Summary
Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.
Abstract
Protein-Protein-Interaktionen sind wichtig für Verständnis zellulärer Signalisierung Kaskaden und Identifizierung neuer Weg Komponenten und Proteindynamik. Die Mehrheit der zellulären Aktivitäten erfordern physikalische Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Um zu analysieren und ordnen Sie diese Interaktionen, wurden verschiedene experimentelle Techniken sowie Bioinformatik-Werkzeuge entwickelt. Autophagie ist ein Handy recycling-Mechanismus, der die Zellen mit verschiedenen Stressoren, wie Nährstoff Entbehrung, Chemikalien und Hypoxie zu bewältigen. Um besser zu verstehen, Signalisierung Autophagie-Veranstaltungen und neuartige Faktoren zu entdecken, die Proteinkomplexe Autophagie regulieren, führten wir durch Protein-Protein Interaktion Bildschirme. Überprüfung dieser Screening-Ergebnisse erfordert den Einsatz von Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken. In diesem System wurden spezifische Autophagie-related Protein-Protein-Interaktionen, die wir entdeckt in Neuro2A getestet (N2A) und HEK293T-Zell-Linien. Details der verwendeten technischen Verfahren werden in diesem Papier visualisiertes Experiment erklärt.
Introduction
Macroautophagy (Autophagie, hierin) ist ein zellulären Stress-Mechanismus, der durch die Sequestrierung von Schüttgut Zytoplasma, Proteinen und Organellen in Doppelmembran Vesikel genannt selbstverdauende Vesikel auszeichnet. Durch Verschmelzung der äußeren Schicht der doppelten Membran selbstverdauende Vesikel und ihre Ladung an Lysosomen geliefert und darin1abgebaut. Autophagie tritt auf einem niedrigen basalen Niveau in allen Zelltypen und in allen Organismen, homöostatischen Funktionen wie Protein Degradation und Organelle (z.B. Mitochondrien) Umsatz. Unter Bedingungen, die auf zellulären Stress, wie Hunger Autophagie ist schnell hochreguliert und ermöglicht es die Zelle, Energie und Grundumsatz1,2,3zu erhalten.
Rund 30 Autophagie Gene haben von der Hefe geklont worden und ihre Protein-Produkte wurden gezeigt, um eine Rolle in verschiedenen Stadien des selbstverdauende Prozesses, einschließlich der Vesikel Keimbildung, Ausbau, Vesikel Fusion zu späten Endosom/Lysosomen und Fracht Abbau 4 , 5. Orthologe der Mehrheit dieser Gene wurden identifiziert und Studien in verschiedenen Organismen bestätigt Erhalt der ihre Zellfunktionen6. Studien in den letzten zehn Jahren hat gezeigt, dass mehrere Autophagie-bezogene Proteinkomplexe und Protein-Protein-Wechselwirkungen vorhanden sind und dass sie Autophagie Wege in eine komplizierte und kontrolliert zu bestimmen. Kreuzungen, Sicherungen, Feedback und Feedforward-Mechanismen existieren, und sie ermöglichen der Zelle Autophagie mit anderen Ereignissen (z. B. vesikuläre Sekretion, Lysosomen Biogenese, Endosomal Sortierung und Transport7, etc.) zu koordinieren In eine unvoreingenommene Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm mit der Autophagie Protein ATG5 als Köder (ATG5 ist ein wichtiger Autophagie Protein beteiligt das E2-artigen conjugating System, das LC3 Lipidation verhungern vermittelt induzierte Autophagie), wir haben ausgemacht, Rezeptor aktiviert C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als eine starke Interaktor und eine neuartige Autophagie Komponente8. Wichtig ist, zeigte der Bildschirm, dass die ATG5-RACK1 Interaktion unverzichtbar für Autophagie Induktion durch klassische Autophagie Induktoren (d.h., Hunger und mTOR-Inhibition).
