Summary
本文介绍了两种抗体蛋白-蛋白质相互作用的研究方法: 免疫荧光和沉淀。这些技术适于研究蛋白质之间的物理相互作用, 以发现细胞信号通路的新成分, 以及了解蛋白质动力学。
Abstract
蛋白质-蛋白质相互作用对于理解细胞信号的叶栅和识别新的通路成分和蛋白质动力学是非常重要的。大多数细胞活动需要蛋白质之间的物理相互作用。为了分析和映射这些相互作用, 开发了各种实验技术以及生物信息学工具。自噬是一种细胞回收机制, 它允许细胞处理不同的压力源, 包括营养匮乏, 化学物质和缺氧。为了更好地了解自噬相关的信号事件, 并发现新的因素, 调节蛋白质复合体自噬, 我们进行蛋白质-蛋白质相互作用的屏幕。验证这些筛选结果需要使用免疫荧光和沉淀技术。在这个系统中, 我们发现的特定的自噬相关蛋白-蛋白质相互作用在 Neuro2A (N2A) 和 HEK293T 细胞系中进行了测试。在这个形象化的实验文件中解释了所使用的技术程序的细节。
Introduction
Macroautophagy (自噬) 是一种细胞应激机制, 其特征是在称为噬囊泡的双膜囊泡中的大体积细胞质、蛋白质和胞器的螯合。通过双膜外层的融合, 噬囊泡及其货物被传递到溶酶体并在其中降解1。自噬发生在所有细胞类型和所有生物体的低基底水平, 执行稳态功能, 如蛋白质降解和器官 (如, 线粒体) 周转。在导致细胞压力的条件下, 如饥饿, 自噬迅速上调并允许细胞维持能量水平和基本代谢1,2,3。
从酵母中克隆出大约30自噬基因, 他们的蛋白质产品在噬过程的各个阶段都扮演了一个角色, 包括囊泡形核、扩张、囊泡融合到晚期 endosome/溶, 以及货物降解4,5. 基因这些基因的大多数已经被确定, 并且在各种生物体中的研究证实了它们的细胞功能的保存情况6。在过去十年的研究表明, 几个自噬相关的蛋白质复合物和蛋白质-蛋白质相互作用存在, 他们控制自噬通路的复杂和控制的方式。交叉路口, 备份, 反馈和前馈机制存在, 他们允许细胞协调自噬与其他相关事件 (如水泡分泌物, 溶生物, 内涵排序和传输7,等)在一个无偏酵母-两个混合屏幕使用自噬蛋白 ATG5 作为诱饵, (ATG5 是一个关键的吞噬蛋白参与 E2-like 共轭系统, 介导 LC3 lipidation 在饥饿诱导自噬), 我们已经确定受体激活c-激酶 1 (RACK1;GNB2L1) 作为一个强大的交互和一个新的自噬成分8。重要的是, 屏幕显示, ATG5-RACK1 相互作用是不可缺少的自噬诱导的经典吞噬诱导 (即, 饥饿和 mTOR 抑制)。
Immunofluorescence-based 方法通常用于监测蛋白质-蛋白质相互作用。这些技术主要是抗体, 有助于可视化交互和确认细胞定位。在这种技术中, 荧光标记共轭抗体是特定的蛋白质的兴趣通常用于特定的染色。每种蛋白质都可以贴上不同荧光染料的抗体。使用蛋白质特异抗体, 在图像被合并时信号的重叠表明在共焦显微镜下蛋白质的共存。该技术适用于细胞甚至组织。免疫荧光技术提供了有关相互作用动力学的线索, 帮助确定蛋白质复合体的大小和分布, 同时跟踪不同条件下细胞形态学的一般变化9。沉淀是另一种常用的抗体技术, 允许分析给定蛋白质之间的相互作用10。利用这一技术, 感兴趣的蛋白质从细胞或组织提取物中分离出来, 使用特定的抗体, 导致蛋白质沉淀在一个复杂的或与感兴趣的蛋白质接触。共沉淀, 其中蛋白质和其 co-interactor 的检测, 不仅揭示了两个蛋白质之间的相互作用, 但可以测量其在不同情况下的相互作用强度11。
本协议详细描述了用于确认和描述 ATG5-RACK1 和 RACK1-LC3 交互的关键技术。重点是免疫荧光和沉淀技术, 重点是在自噬研究的关键步骤和陷阱, 以及故障排除建议。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 免疫荧光
- 在 DMEM 高糖培养基中维持 HEK293T 人胚肾细胞, 在 DMEM 低血糖培养基中 N2A 小鼠 neuroblast 细胞, 在 5% CO 2 加湿培养箱中, 37 和 #176;用10% 热灭活胎牛 (FBS) 血清、抗生素 (50 U/毫升青霉素、50和 #181、g/毫升链霉素) 和 l-谷氨酰胺 (2 mM) 补充培养基.
