Summary
المعروضة هنا تقنيات بحوث التفاعل القائم على جسم البروتين-بروتين اثنين: الفلورة وإيمونوبريسيبيتيشن. وتصلح هذه التقنيات لدراسة التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات لاكتشاف عناصر جديدة من مسارات الإشارات الخلوية وفهم ديناميات البروتين.
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين مهمان للشلالات فهم الإشارات الخلوية وتحديد مسار الرواية عناصر وديناميات البروتين. تتطلب معظم الأنشطة الخلوية التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات. لتحليل ورسم خريطة لهذه التفاعلات، وضعت مختلف التقنيات التجريبية، فضلا عن أدوات المعلوماتية الحيوية. أوتوفاجي هو هاتف خلوي إعادة تدوير إليه تسمح للخلايا للتعامل مع الضغوطات المختلفة، بما في ذلك الحرمان المغذيات والمواد الكيميائية، ونقص. من أجل فهم أفضل لإحداث إشارات متعلقة أوتوفاجي واكتشاف العوامل الرواية التي تنظم البروتين المجمعات في أوتوفاجي، نحن أداء شاشات التفاعل البروتين-بروتين. التحقق من هذه النتائج الفرز يتطلب استخدام الفلورة والتقنيات إيمونوبريسيبيتيشن. في هذا النظام، تم اختبار محددة تتعلق أوتوفاجي البروتين-بروتين التفاعلات التي اكتشفنا في Neuro2A (N2A) وخطوط الخلايا HEK293T. وأوضح تفاصيل الإجراءات التقنية المستخدمة في هذه الورقة تجربة تصور.
Introduction
ماكرووتوفاجي (أوتوفاجي، هنا) هو إليه إجهاد خلوية التي تتميز بعزل معظم السيتوبلازم والبروتينات والعضيات في غشاء مزدوج حويصلات تسمى الحويصلات أوتوفاجيك. من خلال انصهار الطبقة الخارجية من الغشاء مزدوجة، الحويصلات أوتوفاجيك وحمولتها يتم تسليمها إلى lysosomes والمتدهورة فيه1. أوتوفاجي يحدث في تدني المستويات القاعدية في جميع أنواع الخلايا وفي جميع الكائنات الحية، يؤدون وظائف التماثل الساكن مثل تدهور البروتين ودوران عضية (مثلاً، الميتوكوندريا). تحت الظروف التي تؤدي إلى إجهاد الخلوية، مثل الجوع، أوتوفاجي هو سرعة upregulated ويسمح للخلية للحفاظ على مستويات الطاقة والايض الأساسية1،،من23.
وقد تم استنساخ الجينات أوتوفاجي حوالي 30 من الخميرة ومنتجاتها البروتين عرضت القيام بدور في مراحل مختلفة من عملية أوتوفاجيك، بما في ذلك التنو حويصلة، التوسع، والانصهار حويصلة دخلول/يحلول الراحل، وتردي البضائع 4 , 5-أورثولوجس الأغلبية من هذه الجينات قد حددت وأكدت الدراسات في الكائنات المختلفة الحفاظ على تلك الوظائف الخلوية6. في العقد الماضي أظهرت الدراسات أن عدة متعلقة أوتوفاجي البروتين المجمعات وتفاعلات البروتين البروتين موجودة، وأنها تحكم مسارات أوتوفاجي بطريقة معقدة والتي تسيطر عليها. التقاطعات والنسخ الاحتياطية، والتغذية المرتدة، وآليات feedforward موجودة، وأنها تسمح للخلية بتنسيق أوتوفاجي مع الأحداث الأخرى ذات الصلة (مثل إفراز حويصلية، يحلول نشوء حيوي، اندوسومال الفرز والنقل7، إلخ) في شاشة غير متحيزة اثنين والخميرة هجين استخدام البروتين أوتوفاجي ATG5 كطعم، (ATG5 هو بروتين أوتوفاجي رئيسية المنخرطة في نظام التصريف مثل E2 الذي يتوسط ليبيديشن LC3 في المجاعة الناجمين عن أوتوفاجي)، حددنا "المنشط مستقبلات" ج-كيناز 1 (RACK1؛ GNB2L1) إينتيراكتور قوية و مكون أوتوفاجي رواية8. الأهم من ذلك، أظهرت الشاشة أن التفاعل ATG5-RACK1 لا غنى عنه لتحريض أوتوفاجي من أوتوفاجي الكلاسيكي مستحثات (تثبيطأيوالتجويع و mTOR).