Immunfluoreszenz-basierte Methoden werden häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwachen. Diese Techniken basieren hauptsächlich auf Antikörper und helfen, zu visualisieren Interaktionen und zelluläre Lokalisierungen zu bestätigen. Bei dieser Technik markieren fluoreszierende konjugierten Antikörper, die speziell für interessierender Proteine werden im Allgemeinen verwendet für spezifische Färbung. Jedes Protein kann mit Antikörpern gekoppelt mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Mit Protein-spezifischen Antikörpern, zeigt eine Überlappung des Signals beim Zusammenführen von Bildern die Co Lokalisierung der Proteine unter konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist anwendbar auf Zellen oder sogar Gewebe. Immunfluoreszenz-Techniken Aufschlüsse über Interaktion Dynamik und helfen, die Größe und Verteilung der Proteinkomplexe, während allgemeine Veränderungen im zellulären Morphologie unter verschiedenen Bedingungen9tracking zu identifizieren. Immunopräzipitation ist eine weitere häufig verwendete Antikörper-basierte Technik, die ermöglicht eine Analyse der Wechselwirkungen zwischen Proteinen10gegeben. Mit dieser Technik interessierender Proteine sind isoliert von Zellen oder Gewebe extrahiert mit spezifischen Antikörpern, wodurch die Fällung von Proteinen, die in einer Anlage oder in Kontakt mit einem Protein des Interesses sind. Co-Immunopräzipitation, wo das Protein und seine Co Interaktor erkannt werden, zeigt nicht nur die Interaktion zwischen den beiden Proteinen, aber seine Stärke der Interaktion unter verschiedenen Umständen11messen kann.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail wichtige Techniken, die verwendet wurden, um zu bestätigen und ATG5-RACK1 und RACK1 LC3 Interaktion zu charakterisieren. Der Schwerpunkt liegt auf Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken, mit Betonung der kritischen Schritte und Fallstricke für Autophagie Forschung, sowie die Vorschläge zur Fehlerbehebung.
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Protocol
1. Immunfluoreszenz
- pflegen HEK293T menschliche embryonale Nieren-Zellen in DMEM hohe Glukose Medium und N2A Neuroblast Mauszellen in DMEM niedrige Glukose Medium in einer 5 % CO 2-befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Ergänzen die Nährmedien mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen Rind (FBS) Serum, Antibiotika (50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin) und L-Glutamin (2 mM).
- Lösen die Zellen mittels Trypsin 0,25 %. Zuerst entfernen Sie das Medium der Zellkultur dann waschen Sie die Zellen mit 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie mit 1 mL Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Inaktivierung Trypsin durch Zugabe von 2 mL DMEM Medium.
- Waschen die Platte gut durch pipettieren. Entfernen Sie 10 µL der Zelle Lösung zu und mischen Sie es mit 10 µL Trypan blau. Die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Hemocytometer.
- Sowohl HEK293T und N2A adhärenten Zelllinien, jedoch HEK293T Zellen von der Platte leicht lösen. Aus diesem Grund arbeiten mit HEK293T Zelllinie Mantel der Coverslides mit sterilen gefiltert 0,01 % Poly-L-Lysin vor der Aussaat Zellen.
- Ort sterile Coverslides in einer 10 cm Petrischale. Fügen Sie die entsprechende Menge an Poly-L-Lysin-Lösung auf jeder Coverslide. Inkubieren Sie die Coverslides mit Poly-L-Lysin-Lösung für 10 min.
- Die Poly-L-Lysin-Lösung entfernen.
Hinweis: Poly-L-Lysin ist wiederverwendbar; Es ist optional zu sammeln und für weitere Experimente wiederverwenden. Da Poly-L-Lysin giftig ist, warten Sie, bis die Lösung auf die Coverslides vollständig verdampft und dann Wiederherstellen der Poly-L-Lysin. - Die Coverslides mit sterilen PBS waschen.
- Fügen Sie 1 mL DMEM in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte. Legen Sie eine Coverslide in jede Vertiefung.
- Samen 20.000 Zellen/Brunnen, Tropfen für Tropfen beim Schütteln der Plattenrandes gleichzeitig für eine homogene Verteilung der Zellen auf die Coverslides. Halten die Zellen in der CO 2 Inkubator bei 37 ° C und fügen Sie das Medikament so, dass die gesamte Inkubationszeit 48 h nicht überschreitet, d.h. 3 h Torin Behandlung, fügen Sie das Medikament am 45 h Post Aussaat.
