Summary
Представленные здесь являются два методы исследования взаимодействия на основе антител протеин: иммунофлюоресценции и иммунопреципитации. Эти методы подходят для изучения физических взаимодействий между белками для обнаружения новых компонентов клеточной сигнальных путей и понимание динамики белков.
Abstract
Белок белковых взаимодействий являются важными для понимания сотовой сигнальных каскадов и выявления роман путь компонентов и динамики белков. Большая часть клеточной деятельности требует физических взаимодействий между белками. Для анализа и сопоставления этих взаимодействий, были разработаны различные экспериментальные методы, а также инструментов биоинформатики. Autophagy является сотовых рециркуляции механизм, который позволяет справиться с различными раздражители, включая лишение питательных веществ, химических веществ и гипоксии клетки. Чтобы лучше понять сигнализации событий, связанных с autophagy и обнаружить новые факторы, которые регулируют белковых комплексов в autophagy, мы провели экранов взаимодействия протеин протеина. Проверка этих результатов скрининга требует использования иммунофлюоресценции и методы иммунопреципитации. В этой системе, были протестированы конкретных связанных с autophagy белок белковых взаимодействий, которые мы обнаружили в Neuro2A (N2A) и HEK293T клеточных линий. Подробная информация о технических процедур, используемых описаны в этом документе визуализированных эксперимент.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, здесь) представляет собой механизм клеточного стресса характеризуется поглощение сыпучих цитоплазмы, белков и органеллы в двойной мембраной пузырьков называется autophagic везикулы. Через слияние внешнего слоя двойной мембраной autophagic везикулы и их грузы доставляются лизосом и деградированных нем1. Autophagy происходит низкими базальный во всех типах клеток и во всех организмах, выполняя гомеостатических функций, таких как деградации белка и органелл (например, митохондрии) оборот. В условиях, ведущих к клеточного стресса, таких, как голод autophagy быстро upregulated и позволяет ячейки для поддержания уровней энергии и основного обмена1,2,3.
Около 30 autophagy гены клонировали от дрожжей и их белковых продуктов были показаны играть роль на различных этапах процесса autophagic, включая везикул нуклеации, расширение, везикул фьюжн конце endosome/Лизосома, и деградация грузов 4 , 5. были выявлены Ортологи большинства этих генов и исследования в различных организмах подтвердил сохранение их клеточных функций6. Исследования в течение последнего десятилетия показали, что несколько autophagy связанных белковых комплексов и белок белковых взаимодействий существуют и что они управляют autophagy пути замысловатые и контролируемым образом. Перекрестки, резервные копии, механизмы обратной связи и прямой существуют, и они позволяют ячейку для координации autophagy с другими мероприятиями (например, везикулярной секреции, лизосома биогенеза, от англ сортировки и транспорта7и т.д.) В беспристрастной дрожжей два гибридных экране с помощью белка autophagy ATG5 как приманку (ATG5 является ключевой autophagy белка участвуют в системе спрягать E2-как, которая опосредует LC3 lipidation в голода индуцированной autophagy), мы определили рецепторов активировано C-киназы 1 (RACK1; GNB2L1) как сильный элемент и Роман autophagy компонент8. Важно отметить, что экран показал, что ATG5-RACK1 взаимодействие незаменимым для индукции autophagy, autophagy классических индукторов (то есть, голода и mTOR торможения).
Методы, основанные на иммунофлюоресценции обычно используются для отслеживания взаимодействий протеин протеина. Эти методы основаны на основном антитела и помочь визуализировать взаимодействие и подтвердить клеточной локализации. В этой технике, флуоресцентные метки конъюгированных антител, которые являются специфическими для протеинов интереса, обычно используются для специфического окрашивания. Каждый белка могут быть помечены с антителами, в сочетании с различными флуоресцентными красителями. С помощью белка специфические антитела, дублирование сигнала при слиянии изображения указывает Сопредседатель Локализация белков под confocal микроскопии. Этот метод применим к клетки или даже ткани. Методы иммунофлуоресценции предоставляют подсказки о взаимодействия динамики и помочь определить размер и распределение белковых комплексов, отслеживая общие изменения в клеточной морфологии под различные условия9. Иммунопреципитация-это другой часто используемый на основе антител метод, который позволяет для анализа взаимодействий между учетом белков10. Используя эту технику, протеинов интереса изолированы от клеток или тканей выдержки, с использованием специфических антител, в результате осаждения белков, которые в комплексе или в контакте с протеином интереса. Co Иммунопреципитация, где обнаружен белок и его Сопредседатель интерактивных, показывает не только взаимодействие между двумя белками, но можно измерить его сила взаимодействия при различных обстоятельствах11.