الأساليب المستندة إلى الفلورة تستخدم عادة لرصد تفاعلات البروتين البروتين. هذه التقنيات المستندة أساسا إلى جسم، وتساعد على تصور التفاعلات وتأكيد تعريب الهاتف الخلوي. في هذا الأسلوب، علامة نيون مترافق الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات للفائدة تستخدم عموما لتلوين المحددة. قد يكون المسمى كل البروتين مع الأجسام المضادة بالإضافة إلى الأصباغ الفلورية مختلفة. استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين، يشير إلى وجود تداخل في الإشارات عندما يتم دمج الصور التعريب المشارك من البروتينات تحت المجهر [كنفوكل]. هذا الأسلوب ينطبق على الخلايا أو الأنسجة حتى. تقنيات الفلورة تقديم أدلة حول ديناميات التفاعل، والمساعدة في تحديد حجم وتوزيع البروتين المجمعات، بينما تتبع التغيرات العامة في مورفولوجيا الخلوية تحت ظروف مختلفة9. إيمونوبريسيبيتيشن هي آخر تقنية تستند إلى جسم استخداماً يسمح لتحليل التفاعلات بين إعطاء البروتينات10. باستخدام هذا الأسلوب، البروتينات ذات الاهتمام معزولة من الخلايا أو تستخرج الأنسجة باستخدام أجسام مضادة محددة، أسفر هطول الأمطار البروتينات الموجودة في مجمع أو على اتصال بروتين للفائدة. Co-إيمونوبريسيبيتيشن، حيث يتم الكشف عن البروتين وبه إينتيراكتور المشارك، يكشف ليس فقط بالتفاعل بين البروتينات اثنين، ولكن يمكن قياس قوتها التفاعل تحت ظروف مختلفة11.
ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل التقنيات الرئيسية التي استخدمت لتأكيد وتميز تفاعل ATG5-RACK1 و RACK1-LC3. يتم التركيز على تقنيات الفلورة وإيمونوبريسيبيتيشن، مع التركيز على الخطوات الحاسمة والمزالق للبحث أوتوفاجي، فضلا عن اقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الفلورة
- HEK293T الحفاظ على الكلي الجنينية البشرية الخلايا في متوسط ارتفاع الجلوكوز دميم، و N2A الماوس نيوروبلاست الخلايا في دميم منخفض متوسط الجلوكوز، في شركة 5% 2-حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية. تكملة وسائط الثقافة مع المصل 10% معطل الحرارة الجنين من الأبقار (FBS)، المضادات الحيوية (البنسلين U/mL 50، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين)، ولام الجلوتامين (2 مم)-
- فصل الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. أولاً قم بإزالة وسائط ثقافة الخلية ثم تغسل الخلايا مع 10 مل العقيمة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) واحتضان مع 1 مل التربسين في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إيناكتيفاتي التربسين بإضافة 2 مل دميم المتوسطة- أغسل
- اللوحة جيدا من قبل بيبيتينج. إزالة 10 ميليلتر من حل الخلية ومزجها مع 10 ميليلتر من تريبان الأزرق. حساب عدد الخلايا الحية باستخدام هيموسيتوميتير.
- HEK293T كل و N2A خطوط الخلايا ملتصقة، ومع ذلك، فصل الخلايا HEK293T من اللوحة بسهولة. ولذلك، إذا كان يعمل مع خط الخلية HEK293T، تصفية معطف كوفيرسليديس مع العقيمة 0.01 ٪ بولي-L-يسين قبل البذر الخلايا.
- كوفيرسليديس مكان العقيمة في 10 سم طبق بيتري. إضافة كمية مناسبة من محلول بولي-L-يسين على كل كوفيرسليدي. احتضان كوفيرسليديس مع الحل بولي-L-يسين للحد الأدنى 10
- إزالة الحل بولي-L-يسين-
ملاحظة: بولي-L-يسين إعادة استخدامها؛ اختياري لجمع وإعادة استخدامه لإجراء مزيد من التجارب. ولما السامة بولي-L-يسين، الانتظار حتى يتبخر كل من الحل في كوفيرسليديس تماما، واسترداد ثم بولي-L-يسين- - أغسل كوفيرسليديس مع PBS العقيمة.
- إضافة 1 مل دميم في كل من لوحة 12-جيدا جيدا. ضع كوفيرسليدي في كل بئر-
- 20,000 بذور الخلايا/حسنا، قطره قطره بينما تهز اللوحة لتوزيع متجانس للخلايا على كوفيرسليديس في الوقت نفسه. إبقاء الخلايا في الشركة حاضنة 2 في 37 درجة مئوية وإضافة المخدرات حيث أن فترة حضانة إجمالي لا يتجاوز ح 48، أي ح 3 العلاج Torin، إضافة الدواء في ح 45 وظيفة البذر.