- Für RACK1-LC3 Wechselwirkungsstudien, Torin 1, Rapamycin und Hunger dienten als Autophagie Induktoren. Zellen wurden mit Torin 1 (250 nM Endkonzentration); 3 h inkubiert. mit Rapamycin für 16 h (200 nM Endkonzentration); und mit Earle ' s ausgewogen Salz Lösung (EBSS) für 2 h um Zellen verhungern.
Hinweis: Inkubation in DMEM mit 10 % FBS als der Kontrollbedingung diente.
- Für RACK1-LC3 Wechselwirkungsstudien, Torin 1, Rapamycin und Hunger dienten als Autophagie Induktoren. Zellen wurden mit Torin 1 (250 nM Endkonzentration); 3 h inkubiert. mit Rapamycin für 16 h (200 nM Endkonzentration); und mit Earle ' s ausgewogen Salz Lösung (EBSS) für 2 h um Zellen verhungern.
- Nach 48 h insgesamt Inkubationszeit, die Medien auf die Coverslides zu entfernen und waschen Sie sie mit 1 mL PBS.
- Um die Zellen zu beheben inkubieren Sie die Zellen mit 1 mL Eis kalte sterile gefilterte 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), für 20 min bei Raumtemperatur ohne jede Aufregung.
Da PFA lichtempfindlich ist, halten Sie (wichtig) die Platte in der Dunkelheit während der Inkubationszeit; die Abdeckplatte mit Alu-Folie kann helfen. Darüber hinaus PFA ist giftig, daher, unter einem Abzug zu arbeiten, während die Zellen fixieren.
Hinweis: Denken Sie daran, die die Fixierung treten in Immunfluoreszenz Experimente sollten optimiert werden, wie spezifische Antikörper funktionieren am besten mit verschiedenen Fixierung Mittel und Bedingungen. - Nach 20 min PFA Inkubation, entfernen Sie zunächst die PFA-Lösung auf den Coverslides und dann waschen jede Probe 3 Mal mit 1 mL sterile gefilterte PBS. Bei diesem Schritt (wichtig) waschen Brunnen eins nach dem anderen um nicht trocknen lassen. Zu vermeiden, trocknen, da es mit anschließenden Reaktionen der Zellen stören, ändert sich die Zellmorphologie und unspezifische Signale zu erhöhen.
- Wenn die Wäsche abgeschlossen ist, halten Sie die Proben in 1 mL PBS auf Eis.
- Bereiten Sie die blockierende Lösung: PBS mit 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) und 0,1 % Saponin.
- Decken eine 6-Well-Platte mit Paraffin Film. Sicherstellen Sie, dass die Platte unten glatt nach Paraffin Film Deckung. Beschriften Sie die 6-Well-Platte.
- Mit einer Pinzette, Übertragung der Coverslides aus der 12-Well-Platten auf der 6-Well-Platten mit Paraffin Film bedeckt.
- Verwerfen die PBS auf Coverslides und fügen Sie 100 µL Lösung auf jeder Coverslide für Permeabilisierung zu blockieren. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 30 min.
- Bereiten den primären Antikörper blockieren Lösung. Vor Experimenten, optimieren die Antikörper-Verdünnungen definieren die beste Arbeit-Konzentrationen für beflecken.
Hinweis: LC3 Antikörper ist z. B. bei einer Verdünnung von 1: 100 Lösung blockieren. - Nach 30 min Inkubation, die blockierende Lösung zu verwerfen und die Proben vorsichtig mit 1 mL PBS einmal waschen.
- Hinzufügen 100 µL Primärantikörper Lösung für jedes Coverslide. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur 1 h auf einem Schüttler.
Hinweis: Mit dem primären Antikörper Inkubationszeit sollte optimiert werden. Abhängig von der Antikörper kann eine Übernachtung Inkubation bei 4 ° C vorzuziehen. Es empfiehlt sich, auf einen Shaker sanft inkubieren (100 Umdrehungen/min) zu verteilen die Antikörper auf die Coverslides. - Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper Proben einzeln, 3 Mal mit 1 mL PBS waschen.
- Vorbereiten 1: 500 Sekundärantikörper in blocking-Lösung (Optimierungen der Verdünnungen des sekundären Antikörpers können erforderlich sein). Hier, Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 568 diente als ein Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper.