Этот протокол описывает в детали ключевых методов, которые были использованы для подтверждения и характеризуют ATG5-RACK1 и RACK1-LC3 взаимодействия. Основное внимание уделяется иммунофлюоресценции и иммунопреципитации техники, с уделением особого внимания критических шагов и ловушки для autophagy исследований, а также устранение неполадок предложения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. иммунофлюоресценции
- поддерживать HEK293T человеческих эмбриональных почек клеток в среде DMEM высокой глюкозы, и N2A мыши neuroblast клеток в среде DMEM низкий средний глюкозы, 5% CO 2-увлажненные инкубатора 37 ° c. Дополнение к культуре СМИ с 10% тепло инактивированная плода говядину (ФБС) сыворотки, антибиотики (50 ед/мл пенициллин, стрептомицин 50 мкг/мл) и L-глютамин (2 мм).
- Отсоедините клетки с помощью трипсин 0.25%. Сначала удалите носители культуры клетки затем вымыть клетки с 10 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS) и инкубировать 1 мл трипсина при 37 ° C за 5 мин неактивным трипсина, добавив 2 мл DMEM среднего.
- Мыть плиты хорошо закупорить. Удаление 10 мкл раствора клеток и смешайте его с 10 мкл Трипановый синий. Подсчитать количество живых клеток с помощью Горяева.
- Как HEK293T и N2A адэрентных клеток линии, однако, HEK293T клетки отсоединить от пластины легко. Таким образом, при работе с HEK293T клеточной линии, пальто coverslides с стерильной фильтрации 0,01% поли L-лизин до заполнения ячеек.
- Стерильный coverslides место в 10 см Петри. Добавьте соответствующее количество поли L-лизин раствор на каждом coverslide. Инкубировать coverslides раствором поли L-Лизин для 10 мин
- Удаление решения поли L-лизин.
Примечание: Поли-L-лизин многоразового использования; Это необязательно собирать и использовать его для дальнейших экспериментов. Так как поли L-лизин является токсичным, подождать, пока все решения на coverslides полностью испаряется, а затем восстановить поли L-лизин. - Мыть coverslides с стерильных PBS.
- Добавьте 1 mL DMEM в каждой скважине 12-ну плиты. Место coverslide в каждой скважине.
- 20 000 семян клеток/Ну, по капле при встряхивании пластину в то же время обеспечивает однородность распределения клеток на coverslides. Держите клетки в CO 2 инкубатора при 37 ° C и добавить препарат таким образом, чтобы общая инкубации время не превышает 48 часов, т.е., 3 ч лечения Торин, добавить препарат на 45 h пост посева.
Исследования взаимодействия
- для RACK1-LC3, Торин 1, rapamycin и голод были использованы в качестве индукторов autophagy. Клетки инкубировали с Торин 1 для 3 h (250 Нм конечная концентрация); с rapamycin для 16 h (200 Нм конечная концентрация); и с Эрл ' s сбалансированный соли раствора (EBSS) за 2 ч для того чтобы голодать клетки.
Примечание: Инкубации в среде DMEM с 10% FBS была использована как условие управления.
- для RACK1-LC3, Торин 1, rapamycin и голод были использованы в качестве индукторов autophagy. Клетки инкубировали с Торин 1 для 3 h (250 Нм конечная концентрация); с rapamycin для 16 h (200 Нм конечная концентрация); и с Эрл ' s сбалансированный соли раствора (EBSS) за 2 ч для того чтобы голодать клетки.
- После 48 ч инкубации общего времени, удалите средства массовой информации на coverslides и мыть их с 1 мл PBS. Инкубировать
- исправить клетки, клетки с 1 мл льда холодного стерильного отфильтрованного 4% параформальдегида (PFA) в PBS (рН 7,4), 1 x 20 мин при комнатной температуре без каких-либо агитации.
