Summary
Presentert her er to antistoff-basert protein-protein samhandling forskning teknikker: immunofluorescence og immunoprecipitation. Disse teknikkene er egnet for å studere fysiske interaksjonene mellom proteiner for oppdagelsen av romanen komponenter i mobilnettet signalveier og forståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaksjoner er viktig for forståelse mobilnettet signalnettverk cascades og identifisere roman veien komponenter og protein dynamics. Flertallet av mobilnettet aktiviteter krever fysisk interaksjon mellom proteiner. Å analysere og kartlegge disse interaksjoner, ble ulike eksprementelle teknikker samt Bioinformatikk verktøy utviklet. Autophagy er en mobiltelefon resirkulering som gjør at cellene til å takle ulike stressorer, inkludert næringsstoffer deprivasjon, kjemikalier og hypoksi. For å bedre forstå autophagy-relaterte signalnettverk hendelser og oppdage romanen faktorer som regulerer protein kompleks i autophagy, utført vi protein-protein samhandling skjermer. Validering av disse screening resultater krever bruk av immunofluorescence og immunoprecipitation teknikker. I dette systemet, bestemt autophagy-relaterte protein-protein interaksjoner som vi oppdaget ble testet i Neuro2A (N2A) og HEK293T linjer. Detaljer av teknisk prosedyrer brukes forklares i notatet visualisert eksperiment.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, her) er en mobilnettet stress mekanisme som er preget av lagring av bulk cytoplasma, proteiner og organelles i dobbel membran blemmer kalt autophagic blemmer. Gjennom fusjon av det ytterste laget av dobbel membranen, autophagic blemmer og frakten leveres til lysosomer og degradert der1. Autophagy skjer på lave basale nivåer i alle celletyper og alle organismer, utfører homøostatisk funksjoner som protein fornedrelse og organelle (f.eks, mitokondrier) omsetning. Under forhold fører til mobilnettet stress, som sult, autophagy er upregulated og lar cellen å opprettholde energi og grunnleggende stoffskifte1,2,3.
Rundt 30 autophagy gener ha blitt Klon fra gjær og deres protein produkter ble vist å spille en rolle i ulike stadier av autophagic prosessen, inkludert vesicle nucleation, utvidelse, vesicle fusion slutten endosome/lysosome, og Last degradering 4 , 5. Orthologs av fleste av disse genene er identifisert og studier i ulike organismer bekreftet bevaring av deres cellular funksjonene6. Studier i det siste tiåret viste at flere autophagy-relaterte proteiner komplekser og protein-protein interaksjoner finnes og at de styrer autophagy veier i en intrikate og kontrollert måte. Kryss, backup, tilbakemeldinger og feedforward mekanismer finnes, og de tillater cellen å koordinere autophagy med andre relaterte hendelser (for eksempel vesicula sekresjon, lysosome biogenesis, endosomal sortering og transport7, etc.) I en upartisk gjær-to hybrid skjermen med autophagy protein ATG5 som agn, (ATG5 er viktige autophagy protein er involvert i E2-lignende conjugating systemet som formidler LC3 lipidation i sult indusert autophagy), har vi identifisert reseptor aktivert C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) som en sterk interactor og romanen autophagy komponent8. Viktigere, viste skjermen at ATG5-RACK1 samspillet var uunnværlig for autophagy induksjon av klassisk autophagy indusere (dvs., sult og mTOR hemming).