- Inkubieren Sie die Proben mit 100 µL der Sekundärantikörper Lösung für 1 h bei Raumtemperatur in einen Shaker geben. Da der Fluorophor-markierten Sekundärantikörper sind lichtempfindlich, (wichtig) halten Sie die Lösung in der Dunkelheit. Die Proben im Dunkeln zu platzieren, während und nach der Inkubation Sekundärantikörper.
- Nach der Sekundärantikörper Inkubation, waschen Sie die Platte 3 Mal mit PBS.
Hinweis: Baed auf Erfahrung, einige Antikörper haben hohen Hintergrund-Signale, die von PBS nicht beseitigt werden können wäscht. Wenn mit solchen Antikörpers nach Schritt 1.21, kann es helfen, halten die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 6 h.- Bei Bedarf färben die Zellen mit einem DNA-bindenden Farbstoff, wie Hoechst, um die Kerne zu markieren.
- Um mehr als ein Protein zu färben, gilt das gleiche Verfahren ab Schritt 1.16 für das zweite Protein.
- Stellen Sie sicher, dass es keine Arten Reaktivität zwischen die Antikörper bei Färbung mit mehr als einem Antikörper (z. B. Verwendung Maus und Kaninchen-Antikörper).
Hinweis: Hier RACK1 wird gefärbt, als die zweite Protein mit Anti-RACK1 primären Antikörper und Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper verwenden die gleichen Konzentrationen, die oben genannten.
- Stellen Sie sicher, dass es keine Arten Reaktivität zwischen die Antikörper bei Färbung mit mehr als einem Antikörper (z. B. Verwendung Maus und Kaninchen-Antikörper).
- Bereiten Sie die Montage-Lösung: 50 % Glycerin in 1 X PBS. Filter durch ein 22 µm-Sieb.
- Die Folien mit Ethanol mit einem fusselfreien Tuch abwischen und jede Folie 10 µL Befestigungslösung hinzufügen. Legen Sie mit Hilfe einer Pinzette, die Coverslides auf jeder Dropso, die die Seite mit den Zellen in direkten Kontakt mit dem Montage-Medium ist. Entsorgen Sie überschüssige Befestigungslösung sanft mit fusselfreien Wischtücher.
- Abdichtung der Coverslides mit einem transparenten Nagellack. Zuerst die Coverslides zu stabilisieren, indem Tropfen Nagellack auf die 4 Kanten und dann vollständig zu versiegeln.
- Analysieren die Proben unter dem Leuchtstoff oder confocal Mikroskop so bald wie möglich, da nach ein paar Stunden das Fluoreszenzsignal bleichen kann.
- trennen und zählen die Zellen als Schritte 1.2 und 1.3 beschriebenen.
- Samen funktioniert mit HEK293T Zellen, 4 Millionen Zellen für jede Bedingung in 15 cm Petrischalen. Arbeiten mit Zellen N2A Samen Sie 5 Millionen Zellen in 15 cm Petrischalen. Die Zellen in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubieren Sie bis zum Ende des Experiments.
- Behandeln die Zellen mit den entsprechenden Drogen oder Bedingungen für eine festgelegte Dauer, so dass die gesamte Inkubationszeit der Zellen nicht mehr 48 h als
Hinweis: Für die Immunopräzipitation Tests in dieser Studie wurden Zellen für 3 h mit Torin 1 behandelt (250 nM), 16 h mit Rapamycin (200 nM), und 2 h mit EBSS. DMEM mit 10 % FBS, um die Zellen als Steuerelement der hinzugefügt wurde. - Nach 48 h der totalen Inkubationszeit, entfernen Sie das Medium und die Zellen zu ernten. Da HEK293T Zellen leicht von der Platte zu lösen, kann waschen der Platte mit Eis kaltem PBS für Ernte ausreichend. N2A Zellen sind jedoch widerstandsfähiger gegen Ablösung; Zelle Schaber verwenden, um die Zellen zu ernten.
- Sammeln alle Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge Proben bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° C. verwerfen der Überstand und waschen das Pellet mit 1 mL PBS dadurch, dass es erneut durch pipettieren.
- Zentrifuge Schritt zu wiederholen, aber wirf die höchste Geschwindigkeit der Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min. Überstands.