واستخدمت دراسات التفاعل
- عن RACK1-LC3، Torin 1، ربمسن، والتجويع مستحثات أوتوفاجي. كانت الخلايا المحتضنة مع Torin 1 ح 3 (250 نيوتن متر نهائي تركيز)؛ مع ربمسن ح 16 (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي تركيز)؛ ومع إيرل ' s متوازن الملح الحل (ابس) ح 2 بغية تجويع الخلايا.
ملاحظة: حضانة في دميم مع 10% FBS كحالة التحكم-
- عن RACK1-LC3، Torin 1، ربمسن، والتجويع مستحثات أوتوفاجي. كانت الخلايا المحتضنة مع Torin 1 ح 3 (250 نيوتن متر نهائي تركيز)؛ مع ربمسن ح 16 (200 شمال البحر الأبيض المتوسط النهائي تركيز)؛ ومع إيرل ' s متوازن الملح الحل (ابس) ح 2 بغية تجويع الخلايا.
- بعد 48 ساعة من الحضانة مجموع الوقت، قم بإزالة وسائط الإعلام على كوفيرسليديس وغسلها مع 1 مل برنامج تلفزيوني-
- لإصلاح الخلايا، واحتضان الخلايا مع 1 مل الجليد الباردة العقيمة التي تمت تصفيتها 4% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4)، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أي تحريض.
منذ PFA حساس للضوء، تبقى (مهم) اللوحة في الظلام أثناء فترة الحضانة؛ وقد تساعد تغطي اللوحة مع رقائق الألومنيوم. وعلاوة على ذلك، منهاج العمل السامة، وبالتالي، العمل تحت غطاء دخان أثناء تحديد الخلايا.
ملاحظة: أن نأخذ في الاعتبار أن التثبيت خطوة في تجارب الفلورة ينبغي أن يكون الأمثل، كما قد تعمل أجسام مضادة محددة أفضل استخدام تثبيت مختلف العوامل والظروف- - بعد 20 دقيقة من حضانة منهاج عمل بيجين، قم أولاً بإزالة الحل منهاج عمل بيجين على كوفيرسليديس ويغسل كل عينة 3 مرات مع 1 مل العقيمة التي تمت تصفيتها PBS. في هذه الخطوة، (مهم) غسل الآبار واحدة تلو الأخرى حتى لا يؤدي إلى السماح لهم الجافة. تجنب تجفيف نظراً لأنها سوف تتداخل مع ردود لاحقة من الخلايا وتغيير مورفولوجية الخلية وزيادة إشارات غير محددة.
- عند اكتمال الغسيل، تبقى العينات في 1 مل برنامج تلفزيوني على مدت
- إعداد حل حظر: برنامج تلفزيوني مع صابونين ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1% 0.1%-
- تغطية صفيحة 6-جيدا مع الفيلم البارافين. تأكد من أن أسفل لوحة السلس بعد تغطية الفيلم البارافين. تسمية لوحة 6-جيدا-
- باستخدام الملقط، نقل كوفيرسليديس من لوحات 12-جيدا إلى لوحات 6-بئر مغطاة بفيلم البارافين. تجاهل برنامج تلفزيوني في كوفيرسليديس
- وإضافة 100 ميليلتر من عرقلة الحل على كل كوفيرسليدي بيرميبيليزيشن. احتضان هذه العينات في الثلج للحد الأدنى 30
- إعداد جسم أساسي في عرقلة الحل. قبل التجارب، تحسين تخفيف جسم لتحديد تركيزات العامل أفضل لتلطيخ.
ملاحظة: على سبيل المثال، يستخدم جسم LC3 في إضعاف 1: 100 في عرقلة الحل. - بعد الحضانة و 30 دقيقة، تجاهل حل حظر وغسل العينات بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مرة.
- إضافة 100 ميليلتر من حل جسم الأولية لكل كوفيرسليدي. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة ح 1، على شاكر.
ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل في وقت الحضانة مع جسم الأولية. اعتماداً على الأجسام المضادة، قد يكون من الأفضل حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. فمن الأفضل أن تبني على شاكر لطف (100 تناوب/دقيقة) توزيعها بالتساوي الجسم على كوفيرسليديس. - بعد الحضانة مع جسم الأولية، يغسل عينات فردية، 3 مرات مع 1 مل برنامج تلفزيوني- 1: 500
- تحضير جسم الثانوية في عرقلة الحل (أمثل لتخفيف جسم الثانوي قد يكون ضروريا). هنا، كأرنب المضادة مفتش أليكسا فلور 568 جسم أرنب المضادة ثانوية-
- احتضان العينات مع 100 ميليلتر حل جسم الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة على شاكر. نظراً للأجسام المضادة الثانوية المسمى فلوروفوري (مهم) حساسة الضوء، ويبقى الحل في الظلام. وضع العينات في الظلام أثناء وبعد تفريخ جسم الثانوية-
- بعد الاحتضان جسم الثانوية، تغسل اللوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: بعض الأجسام المضادة بايد بناء على التجربة، وقد الإشارات الخلفية العالية التي لا يمكن القضاء عليها من خلال برنامج تلفزيوني يغسل. إذا التعامل مع مثل هذه جسم مضاد، بعد الخطوة 1، 21، قد يساعد في حفظ العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية عن ح 6.- إذا لزم الأمر، وصمة عار الخلايا مع صبغة الحمض النووي ملزمة، مثل هويشت، احتفالا النوى-
- بوصمة عار أكثر من البروتين، تطبيق نفس الإجراء بدءاً من الخطوة 1، 16 للبروتين الثاني-
- تأكد أن هناك لا مفاعليه الأنواع بين الأجسام المضادة عند القيام بتلوين بجسم واحد أو أكثر (مثلاً، استخدام الماوس والارنب أجسام مضادة).
ملاحظة: هنا، RACK1 هو الملون كالبروتين الثاني باستخدام الأجسام المضادة RACK1 المضادة الأولية والماوس المضادة مفتش 488 فلور أليكسا الثانوي الأجسام المضادة باستخدام نفس التركيزات المذكورة أعلاه-
- تأكد أن هناك لا مفاعليه الأنواع بين الأجسام المضادة عند القيام بتلوين بجسم واحد أو أكثر (مثلاً، استخدام الماوس والارنب أجسام مضادة).
- إعداد الحل التركيب: 50% والغليسيرول في برنامج تلفزيوني 1 x. عامل التصفية من خلال عامل تصفية ميكرومتر 22- مسح الشرائح مع الإيثانول باستخدام مسح خالية من الوبر
- وإضافة 10 ميليلتر تصاعد الحل لكل شريحة. استخدام الملاقط، مكان في كوفيرسليديس على كل دروبسو أن الجانب مع الخلايا في اتصال مباشر مع المتوسطة المتصاعدة. تجاهل الحل تركيب الزائدة برفق باستخدام مناديل خالية من الوبر. ختم
- كوفيرسليديس مع طلاء الأظافر شفاف. أولاً، الاستقرار في كوفيرسليديس بإضافة قطرات من طلاء الأظافر على حواف 4 وثم ختم لهم تماما.
- تحليل العينات تحت مجهر فلوري أو [كنفوكل] آق رب وقت ممكن، نظراً لإشارة الفلورية قد التبييض بعد ساعات قليلة.
- فصل وعدد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2 و 1.3.
- إذا كان يعمل مع الخلايا HEK293T، وبذور الخلايا 4 مليون لكل شرط في أطباق بتري 15 سم. إذا كان العمل مع الخلايا N2A، البذور 5 مليون من الخلايا في أطباق بتري 15 سم. احتضان الخلايا في حاضنة 2 CO في 37 درجة مئوية حتى نهاية التجربة.
- علاج الخلايا مع العقاقير ذات الصلة أو شروط لمدة محددة بحيث لا تتجاوز فترة حضانة مجموع الخلايا 48 h.
ملاحظة: للاختبارات إيمونوبريسيبيتيشن في هذه الدراسة، تعامل الخلايا ح 3 مع Torin 1 (250 نيوتن متر)، ح 16 مع ربمسن (200 nM)، وح 2 مع ابس. دميم بنسبة 10% FBS أضيفت إلى الخلايا كعنصر التحكم- - ح بعد 48 من حضانة مجموع الوقت، قم بإزالة الوسائط وحصاد الخلايا. منذ فصل خلايا HEK293T بسهولة من اللوحة، الغسيل صفيحة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني قد تكون كافية للحصاد. ومع ذلك، الخلايا N2A أكثر مقاومة لمفرزة؛ استخدم كاشطات خلية لمساعدة حصاد الخلايا.
- جمع كافة الخلايا في أنابيب ميكروسينتريفوجي.
- عينات من أجهزة الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° جيم تجاهل المادة طافية ويغسل بيليه مع 1 مل برنامج تلفزيوني بإعادة تعليق من قبل بيبيتينج-
- كرر الخطوة أجهزة الطرد المركزي، ولكن على أعلى سرعة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة تجاهل المادة طافية.
