Summary
מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.
Abstract
אינטראקציות חלבון-חלבון חשובים עבור cascades איתות סלולרי הבנה, זיהוי רכיבים הרומן לשביל ודינמיקה חלבון. הרוב המכריע של פעילות הסלולר מחייבים הפיזי אינטראקציות בין חלבונים. כדי לנתח ולמפות אינטראקציות אלה, פותחו טכניקות ניסיוני שונים, כמו גם ושפור. Autophagy הוא סלולרית מיחזור מנגנון המאפשר את התאים להתמודד עם לחצים שונים, כולל מניעת מזון, כימיקלים, היפוקסיה. כדי להבין טוב יותר אירועים איתות הקשורים autophagy, לגלות את הגורמים הרומן לווסת את מתחמי חלבון autophagy, ביצענו מסכי אינטראקציית חלבון-חלבון. אימות של תוצאות אלו ההקרנה מחייב שימוש immunofluorescence וטכניקות immunoprecipitation. במערכת זו, ספציפיות הקשורות autophagy אינטראקציות חלבון שגילינו נבדקו ב- Neuro2A (N2A) וקווים תא HEK293T. הפרטים של ההליכים טכני המשמש מוסברים בעיתון מטמיעים הניסוי הזה.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, במסמך זה) הוא מנגנון הלחץ הסלולר המאופיינת פחמיות הציטופלסמה בתפזורת, חלבונים ו organelles ב קרום כפול שלפוחית הנקראת autophagic שלפוחית. באמצעות היתוך של השכבה החיצונית של קרום כפול, שלפוחית autophagic והמטען שלהם יימסרו lysosomes והשפילו ובזה1. Autophagy מתרחשת ברמות הבזליים נמוכות כל סוגי תאים ובתוך כל האורגניזמים, ביצוע פונקציות homeostatic כגון חלבון השפלה והמסירה אברון (למשל, המיטוכונדריה). בתנאים שמוביל מתח סלולארית, כגון רעב, autophagy במהירות upregulated ומאפשרת את התא לשמור על רמות אנרגיה וחילוף חומרים בסיסי1,2,3.
כ-30 גנים autophagy שיבוט של השמרים, מוצריהם חלבון הוצגו לשחק תפקיד בשלבים שונים של התהליך autophagic, לרבות התגרענות שלפוחית, הרחבה, שלפוחית פיוז'ן כדי אנדוזום מאוחר/ליזוזום והשפלות מטען 4 , 5. Orthologs של הרוב של גנים אלה זוהו ואישר לימודי אורגניזמים שונים שימור שלהם תאיים6. מחקרים בעשור האחרון הראו כי מספר הקשורים autophagy מתחמי חלבון, אינטראקציות חלבון-חלבון קיים, כי הם חלים על מסלולים autophagy בצורה מבוקרת הסבוך. צמתים, גיבויים, משוב, feedforward מנגנונים קיימים, הם מאפשרים את התא לתאם autophagy עם אירועים קרובים אחרים (כגון הפרשת vesicular, ליזוזום להן, מיון של תחבורה endosomal7, וכו ') במסך לא משוחדת היברידית שמרים-2 באמצעות החלבון autophagy ATG5 בו כפתיון, (ATG5 הוא חלבון מפתח autophagy מעורב במערכת conjugating E2 דמוי המעביר LC3 lipidation ב הרעבה מזורזת autophagy), זיהינו הפעלת קולטן C-קינאז 1 (RACK1; GNB2L1) וגם interactor חזקה של רכיב autophagy הרומן8. חשוב, המסך הראה כי האינטראקציה ATG5-RACK1 הייתה הכרחית עבור אינדוקציה autophagy מאת inducers autophagy קלאסית (קרי, רעב ו mTOR עיכוב).