Immunofluorescence-baserte metoder brukes ofte til å overvåke protein-protein interaksjoner. Disse teknikkene er hovedsakelig antistoff-basert, og hjelpe å visualisere interaksjoner og bekrefte mobilnettet steder. I denne teknikken, lysstoffrør tag konjugert antistoffer som gjelder proteiner rundt brukes vanligvis for spesifikk farging. Hver protein kan merkes med antistoffer koblet til forskjellige fluorescerende fargestoffer. Overlapp i signalet når bildene er slått sammen bruker protein-spesifikke antistoffer, og angir den co lokaliseringen av proteiner under AC confocal mikroskopi. Teknikken gjelder eller selv vev. Immunofluorescence teknikker gir hint om samhandling dynamics, og å identifisere størrelse og distribusjon av protein komplekser, mens sporing generelle endringer i mobilnettet morfologi under ulike forhold9. Immunoprecipitation er en annen brukte antistoff pustebasert teknikk som lar for analyse av interaksjoner mellom gitt proteiner10. Bruker denne teknikken, proteiner av interesse er isolert fra celler eller vev trekker ut bruker spesifikke antistoffer, resulterer i nedbør av proteiner som er i et kompleks eller i kontakt med et protein av interesse. Co-immunoprecipitation, der protein og dens co interactor oppdages, avslører ikke bare samspillet mellom de to proteinene, men kan måle dens styrke av interaksjon under forskjellige forhold11.
Denne protokollen beskriver i detalj nøkkel teknikker som brukes for å bekrefte og karakterisere ATG5-RACK1 og RACK1-LC3 interaksjon. Fokus er på immunofluorescence og immunoprecipitation teknikker, med vekt på avgjørende skritt og fallgruver for autophagy research, i tillegg til forslagene til feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunofluorescence
- opprettholde HEK293T menneskelige embryonale nyre celler i DMEM høy glukose medium, og N2A musen neuroblast celler i DMEM lav glukose medium en 5% CO 2-fuktet inkubator på 37 ° C. Supplere kultur media med 10% inaktivert fosterets storfe (FBS) serum, antibiotika (50 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin) og L-glutamin (2 mM).
- Koble celler ved hjelp av 0,25% trypsin. Først fjerne media av cellekultur og vaske cellene med 10 mL steril fosfat-bufret saltvann (PBS) og ruge med 1 mL av trypsin ved 37 ° C i 5 min. Inactivate trypsin ved å legge til 2 mL DMEM medium.
- Vask platen godt av pipettering. Fjerne 10 µL av cell løsningen og bland det med 10 µL av trypan blå. Antall levende celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Både HEK293T og N2A er tilhenger cellelinjer, men HEK293T celler koble fra platen lett. Hvis arbeider med HEK293T celle linje, filtrert derfor pels coverslides med sterilt 0,01% poly-L-lysine før såing cellene.
- Plass sterilt coverslides i en 10 cm Petriskål. Legge til riktig mengde poly-L-lysine løsning på hver coverslide. Inkuber coverslides med poly-L-lysine løsning for 10 min.
- Fjerne poly-L-lysine løsningen.
Merk: Poly-L-lysine er gjenbrukbare; Det er valgfritt å samle inn og bruke den for videre studier. Siden poly-L-lysine er giftig, vent til alle løsningen på coverslides helt fordamper, og deretter gjenopprette poly-L-lysine. - Vask coverslides med sterilt PBS.
- Legge 1 mL DMEM i hver brønn av en 12-vel plate. Plasser en coverslide i hver brønn.
- Frø 20.000 celler/Vel, dråpe for dråpe mens risting platen samtidig for en homogen distribusjon av celler i coverslides. Holde celler i CO 2 inkubator på 37 ° C og legge stoffet slik at den totale inkubasjon tiden ikke overstiger 48 timer, dvs. for 3t Torin behandling, legge stoffet på 45 h innlegget seeding.
- For RACK1-LC3 interaksjon studier, Torin 1, rapamycin og sult ble brukt som autophagy indusere. Cellene ble inkubert med Torin 1 3 h (250 nM siste konsentrasjon); med rapamycin 16 h (200 nM siste konsentrasjon); og med Earle ' s balansert Salt løsning (EBSS) 2 h for å sulte celler.
Merk: Inkubasjon i DMEM med 10% FBS ble brukt som betingelsen kontroll.
- For RACK1-LC3 interaksjon studier, Torin 1, rapamycin og sult ble brukt som autophagy indusere. Cellene ble inkubert med Torin 1 3 h (250 nM siste konsentrasjon); med rapamycin 16 h (200 nM siste konsentrasjon); og med Earle ' s balansert Salt løsning (EBSS) 2 h for å sulte celler.