- Bereiten Radio Immuno-Niederschlag Assay (RIPA) Puffer vor Beginn des Experiments.
Hinweis: Es gibt 3 Arten von RIPA Puffer; Wählen Sie abhängig von der Intensität der Interaktion der Proteine untersucht (siehe Formeln unten).- Ist eine starke Protein-Protein-Interaktion, wählen Sie den regelmäßigen RIPA Puffer.
- Wenn die Interaktion schwach ist, wählen Sie entweder milde RIPA oder milder RIPA.
Hinweis: Die Rezepte dieser Puffer sind in den folgenden Schritten. Alle Puffer, die Immunopräzipitation Tests verwendet werden sollte mit Protease-Inhibitoren ergänzt werden.- Bereiten regelmäßige RIPA-Puffer mit 1 % NP-40, 150 mM NaCl, 0,5 % Natrium Deoxycholate und 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfat in 50 mM Tris pH 8.
- Bereiten Sie milde RIPA-Puffer mit 1 % NP-40, 150 mM NaCl und 0,25 % Natrium-Deoxycholate in 50 mM Tris pH 7,5.
- Bereiten den milderen RIPA-Puffer mit 1 % Triton X-100, 137 mM NaCl, 1 % Glycerin und 1 mM Natrium Orthovanadate 50 mM Tris pH 7.4.
- Nach der Wahl des geeigneten RIPA-Puffers, ergänzen den Puffer mit Protease-Inhibitoren (RIPA +). Dann lösen Sie die Zellen mit 3 x das Volumen der Zelle Pellet in RIPA +.
- Vortex die Suspension für 15 s. lassen Sie ihn auf Eis für 5 min. Wirbel und Puderzucker 5 Mal wiederholen und Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° c
- Übertragen den Überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge, Überrest Zelle Ablagerungen zu entfernen. Überstand in ein sauberes Röhrchen zu übertragen.
- Das Protein Lysates 01:50 verdünnen und bereiten eine 96-Well-Platte mit Blank und Normen. Die Proben zu verdünnen.
- Mix Proben mit Bradford Lösung 01:20. 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Messung die optische Dichte bei 595 nm Wellenlänge. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins über Absorption Werte für jede Probe.
- Am Tag vor der Ernte der Zellen paar Protein A Plus Perlen mit Antikörpern, die spezifisch an das Protein des Interesses sind.
- Die Schnittkante ein 200 µL-Tip mit einer Schere und 25 µL aus der Perle Gülle für jede Bedingung verwenden.
- Waschen die Perlen einmal mit 1 mL PBS, einmal mit 1 mL RIPA Puffer und einmal mit 1 mL RIPA +. Führen Sie die Wäsche bei 3.300 x g, 4 ° C für 1 min.
- Nach der letzten Wäsche 300 µL RIPA + auf die Perlen hinzufügen und fügen Sie 1,5 µg-Antikörper, der spezifisch an das Protein abgerissen werden.
- Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 4 ° C auf ein Rotator (20 Umdrehungen/min).
Hinweis: Hier ATG5 war Immunoprecipitated mit speziellen Anti-ATG5 Antikörpern.
- Nach der Übernachtung Inkubation von Perlen mit dem Antikörper, die Perlen einmal mit PBS, einmal mit RIPA und einmal mit RIPA + waschen wie im Schritt 2.12.2 beschrieben.
- Add 2 mg Protein lysate auf die Perlen für jede Bedingung und füllen Sie das Gesamtvolumen auf 300 µL mit RIPA + Puffer/Schlauch. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht auf ein Rotator bei 4 ° c
- Nach der Inkubation, waschen Sie die Perlen wie oben beschrieben (Schritt 2.12.2).
- Nach dem letzten Waschen, verwenden Sie eine kleinere Pipettieren Spitze, um den Überstand zu entfernen, ohne Sie zu berühren die Perlen.
- Fügen Sie 10 µL 3 x laden Farbstoff: 6 % SDS, 30 % Glycerin, 16 % β-Mercaptoethanol und 0,1 % Bromophenol Blue 1M Tris-HCl pH 6,8.
- Bereiten die Eingabesteuerelemente mit mindestens 100 µg Protein lysate für jede Bedingung. Ausgleich der Probenvolumina mit Wasser und fügen Sie das entsprechende Volumen der 3 x laden Farbstoff.