Так как PFA чувствительны к свету, держите (важно) пластины в темноте в инкубационный период; пластина с алюминиевой фольги может помочь. Кроме того, PFA является токсичным, таким образом, работать под вытяжной шкаф при фиксации клетки.
Примечание: Имейте в виду, что фиксация шагом в иммунофлуоресценции эксперименты должны быть оптимизированы, как специфические антитела могут работать лучше с помощью фиксации различных агентов и условий. - После 20 мин PFA инкубации, сначала удалите PFA решения на coverslides и затем вымыть каждый образец 3 раза с 1 мл стерильного отфильтрованного PBS. На этот шаг, (важно) промыть скважин по одному чтобы не позволить им высохнуть. Избегайте сушки, поскольку он будет вмешиваться с последующей реакции клеток, изменить морфологию клеток и увеличить неконкретные сигналы.
- После мытья, сохранить образцы в 1 мл PBS на ДВС.
- Подготовить блокирующие решение: PBS с 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0,1% сапонинов.
- Крышка 6-колодец с парафином фильм. Убедитесь, что нижней пластины гладкой после покрытия фильм парафин. Ярлык пластину 6-а.
- С помощью пинцета, передачи coverslides из 12-ну пластины 6-ну пластины покрыты пленкой парафин.
- Отменить PBS на coverslides и 100 мкл преграждая разрешение на каждом coverslide для permeabilization. Проинкубируйте образцы на льду на 30 мин
- Подготовить основное антитело блокирует решение. До экспериментов, оптимизировать разбавления антитела для определения лучших рабочей концентрации для пятнать.
Примечание: например, антитела LC3 используется при разбавлении 1: 100 в преграждая разрешение. - После 30 минут инкубации, отказаться от блокирования решения и один раз мыть образцы нежно с 1 мл раствора PBS.
- Добавить 100 мкл раствора первичного антитела к каждому coverslide. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре за 1 ч, на шейкере.
Примечание: Время инкубации с основное антитело должны быть оптимизированы. В зависимости от антител ночь инкубации при температуре 4 ° C может быть предпочтительным. Это лучше для инкубации на шейкер мягко (100 вращ. / мин) чтобы равномерно распределить антител на coverslides. - После инкубации с основного антитела, стирать образцы индивидуально, 3 раза с 1 мл PBS.
- Подготовить 1: 500 вторичное антитело в блокировании решение (оптимизации разведений вторичные антитела могут потребоваться). Здесь, 568 Fluor Alexa IgG против кролик был использован в качестве вторичного антитела анти кролик.
- Проинкубируйте образцы с 100 мкл раствора вторичное антитело для 1 ч при комнатной температуре на шейкер. Поскольку Флюорофор меченых вторичные антитела являются чувствительными к свету, (важно) Держите решение в темноте. Поместите образцы в темноте, во время и после инкубации вторичное антитело.
- После вторичное антитело инкубации, промойте пластины 3 раза с PBS.
Примечание: Baed опыт, некоторые антитела имеют высокий фон сигналы, которые не могут быть устранены путем PBS моет. Если дело с антителом после шага 1.21, сохраняя образцы в PBS на 4 ° C для 6 h может помочь.- В случае необходимости, запятнать клетки с ДНК связывающих красителя, например Hoechst, чтобы отметить ядер.
- Пятно более чем одного белка, применить ту же процедуру, начиная с шага 1.16 для второй белок.
- Убедитесь, что нет никаких видов реактивности между антител при выполнении окрашивание с более чем одного антитела (например, использование мыши и кролик антител).
Примечание: Здесь, RACK1 окрашенные как второй белок с помощью первичных антител анти RACK1 и анти мыши вторичные антитела IgG Alexa Fluor 488 же концентрации, упомянутых выше.
- Убедитесь, что нет никаких видов реактивности между антител при выполнении окрашивание с более чем одного антитела (например, использование мыши и кролик антител).
- Подготовить решение монтажа: 50% глицерина в однократном ПБС. Фильтр через фильтр 22 мкм.
- Протрите слайды с этанолом, с помощью безворсовой wipe и добавить 10 мкл монтажа решение для каждого слайда. Используя пинцет, место coverslides на каждый dropso, что сторона с клетками находится в прямом контакте с носителем установки. Отменить решение избыток монтажа, аккуратно с помощью безворсовой салфетки.