- Etter 48 timer med totalt inkubasjonstiden, fjerne media på coverslides og vask dem med 1 mL PBS.
- å fastsette cellene, ruge cellene med 1 mL isen kalde sterilt filtrerte 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS (pH 7.4), etter 20 min ved romtemperatur uten noen agitasjon.
Siden PFA er følsomme for lys, holde (viktig) plate i mørket under inkubasjonstiden; dekker platen med aluminiumsfolie kan hjelpe. Videre PFA er giftig, derfor, arbeid under avtrekksvifte mens hvordan cellene.
Merk: Husk at fiksering trinn immunofluorescence eksperimenter bør optimeres, som spesifikke antistoffer fungerer best ved å bruke ulike fiksering agenter og forholdene. - Etter 20 min med PFA inkubering, fjerne PFA løsningen på coverslides og så vaske hver prøve 3 ganger med 1 mL steril filtrerte PBS. På dette trinnet, (viktig) vask brønnene enkeltvis for ikke å la dem tørke. Unngå tørke siden det vil forstyrre påfølgende reaksjoner av celler, endre cellen morfologi og øke uspesifisert signaler.
- Når vask er fullført, holde eksemplene i 1 mL PBS på ice.
- Forberede blokkerer løsningen: PBS med 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA) og 0,1% saponin.
- Dekker en 6-vel plate med parafin film. Kontroller at platen bunnen er jevn etter parafin filmen dekker. Etikett 6-vel platen.
- Ved hjelp av pinsett, overføring av coverslides fra 12-vel platene til 6-vel plater dekket med parafin film.
- Forkaste PBS på coverslides og legge 100 µL av blokkering løsning på hver coverslide for permeabilization. Inkuber prøvene på is 30 min.
- Forberede primære antistoffer i blokkering løsning. Før eksperimentene, optimalisere antistoff fortynninger for å definere de beste jobbe-konsentrasjonene til farging.
Merk: For eksempel LC3 antistoff brukes på en 1: 100 fortynning i blokkering løsning. - 30 min incubation, forkaste blokkerer løsningen og vaskes prøvene forsiktig med 1 mL av PBS gang.
- Legge til 100 µL av primære antistoff løsning til hver coverslide. Inkuber prøvene ved romtemperatur 1t, på en shaker.
Merk: Inkubasjon tid med det primære antistoffet skal optimaliseres. Avhengig av antistoffer, kan en overnatting inkubasjon på 4 ° C være å foretrekke. Det er best å ruge på en shaker forsiktig (100 rotasjoner/min) like distribuere antistoffer på coverslides. - Etter inkubasjon med det primære antistoffet, vaske prøver, 3 ganger med 1 mL PBS.
- Forberede 1:500 sekundære antistoff i blokkering løsning (optimaliseringer av fortynninger av sekundær antistoffer kan være nødvendig). Her, anti-kanin IgG Alexa Fluor 568 ble brukt som en sekundær anti-kanin antistoff.
- Ruge prøvene med 100 µL av sekundær antistoff løsning for 1t ved romtemperatur i en shaker. Siden fluorophore-merket sekundære antistoffer er følsom for lys, (viktig) holde løsningen i mørket. Sett prøvene i mørket under og etter den sekundære antistoff inkubering.
- Sekundære antistoff-inkubasjon vaskes platen 3 ganger med PBS.
Merk: Baed på erfaring, noen antistoffer har høye signaler som kan elimineres ved PBS vasker. Hvis håndtere slike et antistoff, etter trinn 1.21, kan holde prøvene i PBS på 4 ° C 6t hjelpe.- Eventuelt flekken cellene med en DNA-bindende fargestoff, som Hoechst, merke kjerner.
- Til stain flere protein, bruker du samme fremgangsmåte fra trinn 1,16 for andre protein.
- Kontroller at det er ingen arter reaktivitet mellom antistoffer når flekker med flere antistoff (f.eks, bruke musen og kanin antistoffer).
Merk: Her RACK1 er farget som andre protein med anti-RACK1 primære antistoffer og anti-musen IgG Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer bruker samme konsentrasjonen ovenfor.