שיטות מבוססות immunofluorescence משמשות כדי לפקח על אינטראקציות חלבון חלבון. טכניקות אלה הן בעיקר נוגדן מבוסס, לסייע להמחיש אינטראקציות ואשר הגרסא הסלולרית המקומית. בטכניקה זו, תיוג פלורסנט מצומדת נוגדנים ספציפיים חלבונים עניין משמשות בדרך כלל עבור צביעת ספציפיים. כל חלבון יכולה להיקרא עם נוגדנים מצמידים צבעי פלורסנט שונים. חפיפה בתוך האות בעת מיזוג תמונות באמצעות נוגדנים ספציפיים חלבון, מציין לוקליזציה שיתוף של חלבונים תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקה היא החלים על תאים או רקמות אפילו. Immunofluorescence טכניקות מספקים רמזים לגבי האינטראקציה dynamics, לזהות את גודל ואת ההפצה של מתחמי חלבון, תוך מעקב אחר שינויים כלליים במורפולוגיה הסלולר תחת תנאים שונים9. Immunoprecipitation הוא נפוץ נוגדן מבוסס טכניקה נוספת המאפשרת הניתוח של אינטראקציות בין חלבונים10שניתנו. בעזרת טכניקה זו, חלבונים עניין מבודדים מתאי או רקמות תמציות באמצעות נוגדנים ספציפיים, וכתוצאה מכך המשקעים של חלבונים הנמצאים במתחם או במגע עם חלבון עניין. Co-immunoprecipitation, שבו מזוהים החלבון ו interactor המשנה שלה, מגלה לא רק את האינטראקציה בין שני סוגי החלבונים, אבל יכול למדוד את עוצמתה של אינטראקציה תחת נסיבות שונות11.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות מפתח פרט ששימשו לאשר ולאפיין ATG5-RACK1 ו- RACK1-LC3 אינטראקציה. הדגש הוא על טכניקות immunofluorescence ו- immunoprecipitation, עם דגש על שלבים קריטיים ואת החסרונות autophagy המחקר, כמו גם הצעות לפתרון בעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-immunofluorescence
- HEK293T לשמור על הכליה עובריים אנושיים תאים DMEM גלוקוז גבוה בינוני, N2A העכבר neuroblast תאים DMEM נמוך בינוני גלוקוז, ב- 5% CO 2-חממה humidified ב 37 º C. תוספת של תרבות התקשורת עם 10% לא פעיל חום העובר שור (FBS) בסרום, אנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 50, 50 סטרפטומיצין µg/mL), וגלוטמין (2 מ מ)-
- ניתוק התאים באמצעות טריפסין 0.25%. תחילה להסיר את המדיה של התרבות תאים ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 10 מ"ל סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), דגירה עם 1 מ"ל של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק טריפסין Inactivate על-ידי הוספת 2 מ"ל DMEM בינונית.
- לשטוף את הצלחת היטב על ידי pipetting. להסיר µL 10 של פתרון תא ומערבבים אותו עם µL 10 של trypan blue. לספור את מספר תאים חיים באמצעות hemocytometer.
- HEK293T הן ו- N2A הם שורות תאים חסיד, עם זאת, תאים HEK293T ניתוק מהצלחת בקלות. לכן, אם עובד עם שורת התאים HEK293T, המעיל coverslides עם סטרילי מסונן 0.01% פולי-L-ליזין לפני זריעה התאים.
- Coverslides עקר את המקום ב- 10 ס מ פטרי. להוסיף את הכמות המתאימה של פולי-L-ליזין פתרון על כל coverslide. דגירה של coverslides עם פולי-L-ליזין פתרון עבור 10 דקות
- להסיר הפתרון פולי-L-ליזין.
הערה: פוליפוני-L-ליזין הוא מחדש שמיש; . זה אופציונלי לאסוף ולהשתמש מחדש זה לניסויים נוספים. מאז פולי-L-ליזין היא רעילה, המתן עד כל הפתרון על coverslides מתאדה לחלוטין ולאחר ואז לשחזר את פולי-L-ליזין. - לרחוץ את coverslides עם PBS סטרילי.
- להוסיף 1 מ"ל DMEM לתוך כל טוב של צלחת 12-. טוב. מקום coverslide של כל טוב.
- זרע 20,000 תאים/טוב, טיפה על ידי ירידה תוך טלטול את הצלחת במקביל עבור התפלגות הומוגנית של תאים על coverslides. לשמור תאים בראש 2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף את הסם כך זמן הדגירה הכולל אינו עולה על 48 שעות, קרי, עבור 3 שעות טיפול טורין, להוסיף את התרופה בכל זריעה פוסט 45 h.
