Summary
Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.
Abstract
Interazioni proteina-proteina sono importanti per Cascate di segnalazione cellulare comprensione e identificazione via novella componenti e dinamica di proteine. La maggior parte delle attività cellulari richiede interazioni fisiche tra proteine. Per analizzare e mappare queste interazioni, sono state sviluppate varie tecniche sperimentali, nonché strumenti di bioinformatica. L'autofagia è un cellulare di riciclaggio il meccanismo che permette alle cellule di far fronte a diversi fattori di stress, compreso ipossia, prodotti chimici e privazione nutriente. Al fine di comprendere meglio autophagy-relative segnalazione eventi e scoprire nuovi fattori che regolano i complessi della proteina nell'autofagia, abbiamo effettuato gli schermi di interazione proteina-proteina. Convalida di questi risultati di screening richiede l'utilizzo di tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza. In questo sistema, interazioni proteina-proteina specifica autophagy-relative che abbiamo scoperto sono state testate in Neuro2A (N2A) e linee cellulari di HEK293T. Dettagli delle procedure tecniche utilizzate sono spiegati in questa carta visualizzati esperimento.
Introduction
Macroautophagy (autofagia, nel presente documento) è un meccanismo di stress cellulare che si caratterizza per il sequestro di massa citoplasma, proteine e organelli in vescicole di membrana doppia chiamati vescicole autofagiche. Attraverso la fusione dello strato esterno della membrana doppia, vescicole autofagiche e loro carico vengono recapitati ai lisosomi e degradato in esso1. L'autofagia si verifica a bassi livelli basali in tutti i tipi cellulari e in tutti gli organismi, svolgono funzioni omeostatiche come degradazione proteica e fatturato organello (ad es., mitocondri). Sotto condizioni che portano a stress cellulare, come la fame, l'autofagia è rapidamente aumentata e permette alla cellula di mantenere livelli di energia e metabolismo di base1,2,3.
Circa 30 geni di autofagia sono stati clonati dal lievito e loro prodotti proteici sono stati indicati per svolgere un ruolo nelle varie fasi del processo autofagico, tra cui nucleazione della vescicola, espansione, fusione della vescicola a fine endosoma/lisosoma e il degrado del carico 4 , 5. ortologhi della maggior parte di questi geni sono stati identificati e gli studi in vari organismi hanno confermato la conservazione delle loro funzioni cellulari6. Studi nell'ultimo decennio hanno dimostrato che diversi autophagy-relative complessi della proteina e interazioni proteina-proteina esistano e che governano le vie dell'autofagia in modo intricato e controllato. Intersezioni, backup, feedback e feedforward meccanismi esistono, e consentono la cella coordinare l'autofagia con altri eventi correlati (ad esempio la secrezione vescicolare, biogenesi lisosoma, endosomal cernita e trasporto7, ecc.) In uno schermo di imparziale LIEVITO-due ibrido utilizzando la proteina di autofagia ATG5 come esca, (ATG5 è una proteina di autofagia chiave coinvolti nel sistema di coniugazione E2-come che media LC3 translazionale nell'inedia indotta autofagia), abbiamo identificato il recettore attivato C-chinasi 1 (RACK1; GNB2L1) come una forte interazione e un romanzo autofagia componente8. D'importanza, lo schermo ha mostrato che l'interazione di ATG5-RACK1 era indispensabile per induzione di autofagia da induttori di autofagia classica (cioè, inedia e mTOR inibizione).
Metodi basati su immunofluorescenza sono comunemente utilizzati per monitorare le interazioni proteina-proteina. Queste tecniche sono principalmente basati su anticorpi e aiutano a visualizzare interazioni e confermare localizzazioni cellulari. In questa tecnica, fluorescente tag anticorpi coniugati che sono specifici per le proteine di interesse sono generalmente utilizzate per la colorazione specifica. Ogni proteina può essere etichettato con anticorpi accoppiati a tinture fluorescenti differenti. Utilizzando anticorpi specifici per proteine, una sovrapposizione del segnale quando le immagini vengono unite indica la co-localizzazione di proteine nell'ambito di microscopia confocale. La tecnica è applicabile a cellule o tessuti anche. Tecniche di immunofluorescenza forniscono indizi circa la dinamica di interazione e aiutano a identificare le dimensioni e la distribuzione dei complessi della proteina, tenendo traccia delle modifiche generali in morfologia cellulare sotto diverse condizioni9. Immunoprecipitazione è un'altra tecnica comunemente usata anticorpo-basato che permette l'analisi delle interazioni tra dato proteine10. Utilizzando questa tecnica, le proteine di interesse sono isolate da cellule o tessuti estratti utilizzando anticorpi specifici, con conseguente precipitazione delle proteine che sono in un complesso o a contatto con una proteina di interesse. Co-immunoprecipitazione, dove la proteina e la sua co-interactor vengono rilevati, rivela non solo l'interazione tra le due proteine, ma può misurare la sua forza di interazione sotto diverse circostanze11.