- Kontroller at det er ingen arter reaktivitet mellom antistoffer når flekker med flere antistoff (f.eks, bruke musen og kanin antistoffer).
- Forberede montering løsningen: 50% glyserol i 1 x PBS. Filteret gjennom en 22 µm.
- Tørke lysbildene med etanol med en lofri tørke og legge 10 µL monteringsløsning til hvert lysbilde. Bruker en tweezer, plass coverslides på hver dropso som siden med cellene er i direkte kontakt med montering medium. Kaste overflødig monteringsløsning forsiktig ved hjelp av lofri kluter.
- Sel coverslides med en gjennomsiktig neglelakk. Først stabilisere coverslides ved å legge dråper neglelakk 4 kantene og deretter sel dem helt.
- Analysere prøvene under mikroskop fluorescent eller AC confocal så snart som mulig, siden fluorescerende signalet kan bleke etter noen timer.
- Koble og teller cellene som beskrevet i trinn 1.2 og 1.3.
- Hvis arbeider med HEK293T celler, frø 4 millioner celler for hvert vilkår i 15 cm Petri retter. Hvis arbeider med N2A celler, frø 5 millioner celler i 15 cm Petri retter. Inkuber cellene i en CO 2 inkubator på 37 ° C til slutten av eksperimentet.
- Behandle cellene med relevante narkotika eller betingelser for en definert varighet slik at total inkubasjon tiden cellene ikke overstiger 48 h.
Merk: For immunoprecipitation tester i denne studien, celler ble behandlet for 3t Torin 1 (250 nM), 16 h med rapamycin (200 nM), og 2 timer med EBSS. DMEM med 10% FBS ble lagt til cellene som kontroll. - Etter 48 h totale inkubasjon tid, Fjern media og høste celler. Siden HEK293T celler løsner lett fra platen, kan vaske platen med isen kalde PBS være tilstrekkelig for høsting. Men er N2A celler mer motstandsdyktig mot avdeling; Bruk cellen skrapere å høste celler.
- Samle alle cellene i microcentrifuge rør.
- Sentrifuge prøver 16.000 x g i 15 min 4 ° C. Forkast nedbryting og vask pellets med 1 mL PBS ved å deaktivere det ved pipettering.
- Gjenta sentrifuge trinn, men med høyeste sentrifuge hastighet på 4 ° C i 15 min. forkaste nedbryting.
- Forberede Radio Immuno-nedbør analysen (RIPA) bufferen før du starter eksperimentet.
Merk: Det er 3 typer RIPA buffer; velge etter samhandling intensiteten av proteiner etterforsket (se formlene nedenfor).- Hvis det er en sterk protein-protein samspill, velger du vanlig RIPA bufferen.
- Hvis samhandlingen er svak, velge mild RIPA eller mildere RIPA.
Merk: Oppskrifter på buffere er i fremgangsmåten. Alle buffere som brukes i immunoprecipitation tester bør suppleres med proteasehemmere.- Forberede vanlige RIPA Buffer med 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,5% natrium deoxycholate og 0,1% natrium dodecyl sulfat i 50 mM Tris pH 8.
- Forberede mild RIPA Buffer med 1% NP-40 og 150 mM NaCl 0,25% natrium deoxycholate i 50 mM Tris pH 7.5.
- Forberede mildere RIPA bufferen med 1 Triton-X 100%, 137 mM NaCl, 1% glyserol og 1 mM natrium orthovanadate i 50 mM Tris pH 7.4.
- Når du har valgt den riktige RIPA bufferen, supplere buffer med proteasehemmere (RIPA +). Deretter lyse cellene med 3 x volumet av cellen pellet i RIPA +.
- Vortex suspensjon for 15 s. holde den på is for 5 min. Gjenta vortex og glasur 5 ganger og deretter virvel prøvene 16.000 x g i 15 min 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ren microcentrifuge rør og sentrifuger fjerne rest celle rusk. Overføre nedbryting slik rent.
- Fortynne protein lysates 1:50 og forberede en 96-brønns plate med Tom og standarder. Fortynne prøvene.