- المخزن المؤقت المقايسة المناعية-ترسيب الإذاعة إعداد (ريبا) قبل البدء في التجربة.
ملاحظة: هناك 3 أنواع من المخزن المؤقت للمعهد الملكي؛ اختر وفقا لشدة تفاعل البروتينات قيد التحقيق (انظر الصيغ أدناه).- إذا كان هناك تفاعل قوي من بروتين بروتين، اختر المخزن المؤقت ريبا العادية-
- إذا كان التفاعل ضعيفا، اختر أما ريبا معتدل أو ريبا أكثر اعتدالا.
ملاحظة: الوصفات لهذه المخازن المؤقتة في الخطوات التالية. وينبغي أن تستكمل كافة المخازن المؤقتة التي يتم استخدامها في الاختبارات إيمونوبريسيبيتيشن مع مثبطات البروتياز.- إعداد "المخزن المؤقت ريبا" العادية باستخدام 1% NP-40 150 مم كلوريد الصوديوم، deoxycholate الصوديوم 0.5% والصوديوم 0.1% دوديسيل كبريتات في 50 ملم تريس pH 8-
- إعداد معتدل "ريبا المخزن المؤقت" استخدام ديوكسيتشولاتي الصوديوم NP-40 و 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.25% 1% في 50 ملم تريس pH 7.5.
- إعداد "المخزن المؤقت ريبا" أكثر اعتدالا باستخدام 1 تريتون-X 100 ٪، 137 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 1% وأورثوفاناداتي الصوديوم 1 مم في 50 ملم تريس الأس الهيدروجيني 7.4.
- بعد اختيار المخزن المؤقت ريبا المناسبة، تكملة المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز (RIPA +). ثم، الخلايا التي تحتوي على 3 × حجم الخلية بيليه في المعهد الملكي +-
- دوامة تعليق 15 س. يبقيه على الجليد للحد الأدنى 5 تكرار دوامة والجليد 5 مرات وثم الطرد المركزي هذه العينات في س 16,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة والطرد المركزي لإزالة بقايا خلية الحطام. نقل المادة طافية في أنبوب نظيف. تمييع البروتين ليساتيس 01:50
- وإعداد لوحة 96-جيدا مع فارغة والمعايير. تمييع العينات.
- العينات ميكس مع برادفورد الحل 01:20. احتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام-
- قياس الكثافة البصرية عند الطول الموجي نانومتر 595. حساب تركيز البروتين باستخدام قيم امتصاص لكل عينة.
- يوم قبل الحصاد في الخلايا، والزوجين الخرز "أ بالإضافة إلى" البروتين مع الأجسام المضادة التي محددة لبروتين الفائدة.
- قطع حافة تلميح 200 ميليلتر استخدام مقص واستخدام 25 ميليلتر من الملاط حبة لكل شرط. أغسل
- الخرز مرة واحدة مع 1 مل برنامج تلفزيوني ومرة مع 1 مل ريبا المخزن المؤقت، ومرة مع 1 مل ريبا +. القيام بخطوات الغسيل في 3,300 س ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 1
- بعد الغسيل الأخير، إضافة 300 ميليلتر من المعهد الملكي + في الخرز وإضافة 1.5 ميكروغرام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين ليتم سحبها إلى أسفل.
- احتضان هذه الأنابيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دوار (تناوب 20/دقيقة)-
ملاحظة: هنا، كان ATG5 إيمونوبريسيبيتاتيد باستخدام الأجسام المضادة المحددة-ATG5-
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها من الخرز مع الجسم، تغسل حبات مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومرة مع المعهد الملكي، ومرة مع المعهد الملكي + كما هو موضح في الخطوة 2.12.2.
- إضافة 2 ملغ من البروتين على الخرز لكل حالة وإكمال الحجم الإجمالي إلى 300 ميليلتر مع المعهد الملكي + المخزن المؤقت/أنبوب. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في دوار عند 4 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، تغسل حبات كما تم وصفه سابقا (الخطوة 2.12.2)-
- بعد الغسيل الأخير، استخدام تلميح بيبيت أصغر لإزالة جميع المادة طافية دون لمس الخرز.
- إضافة 10 ميليلتر من 3 × تحميل صبغ: الحزب الديمقراطي الصربي 6% و 30% والغليسيرول، 16% β-Mercaptoethanol و 0.1% بروموفينول الأزرق في م 1 تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8.
- إعداد عناصر تحكم الإدخال باستخدام البروتين على الأقل 100 ميكروغرام ليساتي لكل حالة. مساواة حجم العينة باستخدام المياه وإضافة حجم 3 × تحميل صبغ المناسبة.
