Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.
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Articolo metodologico
Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni proteina-proteina sono importanti per Cascate di segnalazione cellulare comprensione e identificazione via novella componenti e dinamica di proteine. La maggior parte delle attività cellulari richiede interazioni fisiche tra proteine. Per analizzare e mappare queste interazioni, sono state sviluppate varie tecniche sperimentali, nonché strumenti di bioinformatica. L'autofagia è un cellulare di riciclaggio il meccanismo che permette alle cellule di far fronte a diversi fattori di stress, compreso ipossia, prodotti chimici e privazione nutriente. Al fine di comprendere meglio autophagy-relative segnalazione eventi e scoprire nuovi fattori che regolano i complessi della proteina nell'autofagia, abbiamo effettuato gli schermi di interazione proteina-proteina. Convalida di questi risultati di screening richiede l'utilizzo di tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza. In questo sistema, interazioni proteina-proteina specifica autophagy-relative che abbiamo scoperto sono state testate in Neuro2A (N2A) e linee cellulari di HEK293T. Dettagli delle procedure tecniche utilizzate sono spiegati in questa carta visualizzati esperimento.
Introduzione
Macroautophagy (autofagia, nel presente documento) è un meccanismo di stress cellulare che si caratterizza per il sequestro di massa citoplasma, proteine e organelli in vescicole di membrana doppia chiamati vescicole autofagiche. Attraverso la fusione dello strato esterno della membrana doppia, vescicole autofagiche e loro carico vengono recapitati ai lisosomi e degradato in esso1. L'autofagia si verifica a bassi livelli basali in tutti i tipi cellulari e in tutti gli organismi, svolgono funzioni omeostatiche come degradazione proteica e fatturato organello (ad es., mitocondri). Sotto condizioni che portano a stress cellulare, come la ....
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Protocollo
1. immunofluorescenza
- mantenere HEK293T embrionali umane del rene cellule nel mezzo di alto glucosio DMEM, e cellule di neuroblasto N2A topo in DMEM bassa media di glucosio, in un 5% CO 2-incubatore a 37 ° C. Integrare i mezzi di coltura con il siero di 10% inattivati bovino fetale (FBS), antibiotici (50 U/mL penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina) e L-Glutammina (2 mM).
- Scollegare le cellule utilizzando 0,25% tripsina. Prima di rimuovere il supporto di coltura delle cellule quindi lavare le cellule con salino (PBS) tampone fosfato sterile di 10 mL e incubare con 1 mL di tripsina a 37 ° C per 5 min Inactivate tripsina aggiungendo 2 mL ....
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Risultati
In Figura 1 un esempio di una co-localizzazione viene mostrato il risultato ottenuto utilizzando questo protocollo. Una figura dal nostro recente libro è presentata8. Qui, proteina endogena RACK1 era macchiata in verde, mentre LC3 endogeno era macchiato in rosso. I puntini gialli che si osservano nelle immagini Unite indicano siti di sovrapposizione tra i segnali verdi e rossi. Così i punti gialli rappresentano la co-localizzazione parziale di queste due proteine.
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Discussione
Tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza sono cruciali per lo studio delle interazioni proteina-proteina. Anche se queste due tecniche sono comunemente utilizzati e ben consolidata, dovrebbero essere considerati diversi criteri per definire la qualità di esperimenti durante l'utilizzo di queste tecniche.
In primo luogo, primari anticorpi che vengono utilizzati in queste prove devono essere specifici per le proteine di interesse. A tal fine, utilizzare shRNA atterramenti o cellu.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da scientifica e tecnologica ricerca Consiglio della Turchia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l'Università di Sabanci. SEB e NMK sono supportati da una borsa di studio di TUBITAK BIDEB 2211 per gli studi di dottorato di ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tripsina EDTA Soluzione A | Industrie Biologiche | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (glucosio alto) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (basso glucosio) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Emocitometro | Sigma | Z359629-1EA | |
| vetrini | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| vetrini | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponina | Sigma | 84510 | |
| LC3 Anticorpo | Sigma | L7543 | |
| Anti-Coniglio IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Anticorpo | Santa Cruz Biotecnologia | sc-17754 | |
| Anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Cloruro di sodio | Applichem | A9242.5000 | |
| Desossicolato di sodio | Sigma | 30970 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodio ortovanadato | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Anticorpo | Sigma | A0856 | |
| Glicerolo | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoetanolo | Applichem | A1108.0250 | |
| Blu di bromofenolo | Applichem | A3640.0005 | |
| Latte scremato | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodio | Azide Riedel de Haen | 13412 | |
| Fenolo rosso | Sigma | 114537-5G | |
| anti-coniglio IgG, HRP coniugato | Jackson Immuno. | ||
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Acido cumerico | Sigma | C9008 | |
| Perossido di idrogeno | Merck | K35522500604 | |
| anti IgG di topo, HRP coniugato | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Anticorpo actina | Sigma | A5441 | |
| Siero normale di coniglio | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamicina | Sigma | R0395 | |
| Perline di proteina A-agarosio | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| siero bovino fetale | Biowest | S1810-500 | |
| penicillina/soluzione di streptomicina | Industrie biologiche | 03-031-1B | |
| L-glutammina | Industrie biologiche | BI03-020-1B | |
| Soluzione Bradford | Sigma | 6916 | |
| Membrana in nitocellulosa | GE Healthcare | A10083108 | |
| Pellicole radiografiche | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Inibitore della proteasi | Sigma | P8340 |
Riferimenti
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
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Ristampe e permessi