- Mix utvalg med Bradford løsning 1:20. Inkuber i 15 min i mørket.
- Måle optisk densitet ved 595 nm bølgelengde. Beregn protein konsentrasjonen bruker absorbansen verdier for hvert utvalg.
- Dagen før høsting cellene, par protein A Plus perler med antistoffer som er spesifikke for protein interessepunkter.
- Kutt kanten av et 200 µL tips med saks og bruker 25 µL fra perle gjødsel for hvert vilkår.
- Vask perler når med 1 mL PBS, en gang med 1 mL RIPA buffer, og en gang med 1 mL RIPA +. Utføre vask trinnene på 3,300 x g, 4 ° C i 1
- Etter siste vask, legger 300 µL av RIPA + på perler og legge til 1,5 µg antistoff som er spesifikke for protein som trekkes ned.
- Ruge rør overnatting på 4 ° C på et rotator (20 rotasjoner/min).
Merk: Her ATG5 var immunoprecipitated bruke spesielle anti-ATG5 antistoffer.
- Den natten inkubasjonstiden for perler med antistoffer, vaskes perlene gang med PBS, en gang med RIPA, og en gang med RIPA + som beskrevet i trinn 2.12.2.
- Legge til 2 mg protein lysate på perlene for hver tilstand og fullføre det totale volumet til 300 µL med RIPA + buffer/rør. Inkuber rør overnatter på et rotator på 4 ° C.
- Inkubasjon vaskes perler som beskrevet tidligere (trinn 2.12.2).
- Etter siste vask, bruke en mindre Pipetter tips for å fjerne alle nedbryting uten å berøre perlene.
- Legge til 10 µL av 3 x lasting fargestoff: 6% SDS, 30% glyserol, 16% β-Mercaptoethanol og 0,1% Bromophenol blå i 1M Tris-HCl pH 6.8.
- Forberede inndatakontroller med minst 100 µg protein lysate for hvert vilkår. Utjevne eksempel volumer med vann og legge den aktuelle mengden 3 x lasting fargestoff.
- Koke eksempler på 95 ° C i 10 min.
Merk: Vanligvis når kokende prøvene, caps av rørene kan åpne spontant og prøvene går tapt. Unngå dette ved å holde caps stengt med en bestemt cap blokkering. - Spinn ned prøvene og Last på SDS side gels skille proteiner ifølge deres størrelser ved hjelp av standardprotokoller.
Merk: I denne studien på RACK1 og ATG5 prøver ble kjørt gjennom 12% polyakrylamid gels på 80 V i 30 min og så på 120 V i ca 90 minutter. Men for mindre proteiner som LC3, bruke 15% polyakrylamid gels er mer egnet. - Etter gel kjører er fullført, overføre proteiner nitrocellulose eller PVDF membraner ved hjelp av enten våt eller semi-tørr metoder. Deretter blokkere membraner av inkubasjon i 5% ikke-fett melk i PBS 0,05% mellom 20 (PBST) ved romtemperatur for 1 h. vask membraner 3 ganger med PBST for 5 min.
- Ruge membraner med primære antistoffer i arbeider konsentrasjoner 1t ved romtemperatur. Primære antistoff fortynninger, bruke BSA som inneholder røde løsninger (5% BSA Cohn V brøkdel, 0.02% Natriumazid i PBST, pH 7.5; legge fenol red lagt som en pH-markør) å tillate gjenbruk av antistoffer.
Merk: For eksempel fortynne ATG5 antistoff 2000 x i rød løsningen.- På slutten av inkubasjon tiden, vaske membraner 3 ganger med PBST.
- Ruge membraner med HRP-konjugerte sekundære antistoffer som ble utarbeidet i 5% ikke-fett melk løsning (her, anti-rabbit IgG på 1:10.000 ble brukt). Deretter vaske membraner 3 x med PBST for 5 min.
- Gjøre ECL løsningen: 25 mM luminol, 9 mM coumaric syre, 3 x 10 -4% H 2 O 2 i 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Bruke friske H 2 O 2 for hvert eksperiment.