- 使用0.25% 胰蛋白酶分离细胞。首先删除细胞培养的培养基, 然后用10毫升无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗细胞, 在37和 #176 中孵育1毫升的胰蛋白酶; C 为5分钟, 添加2毫升 DMEM 培养基, 使胰蛋白酶失活.
- 用移把盘子洗好。移除10和 #181; l 细胞溶液, 并与10和 #181 混合; 我的台盼蓝。使用例计算活单元数.
- HEK293T 和 N2A 都是粘附的细胞系, 但是, HEK293T 细胞很容易从钢板上分离出来。因此, 如果使用 HEK293T 细胞系, 在播种细胞之前, 用无菌过滤的0.01% 聚 l-赖氨酸涂层 coverslides.
- 将无菌 coverslides 放置在10厘米的培养皿中。在每个 coverslide 上加入适量的聚 l-赖氨酸溶液。用聚 l-赖氨酸溶液孵育 coverslides 10 分钟.
- 移除聚 l-赖氨酸溶液.
注: 聚 l-赖氨酸是可重用的;它是可选的收集和重用它作进一步的实验。由于聚 l-赖氨酸是有毒的, 等待, 直到所有的解决方案上的 coverslides 完全蒸发, 然后恢复聚 l-赖氨酸. - 用无菌 PBS 清洗 coverslides.
- 将 1 mL DMEM 添加到12个井板的每个井中。每井放置一个 coverslide.
- 种子2万细胞/井, 在同时摇动板时下落, 以使 coverslides 上的细胞均匀分布。将 CO 2 孵化器中的单元格保持在37和 #176; C 和添加药物, 使总潜伏期不超过48小时, 即 , 3 润治疗, 添加药物在 45 h 后播种.
- 用于 RACK1-LC3 相互作用研究, 润 1, 雷帕霉素和饥饿被用作自噬诱导。细胞孵育与润1为 3 h (250 毫微米最后的集中);与雷帕霉素为 16 h (200 毫微米最后的集中);与厄尔和 #39 的平衡盐溶液 (EBSS) 为2小时, 以饿死细胞.
注: 以 10% FBS 的 DMEM 为控制条件.
- 用于 RACK1-LC3 相互作用研究, 润 1, 雷帕霉素和饥饿被用作自噬诱导。细胞孵育与润1为 3 h (250 毫微米最后的集中);与雷帕霉素为 16 h (200 毫微米最后的集中);与厄尔和 #39 的平衡盐溶液 (EBSS) 为2小时, 以饿死细胞.
- 在总潜伏期48小时后, 取出 coverslides 上的介质并用1毫升 PBS 清洗.
- 固定细胞, 孵育细胞与1毫升冰冷无菌过滤4% 甲醛 (粉煤灰) 在 1x PBS (pH 7.4), 在室温下20分钟没有任何躁动.
由于粉煤灰对光敏感, 在潜伏期时保持 (重要) 在黑暗中的板块;用铝箔盖板可能有帮助。此外, 粉煤灰是有毒的, 因此, 工作在通风罩, 而固定的细胞.
注意: 请记住, 免疫荧光实验中的固定步骤应该优化, 因为特定的抗体可能使用不同的固定剂和条件. - 在20分钟的粉煤灰孵化后, 首先删除 coverslides 上的煤灰溶液, 然后用1毫升无菌过滤 PBS 洗涤每个样品3次。在这一步, (重要) 一个一个地洗井, 以免让他们干。避免干燥, 因为它会干扰细胞的后续反应, 改变细胞的形态, 并增加非特异性信号.
- 清洗完成后, 将样品保存在1毫升的冰上.
- 准备阻塞解决方案: PBS 与0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和0.1% 皂甙.
- 用石蜡薄膜覆盖6层板。确保板底在石蜡膜覆盖后光滑。标签6井板.