Questo protocollo descrive in dettaglio le tecniche di base che sono state usate per confermare e caratterizzare ATG5-RACK1 e RACK1-LC3 interazione. Il focus è sulle tecniche di immunofluorescenza e immunoprecipitazione, con enfasi di passaggi critici e insidie per autofagia ricerca, così come suggerimenti di risoluzione dei problemi.
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Protocol
1. immunofluorescenza
- mantenere HEK293T embrionali umane del rene cellule nel mezzo di alto glucosio DMEM, e cellule di neuroblasto N2A topo in DMEM bassa media di glucosio, in un 5% CO 2-incubatore a 37 ° C. Integrare i mezzi di coltura con il siero di 10% inattivati bovino fetale (FBS), antibiotici (50 U/mL penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina) e L-Glutammina (2 mM).
- Scollegare le cellule utilizzando 0,25% tripsina. Prima di rimuovere il supporto di coltura delle cellule quindi lavare le cellule con salino (PBS) tampone fosfato sterile di 10 mL e incubare con 1 mL di tripsina a 37 ° C per 5 min Inactivate tripsina aggiungendo 2 mL di terreno DMEM.
- Lavare la piastra ben pipettando. Rimuovere 10 µ l di soluzione di cella e mescolare con 10 µ l di blu di trypan. Contare il numero di cellule vive utilizzando un emocitometro.
- Sia HEK293T e N2A sono linee cellulari aderenti, tuttavia, HEK293T cellule si staccano facilmente dalla piastra. Pertanto, se lavora con la linea cellulare di HEK293T, cappotto coverslides con sterile filtrata 0,01% poli-L-lisina prima della semina delle cellule.
- Il coverslides sterile posto in una capsula di Petri di 10 cm. Aggiungere la quantità appropriata della soluzione di poli-L-lisina su ogni coverslide. Incubare la coverslides con soluzione di poli-L-lisina per 10 min.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina.
Nota: Poli-L-lisina è riutilizzabile; è facoltativo raccogliere e riutilizzarlo per ulteriori esperimenti. Poiché poli-L-lisina è tossico, attendere fino a quando tutta la soluzione sul coverslides evapora completamente e poi recuperare il poli-L-lisina. - Lavare la coverslides con PBS sterile.
- Aggiungere 1 mL DMEM in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Inserire un coverslide in ciascun pozzetto.
- Seme 20.000 cellule/pozzetto, goccia a goccia mentre si stringono la piastra al tempo stesso per una distribuzione omogenea delle cellule sulla coverslides. Mantenere le cellule nella CO 2 incubatore a 37 ° C e aggiungere il farmaco affinché il tempo di incubazione totale non superi 48 ore, vale a dire, per 3 h trattamento Torin, aggiungere il farmaco alle h 45 post semina.
Studi di interazione di
- per RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina e della fame sono stati utilizzati come induttori di autofagia. Le cellule sono state incubate con Torin 1 per 3 h (250 concentrazione finale nM); con rapamicina per 16 h (200 concentrazione finale nM); e con Earle ' s delle soluzione salina equilibrata (EBSS) per 2 h per morire di fame le cellule.
Nota: Incubazione in DMEM con 10% FBS è stato usato come la condizione di controllo.
- per RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina e della fame sono stati utilizzati come induttori di autofagia. Le cellule sono state incubate con Torin 1 per 3 h (250 concentrazione finale nM); con rapamicina per 16 h (200 concentrazione finale nM); e con Earle ' s delle soluzione salina equilibrata (EBSS) per 2 h per morire di fame le cellule.
- Dopo 48 h di incubazione totale, rimuovere il supporto sulla coverslides e lavarli con 1 mL di PBS.
- Per fissare le cellule, incubare le cellule con 1 mL ghiaccio freddo sterile filtrata paraformaldeide al 4% (PFA) in 1X PBS (pH 7.4), per 20 min a temperatura ambiente senza alcuna agitazione.