- על RACK1-LC3 אינטראקציה מחקרים, 1 טורין, rapamycin ו הרעבה שימשו autophagy inducers. התאים היו מודגרות עם טורין 1 בשביל 3 h (250 ננומטר הסופי ריכוז); עם rapamycin עבור 16 h (200 ננומטר הסופי ריכוז); עם ארל ' s מאוזנת מלח פתרון (EBSS) כבר שעתיים על מנת להרעיב תאים.
הערה: הדגירה ב DMEM עם 10% FBS שימש התנאי שליטה.
- על RACK1-LC3 אינטראקציה מחקרים, 1 טורין, rapamycin ו הרעבה שימשו autophagy inducers. התאים היו מודגרות עם טורין 1 בשביל 3 h (250 ננומטר הסופי ריכוז); עם rapamycin עבור 16 h (200 ננומטר הסופי ריכוז); עם ארל ' s מאוזנת מלח פתרון (EBSS) כבר שעתיים על מנת להרעיב תאים.
- לאחר 48 שעות של זמן הדגירה הכולל, להסיר בתקשורת על coverslides ולשטוף אותם עם 1 מ"ל PBS.
- לתקן את התאים, דגירה התאים עם 1 מ"ל קרח קר סטרילי מסוננים 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 1 x (pH 7.4), למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ללא שום עצבנות.
מאז כדורגלן הוא רגיש לאור, לשמור על (חשוב) את הצלחת בחושך במהלך תקופת הדגירה; כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום עשוי לעזור. יתר על כן, מחברים רעיל, לכן, לעבוד תחת ברדס fume תוך תיקון התאים.
הערה: זכרו כי הקיבעון. צעד בניסויים immunofluorescence צריך להיות אופטימיזציה, כמו נוגדנים ספציפיים יפעלו בצורה הטובה ביותר בעזרת קיבוע שונות סוכנים ותנאים. - לאחר 20 דקות של כדורגלן דגירה, להסיר תחילה את הפתרון מחברים על coverslides ולאחר מכן לשטוף כל מדגם 3 פעמים עם PBS מסוננים עקר 1 מ"ל. בכל שלב זה, (חשוב) לשטוף הבארות אחד כדי לא לתת להן להתייבש. למנוע ייבוש מאז זה להפריע תגובות עוקבות של התאים, לשנות את המורפולוגיה תא ולהגדיל שאינם ספציפיים אותות.
- עם השלמת בכביסה, שומרים את הדגימות ב 1 מ"ל PBS על קרח
- להכין את הפתרון חסימה: PBS עם סאפונין שור אלבומין (BSA) ו- 0.1% 0.1%-
- מכסים צלחת 6-ובכן עם סרט פרפין. ודא כי בתחתית צלחת חלקה לאחר כיסוי הסרט פרפין. תווית לוח 6-ובכן.
- באמצעות פינצטה, העברת coverslides מן הלוחות 12-ובכן אל צלחות 6-ובכן מכוסה בסרט פרפין.
- למחוק את PBS ב- coverslides, להוסיף 100 µL של חסימת פתרון על כל coverslide עבור permeabilization. דגירה בדגימות בקרח במשך 30 דקות
- להכין נוגדן ראשוני בחסימה פתרון. לפני הניסויים, למטב את דילולים נוגדן להגדרת ריכוז העבודה הטובה ביותר עבור צביעת.
הערה: למשל, נוגדן LC3 משמש לדילול מטריים בחסימה פתרון. - לאחר 30 דקות הדגירה, לבטל את הפתרון חסימה ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS פעם.
- µL להוסיף 100 נוגדן ראשוני לפתרון כל coverslide. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך h 1, במטרף.
הערה: זמן הדגירה עם הנוגדן העיקרי צריך להיות מותאם. בהתאם הנוגדן, דגירה לילה ב 4 ° C עשוי להיות עדיף. מומלץ דגירה על מטרף בעדינות (100 סיבובים לדקה) להפיץ באותה מידה הנוגדן-coverslides. - לאחר דגירה עם נוגדן ראשוני, לשטוף דגימות בנפרד, 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS.
- הכן שבערך נוגדנים משניים בחסימה פתרון (מיטוב של דילולים של הנוגדן המשני עשוי להיות נחוץ). הנה, ארנב אנטי אג אלקסה עבור חיל הים 568 שימש של נוגדן אנטי-ארנב משני.