- 使用镊子, 将 coverslides 从12井板转移到覆盖有石蜡膜的6层板上.
- 在 coverslides 上丢弃 PBS, 并在每个 coverslide 上添加100和 #181; 性。在冰上孵育样品30分钟.
- 准备阻断溶液中的主抗体。在实验之前, 优化抗体稀释, 以确定最佳工作浓度的染色.
注: 例如, LC3 抗体在阻断溶液中以1:100 稀释的方式使用. - 30 分钟孵化后, 丢弃堵塞溶液, 用1毫升 PBS 轻轻冲洗样品一次.
- 在每个 coverslide 中添加100和 #181; 主要抗体溶液将样品在室温下孵育1小时, 放在振动筛上.
注意: 与主抗体的孵育时间应优化。根据抗体, 夜间孵化在4和 #176; C 可能是可取的。最好在摇床上轻轻地孵育 (100 轮/分钟), 以便在 coverslides 上均匀地分布抗体. - 孵育后与主抗体, 单独洗涤样本, 3 次与1毫升 PBS.
- 在阻塞解决方案中准备1:500 次抗体 (可能需要对二次抗体的稀释进行优化)。在这里, 兔 IgG Alexa 568 被用作第二兔抗体.
- 将100和 #181 的样品孵育到一个振动筛的室温下的二次抗体溶液 L。由于荧光标记的二级抗体对光敏感, (重要) 在黑暗中保持溶液。在二次抗体孵化期间和之后放置样品在黑暗中.
- 继二次抗体孵化后, 用 PBS 冲洗盘子3次.
注: 基于根据经验, 一些抗体有高的背景信号, 不能消除 PBS 洗。如果处理这种抗体, 在步骤1.21 之后, 在 PBS 中保持样品在4和 #176; C 为 6 h 可能帮助。- 如果需要, 用 DNA 结合染料 (如赫斯特) 将细胞染色, 以标记细胞核.
- 要对多个蛋白质进行着色, 请在第二个蛋白质的步骤1.16 开始应用相同的过程.
- 确保在执行带有多个抗体的染色 ( 例如 、使用鼠标和兔抗体) 时, 抗体之间没有物种反应性。 注: 在这里, RACK1 被染色作为第二个蛋白质使用 anti-RACK1 主要抗体和 anti-mouse IgG Alexa 488 次抗体使用相同浓度上述.
- 准备安装解决方案: 1x PBS 中的50% 甘油。筛选通过22和 #181; m 过滤器.
- 使用无皮棉擦拭擦除带有乙醇的幻灯片, 并添加10和 #181; 每张幻灯片的安装解决方案。使用镊子, 将 coverslides 放在每个 dropso 上, 与单元格的侧面直接接触安装介质。使用无绒抹布轻轻地丢弃多余的安装解决方案.
- 用透明指甲油密封 coverslides。首先, 通过在4棱上加入滴指甲油来稳定 coverslides, 然后完全密封.
- 在荧光或共聚焦显微镜下尽快分析样品, 因为荧光信号可能在几个小时后漂白.
- 分离和计数单元格, 如步骤1.2 和1.3 所述.
- 如果使用 HEK293T 单元格, 则在 15 cm 的培养皿中为每个条件种子400万细胞。如果工作与 N2A 细胞, 种子500万细胞在 15 cm 培养皿。在37和 #176 的 CO 2 孵化器中孵育细胞, 直到实验结束.
- 在定义的持续时间内, 使用相关药物或条件对细胞进行治疗, 使细胞的总潜伏期不超过48小时.
注: 对于本研究中的沉淀试验, 细胞被治疗 3 h 与润 1 (250 nm), 16 h 与雷帕霉素 (200 nm), 和 2 h 与 EBSS。DMEM 以 10% FBS 作为控件添加到单元格中. - 在总孵育时间48小时后, 取出介质并采集细胞。由于 HEK293T 细胞很容易从钢板上分离出来, 用冰冷 PBS 冲洗盘子可能就足够了。然而, N2A 细胞更耐脱落;使用单元格刮刀来帮助收割细胞.
- 收集离心管中的所有单元格.
- 在4和 #176 上离心取样, 15 分钟 1.6万 x g; c. 用1毫升 PBS 去除上清液, 用 re-suspending 移.