- Уплотнение coverslides с прозрачным лаком. Во-первых, стабилизировать coverslides, добавляя капли лак по краям 4 и затем запечатать их полностью.
- Анализ образцов под люминесцентные или Конфокальный микроскоп как можно скорее, поскольку флуоресцентного сигнала могут отбеливать через несколько часов.
- отсоединения и количество ячеек, как описано в шагах 1.2 и 1.3.
- При работе с HEK293T клетками, семян 4 миллионов клеток для каждого условия в чашках Петри 15-см. При работе с N2A клетки, семян 5 миллионов клеток в чашках Петри 15 см. Инкубировать клетки в инкубатор CO 2 при 37 ° C до конца эксперимента.
- Лечения клетки с соответствующими препаратами или условия на определенный срок, так что время общая инкубации клеток не превышает 48 ч.
Примечание: Для иммунопреципитации тестов в этом исследовании, клетки лечили 3 часа с 1 Торин (250 Нм), 16 h с rapamycin (200 Нм) и 2 h с EBSS. DMEM с 10% FBS был добавлен к ячейкам элемента управления. - После 48 ч инкубации общего времени, удалите средства массовой информации и урожай клетки. Поскольку HEK293T клетки легко отсоединить от плиты, мытье пластину с льдом холодной PBS может быть достаточным для уборки. Однако N2A клетки более устойчивы к отряда; использовать ячейки скребки для сбора клеток.
- Собрать все клетки в пробирках microcentrifuge.
- Образцы центрифуги g 16000 x 15 мин на 4 ° C. удалить супернатант и мыть лепешка с 1 мл PBS приостановив его повторно, закупорить.
- Повторите центрифуги, но в самую высокую скорость центрифуги на 4 ° C на 15 мин удалить супернатант.
- Подготовить радио иммуно-осадков Assay (RIPA) буфера до начала эксперимента.
Примечание: Существует 3 типа Буфер RIPA; Выберите по интенсивности взаимодействия белков, расследуются (см. ниже формулы).- Если есть сильный протеин взаимодействия, выбрать регулярные Буфер RIPA.
- Если взаимодействие слабых, выбрать мягкий RIPA или мягкий RIPA.
Примечание: Рецепты этих буферов находятся в следующих шагах. Все буферы, которые используются в иммунопреципитации тесты должны дополняться ингибиторов протеазы.- Готовить регулярные Буфер RIPA, с использованием 1% NP-40, 150 мм NaCl, Дезоксихолат натрия 0,5% и 0,1% натрия Додециловый сульфат 50 мм трис рН 8.
- Подготовить мягкая Буфер RIPA, используя Дезоксихолат натрия 1% NP-40, 150 мм NaCl и 0,25% в 50 мм трис pH 7.5.
- Подготовить мягче Буфер RIPA, с использованием 1% тритон-X 100, 137 мм NaCl, 1% глицерина и 1 мм Ортованадат натрия в 50 мм трис рН 7,4.
- Выбрав соответствующий буфер RIPA, дополнение буфер с ингибиторами протеаз (RIPA +). Затем, Лизируйте клетки с 3 x объем ячейки Пелле в RIPA +.
- Водоворот подвеска для 15 s. держать его на льду за 5 мин повторить вихря и обледенения 5 раз и затем Центрифугуйте образцы на 16000 x g 15 мин на 4 ° C.
- Передачи супернатант чистой microcentrifuge трубки и центрифуги для удаления остатков клеток мусора. Передавать чистый трубки супернатант.
- Развести белка лизатов 1:50 и подготовить 96-луночных пластины с пустым и стандартов. Развести образцы.
- Mix образцы с Брэдфорд раствор 1:20. Инкубируйте 15 мин в темноте.
- Измеряют оптическую плотность на 595 Нм длины волны. Рассчитать концентрацию протеина, с помощью оптической плотности значений для каждой выборки.
- За день до уборки клеток, пара белков плюс бусины с антителами, которые являются специфическими для протеина интереса.
- Край кончик 200 мкл, ножницами вырезать и использовать 25 мкл из бисера пульпы для каждого условия.