- דגירה בדגימות עם µL 100 של נוגדנים משניים פתרון לשעה בטמפרטורת החדר על מטרף. מאז הנוגדנים משני התווית על-ידי fluorophore רגישים לשמור אור, (חשוב) הפתרון בחושך. מקם את הדגימות בחושך במהלך ואחרי הדגירה נוגדנים משניים.
- לאחר הדגירה נוגדנים משניים, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם PBS.
הערה: Baed על ניסיון, נוגדנים מסוימים יש רקע אותות לא יכולים להיות מסולקים על ידי PBS שוטף. אם מתעסק עם כזה נוגדן, לאחר שלב 1.21, שומרים את הדגימות ב- PBS ב 4 ° C עבור 6-אייץ ' עשוי לעזור.- אם יש צורך, מכתים את התאים עם צבע מחייב דנ א, כגון Hoechst, כדי לסמן את הגרעינים.
- כתם חלבון אחד או יותר-להחיל את אותו הנוהל החל משלב 1.16 עבור החלבון השני.
- כדי לוודא שאין שום תגובתיות מינים בין הנוגדנים בעת ביצוע מכתים עם נוגדן אחד או יותר (למשל, שימוש בעכבר וארנבת נוגדנים).
הערה: כאן, RACK1 זה ישאר כמו החלבון השני באמצעות נוגדנים anti-RACK1 ראשי והעכבר אנטי אג אלקסה עבור חיל הים 488 משני נוגדנים באמצעות ריכוז אותו הנ ל.
- כדי לוודא שאין שום תגובתיות מינים בין הנוגדנים בעת ביצוע מכתים עם נוגדן אחד או יותר (למשל, שימוש בעכבר וארנבת נוגדנים).
- להכין את הפתרון הרכבה: 50% גליצרול ב- 1 x PBS. מסנן דרך מסנן מיקרומטר 22.
- לנגב את השקופיות עם אתנול באמצעות מגבון נטולת ולהוסיף 10 µL הרכבה פתרון לכל שקופית. באמצעות פינצטה, מניחים את coverslides על כל dropso זה הצד עם תאי במגע ישיר עם המדיום הרכבה. למחוק פתרון הרכבה עודף בעדינות באמצעות מגבונים ללא מוך.
- חותם את coverslides עם לק שקוף. ראשית, לייצב את coverslides על-ידי הוספת טיפות לק בקצוות 4, ואז לאטום אותם לגמרי.
- לנתח את הדגימות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט בהקדם האפשרי, מאז האות פלורסנט עלולה להלבין אחרי כמה שעות.
- ניתוק, ספירת התאים כפי שתואר בשלבים 1.2 ו- 1.3.
- אם עובד עם תאים HEK293T, זרע 4 מיליון תאים עבור כל תנאי ב 15-ס"מ פטרי.... אם עובדים עם תאים N2A, זרע 5 מיליון תאים צלחות פטרי 15 ס מ. דגירה התאים חממה 2 CO ב 37 ° C עד תום הניסוי.
- לטיפול תאי עם סמים רלוונטי או התנאים עבור משך זמן מוגדר כך זמן הדגירה הכולל של התאים אינו עולה על ה 48
הערה: לצורך בדיקות immunoprecipitation במחקר זה, תאים טופלו במשך 3 שעות עם טורין 1 (250 ננומטר), h 16 עם rapamycin (200 ננומטר), ו- h 2 עם EBSS. DMEM עם 10% FBS נוסף על התאים של הפקד. - /H לאחר 48 של זמן הדגירה הכולל, מסיר את המדיה ולקצור את התאים. מאז HEK293T תאים לנתק בקלות מהצלחת, לשטוף את הצלחת עם קרח PBS קר עשוי להיות נאותה קציר. עם זאת, תאים N2A הם עמידים יותר בפני ניתוק; השתמש מגרדים תאים כדי לסייע לקצור את התאים.
- לאסוף את כל התאים צינורות microcentrifuge.
- צנטריפוגה דגימות ב g 16,000 x למשך 15 דקות ב 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע, לשטוף גלולה עם 1 מ"ל PBS תליית אותה מחדש על-ידי pipetting.
- חזור על שלב צנטריפוגה, אך מהירות צנטריפוגה הגבוה ביותר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לבטל את תגובת שיקוע.