- Kochen Proben bei 95 ° C für 10 min.
Hinweis: In der Regel bei die Proben zu kochen, die Kappen der Rohre können sich öffnen, spontan und Proben sind verloren. Vermeiden, indem Sie die Kappen mit einem bestimmten GAP-Blocker geschlossen halten. - Spin die Proben und die Ladung auf SDS-PAGE Gelen, die Proteine entsprechend ihrer Größe mit standard-Protokolle zu trennen.
Hinweis: In dieser Studie über RACK1 und ATG5, wurden Proben durch 12 % Polyacrylamid-Gele bei 80 V für 30 min, und dann bei 120 V für ca. 90 min laufen. Jedoch für kleinere Proteine wie LC3, besser geeignet ist mit 15 % Polyacrylamid-Gele. - Nach Abschluss der Gel ausgeführt, die Proteine auf Nitrozellulose oder PVDF-Membranen mit entweder nass oder halbtrocken Transfermethoden übertragen. Dann blockieren die Membranen durch Inkubation in 5 % fettfreie Milch in PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBST) bei Raumtemperatur 1 Stunde waschen Membranen 3 Mal mit PBST für 5 min.
- Inkubieren der Membranen mit primären Antikörper bei Arbeiten Konzentrationen für 1 h bei Raumtemperatur. Für Primärantikörper Verdünnungen verwenden BSA mit roten Lösungen (5 % BSA Cohn V Bruchteil, 0,02 % Natriumazid in PBST, pH 7,5; Phenol rot hinzugefügt als pH Marker hinzufügen) ermöglicht die Wiederverwendung von Antikörpern.
Hinweis: zum Beispiel verdünnen Sie ATG5 Antikörper 2.000 x in die rote Lösung.- Am Ende der Inkubationszeit, waschen die Membranen 3 Mal mit PBST.
- Brüten die Membranen mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper in 5 % fettfreie Milchlösung hergestellt wurden (hier Anti-Kaninchen IgG bei 1:10.000 eingesetzt wurde). Dann waschen Sie die Membranen 3 X mit PBST für 5 min.
- Machen die ECL-Lösung: 25 mM Luminol, Cumarsäure Säure 9 mM, 3 x 10 -4 % H 2 O 2 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Verwenden Sie frische H 2 O 2 für jedes Experiment.
Hinweis: Die Reaktion beginnt nach H 2 < /sub > O 2-Zufuhr und es dauert ca. 20 min.- Brüten die Membranen und x-ray Filme für 20 min in ECL. Entwickeln und befestigen Sie sie in einem dunklen Raum.
- Um die co-Immunopräzipitation von Proteinen mit schließen oder sich überschneidende Molekulargewichte zu überprüfen, ist es möglicherweise erforderlich, die Antikörper aus den Membranen Streifen durch Inkubation der Membranen bei 60 ° C für 30 min in den abstreifenden Puffer: (25 mM Tris-HCl pH 2 und 1 % SDS). Wiederholen Sie die Schritte 2,20 bis 2.23
- für co-Immunopräzipitation mit verschiedenen Antikörpern zu überprüfen. Zum Beispiel wurde folgende ATG5 Erkennung und Abisolieren der Membranen, RACK1 Protein auf den gleichen Membranen mit einem Anti-RACK1 Primärantikörper (1:1 000) und sekundäre Antikörper (01:10, 000) getestet. Β-Aktin diente als das Steuerelement laden; und IgG Signal diente als das Steuerelement laden für Immunoprecipitated Proben.
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Representative Results
In Abbildung 1 ein Beispiel für eine Co Lokalisierung ist Ergebnis unter Verwendung dieses Protokolls dargestellt. Eine Figur aus unserem jüngsten Papier wird8vorgestellt. Hier war endogenen RACK1 Protein in grün gefärbt, während endogene LC3 rot gefärbt war. Die gelben Punkte, die in den fusionierten Bildern beobachtet werden zeigen Websites der Überlappung zwischen den grünen und roten Signalen. Die gelben Punkte stellen somit die teilweise Co Lokalisierung dieser beiden Proteine.