- Мыть бусины с 1 мл PBS, раз с 1 мл Буфер RIPA и один раз с 1 мл RIPA +. Выполнить шаги мыть на 3300 x g, 4 ° C в течение 1 мин
- После последнего мыть, 300 мкл RIPA + на бисер и добавить 1,5 мкг антитела, относящиеся к белка, чтобы быть снесены.
- Инкубировать трубы на ночь при 4 ° C на вращателе (20 вращ. / мин).
Примечание: Здесь, ATG5 был immunoprecipitated, с использованием конкретных анти ATG5 антител с.
- После ночи инкубации бусы с антителом, мыть бусины раз с PBS, один раз с RIPA и один раз с RIPA +, как описано в шаге 2.12.2.
- Добавить 2 мг белка lysate на бусы для каждого состояния и завершить общий объем до 300 мкл с RIPA + трубки буфера. Инкубируйте трубы на ночь на вращателе на 4 ° C.
- После инкубации, мыть как описано бусины (шаг 2.12.2).
- После последнего мыть, использовать меньше наконечник пипетки для удаления всех супернатант без касатьться бисер.
- Добавить 10 мкл 3 x загрузки краска: 6% SDS, 30% глицерина, β-меркаптоэтанол 16% и 0,1% бромфеноловый синий в 1 М трис-HCl pH 6.8.
- Подготовить элементы управления вводом, используя по меньшей мере 100 мкг белка lysate для каждого условия. Выравнивают образец томов с помощью воды и добавить соответствующий объем 3 x загрузки красителя.
- Образцы кипения при 95 ° C на 10 мин
Примечание: Обычно при кипячении образцы, колпачки трубы можно открыть спонтанно и образцы будут потеряны. Избежать этого, удерживая шапки, закрыт с блокатор конкретных Кап. - Спин вниз образцов и нагрузки на гелях SDS-PAGE чтобы отделить протеины по их размерам, с использованием стандартных протоколов.
Примечание: В этом исследовании на RACK1 и ATG5, образцы были запустить через 12% полиакриламидных гелей на 80 V для 30 минут, а затем на 120 V приблизительно 90 мин. Однако, для небольших белки, например LC3, с использованием полиакриламидных гелей на 15% больше подходит. - После завершения, гель работает передача белков на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны, либо методом мокрой или полусухой передачи. Затем, блокировать мембраны, инкубации в 5% обезжиренное молоко в PBS с 0,05% анимации 20 (PBST) при комнатной температуре в течение 1 ч. мыть мембраны 3 раза с PBST на 5 мин
- Инкубации мембран с первичных антител в рабочих концентрациях за 1 ч при комнатной температуре. Для разведения основное антитело, Используйте BSA, содержащие красный решения (5% BSA Кона V дроби, азид натрия 0,02% в PBST, рН 7,5; добавить фенола Красного добавлены как маркер рН) чтобы разрешить повторное использование антител.
Примечание: например, развести ATG5 антитела 2000 x в красный решения.- В конце время инкубации, мыть мембраны 3 раза с PBST.
- Инкубации мембран с ПХ конъюгированных вторичные антитела, которые были подготовлены в раствор 5% обезжиренное молоко (здесь, анти кролик IgG в также использовался). Затем вымойте мембраны 3 x с PBST на 5 мин
- Сделать решение ECL: luminol 25 мм, 9 мм кумариновая кислота, 3 x 10 -4% H 2 O 2 в 70 мм трис-HCl рН 8,8. Используйте свежие H 2 O 2 для каждого эксперимента.
Примечание: Реакция начинается после H 2 < /sub > O 2 сложения и он продолжает на около 20 мин.- Инкубации мембран и рентгеновские пленки для 20 мин в стэк. Разработать и исправить их в темной комнате.
- Для проверки co иммунопреципитация белков с close или перекрывающихся молекулярным весом, может быть необходимо лишить антитела от мембраны, инкубации мембран при 60 ° C на 30 мин в буфере зачистки: (25 мм трис-HCl рН 2 и 1% SDS).