- להכין רדיו חיסונית-משקעים Assay (ריפה) מאגר לפני תחילת הניסוי.
הערה: ישנם 3 סוגים של המאגר ריפה; לבחור על פי עוצמת האינטראקציה של החלבונים נחקר (ראה להלן נוסחאות).- אם יש אינטראקציה חלבון חזקה, לבחור את המאגר ריפה רגיל.
- אם האינטראקציה חלשה, לבחור ריפה מתון או ריפה מתון יותר.
הערה: המתכונים של מאגרים אלה הם בשלבים הבאים. כל מאגרי משמשים בבדיקות immunoprecipitation יש להשלימה עם מעכבי פרוטאז.- להכין מאגר ריפה רגיל באמצעות 1% NP-40, 150 מ מ NaCl, deoxycholate נתרן 0.5% ו- 0.1% נתרן dodecyl סולפט ב- pH טריס 50 מ מ 8-
- להכין מאגר ריפה קלה באמצעות deoxycholate נתרן NP-40, 150 מ מ NaCl ו- 0.25% 1% ב- 50 מ מ טריס pH 7.5.
- להכין מאגר ריפה מתון יותר באמצעות 1% טריטון-X 100 מ מ 137 NaCl, גליצרול 1%, orthovanadate נתרן 1 מ מ ב- 50 מ מ טריס pH 7.4.
- לאחר בחירת המאגר ריפה המתאים, תוספת למאגר עם מעכבי פרוטאז (ריפה +). לאחר מכן, lyse התאים עם 3 x נפח בגדר תא ב ריפה +.
- מערבולת ההשעיה 15 ס לשמור זה על קרח 5 דק. חזור על מערבולת ו התקרחות 5 פעמים, ואז centrifuge את הדגימות ב g 16,000 x למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge, צנטריפוגה כדי להסיר שאריות תאים שריד. תגובת שיקוע להעביר צינור נקי.
- לדלל את החלבון lysates 1:50 והכן צלחת 96-ובכן עם ריק ותקנים. לדלל את הדגימות.
- דגימות לערבב עם ברדפורד פתרון 1:20. תקופת דגירה של 15 דקות בחושך.
- מודדים את צפיפות אופטית-595 nm גל. חשב את ריכוז חלבון באמצעות ספיגת ערכים עבור כל דגימה.
- יום לפני הקטיף התאים, כמה חלבון A בתוספת חרוזים עם נוגדנים ספציפיים החלבון עניין.
- לחתוך את הקצה של טיפ 200 µL באמצעות מספריים ולהשתמש µL 25 מ slurry חרוז כל תנאי-
- לרחוץ את החרוזים פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, פעם עם מאגר ריפה 1 מ"ל, ועם פעם 1 מ"ל ריפה +. לבצע את השלבים שטיפת ב g x 3,300, 4 ° C עבור מינימלית 1
- לאחר השטיפה האחרונה תוסיפי µL 300 של ריפה + החרוזים ולהוסיף 1.5 נוגדן µg הייחודיים לחלבון ששולפים אותך.
- דגירה הצינורות בין לילה ב 4 ° C-מסובב (20 סיבובים/דקה).
הערה: כאן, ATG5 היה immunoprecipitated באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד-ATG5.
- לאחר הדגירה לילה של חרוזים עם הנוגדן, לשטוף את החרוזים פעם אחת עם PBS, פעם עם ריפה, ועם פעם ריפה + כפי שמתואר בשלב 2.12.2.
- להוסיף 2 מ"ג חלבון lysate על חרוזים לכל תנאי ולהשלים לנפח הכללי כדי µL 300 עם ריפה + מאגר/צינור. דגירה הצינורות בין לילה ב rotator 4 מעלות צלזיוס
- לאחר הדגירה, לשטוף את החרוזים כאמור תיאר (שלב 2.12.2).
- לאחר בכביסה האחרונה, השתמש טיפ pipet קטנות יותר כדי להסיר את כל תגובת שיקוע בלי לגעת את החרוזים.
- להוסיף 10 µL של 3 x בטעינת צבע: 6% מרחביות, 30% גליצרול, 16% β-Mercaptoethanol ו- 0.1% כחול Bromophenol ב pH טריס-HCl 1 מ' 6.8.