- عينات يغلي عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10
ملاحظة: عادة عند الغليان العينات، يمكن فتح أغطية الأنابيب عفويا وعينات تضيع. تجنب هذا بعقد قبعات مغلقة مع حظر الإطارات سقف محدد. - تدور على عينات والتحميل على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الهلام لفصل البروتينات حسب أحجامها باستخدام البروتوكولات القياسية.
ملاحظة: في هذه الدراسة في RACK1 و ATG5، تم تشغيل عينات من خلال 12% polyacrylamide المواد الهلامية في 80 الخامس لمدة 30 دقيقة، ومن ثم في 120 الخامس لحوالي 90 دقيقة. أصغر من البروتينات مثل LC3، استخدام المواد الهلامية polyacrylamide 15% غير مناسبة أكثر. - بعد اكتمال هلام قيد التشغيل، نقل البروتينات إلى النيتروسليلوز أو الأغشية PVDF باستخدام أما أساليب نقل الرطب أو الجاف لشبه. ثم، كتلة الأغشية بالحضانة في الحليب غير الدسم 5% في برنامج تلفزيوني مع 0.05% توين 20 (ببست) في درجة حرارة الغرفة للأغشية يغسل حاء – 1 3 مرات مع ببست للحد الأدنى 5
- احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية في تركيزات العامل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. لتخفيف جسم الرئيسي، استخدم جيش صرب البوسنة الذي يحتوي على الحلول أحمر (5% "جزء الخامس كوهن جيش صرب البوسنة"، وأزيد الصوديوم 0.02% في ببست، درجة الحموضة 7.5؛ إضافة الفينول الأحمر أضيف كعلامة الرقم الهيدروجيني) للسماح بإعادة استخدام الأجسام المضادة.
ملاحظة: على سبيل المثال، تضعف جسم ATG5 x 2,000 في الحل أحمر.- في نهاية فترة الحضانة، غسل الأغشية 3 مرات مع ببست.
- احتضان الأغشية مع مترافق HRP الثانوي الأجسام المضادة التي تم إعدادها في حل الحليب غير الدسم 5% (هنا، استخدمت أرنب المضادة مفتش في شباب). ثم يغسل في الأغشية 3 x مع ببست للحد الأدنى 5
- جعل الحل القامة: لومينول 25 مم، وعيار 9 ملم حمض coumaric، 3 × 10 -4% ح 2 س 2 في 70 ملم تريس-HCl pH 8.8. استخدام الطازجة ح 2 س 2 لكل تجربة.
ملاحظة: رد فعل يبدأ بعد ح 2 إضافة 2 س، وأنه ما زال لحوالي 20 دقيقة. احتضان الأغشية- والأشعة السينية الأفلام لمدة 20 دقيقة في القامة. تطوير وإصلاح هذه المشكلات في غرفة مظلمة.
- للتحقق من الشركة إيمونوبريسيبيتيشن البروتينات مع إغلاق أو تداخل الأوزان الجزيئية، أنه قد يكون من الضروري على تجريد الأجسام المضادة قبالة الأغشية التي تفرخ في الأغشية عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت لتجريد: (25 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 2 والحزب الديمقراطي الصربي 1%).
- كرر الخطوات 2.20 إلى 2.23 للتحقق من co-إيمونوبريسيبيتيشن باستخدام الأجسام المضادة المختلفة. على سبيل المثال، في أعقاب الكشف عن ATG5 وتجريد الأغشية، تم اختبار البروتين RACK1 على الأغشية نفس استخدام جسم RACK1 المضادة أساسي (1:1، 000) والأجسام المضادة الثانوية (01:10، 000). Β-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل; وتستخدم إشارة مفتش كعنصر تحكم تحميل عينات إيمونوبريسيبيتاتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1 مثال الترجمة المشارك النتيجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. ويرد هذا رقم من ورقتنا الأخيرة8. هنا، كان الذاتية RACK1 البروتين الملون باللون الأخضر، بينما LC3 الذاتية كان الملون باللون الأحمر. تشير النقاط الصفراء التي تلاحظ في الصور المدمجة إلى مواقع التداخل بين الإشارات الخضراء والحمراء. وهكذا تمثل النقاط الصفراء التعريب المشارك جزئية من هذه البروتينات اثنين.
