلات أوتوفاجيك. من خلال انصهار الطبقة الخارجية من الغشاء مزدوجة، الحويصلات أوتوفاجيك وحمولتها يتم تسليمها إلى lysosomes والمتدهورة فيه1. أوتوفاجي يحدث في تدني المستويات القاعدية في جميع أنواع الخلايا وفي جميع الكائنات الحية، يؤدون وظائف التماثل الساكن مثل تدهور البروتين ودوران عضية (مثلاً، الميتوكوندريا). تحت الظروف التي تؤدي إلى إجهاد الخلوية، مثل الجوع، أوتوفاجي هو سرعة upregulated ويسمح للخلية للحفاظ على مستويات الطاقة والايض الأساسية1،،من
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الفلورة
- HEK293T الحفاظ على الكلي الجنينية البشرية الخلايا في متوسط ارتفاع الجلوكوز دميم، و N2A الماوس نيوروبلاست الخلايا في دميم منخفض متوسط الجلوكوز، في شركة 5% 2-حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية. تكملة وسائط الثقافة مع المصل 10% معطل الحرارة الجنين من الأبقار (FBS)، المضادات الحيوية (البنسلين U/mL 50، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين)، ولام الجلوتامين (2 مم)-
- فصل الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. أولاً قم بإزالة وسائط ثقافة الخلية ثم تغسل الخلايا مع 10 مل العقيمة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) واحتضان مع 1 مل التربسين في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إيناكتيفاتي التربسين بإضافة 2 مل دميم المتوسطة- أغسل
- اللوحة جيدا من قبل بيبيتينج. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1 مثال الترجمة المشارك النتيجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. ويرد هذا رقم من ورقتنا الأخيرة8. هنا، كان الذاتية RACK1 البروتين الملون باللون الأخضر، بينما LC3 الذاتية كان الملون باللون الأحمر. تشير النقاط الصفراء التي تلاحظ في الصور المدمجة إلى مواقع التداخل بين الإشارات الخضراء والحمراء. وهكذا تمثل النقاط الصفراء التعريب المشارك جزئية من هذه البروتينات اثنين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنيات إيمونوبريسيبيتيشن والفلوره ذات أهمية حاسمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. على الرغم من أن يشيع استخدام هذه التقنيات اثنين وراسخة، ينبغي النظر عدة معايير لتحديد نوعية التجارب أثناء استخدام هذه التقنيات.
ينبغي أن تكون أجسام أولاً، الأولية المستخدمة في هذه الاختبارات محددة للبروتينات للفائدة. ولضمان ذلك، استخدم شرنا كنوكدوونس أو الخلايا بالضربة القاضية لاختبار خصوصية الجسم في السؤال. بالإضافة إلى ذلك، استخدام عناصر إيجابية، أو التعامل مع الخلايا التي تحتوي محفز معروف من بروتين الفائدة. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل العلمية والتكنولوجية أبحاث المجلس من تركيا (توبيتاك) 1001 107T153 منحة، جامعة سابانجى. سيب و NMK تدعمها توبيتاك 2211 بدب منحة دراسية لدراسات الدكتوراه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Trypsin EDTA Solution A | للصناعات البيولوجية | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (ارتفاع الجلوكوز) | Sigma ؛ | 5671 | |
| DMEM (منخفض الجلوكوز) | سيجما | 5546 | |
| تريبان بلو | سيجما | T8154 | |
| مقياس الدم | سيجما | Z359629-1EA | |
| coverslides | جينا بيوساينس | CSL-103 | |
| شرائح | Isolab | I.075.02.005 | |
| بولي إل ليسين | سيجما | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| بارافورمالدهيد (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 الأجسام المضادة | Sigma | L7543 | |
| المضادة للأرانب IgG Alexa Fluor 568 | ؛ Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 الأجسام المضادة | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-17754 | |
| مكافحة الماوس IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| كلوريد الصوديوم | Applichem | A9242.5000 | |
| ديوكسي كولات الصوديوم | Sigma | 30970 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X & nbsp ؛ | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 الأجسام المضادة | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| & beta ; -Mercaptoethanol ; | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| الحليب الخالي من الدسم | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| مضاد للأرانب IgG ، HRP مترافق | جاكسون إيمون. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| حمض الكومريك | Sigma | C9008 | |
| بيروكسيد الهيدروجين | Merck | K35522500604 | |
| مضاد للفأر IgG ، HRP مترافق | جاكسون إيمون. | 115035003 | |
| &-الأجسام المضادة للأكتين | سيجما | A5441 | |
| مصل الأرانب العادي | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| بروتين A-Agarose الخرز | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-2001 | |
| مصل الأبقار الجنينية | Biowest | S1810-500 | |
| محلول البنسلين / الستربتومايسين | الصناعات البيولوجية ؛ | 03-031-1B | |
| L-glutamine ؛ | الصناعات البيولوجية | BI03-020-1B | |
| برادفورد سوليشن | سيجما | 6916 | |
| غشاء النيتوسليلوز | أفلام الأشعة السينية A10083108 | ||
| Healthcare | Fujifilm | 47410 19289 | |
| مثبط البروتياز | Sigma | P8340 |
المراجع
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