- 重复离心机步骤, 但在最高离心机速度为4和 #176; C 为15分钟, 丢弃上清液.
- 在开始实验前准备无线电免疫沉淀化验 (帕) 缓冲器.
注意: 有3种类型的帕缓冲区;根据被调查的蛋白质的相互作用强度选择 (参见下面的公式)。- 如果存在强烈的蛋白质-蛋白质相互作用, 请选择常规的帕缓冲区.
- 如果交互较弱, 请选择轻度帕或较温和的帕.
注意: 这些缓冲区的配方包括以下步骤。所有在沉淀测试中使用的缓冲器都应辅以蛋白酶抑制剂。- 使用 1% NP-40、150毫米氯化钠、0.5% 钠胆酸和0.1% 十二烷基硫酸钠在 50 mM 的 pH 值8中准备常规帕缓冲.
- 用 1% NP-40、150毫米氯化钠和0.25% 钠胆酸在 50 mm 的 pH 7.5 中制备轻度帕缓冲液.
- 准备较温和的帕缓冲剂, 使用1% 卫三 100, 137 毫米氯化钠, 1% 甘油, 1 毫米钠钒在50毫米, pH 7.4.
- 选择适当的帕缓冲区后, 用蛋白酶抑制剂 (帕 +) 补充缓冲。然后, 溶解的细胞与3x 的细胞颗粒的体积在帕 +.
- 涡旋暂停十五年代. 在冰上保持5分钟重复涡和结冰5次, 然后离心样品在 1.6万 x g 为 15 min 在4和 #176; C.
- 将上清液转移到清洁的离心管和离心机上, 去除残留的细胞碎片。把上清液转移到干净的管子上.
- 稀释裂解1:50 的蛋白质, 并准备一个具有空白和标准的96井板。稀释样品.
- 将示例与布拉德福德解决方案1:20 混合使用。在黑暗中孵育15分钟.
- 测量 595 nm 波长的光学密度。使用每个样本的吸光度值计算蛋白质浓度.
- 在捕获单元格之前的前一天, 将蛋白质 A 加一个带有特定于感兴趣蛋白质的抗体的念珠。
- 剪切200和 #181 的边缘; 使用剪刀并使用25和 #181; 从每个条件的珠浆中 l.
- 一次用1毫升 PBS 洗涤, 一次用1毫升帕缓冲, 一次用1毫升帕 +。在 3300 x g, 4 和 #176 执行洗涤步骤; C 为 1 min.
- 最后一次洗涤后, 添加300和 #181; 帕 + 上的珠子, 并添加1.5 和 #181; g 抗体, 是特定的蛋白质被拉下来.
- 在4和 #176 上过夜, 在一个转子 (20 旋转/分钟) 上的 C 上孵化试管.
注: 在这里, ATG5 是 immunoprecipitated 使用特定的 anti-ATG5 抗体.
- 在一夜的念珠与抗体的孵化后, 一次用 PBS 洗涤珠子, 一次用帕, 一次用帕 + 如步骤2.12.2 所述.
- 在每个条件下的珠子上添加2毫克的蛋白质, 并完成总体积到300和 #181; 帕 + 缓冲/管。在4和 #176 的转子上一夜间孵育试管; C.
- 在孵化后, 如前面所描述的那样洗涤珠子 (步骤 2.12.2).
- 在最后一次清洗后, 使用较小的吸管提示来除去所有上清液而不接触珠子.
- 添加10和 #181; L 3x 加载染料: 6% SDS, 30% 甘油, 16% 和 #946;-基和0.1% 溴蓝色在1M 三盐酸 pH 6.8.
- 使用至少100和 #181 准备输入控件; 每个条件的 g 蛋白裂解。使用水平衡样品体积, 并加入适量的3x 负载染料.
- 在95和 #176 中煮沸样品; C 为10分钟.
注: 通常在煮沸样品时, 管子的盖子可以自发地打开, 样品也会丢失。通过用特定的盖帽阻止器来保持瓶盖的闭合来避免这一点. - 自旋下来的样本, 并加载到 SDS 页凝胶, 以分离的蛋白质, 根据其大小使用标准的协议.