الشكل 1 : نتائج الفلورة الممثل. تم استزراع الخلايا HEK293T في كوفيرسليديس. تعامل أو لا تعامل مع ربمسن الخلايا (رابا، 200 نانومتر، ح 16) 1 Torin (Torin، شمال البحر الأبيض المتوسط 250، ح 3)، أو جوعاً في ابس (Stv، ح 2). ثم كانت البروتينات الذاتية إيمونوستينيد باستخدام الأجسام المضادة الأولية RACK1 المضادة ومكافحة LC3. وجرى تحليل الخلايا تحت مجهر [كنفوكل]. المركز الوطني للاستشعار، الخلايا غير المعالجة؛ دمج، تراكب ريدسيجنالس جريناند. أبيض أرووسشوو ييلووسيتوبلاسميك النقاط مع التعريب المشارك RACK1 و LC3. هذا البحث تم نشرة في الأصل باربيل et al. 8 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويرد في الشكل 2، مثال على نتيجة إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية. في هذا الشكل، عجل البروتين ATG5 وتم الكشف عن RACK1 co-إيمونوبريسيبيتيشن تحت ظروف مختلفة. واستخدمت المصل الأرنب العادي كعنصر سلبي.
رقم 2: نتائج الممثل إيمونوبريسيبيتيشن. خلايا HEK293T كانت تعامل أو لا تعامل مع ربمسن (رابا، 200 نانومتر، ح 16) أو 1 Torin (Torin، شمال البحر الأبيض المتوسط 250، ح 3)، أو جوعاً في ابس (ح 2). وكان الذاتية ATG5 البروتين إيمونوبريسيبيتاتيد من مقتطفات الخلية باستخدام الأجسام المضادة ATG5 المضادة التي اقترنت بالخرز "أ بالإضافة إلى" البروتين. استخدمت الأجسام المضادة ATG5 ومكافحة RACK1 إيمونوبلوتينج. المصل، تحكم أرنب المصل. هذا البحث تم نشرة في الأصل باربيل et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تشير هذه النتائج إلى أن يشارك البروتين RACK1 في الممرات أوتوفاجي. بروتين RACK1 مترجمة يشترك مع البروتين LC3 على هياكل مثل أوتوفاجوسومي أثناء أوتوفاجي التعريفي. وعلاوة على ذلك، أظهرت نتائج شركة إيمونوبريسيبيتيشن أن كانت تتفاعل البروتينات RACK1 و ATG5 حتى في ظروف القاعدية، وزيادة مستويات التفاعل تحت أوتوفاجي تفعيل الشروط. وأكد نحن سابقا استخدام تدهور p62 والثاني LC3 تراكم الاختبارات في وجود أو عدم وجود مثبطات الليزوزومية (A بافيلوميسين، E64D/بيبستاتين) أن التمويه أوتوفاجيك قد لا تحول دون تحت ظروف تجريبية8. ولذلك، النتائج المعروضة هنا، وفي أماكن أخرى قد أظهرت أن تفاعل RACK1-ATG5 مهم للمراحل الأولية من أوتوفاجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات إيمونوبريسيبيتيشن والفلوره ذات أهمية حاسمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. على الرغم من أن يشيع استخدام هذه التقنيات اثنين وراسخة، ينبغي النظر عدة معايير لتحديد نوعية التجارب أثناء استخدام هذه التقنيات.
ينبغي أن تكون أجسام أولاً، الأولية المستخدمة في هذه الاختبارات محددة للبروتينات للفائدة. ولضمان ذلك، استخدم شرنا كنوكدوونس أو الخلايا بالضربة القاضية لاختبار خصوصية الجسم في السؤال. بالإضافة إلى ذلك، استخدام عناصر إيجابية، أو التعامل مع الخلايا التي تحتوي محفز معروف من بروتين الفائدة. دفعة دفعة هناك تباينات من الأجسام المضادة كذلك. وعلاوة على ذلك، قد يكون بعض [بولكلونل] أجسام أو الأمصال خلفية عالية والعصابات غير محددة. على الرغم من أن بعض هذه العصابات قد تكون أشكال بديلة لبروتين الاهتمام، بصورة عامة أنها ناتجة عن ه من [بولكلونل] أجسام مع البروتينات ذات الصلة أو أنها قد تكون التمثيلات غير محددة. [مونوكلونل] بعامة أكثر تحديداً في هذا المعني، على الرغم من الإشارات التي تم إنشاؤها يمكن أن تكون أضعف. تأكيد خصوصية جسم مع المعلمة البروتينات وأنشئت العلامة المضادة الأجسام المضادة قد تكون مفيدة، ولكن التفاعلات الذاتية لا تزال أكثر قيمة وضرورية.