Poiché PFA è sensibile alla luce, mantenere (importante) la piastra al buio durante il periodo di incubazione; può aiutare a coprire la piastra con un foglio di alluminio. Inoltre, PFA è tossico, quindi, lavorare sotto cappa aspirante, mentre le cellule di fissaggio.
Nota: Tenere presente che la fissazione passo in esperimenti di immunofluorescenza deve essere ottimizzato, come gli anticorpi specifici potrebbero funzionare meglio utilizzando fissazione diversi agenti e alle condizioni. - Dopo 20 min di incubazione PFA, rimuovere prima la soluzione PFA sulla coverslides e poi lavare ogni campione 3 volte con 1 mL di PBS filtrato sterile. In questo passaggio, (importante) lavare i pozzetti uno per uno per non lasciarli asciugare. Evitare l'essiccazione poiché interferiscono con le reazioni successive delle cellule, cambierà la morfologia delle cellule e aumentare i segnali aspecifici.
- Quando il lavaggio è completo, mantenere i campioni in 1 mL di PBS su ghiaccio.
- Preparare la soluzione bloccante: PBS con 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) e 0,1% di saponina.
- Coprire una piastra a 6 pozzetti con la pellicola di paraffina. Assicurarsi che il fondo piatto è liscio dopo il film di copertura di paraffina. Etichettare la piastra a 6 pozzetti.
- Con una pinzetta, trasferimento il coverslides dalle piastre 12-pozzetti per la piastre da 6 pozzetti ricoperti con una pellicola di paraffina.
- Scartare il PBS su coverslides e aggiungere 100 µ l di soluzione su ogni coverslide per permeabilizzazione di blocco. Incubare i campioni in ghiaccio per 30 min.
- Preparare l'anticorpo primario nella soluzione di blocco. Prima gli esperimenti, ottimizzare le diluizioni di anticorpo per definire le migliori concentrazioni di lavoro per la macchiatura.
Nota: ad esempio, LC3 anticorpo è usato ad una diluizione di 1: 100 in soluzione bloccante. - Dopo l'incubazione di 30 min, scartare la soluzione bloccante e lavare delicatamente con 1 mL di PBS i campioni una volta.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di anticorpo primario per ogni coverslide. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 1 h, su un agitatore.
Nota: Il tempo di incubazione con anticorpo primario deve essere ottimizzato. A seconda dell'anticorpo, un'incubazione overnight a 4 ° C può essere preferibile. Si consiglia di incubare su un agitatore delicatamente (100 giri/min) di distribuire equamente l'anticorpo sul coverslides. - Dopo incubazione con anticorpo primario, lavare campioni singolarmente, 3 volte con 1 mL di PBS.
- Preparare 1: 500 anticorpo secondario nella soluzione (ottimizzazioni delle diluizioni di anticorpo secondario potrebbero essere necessarie) di blocco. Qui, anti-coniglio IgG Alexa Fluor 568 è stata usata come un anticorpo secondario anti-coniglio.
- Incubare i campioni con i 100 µ l di soluzione di anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente in un agitatore. Poiché gli anticorpi secondari fluoroforo sono sensibili alla luce, (importante) è possibile mantenere la soluzione al buio. Posizionare i campioni al buio durante e dopo l'incubazione anticorpo secondario.
- Dopo l'incubazione anticorpo secondario, lavare la piastra 3 volte con PBS.
Nota: Baed su esperienza, alcuni anticorpi sono segnali di alta priorità bassa che non possono essere eliminati tramite il PBS lava. Se trattare con tali anticorpi, dopo passaggio 1.21, mantenendo i campioni in PBS a 4 ° C per 6 h può aiutare.- Se necessario, macchia le celle con una tintura di legame al DNA, come Hoechst, per contrassegnare i nuclei.
- Per macchiare le più proteine, applicare la stessa procedura a partire dal punto 1.16 per la seconda proteina.
- Assicuratevi che non vi sia alcuna reattività di specie tra gli anticorpi durante l'esecuzione di macchiatura con più di un anticorpo (ad es., uso del mouse e coniglio anticorpi).
Nota: Qui, RACK1 è macchiato come la seconda proteina utilizzando anti-RACK1 primario e gli anticorpi anti-topo IgG Alexa Fluor 488 secondario utilizzando le stesse concentrazioni di cui sopra.