注: 在本研究中的 RACK1 和 ATG5, 样品运行12% 聚丙烯酰胺凝胶在 80 v 30 分钟, 然后在 120 v 约90分钟。然而, 对于较小的蛋白质, 如 LC3, 使用15% 聚丙烯酰胺凝胶更适合. - 在凝胶运行完成后, 使用湿或半干转移方法将蛋白质转移到硝化纤维素或 PVDF 膜上。然后, 在 PBS 的5% 脱脂牛奶中用0.05% 吐温 20 (PBST) 在室温下用1小时的时间来阻挡细胞膜, 以 PBST 3 分钟的冲洗膜, 可为5分.
- 在室温下, 在工作浓度为1小时的基础抗体孵育膜。对于初级抗体稀释, 使用含有红色溶液的 bsa (5% bsa V 分数, 0.02% PBST 中叠氮化钠, ph 值 7.5; 添加酚红色作为 ph 值标记), 以允许重复使用抗体.
注: 例如, 在红色溶液中稀释 ATG5 抗体2,000x。- 在潜伏期结束时, 用 PBST 冲洗膜3次.
- 使用在5% 脱脂牛奶溶液中制备的 HRP 共轭二级抗体孵育膜 (这里, 兔 IgG 在 1:10.000)。然后用 PBST 冲洗膜 3x 5 分钟.
- 制作 ECL 解决方案:25 mm 鲁米诺、9 mm 豆酸、3 x 10 -4 % H 2 O 2 在 70 mm 中, 三盐酸 pH 8.8。对每个实验使用新的 H 2 O 2 .
注: 在 H 2/su 后开始反应b >> O 2 加法, 它持续约20分钟。- 在 ECL 中孵育20分钟的膜和 X 射线胶片。开发和修复他们在一个黑暗的房间.
- 要检查具有相近或重叠分子量的蛋白质的 co-immunoprecipitation, 可能需要通过在60和 #176 上孵化膜来剥离细胞膜上的抗体; 在剥离缓冲器中为30分钟: (25 毫米的三-HCl pH2和 1% SDS).
- 重复步骤2.20 到2.23 以检查使用不同抗体的 co-immunoprecipitation。例如, 在 ATG5 检测和剥离膜后, RACK1 蛋白在同一膜上使用 anti-RACK1 原抗体 (1:1、000) 和二级抗体 (1:10,000) 进行测试。和 #946;-肌动蛋白用作加载控制;用 IgG 信号作为 immunoprecipitated 样品的加载控制.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在图 1中显示了使用此协议获得的共存结果的示例。我们最近的一篇论文中的一个数字显示为8。在这里, 内源性 RACK1 蛋白呈绿色染色, 内源性 LC3 染红。在合并的图片中观察到的黄色点表示绿色和红色信号之间的重叠点。因而黄色点代表这二个蛋白质的部份共存。
图 1: 具有代表性的免疫荧光结果.HEK293T 细胞在 coverslides 上培养。细胞治疗或不治疗与雷帕霉素 (复活, 200 nm, 16 h) 或润 1 (Torin,250 nm, 3 h), 或饿死在 EBSS (Stv,2 h). 然后利用 anti-RACK1 和 anti-LC3 原代抗体 immunostained 内源性蛋白。在共聚焦显微镜下分析细胞。碳纳米管, 处理细胞;合并, 叠加 greenand redsignals。白色 arrowsshow yellowcytoplasmic 点与 RACK1 和 LC3 共存。这项研究最初发表于埃尔比勒et al.8 请单击此处查看此图的较大版本.
在图 2中, 给出了一个内生沉淀结果的示例。在这个数字中, ATG5 蛋白沉淀和 RACK1 co-immunoprecipitation 在不同的条件下检测。正常家兔血清被用作阴性对照。
图 2:代表沉淀结果.HEK293T 细胞治疗或不治疗雷帕霉素 (复活, 200 nm, 16 h) 或润 1 (润, 250 nm, 3 h), 或饿死在 EBSS (2 h)。内源性 ATG5 蛋白是 immunoprecipitated 的细胞提取物使用 anti-ATG5 抗体耦合蛋白 A 加珠。Anti-ATG5 和 anti-RACK1 抗体用于免疫。血清, 控制兔血清。这项研究最初发表于埃尔比勒et al.8.请单击此处查看此图的较大版本.