Merk: Reaksjonen starter etter H 2 < /sub > O 2 tillegg, og det fortsetter for ca 20 min.- Ruge membraner og X-ray filmer for 20 min i ECL. Utvikle og fikse dem i et mørkt rom.
- For å sjekk co-immunoprecipitation proteiner med lukking eller overlappende molekylvekt, kan det være nødvendig å strippe antistoffer av membraner av rugende membraner på 60 ° C i 30 min i stripping bufferen: (25 mM Tris-HCl pH 2 og 1% SDS).
- Gjennta punkt 2,20 til 2,23 etter co-immunoprecipitation med forskjellige antistoffer. For eksempel ble etter ATG5 gjenkjenning og stripping av membraner, RACK1 protein testet på samme membraner bruker et anti-RACK1 primære antistoff (1:1, 000) og sekundær antistoffer (1:10, 000). Β-utgangen ble brukt som lasting kontrollen. og IgG signalet ble brukt som kontrollen lasting for immunoprecipitated prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 et eksempel på en co lokalisering vises resultatet bruker denne protokollen. En figur fra vår siste papir presenteres8. Her var endogene RACK1 protein farget i grønt, mens endogene LC3 var farget i rødt. Gule prikker som er observert i flettede bilder viser områder av overlapping mellom de grønne og røde signalene. Dermed representerer gule prikker den delvise co lokaliseringen av disse to proteinene.
Figur 1 : Representative immunofluorescence resultater. HEK293T celler ble kultivert på coverslides. Cellene ble behandles eller ikke behandles med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) eller sultet i EBSS (Stv, 2 h). Da var endogene proteiner immunostained ved hjelp av anti-RACK1 og anti-LC3 primære antistoffer. Cellene ble analysert under AC confocal mikroskop. CNT, ikke-behandlede celler. Flettingen, overlapping av greenand redsignals. Hvite arrowsshow yellowcytoplasmic prikker med RACK1 og LC3 co lokalisering. Denne forskningen ble opprinnelig publisert av Erbil et al. 8 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I figur 2vises et eksempel på en endogen immunoprecipitation resultat. I denne figuren ATG5 protein var politi og RACK1 co-immunoprecipitation ble oppdaget under ulike forhold. Normal kanin serum ble brukt som en negativ kontroll.
Figur 2: Representant immunoprecipitation resultater. HEK293T celler ble behandlet ikke behandlet med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) eller sultet i EBSS (2 t). Endogene ATG5 protein var immunoprecipitated fra cellen ekstrakter med anti-ATG5 antistoffer som var koblet til protein A Plus perler. Anti-ATG5 og anti-RACK1 antistoffer ble brukt for immunoblotting. Serum, kontroll kanin serum. Denne forskningen ble opprinnelig publisert av Erbil et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disse resultatene indikerer at RACK1 protein er involvert i autophagy veier. RACK1 protein Co lokalisert med LC3 protein på autophagosome-lignende strukturer under autophagy Innledning. Videre viste co-immunoprecipitation resultatene at RACK1 og ATG5 proteiner var samspill selv på basale forhold, og samhandlingen økt under autophagy aktivere forhold. Vi bekreftet tidligere ved hjelp av p62 fornedrelse og LC3-II akkumulering tester i tilstedeværelse eller fravær av lysosomale hemmere (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) at autophagic flux ikke var hemmet under eksperimentelle forhold8. Derfor resultatene presenteres her og andre steder viste at RACK1-ATG5 interaksjon er viktige for den innledende stadiet av autophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation og immunofluorescence er avgjørende for studiet av protein-protein interaksjoner. Selv om disse to teknikker brukes ofte og godt etablerte flere kriterier bør vurderes å definere kvaliteten på eksperimenter mens du bruker disse teknikkene.