اختبارات التعريب المشارك أو co-إيمونوبريسيبيتيشن لن تقيم نهائياً ما إذا كانت تفاعلات البروتين البروتين مباشرة أم لا. فمن الممكن أن شركاء إضافيين يمكن التوسط التفاعلات الملاحظة. وفي الواقع، في الشكل 1، ترجمة جزئية المشارك من البروتينات RACK1 و LC3 لوحظ، التي يمكن أن تكون علامة على التفاعل فيما بينها؛ ومع ذلك، الربط المباشر اختبارات مثل فحوصات في المختبر سحب لأسفل باستخدام البروتينات المؤتلف أو مجهرية Fluorescence الرنين الطاقة نقل (الحنق) يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت التفاعلات الملاحظة مباشرة أم لا. من ناحية أخرى، سوف تساعد تقنيات مثل هلام الترشيح للكشف عن تفاعلات البروتينات المعقدة التي تشمل اثنين أو أكثر من البروتينات بطريقة أكثر إقناعاً. سيكون تحليل أكثر دقة للنتائج الفلورة من منظور أوتوفاجي لرصد أوتوفاجي التعريفي بإحصاء عدد النقاط التي إيجابية بالنسبة لعلامة أوتوفاجي LC3 في كل خلية، منذ زيادة عدد LC3 النقاط الإيجابية يرتبط بعدد أوتوفاجوسوميس. استخدام معامل Pearson أسلوب لي أو اختبارات معاملات مانديرس توفير أفضل من التقييم الكمي والمقارن للنتائج التجريبية.
هناك نقطة أخرى مهمة هي التحقق التفاعلات باستخدام تقنيات مستقلة وخطوط الخلايا المختلفة. قد تكون بعض التفاعلات القطع الأثرية التي تتعلق بالالتصاق البروتينات أو أوفيريكسبريشن البروتين. إذا كان لا بعناية غسلها، البروتين ATG5 معرضة أيضا للتمسك بالخرز المستخدمة في إيمونوبريسيبيتيشنز (الخرز [اغروس] أو سيفاروسي). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل overexpression البروتين في اختبارات الفلورة، المجاميع التي تبدو مثل أوتوفاجوسوميس أو أوتوليسوسوميس. ولذلك، أثناء أداء عابر ترانسفيكتيونس استخدام البروتينات الفلورية شارك transfected كمراقبة فعالية تعداء، في إيمونوبلوتس، يمكن مقارنة مستويات التعبير من البروتينات للفائدة إلى مستويات البروتين الفلورية في مستخلصات استخدام الأجسام المضادة المحددة، توفير وسيلة لتطبيع العلاقات.
في كل هذه التجارب، إمكانية تكرار نتائج نتائج ذات أهمية قصوى. ونحن نفضل لتكرار التجربة كل 3-4 مرات على الأقل مقتنعا بالنتائج التي تم الحصول عليها. كما نقوم بتجارب مماثلة في خطوط الخلايا مختلفة اثنين على الأقل لإثبات أن ملاحظاتنا لا خلية نوع معين. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي التخطيط الصحيح عناصر إيجابية وسلبية (مثلاً، الخرز وحدها أو الأجسام المضادة للتحكم بالإضافة إلى مصل للاختبارات إيمونوبريسيبيتيشن) للتوصل إلى استنتاجات صحيحة. أثناء الاستفادة المثلى تقنيات الفلورة، من المفيد أن يكون عنصر تحكم فقط الأجسام المضادة ثانوية حيث تم حذف جسم الأولية. عنصر التحكم هذا تأكد من أنه لاحظ الإشارات التي تأتي من الربط جسم الرئيسي للبروتين للفائدة، وليس من ربط غير محددة من الجسم المضاد الثانوي.
هي زيادة عدد مجمعات البروتين تنظيم أوتوفاجي وغيرها من الأحداث البيولوجية في اكتشاف، ولكن هذا البحث أبعد ما يكون عن بعد صورة كاملة. على الرغم من أن مواصلة الفائق تقنيات مثل الطيف الكتلي أو تنبؤات القائم على المعلوماتية الحيوية للكشف عن شبكات للتفاعل للبروتينات ذات الصلة أوتوفاجي عدة، وتأكيدا لهذه التفاعلات باستخدام الكيمياء الحيوية الكلاسيكية و أساليب الفحص المجهري مهم من أجل الكشف عن الخصائص الوظيفية والحيوية لهذا المسار الخلوية الأساسية والهامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل العلمية والتكنولوجية أبحاث المجلس من تركيا (توبيتاك) 1001 107T153 منحة، جامعة سابانجى. سيب و NMK تدعمها توبيتاك 2211 بدب منحة دراسية لدراسات الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