Abbildung 1 : Repräsentative Immunfluoreszenz Ergebnisse. HEK293T Zellen wurden auf Coverslides kultiviert. Zellen wurden behandelt oder nicht behandelt mit Rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) oder Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) oder verhungert in EBSS (Stv, 2 h). Körpereigene Proteine wurden dann Immunostained mit Anti-RACK1 und Anti-LC3 Primärantikörper. Zellen wurden unter einem confocal Mikroskop analysiert. CNT, unbehandelten Zellen; Zusammenführen, Überlagerung von GREENund Redsignals. Weiße Arrowsshow Yellowcytoplasmic Punkte mit RACK1 und LC3 Co Lokalisierung. Diese Forschung wurde ursprünglich von Erbil Et Al. veröffentlicht. 8 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
In Abbildung 2ist ein Beispiel für eine endogene Immunopräzipitation Ergebnis präsentiert. In dieser Abbildung wurde ATG5 Protein ausgefällt und RACK1 co-Immunopräzipitation wurde unter verschiedenen Bedingungen erkannt. Normale Kaninchen-Serum wurde als Negativkontrolle verwendet.
Abbildung 2: Vertreter Immunopräzipitation Ergebnisse. HEK293T Zellen wurden behandelt oder nicht behandelt mit Rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) oder Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) oder verhungert in EBSS (2 h). Endogene ATG5 Protein war Immunoprecipitated aus Zelle Extrakten mit Anti-ATG5-Antikörper, die mit Protein A Plus Perlen gekoppelt waren. Anti-ATG5 und Anti-RACK1 Antikörper wurden für Immunoblotting verwendet. Serum, Kontrollserum Kaninchen. Diese Forschung wurde ursprünglich von Erbil Et Al. veröffentlicht. 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Autophagie Wege RACK1 Protein beteiligt ist. RACK1 Protein zusammen mit dem LC3-Protein auf die Autophagosome-artigen Strukturen während Autophagie Induktion lokalisiert. Co-Immunopräzipitation Ergebnisse zeigte darüber hinaus, dass RACK1 und ATG5 Proteine auch bei basalen Bedingungen interagieren wurden und die Interaktion unter Autophagie aktivieren Bedingungen erhöht. Wir haben zuvor mit p62 Abbau und LC3-II Ansammlung Tests in das Vorhandensein oder Fehlen von lysosomalen Inhibitoren (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A), dass selbstverdauende Flux nicht unter den experimentellen Bedingungen8gehemmt wurde bestätigt. Daher die Ergebnisse präsentiert hier und anderswo haben gezeigt, dass RACK1 ATG5 Interaktion wichtig für die Anfangsphase der Autophagie.
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Discussion
Immunopräzipitation und Immunfluoreszenz-Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Obwohl diese beiden Techniken weit verbreitet sind und gut etablierte, mehrere Kriterien berücksichtigt werden, die Qualität der Experimente zu definieren, bei der Verwendung dieser Techniken.
Erste, primäre Antikörper, die in diesen Tests verwendet werden sollte für die interessierenden Proteine spezifisch sein. Um dies zu gewährleisten, verwenden Sie ShRNA Niederschlägen oder Ko-Zellen, um die Spezifität des Antikörpers in Frage zu testen. Darüber hinaus verwenden Sie Positivkontrollen oder behandeln Sie Zellen mit einem bekannten Induktor des Proteins des Interesses zu. Charge zu Charge Variationen von Antikörpern sind auch vorhanden. Darüber hinaus möglicherweise einige polyclonal Antikörper oder Sera hohen Hintergrund und unspezifische Bänder. Obwohl einige dieser Bands alternative Formen des Proteins von Interesse sein können, können im Allgemeinen sie ergeben sich aus der Kreuzreaktivität der polyclonal Antikörper mit verwandten Proteinen oder sie unspezifische Interaktoren. Monoklonale Antikörper sind im Allgemeinen genauer in diesem Sinne, obwohl erzeugten Signale schwächer werden können. Die Bestätigung des Antikörperbesonderheit mit tagged Proteinen und etablierten Anti-Tag-Antikörpern kann nützlich sein, aber endogene Interaktionen sind noch wertvoller und wesentlicher.