- Assicuratevi che non vi sia alcuna reattività di specie tra gli anticorpi durante l'esecuzione di macchiatura con più di un anticorpo (ad es., uso del mouse e coniglio anticorpi).
- Preparare la soluzione di montaggio: 50% glicerolo in PBS 1X. Filtrare attraverso un filtro 22 µm.
- Pulire le diapositive con etanolo servendosi di un panno privo di lanugine e aggiungere 10 µ l di soluzione di montaggio per ogni diapositiva. Utilizzando una pinzetta, posizionare la coverslides su ogni dropso che il lato con le cellule è a diretto contatto con il mezzo di montaggio. Eliminare la soluzione di montaggio in eccesso delicatamente utilizzando salviette privo di lanugine.
- Guarnizione coverslides con uno smalto trasparente. In primo luogo, stabilizzare la coverslides con l'aggiunta di gocce di smalto sui 4 bordi e poi sigillare completamente.
- Analizzare i campioni sotto un microscopio confocale o fluorescente più presto, dato che il segnale fluorescente può scolorire dopo poche ore.
- Detach e conteggio le celle come descritto ai punti 1.2 e 1.3.
- Se lavora con celle di HEK293T, semi 4 milioni di cellule per ogni condizione di Petri di 15 cm. Se lavora con cellule N2A, seme 5 milioni cellule in piastre di Petri 15 cm. Incubare le cellule in un incubatore a CO 2 a 37 ° C fino alla fine dell'esperimento.
- Trattare le cellule con le droghe relative o le condizioni per una durata definita in modo che il tempo totale di incubazione delle cellule non superi 48 h.
Nota: Per le prove di immunoprecipitazione in questo studio, le cellule sono state trattate per 3 h con Torin 1 (250 nM), 16 h con rapamicina (200 nM) e 2 h con EBSS. DMEM con 10% FBS è stato aggiunto alle celle del controllo. - Dopo 48 h di incubazione totale, rimuovere il supporto e raccogliere le cellule. Poiché HEK293T cellule si staccano facilmente dalla piastra, lavare la piastra con ghiaccio PBS freddo può essere adeguato per la raccolta. Tuttavia, le cellule N2A sono più resistenti al distacco; utilizzare raschietti di cella consente di raccogliere le cellule.
- Raccogliere tutte le celle nella microcentrifuga.
- Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C. scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di PBS sospendendo ri-pipettando.
- Ripetere la centrifuga, ma alla massima velocità di centrifuga a 4 ° C per 15 min. scartare il sopranatante.
- Buffer di preparare Radio Immuno-precipitazione Assay (RIPA) prima di iniziare l'esperimento.
Nota: Ci sono 3 tipi di buffer RIPA; scegliere secondo l'intensità di interazione delle proteine oggetto di indagine (Vedi formule di seguito).- Se c'è una forte interazione della proteina-proteina, scegliere il buffer RIPA regolare.
- Se l'interazione è debole, scegliere RIPA mite o più mite RIPA.
Nota: Le ricette di questi buffer sono nei passaggi seguenti. Tutti i buffer che vengono utilizzati nei test di immunoprecipitazione dovrebbero essere completati con inibitori della proteasi.- Preparare regolari RIPA Buffer utilizzando 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,5% sodio desossicolato e 0,1% di sodio dodecil solfato in Tris 50 mM a pH 8.
- Preparare mite RIPA Buffer utilizzando 1% NP-40, 150 mM NaCl e 0,25% sodio desossicolato in Tris 50 mM a pH 7.5.
- Preparare più mite RIPA Buffer utilizzando 1% Triton-X100, 137 mM NaCl, 1% glicerolo e 1 mM sodio ortovanadato in Tris 50 mM a pH 7.4.
- Dopo aver scelto il buffer RIPA appropriato, integrare il buffer con inibitori della proteasi (RIPA +). Quindi, lisare le cellule con 3 volte il volume del pellet cellulare in RIPA +.
- Vortex la sospensione per 15 s. tenerlo sul ghiaccio per 5 min ripetere vortice e velo 5 volte e poi Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in un tubo del microcentrifuge pulito e centrifuga per rimuovere i detriti cellulari residuo. Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
- Diluire la proteina lisati 01:50 e preparare una piastra a 96 pozzetti con fusto e standard. Diluire i campioni.
- Mix campioni con Bradford soluzione 01:20. Incubare per 15 minuti al buio.