- להכין את פקדי קלט באמצעות חלבון לפחות 100 µg lysate עבור כל תנאי. להשוות את אמצעי האחסון מדגם באמצעות מים ומוסיפים נפח מתאים של 3 x טוען לצבוע.
- רותחים דגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
הערה: בדרך כלל כאשר רותחים הדגימות, הפקקים של הצינורות יוכלו לפתוח באופן ספונטני של דגימות אובדות. להימנע מכך על-ידי החזקת את הפקקים סגורים עם חוסם כובע מסוים. - ספין את הדגימות ואת עומס על גבי עמודים מרחביות ג'לים כדי להפריד את החלבונים בהתאם לגודלן באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
הערה: במחקר זה על RACK1 ועל ATG5, דגימות נוהלו באמצעות ג'ל לזיהוי 12% 80 V למשך 30 דקות, ולאחר מכן 120 V עבור-90 דקות. עם זאת, עבור חלבונים קטנים יותר כגון LC3, באמצעות ג'ל לזיהוי 15% היא מתאימה יותר. - לאחר השלמת הג'ל פועל, להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה או ממברנות PVDF בשיטות או העברת רטוב או חצי יבש. לאחר מכן, חסום בקרום הדגירה ב- 5% שומן חלב ב- PBS עם 0.05% Tween 20 (PBST) בטמפרטורת החדר לממברנות ווש ה 1 3 פעמים עם PBST עבור 5 דק
- תדגור על הממברנות עם נוגדנים העיקרי בריכוזים עובד לשעה בטמפרטורת החדר לשימוש נוגדן ראשוני דילולים, BSA המכיל פתרונות אדום (5% BSA כהן V שבר, אזיד הנתרן 0.02% ב- PBST, pH 7.5; הוספת פנול אדום הוסיף כסמן pH) כדי לאפשר שימוש חוזר נוגדנים.
הערה: לדוגמה, לדלל x 2,000 נוגדן ATG5 בפתרון אדום.- בסוף זמן הדגירה, לשטוף את הקרומים 3 פעמים עם PBST.
- דגירה בקרום עם נוגדנים משניים מצומדת HRP שהוכנו בפתרון 5% שומן חלב (הנה, ארנב אנטי איג-1:10.000 שימשה). לאחר מכן לשטוף את הקרומים 3 x עם PBST עבור 5 דק
- להפוך את הפתרון ECL: 25 מ מ הלומינול, חומצה coumaric 9 מ מ, 3 x 10 -4% H 2 O 2 ב- pH 70 מ"מ טריס-HCl 8.8. השתמש H טריים 2 O 2 עבור ניסוי.
הערה: התגובה מתחיל לאחר H 2 < שקטהb > תוספת 2 O והוא נמשך כ- 20 דקות.- דגירה של הממברנות, רנטגן סרטים עבור 20 דקות ב- ECL. לפתח ולתקן אותם בחדר חשוך.
- כדי לבדוק את co-immunoprecipitation של חלבונים עם קרובים או חופפים מולקולרית משקולות, זה ייתכן שיהיה צורך להתפשט הנוגדנים את הממברנות מאת המקננת על הממברנות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במאגר הפשטת: (25 מ מ טריס-HCl pH 2 ו- 1% מרחביות).
- חזור על צעדים 2.20 כדי 2.23 לבדיקת co-immunoprecipitation באמצעות נוגדנים שונים. לדוגמה, בעקבות גילוי ATG5, בנוכחות אחר של הממברנות, חלבון RACK1 נבחנה על הממברנות אותו באמצעות נוגדן ראשוני אנטי-RACK1 (1:1, 000) ונוגדנים משניים (1:10, 000). Β-אקטין שימש את פקד הטעינה; IgG אות שימש פקד הטעינה עבור דגימות immunoprecipitated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 דוגמה של לוקליזציה שיתוף התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה מוצג. דמות מנייר האחרונה שלנו מוצג8. כאן, חלבון RACK1 אנדוגני היה מוכתם בירוק, בעוד LC3 אנדוגני היה מוכתם באדום. הנקודות הצהובות זה הם נצפו בתמונות הממוזג מצביעים על אתרים של חפיפה בין האותות ירוק ואדום. ולכן הנקודות הצהובות מייצגים לוקליזציה שותף חלקי של שני חלבונים אלה.