Co-Lokalisierung oder co-Immunopräzipitation Tests werden nicht endgültig feststellen, ob Protein-Protein-Wechselwirkungen sind. Es ist möglich, dass weitere Partner die beobachteten Interaktionen vermitteln können. In der Tat wurde in Abbildung 1, eine partielle Co Lokalisierung RACK1 und LC3 Proteine beobachtet, die möglicherweise ein Zeichen für ihre Interaktion; Allerdings testet direkte Bindung wie z. B. in-vitro- Pulldown-assays mit rekombinanten Proteinen oder Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Mikroskopie verwendet werden, um festzustellen, ob die beobachteten Interaktionen oder nicht sind. Auf der anderen Seite helfen Techniken wie Gel Filtration um der komplexen Protein-Interaktionen mit mehr als zwei Proteine in überzeugender Weise zu entdecken. Eine gründlichere Analyse der Immunfluoreszenz Ergebnisse aus Sicht der Autophagie wäre Autophagie Induktion durch zählen der Anzahl von Punkten, die da eine Erhöhung der Anzahl der LC3 positiv für den LC3 Autophagie Marker in jeder Zelle sind zu überwachen positive Punkte korreliert mit der Anzahl der Autophagosom. Nutzung der Pearson-Koeffizient, LIS-Methode oder Manders Koeffizienten Tests bieten bessere quantitative und vergleichende Bewertung der Versuchsergebnisse.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Validierung von Interaktionen mit unabhängigen Techniken und verschiedene Zelllinien. Einige Interaktionen möglicherweise Artefakte, die die Klebrigkeit von Proteinen oder Protein Überexpression verbunden sind. Wenn Sie nicht sorgfältig gewaschen, ist das ATG5-Protein auch anfällig für an die Perlen zu halten, die in Immunperoxidase (Agarose oder Sepharose-Kügelchen) verwendet werden. Darüber hinaus kann Protein Überexpression in Immunofluoreszenz Tests Aggregate bilden, die aussehen wie Autophagosom oder Autolysosomes. Daher können während der Durchführung transiente Transfektionen mit Co transfizierten fluoreszierende Proteine als die Transfektion Wirksamkeit Kontrolle in Immunoblots, Ausdruck Niveaus der interessierenden Proteine mit fluoreszierenden Protein-Ebene in den Auszügen mit verglichen werden spezifische Antikörper, Bereitstellung einer Methode der Normalisierung.
Bei diesen Tests ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von größter Bedeutung. Wir bevorzugen jedes Experiment mindestens 3-4 Mal wiederholen, um die erzielten Ergebnisse überzeugt sein. Wir führen auch ähnliche Experimente in mindestens zwei verschiedenen Zelllinien zu beweisen, dass unsere Beobachtungen nicht Zelle typspezifische sind. Darüber hinaus sollten richtige positive und negative Kontrollen (z.B., Perlen allein oder Kontrolle Antikörper plus Serum für Immunopräzipitation Tests) geplant, um richtige Schlussfolgerungen zu gelangen. Bei der Optimierung der Immunfluoreszenz-Techniken ist es sinnvoll, eine sekundäre Antikörper nur Kontrolle wo Primärantikörper ausgelassen. Dieses Steuerelement stellen Sie sicher, zu beobachten, dass Signale, die aus der primären Antikörper-Bindung an das Protein des Interesses und nicht aus einer unspezifischen Bindung des sekundären Antikörpers stammen.
Die Zahl der Proteinkomplexe, die Regulierung der Autophagie und andere biologischen Gefahrenlagen sind bei Entdeckung zu, doch die Forschung ist weit davon entfernt, ein vollständiges Bild. Hochdurchsatz-Techniken wie Massenspektrometrie oder Bioinformatik-basierte Prognosen weiterhin Netzwerke der Interaktion für mehrere Autophagie-Proteine, Bestätigung dieser Interaktionen mit klassischen Biochemie zu offenbaren und Mikroskopieverfahren ist wichtig, um die funktionelle und dynamischen Eigenschaften von dieser grundlegenden und wichtigen zellulären Signalweg aufzudecken.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch wissenschaftliche und technologische Forschung Rat der Türkei (TÜBITAK) 1001 Grant 107T153, der Sabanci-Universität unterstützt. SEB und NMK werden durch ein TUBITAK BIDEB 2211-Stipendium für Promotion unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
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- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
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- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
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- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