- Misurare la densità ottica a 595 nm. Calcolare la concentrazione di proteina utilizzando i valori di assorbanza per ciascun campione.
- Il giorno prima della raccolta delle cellule, coppia di perle A più proteine con anticorpi specifici per la proteina di interesse.
- Tagliare il bordo di una punta di 200 µ l con le forbici e utilizzare 25 µ l dai liquami perlina per ogni condizione.
- Lavare le perle di una volta con 1 mL di PBS, una volta con 1 mL di tampone di RIPA e una volta con 1 mL RIPA +. Eseguire le operazioni di lavaggio a 3.300 x g, 4 ° C per 1 min.
- Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 µ l di RIPA + sui branelli e aggiungere 1,5 µ g anticorpo che è specifico per la proteina di essere tirato giù.
- Incubare le provette durante la notte a 4 ° C in un rotatore (20 rotazioni/min).
Nota: Qui, ATG5 era immunoprecipitati utilizzando anticorpi specifici anti-ATG5.
- Dopo l'incubazione overnight di perline con l'anticorpo, lavare le perle di una volta con PBS, una volta con RIPA e una volta con RIPA + come descritto nel passaggio 2.12.2.
- Add 2 mg di proteina lisata sui branelli per ciascuna condizione e completare il volume totale a 300 µ l con RIPA + tubo buffer. Incubare i tubi durante la notte su un rotore a 4 ° C.
- Dopo l'incubazione, lavare le perle come descritte in precedenza (passo 2.12.2).
- Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare un puntale più piccoli per rimuovere tutto il supernatante senza toccare i branelli.
- Aggiungere 10 µ l di 3 x tintura di caricamento: 6% SDS, 30% glicerolo, 16% β-mercaptoetanolo e azzurro del bromofenolo 0.1% in 1M Tris-HCl pH 6.8.
- Preparare i controlli di input utilizzando lisato proteico di almeno 100 µ g per ogni condizione. Equalizzare i volumi di campione con acqua e aggiungere il volume appropriato di 3 x caricamento tintura.
- Campioni di ebollizione a 95 ° C per 10 min.
Nota: Solitamente i campioni di acqua in ebollizione, i tappi delle provette possono aprire spontaneamente e campioni vengono persi. Evitare questo tenendo i tappi chiusi con uno stampo specifico cap. - Spin giù i campioni e il carico su gel di SDS-PAGE per separare le proteine in base alle loro dimensioni utilizzando protocolli standard.
Nota: In questo studio su RACK1 e ATG5, i campioni sono stati analizzati attraverso gel di poliacrilammide del 12% a 80 V per 30 min e poi a 120 V per circa 90 min. Tuttavia, per le più piccole proteine come LC3, utilizzando gel di poliacrilammide di 15% è più adatto. - Dopo il gel in esecuzione è completato, trasferire le proteine a nitrocellulosa o membrane di PVDF utilizzando sia metodi di trasferimento bagnato o semi-secco. Quindi, bloccare le membrane tramite incubazione in 5% senza grassi del latte in PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente per membrane di 1 h. lavare 3 volte con PBST per 5 min.
- Incubare le membrane con gli anticorpi primari a concentrazioni di lavoro per 1 h a temperatura ambiente. Per diluizioni di anticorpo primario, utilizzare BSA contenente soluzioni rossi (5% BSA Cohn V frazione, 0,02% di sodio azide in PBST, pH 7.5; aggiungere rosso fenolo aggiunto come un indicatore di pH) per consentire il riutilizzo degli anticorpi.
Nota: ad esempio, diluire ATG5 anticorpo x 2.000 nella soluzione rossa.- Alla fine del tempo di incubazione, lavare le membrane 3 volte con PBST.
- Incubare le membrane con HRP-coniugato gli anticorpi secondari che sono stati preparati in soluzione di 5% senza grassi del latte (qui, è stato utilizzato anti-coniglio IgG a 1: 10.000). Poi lavare le membrane 3 x con PBST per 5 min.
- Rendono la soluzione di ECL: 25mm luminol, acido cumarico 9 mM, 3 x 10 -4% H 2 O 2 a 70 mM Tris-HCl a pH 8,8. Utilizzare fresco H 2 O 2 per ogni esperimento.
Nota: La reazione inizia dopo H 2 < /sub > Aggiunta di O 2 e continua per circa 20 min.- Incubare le membrane e pellicole per 20 min in ECL radiografiche. Sviluppare e fissarli in una stanza buia.