איור 1 : תוצאות נציג immunofluorescence. HEK293T התאים היו תרבותי על coverslides. התאים היו מטופלים או לא שטופלו rapamycin (ראפה, 200 ננומטר, 16 h) טורין 1 (טורין, 250 ננומטר, 3 h) או מורעבים ב EBSS (Stv, 2 h). ואז חלבונים אנדוגני היו immunostained באמצעות נוגדנים anti-RACK1 ו- anti-LC3 העיקרי. תאים נותחו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. CNT, תאים שאינם מטופלים; מיזוג, כיסוי של redsignals מעורר. לבן arrowsshow נקודות yellowcytoplasmic עם RACK1 ו- LC3 לוקליזציה שיתוף. מחקר זה פורסם במקור על ידי Erbil. et al. 8 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2, מוצגת דוגמה של תוצאה immunoprecipitation אנדוגני. באיור זה חלבון ATG5 היה זירז, RACK1 co-immunoprecipitation זוהה בתנאים שונים. ארנבת רגילה שימש פקד שלילי.
איור 2: נציג immunoprecipitation תוצאות. HEK293T התאים היו מטופלים לא שטופלו rapamycin (ראפה, 200 ננומטר, 16 h) או 1 טורין (טורין, 250 ננומטר, 3 h) או מורעבים ב- EBSS (ח 2). חלבון ATG5 אנדוגני היה immunoprecipitated של תמציות התא באמצעות נוגדנים anti-ATG5 היו מצמידים חרוזים פלוס חלבון. נוגדנים אנטי-ATG5 ו- anti-RACK1 שימשו immunoblotting. סרום, סרום הארנב שליטה. מחקר זה פורסם במקור על ידי Erbil. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
תוצאות אלו מצביעות על כי RACK1 חלבון מעורב autophagy מסלולים. חלבון RACK1 שותף מקומי עם החלבון LC3 על מבנים דמויי autophagosome במהלך autophagy אינדוקציה. יתר על כן, co-immunoprecipitation תוצאות המחקר הראו כי חלבונים RACK1 ו- ATG5 היו אינטראקציה אפילו על תנאי הבסיס, רמת האינטראקציה גדל תחת autophagy מפעיל את התנאים. אנחנו קודם לכן אישר שימוש p62 השפלה ובדיקות הצטברות LC3-II ב נוכחות או היעדרות של מעכבי lysosomal (Bafilomycin A, A E64D/Pepstatin) היה שטף autophagic לא עכבות תחת תנאים ניסיוני8. לכן, התוצאות המובאות כאן, במקום אחר הראה כי האינטראקציה RACK1-ATG5 חשוב בשלבים הראשונים של autophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation טכניקות immunofluorescence מכריעים עבור חקר אינטראקציות חלבון-חלבון למרות שתי שיטות אלה משמשות ומבוססת, מספר קריטריונים לשקול להגדיר את האיכות של ניסויים תוך שימוש הטכניקות הללו.
נוגדנים לאדמתה המשמשים המבחנים האלה צריך להיות ספציפי החלבונים של ריבית. כדי להבטיח זאת, השתמש shRNA נפילות או נוקאאוט תאים כדי לבדוק יחודיות של הנוגדן המדובר. בנוסף, השתמש בפקדי חיובית, או יטפל בתאים עם משרן הידוע של החלבון עניין. אצווה לווריאציות אצווה של נוגדנים קיים גם כן. יתר על כן, נוגדנים polyclonal או סרה מסוימים ייתכן רקע ולהקות שאינם ספציפיים. אמנם, ייתכן שחלק הלהקות האלה צורות חלופיות של החלבון עניין באופן כללי הם תוצאה של אשיג נוגדנים polyclonal עם חלבונים הקשורים או שהם עשויים להיות לא ספציפית interactors. נוגדנים חד-שבטיים הם ספציפיים יותר כללי במובן זה, למרות אותות שנוצר יכול להיות חלש יותר. האישור של יחודיות נוגדנים עם חלבונים מתויגות, הוקמה נוגדנים אנטי-תג עשוי להיות שימושי, אבל אינטראקציות אנדוגני עוד יותר חשוב וחיוני.