这些结果表明, RACK1 蛋白参与自噬通路。RACK1 蛋白 co-localized 与 LC3 蛋白在自噬诱导的 autophagosome 样结构。co-immunoprecipitation 结果表明, RACK1 和 ATG5 蛋白在基底条件下相互作用, 在自噬活化条件下, 相互作用水平增加。我们先前确认使用 p62 降解和 LC3-II 积累试验在存在或没有溶酶体抑制剂 (a1, E64D/Pepstatin a), 噬通量没有抑制在实验条件下8。因此, 这里和其他地方的结果表明, RACK1-ATG5 相互作用是重要的自噬的初始阶段。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
沉淀和免疫荧光技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用的关键。虽然这两种技术是常用的和完善的, 但应考虑在使用这些技术时确定实验质量的几个标准。
首先, 在这些测试中使用的主要抗体应该是特定的蛋白质的兴趣。为了确保这一点, 使用 shRNA knockdowns 或敲除细胞测试的特异性抗体的问题。此外, 使用积极的控制, 或治疗细胞与已知的蛋白质诱导的兴趣。批次的抗体的变种也存在。此外, 一些多克隆抗体或血清可能有较高的背景和非特异性带。虽然这些波段中的一些可能是感兴趣的蛋白质的替代形式, 但总的来说, 它们是由多克隆抗体与相关蛋白交叉的结果, 或者是非特异性的团员。在这个意义上, 单克隆抗体一般更具体, 虽然产生的信号可能较弱。证实抗体特异性与标记的蛋白质和建立的 anti-tag 抗体可能是有用的, 但内源相互作用仍然是更加可贵和必要的。
联合定位或 co-immunoprecipitation 测试不会确定蛋白质-蛋白质相互作用是否是直接的。另外的合作伙伴可能会调解观察到的相互作用。实际上, 在图 1中, 观察到了 RACK1 和 LC3 蛋白的部分共存, 这可能是它们相互作用的标志;但是, 使用重组蛋白或荧光共振能量转移 (烦躁) 显微镜进行的直接结合测试 (如体外下拉法) 可以用来确定观察到的相互作用是否是直接的。另一方面, 如凝胶过滤技术将有助于发现复杂的蛋白质相互作用涉及两个以上的蛋白质以更有说服力的方式。从自噬的角度对免疫荧光结果进行更严格的分析, 将是通过计算每个细胞中 LC3 吞噬标记阳性的点数, 来监测吞噬诱导, 因为 LC3 的数量增加了。正点与体的数量相关。使用皮尔逊系数, 李氏法, 或曼德斯系数试验提供了更好的定量和比较评价的实验结果。
另一个重要的一点是使用独立的技术和不同的细胞系来验证相互作用。有些相互作用可能是与蛋白质或蛋白质的粘性相关的伪影。如果不小心冲洗, ATG5 蛋白也容易粘在 immunoprecipitations (琼脂糖或琼脂珠) 上使用的珠子。此外, 在免疫荧光试验中, 蛋白质过度表达可以形成聚合体, 看起来像体或 autolysosomes。因此, 在使用 co-transfected 荧光蛋白作为转染效果控制的瞬态染中, 在 immunoblots 中, 可将感兴趣的蛋白表达水平与提取物中的荧光蛋白水平进行比较。特定的抗体, 提供一种正常化的方法。
在所有这些测试中, 结果的重现性至关重要。我们更愿意重复每项试验至少3-4 次, 以获得结果的说服力。我们也在至少两个不同的细胞线上进行类似的实验, 以证明我们的观察不是特定于细胞类型的。此外, 正确的积极和消极的控制 (例如, 单独的珠子或控制抗体加上血清的沉淀测试) 应该计划得出正确的结论。在免疫荧光技术的优化, 它是有用的, 有一个二级抗体只控制的主要抗体被省略。这种控制确保观察到的信号来源于与感兴趣的蛋白质结合的主要抗体, 而不是来自二级抗体的非特异性结合。
在发现中, 调节自噬和其他生物事件的蛋白质复合物的数量在不断增加, 但研究远非完整的。虽然高通量技术, 如质谱法或 bioinformatics-based 预测继续揭示了相互作用网络的几个自噬相关蛋白, 确认这些互动使用经典生物化学和显微镜方法是重要的, 以揭示功能和动态性质的这一基本的和重要的细胞通路。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到了土耳其科学和技术研究理事会 (研究) 1001 赠款 107T153, 萨班吉大学的支持。赛博和 NMK 的支持下, 研究 BIDEB 2211 奖学金的博士学位研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