- Per controllare la co-immunoprecipitazione delle proteine con close o sovrapposizione di pesi molecolari, può essere necessario mettere a nudo gli anticorpi fuori le membrane incubando le membrane a 60 ° C per 30 min nel buffer di spogliatura: (25 mM Tris-HCl a pH 2 e 1% SDS).
- Ripetere i passaggi da 2,20 a 2.23 per verificare la co-immunoprecipitazione utilizzando anticorpi differenti. Ad esempio, dopo il rilevamento di ATG5 e stripping delle membrane, RACK1 proteina è stata testata sulle membrane stesse utilizzando un anticorpo primario anti-RACK1 (1:1, 000) e gli anticorpi secondari (01:10, 000). Β-actina è stato usato come il controllo di carico; e segnale di IgG è stato utilizzato come il controllo di caricamento per i campioni immunoprecipitati.
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Representative Results
In Figura 1 un esempio di una co-localizzazione viene mostrato il risultato ottenuto utilizzando questo protocollo. Una figura dal nostro recente libro è presentata8. Qui, proteina endogena RACK1 era macchiata in verde, mentre LC3 endogeno era macchiato in rosso. I puntini gialli che si osservano nelle immagini Unite indicano siti di sovrapposizione tra i segnali verdi e rossi. Così i punti gialli rappresentano la co-localizzazione parziale di queste due proteine.
Figura 1 : Risultati rappresentativi immunofluorescenza. HEK293t cellule sono state coltivate su coverslides. Le cellule sono state trattate o non trattate con rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h), o affamato in EBSS (Stv, 2h). Quindi proteine endogene immunostained utilizzando anticorpi anti-RACK1 e anti-LC3 primari. Le cellule sono state analizzate al microscopio confocale. CNT, cellule non trattate; Unione, sovrapposizione di greenand redsignals. Bianco arrowsshow yellowcytoplasmic puntini con RACK1 e LC3 co-localizzazione. Questa ricerca è stato originariamente pubblicata da Erbil et al. 8 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In Figura 2, è presentato un esempio di un risultato di immunoprecipitazione endogeno. In questa figura, ATG5 proteina è stata precipitata e RACK1 co-immunoprecipitazione è stato rilevato in condizioni diverse. Siero di coniglio normale è stato usato come controllo negativo.
Figura 2: Rappresentante immunoprecipitazione risultati. HEK293t cellule sono state trattate o non trattate con rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) o 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h) o affamate in EBSS (2 h). Proteina endogena di ATG5 era immunoprecipitated dagli estratti di cellule usando gli anticorpi anti-ATG5 che sono stati accoppiati ai branelli di proteina A Plus. Gli anticorpi anti-ATG5 e anti-RACK1 sono stati utilizzati per immunoblotting. Siero, siero di coniglio di controllo. Questa ricerca è stato originariamente pubblicata da Erbil et al. 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questi risultati indicano che la proteina RACK1 è coinvolto nelle vie di autofagia. Proteina di RACK1 co-localizzata con la proteina LC3 sull'autofagosoma-come le strutture durante l'induzione di autofagia. Inoltre, co-immunoprecipitazione risultati hanno mostrato che RACK1 e ATG5 proteine interagivano anche in condizioni basali, e i livelli di interazione aumentata sotto l'autofagia condizioni di attivazione. Abbiamo confermato in precedenza utilizzando p62 degrado e prove di accumulo di LC3-II in presenza o in assenza di inibitori lisosomiali (Bafilomycin A, E64D/pepstatina A) che autofagica flusso non è stata inibita sotto le condizioni sperimentali8. Di conseguenza, i risultati presentati qui e altrove hanno mostrato che l'interazione RACK1-ATG5 è importante per le fasi iniziali dell'autofagia.
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Discussion
Tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza sono cruciali per lo studio delle interazioni proteina-proteina. Anche se queste due tecniche sono comunemente utilizzati e ben consolidata, dovrebbero essere considerati diversi criteri per definire la qualità di esperimenti durante l'utilizzo di queste tecniche.