בדיקות לוקליזציה שיתוף או co-immunoprecipitation לא באופן מוחלט תקים אם אינטראקציות חלבון-חלבון ישירים. זה אפשרי כי שותפים נוספים יכולים לתווך את האינטראקציות שנצפו. אכן, איור 1, לוקליזציה שותף חלקי של חלבונים RACK1 ו- LC3 נצפתה, אשר יכול להיות סימן של האינטראקציה שלהם; עם זאת, איגוד ישירה בדיקות כגון מבחני במבחנה הנפתח באמצעות חומרים או מיקרוסקופ פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג) יכול לשמש כדי לקבוע אם האינטראקציות שנצפו הם ישיר או לא. מצד שני, טכניקות כגון סינון ג'ל יעזור כדי לחשוף את האינטראקציות חלבונים מורכבים המערבים יותר משני חלבונים באופן משכנע יותר. ניתוח קפדנית יותר של תוצאות immunofluorescence מנקודת מבט autophagy יהיה לפקח autophagy אינדוקציה על-ידי ספירת מספר הנקודות הם חיוביים עבור דה מרקר autophagy LC3 בכל תא, מאז עלייה של מספר LC3 נקודות חיוביות בקורלציה עם המספר של autophagosomes. השימוש המקדם של פירסון, Li של שיטת או בדיקות המקדמים של Manders מספקים הערכה כמותית ולמשפט השוואתי טוב יותר של תוצאות הניסוי.
נקודה חשובה נוספת היא האימות של אינטראקציות באמצעות שורות תאים שונים וטכניקות עצמאית. אינטראקציות מסוימות עשויים להיות חפצים הקשורים הדביקות של חלבונים או ביטוי חלבון. אם לא בקפידה שטף, החלבון ATG5 הוא גם נוטה לדבוק החרוזים המשמשים immunoprecipitations (חרוזים גם agarose או sepharose). בנוסף, בבדיקות immunofluorescence, ביטוי חלבונים יכולים ליצור צבירות שנראים כמו autophagosomes או autolysosomes. לכן, בעת ביצוע ארעי transfections באמצעות שיתוף transfected חלבונים פלורסנט של הפקד היעילות של תרביות תאים, ב immunoblots, רמות ביטוי של חלבונים של עניין ניתן להשוות רמות החלבון הניאון תמציות באמצעות נוגדנים ספציפיים, מתן שיטה של נורמליזציה.
כל המבחנים האלה, הפארמצבטית של תוצאות הוא בעל חשיבות עליונה. אנו מעדיפים לחזור על ניסוי לפחות 3 - 4 פעמים כדי להשתכנע תוצאות שהושג. אנחנו גם לבצע ניסויים דומים לפחות שתי שורות תאים שונים כדי להוכיח כי התצפיות שלנו אינם תאים ייחודיים לסוג. בנוסף, מומלץ לתכנן בקרות חיוביים ושליליים הנכון (למשל, חרוזים לבד או שליטה נוגדנים בתוספת סרום לבדיקות immunoprecipitation) כדי להגיע למסקנות הנכונות. במהלך המיטוב של טכניקות immunofluorescence, היא שימושית יש שליטה היחיד נוגדנים משניים היכן נוגדן ראשוני מושמט. פקד זה לוודא כי נצפתה אותות מקורם האיגוד נוגדן ראשוני כדי החלבון של עניין, ולא איגוד שאינם ספציפיים של הנוגדן משנית.
מספר מתחמי חלבון ויסות autophagy ואירועים ביולוגיים אחרים מתרבים בגילוי, אך המחקר הוא רחוק שיש תמונה שלמה. למרות תפוקה גבוהה טכניקות כגון ספקטרומטר מסה או מבוסס-ביואינפורמטיקה תחזיות להמשיך לחשוף את רשתות של אינטראקציה עם מספר הקשורות autophagy חלבונים, אישור על אינטראקציות אלה באמצעות ביוכימיה קלאסית, מיקרוסקופ שיטות חשובה על מנת לחשוף מאפיינים פונקציונליים ודינאמי של מסלול סלולרי זה הבסיסי והחשוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מדעי, טכנולוגי מחקר המועצה של טורקיה (TUBITAK) 1001 גרנט 107T153, האוניברסיטה Sabanci. סאב NMK נתמכים על ידי מלגה TUBITAK BIDEB 2211 ללימודי דוקטורט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