Første, primære antistoffer som brukes i disse testene bør være bestemt proteiner av interesse. For å sikre dette, kan du bruke shRNA bokseren eller knockout celler for å teste spesifisitet av antistoffer i spørsmålet. I tillegg bruker positiv kontroller, eller behandle celler med en kjent induser av protein av interesse. Bunke til bunke varianter av antistoffer finnes også. Videre kan noen polyklonale antistoffer eller sera ha høye og uspesifikk band. Selv om noen av disse bandene alternative former for protein av interesse, generelt de resultat fra kryssreaktivitet av polyklonale antistoffer med relaterte proteiner eller de kan være ikke-spesifikk interaktører. Monoklonale antistoffer er i generelt mer bestemt i denne forstand, men generert kan være svakere. Bekreftelse av antistoff spesifisitet med merket proteiner og etablerte anti-tag antistoffer kan være nyttig, men endogene interaksjoner er enda mer verdifull og viktig.
Co lokalisering eller co-immunoprecipitation tester vil ikke definitivt opprette om protein-protein interaksjoner er direkte. Er det mulig at flere partnere kan megle observert interaksjoner. Faktisk i figur 1, ble en delvis co lokalisering av RACK1 og LC3 proteiner observert, som kan være et tegn på deres samspill; imidlertid tester direkte bindende i vitro rykk-ned søk bruker rekombinante proteiner eller fluorescens resonans energi overføring (bånd) mikroskopi kan brukes til å opprette om observerte samspillet er direkte eller ikke. På den annen side, vil teknikker som gel filtrering bidra til å avdekke komplekse protein samhandlingene med mer enn to proteiner i en mer overbevisende måte. En mer grundig analyse av immunofluorescence resultatene fra et autophagy perspektiv vil være å overvåke autophagy induksjon ved å telle antall prikker som er positivt for LC3 autophagy markøren i hver celle, siden en økning av antall LC3 positiv prikker samsvarer med antall autophagosomes. Bruk den Pearson koeffisienten, LIS metode eller Manders' koeffisientene tester gir bedre kvantitative og komparativ vurdering av de eksperimentelle resultatene.
Et annet viktig poeng er validering av ved hjelp av uavhengige teknikker og forskjellige linjer. Noen interaksjoner kan være gjenstander som er relatert til stickiness av proteiner eller protein overuttrykte. Hvis ikke nøye vasket, er ATG5 protein også utsatt for å holde seg til perler som brukes i immunoprecipitations (både agarose og sepharose perler). I tillegg i immunofluorescence tester, kan protein overuttrykte danne aggregater som ser ut som autophagosomes eller autolysosomes. Derfor ved utføring midlertidig transfections med co transfekterte fluorescerende proteiner som hva effekten kontrollen, i immunoblots, kan uttrykk nivåer av proteiner rundt bli sammenliknet med fluorescerende protein nivå i ekstrakter bruker spesifikke antistoffer, gir en metode for normalisering.
I alle disse testene er reproduserbarhet resultater av største betydning. Vi foretrekker å gjenta hvert eksperiment minst 3 - 4 ganger å være overbevist om innhentet resultater. Vi utfører lignende eksperimenter i minst to ulike linjer å bevise at våre observasjoner ikke er celle type-spesifikk. I tillegg må riktig positive og negative kontroller (f.eks, perler alene eller kontroll antistoffer pluss serum for immunoprecipitation tester) planlegges å nå rette konklusjoner. Under optimalisering av immunofluorescence teknikker er det nyttig å ha en sekundær antistoff bare kontroll der primære antistoff utelates. Denne kontrollen kontroller som observert signaler stamme fra den primære antistoff bindingen til protein av interesse, og ikke fra en uspesifisert binding av sekundær antistoffer.
Antall protein komplekser regulerer autophagy og andre biologiske hendelser er økende i funnet, men forskningen er langt fra å ha et komplett bilde. Selv om høy gjennomstrømming teknikker som massespektrometri eller bioinformatikk-baserte spådommer fortsette å avsløre nettverk av samhandling for flere autophagy-relaterte proteiner, bekreftelse av disse interaksjoner ved hjelp av klassisk biokjemi og mikroskopi metoder er viktig for å avdekke funksjonelle og dynamiske egenskapene til denne grunnleggende og viktig mobilnettet veien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av vitenskapelige og teknologiske Research Council av Tyrkia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci universitetet. SEB og NMK støttes av TUBITAK BIDEB 2211 stipend for doktorgrad studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