In primo luogo, primari anticorpi che vengono utilizzati in queste prove devono essere specifici per le proteine di interesse. A tal fine, utilizzare shRNA atterramenti o cellule knockout per testare la specificità dell'anticorpo in questione. Inoltre, utilizzare controlli positivi o trattare le cellule con un induttore conosciuto della proteina di interesse. Lotto a lotto esistono anche varianti di anticorpi. Inoltre, alcuni anticorpi policlonali o sieri potrebbero avere elevato rumore di fondo e fasce non specifiche. Anche se alcune di queste bande possono essere forme alternative della proteina di interesse, in genere dovuti a cross-reattività degli anticorpi policlonali con proteine correlate o possono essere non specifici interattori. Gli anticorpi monoclonali sono in generale più specifico in questo senso, anche se i segnali generati possono essere più deboli. La conferma della specificità dell'anticorpo con proteine etichettate e stabilito gli anticorpi anti-tag può essere utile, ma endogeni interazioni sono ancora più preziosa ed essenziale.
Co-localizzazione o co-immunoprecipitazione test non stabilirà definitivamente se interazioni proteina-proteina sono dirette. È possibile che altri partner possono mediare le interazioni osservate. Infatti, nella Figura 1, una parziale co-localizzazione delle proteine RACK1 e LC3 è stata osservata, che potrebbe essere un segno della loro interazione; Tuttavia, il binding diretto test come in vitro discesa saggi utilizzando proteine ricombinanti o microscopia di fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) può essere utilizzata per stabilire se le interazioni osservate sono dirette o non. D'altra parte, tecniche come la gel filtrazione verranno aiuterà a scoprire le interazioni proteiche complesse che coinvolgono più di due proteine in modo più convincente. Un'analisi più rigorosa dei risultati dal punto di vista dell'autofagia immunofluorescenza sarebbe quello di monitorare l'induzione di autofagia contando il numero di punti che sono positivo per il marcatore di autofagia LC3 in ogni cellula, in quanto un aumento del numero di LC3 punti positivi correla con il numero di autofagosomi. L'uso del coefficiente di Pearson, metodo di Li o test di coefficienti di Manders fornire migliore valutazione quantitativa e comparativa dei risultati sperimentali.
Un altro punto importante è la validazione delle interazioni utilizzando tecniche indipendenti e differenti linee cellulari. Alcune interazioni possono essere artefatti che sono collegati con la viscosità delle proteine o sovraespressione della proteina. Se non accuratamente lavate, la proteina di ATG5 è anche soggetta a bastone per le perle che sono utilizzate in immunoprecipitati (sia dell'agarosi o sepharose perline). Inoltre, nei test di immunofluorescenza, sovraespressione della proteina possa formare aggregati che sembrano autofagosomi o autolysosomes. Pertanto, durante l'esecuzione di transfezioni transienti usando co-trasfettate proteine fluorescenti come il controllo di efficacia di transfezione, in immunoblots, i livelli di espressione di proteine di interesse possono essere paragonati ai livelli della proteina fluorescente negli estratti utilizzando anticorpi specifici, fornendo un metodo di normalizzazione.
In tutte queste prove, la riproducibilità dei risultati è della massima importanza. Noi preferiamo ripetere ogni esperimento almeno 3 - 4 volte di essere convinto dei risultati ottenuti. Eseguiamo anche esperimenti simili in almeno due differenti linee cellulari per dimostrare che le nostre osservazioni non sono specifici del tipo di cella. Inoltre, devono essere pianificati corretti controlli positivi e negativi (ad es., perline da solo o anticorpi di controllo più siero per immunoprecipitazione test) per giungere a conclusioni corrette. Durante l'ottimizzazione delle tecniche di immunofluorescenza, è utile avere un controllo unico anticorpo secondario dove anticorpo primario viene omesso. Questo controllo assicurarsi che osservati segnali provengono dall'associazione primaria dell'anticorpo alla proteina di interesse e non da un legame non specifico dell'anticorpo secondario.
Il numero di complessi di proteine che regolano l'autofagia e altri eventi biologici è in aumento nella scoperta, ma la ricerca è lungi dall'avere un quadro completo. Anche se tecniche di alto-rendimento come spettrometria di massa o previsioni basate su bioinformatica continuano a rivelare reti di interazione per diverse proteine autophagy-relative, conferma di queste interazioni usando biochimica classica e metodi di microscopia è importante al fine di scoprire le proprietà funzionali e dinamiche di questa essenziale e importante via cellulare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da scientifica e tecnologica ricerca Consiglio della Turchia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l'Università di Sabanci. SEB e NMK sono supportati da una borsa di studio di TUBITAK BIDEB 2211 per gli studi di dottorato di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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