- Повторите шаги 2.20 в 2.23 для проверки co иммунопреципитация, с использованием различных антител. Например после обнаружения ATG5 и зачистки мембран, RACK1 белка был протестирован на же мембраны, с использованием основного антитела анти RACK1 (1:1, 000) и вторичные антитела (1:10 000). Β-актина был использован в качестве элемента управления загрузкой; и IgG сигнал был использован как контроль погрузки для образцов immunoprecipitated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В Рисунок 1 пример совместного локализации отображается результат, полученные с помощью этого протокола. Фигура из нашей недавней работе представлен8. Здесь эндогенного белка RACK1 был окрашенных в зеленый цвет, в то время как эндогенных LC3 был окрашенных в красный цвет. Желтые точки, которые наблюдаются в Объединенном фотографии указывают места перекрытия между зеленый и красный сигналы. Таким образом желтые точки представляют собой частичное совместное локализации этих двух белков.
Рисунок 1 : Результаты представитель иммунофлюоресценции. HEK293T клетки были культивированный на coverslides. Клетки были лечить или не лечить с rapamycin (рапа, 200 Нм, 16 h) или 1 Торин (Торин, 250 Нм, 3 ч), или от голода в EBSS (СТВ, ч. 2). Затем эндогенного белки были immunostained с помощью анти RACK1 и анти LC3 первичных антител. Клетки были проанализированы под конфокального микроскопа. НКТ, не обработанные клетки; Слияние, наложение greenand redsignals. Белые точки yellowcytoplasmic arrowsshow с RACK1 и LC3 Сопредседатель локализации. Это исследование был первоначально опубликован в Эрбиле и др. 8 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2представлен пример результата эндогенного иммунопреципитации. На этом рисунке ATG5 белков было ускорено и RACK1 co иммунопреципитация был обнаружен в различных условиях. Сыворотке нормальный кролик был использован как отрицательный контроль.
Рисунок 2: Результаты представитель иммунопреципитации. HEK293T клетки были лечить или не лечить rapamycin (рапа, 200 Нм, 16 h) или 1 Торин (Торин, 250 Нм, 3 ч) или голодали в EBSS (2 ч). Эндогенного белка ATG5 был immunoprecipitated от выдержек клетки, с использованием антител анти ATG5, которые были соединены белка плюс бисером. Анти-ATG5 и анти RACK1 антитела были использованы для immunoblotting. Сыворотки, сыворотка кролика управления. Это исследование был первоначально опубликован в Эрбиле и др. 8. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Эти результаты показывают, что RACK1 белок участвует в пути autophagy. RACK1 белок совместно локализованы с LC3 белка на autophagosome как структуры во время индукции autophagy. Кроме того co иммунопреципитация результаты показали, что даже в базальных условиях взаимодействия RACK1 и ATG5 белки, и уровни взаимодействия возросла под autophagy, активация условий. Мы подтвердили ранее, используя p62 деградации и LC3-II накопление тесты в присутствии или отсутствии лизосомальных ингибиторы (Bafilomycin, E64D/Pepstatin A), что autophagic потока не препятствует в экспериментальных условиях8. Таким образом результаты представленные здесь и в других местах показали, что RACK1-ATG5 взаимодействия имеет важное значение для начальных этапов autophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы иммунопреципитации и иммунофлюоресценции имеют решающее значение для изучения взаимодействий протеин протеина. Хотя эти две техники широко используются и устоявшейся, некоторые критерии должны рассматриваться для определения качества экспериментов при использовании этих методов.
Во-первых, первичного антитела, которые используются в этих испытаний должны быть конкретными для протеинов интереса. Для обеспечения этого, используйте индуцируемый нокдаунов или нокаут клетки для тестирования Специфичность антител в вопросе. Кроме того использовать позитивные элементы, или лечить клетки с известный индуктор протеина интереса. Также существуют партии для пакетного изменения антител. Кроме того некоторые Поликлональные антитела или Сера может иметь высокий фон и неспецифичных. Хотя некоторые из этих групп могут быть альтернативные формы протеина интереса, в целом они являются результатом перекрестной реактивности поликлональных антител с родственных белков или они могут быть неспецифическими посредники. Моноклональные антитела, в общем более конкретные в этом смысле, хотя сигналов может быть слабее. Подтверждение о специфичности антитела с тегами белков и установленным антитела анти тег может быть полезным, но эндогенного взаимодействия еще более ценным и важным.
Совместное локализации или co иммунопреципитация тесты не установит окончательно ли белок белковых взаимодействий являются прямыми. Вполне возможно, что дополнительных партнеров может посредничать наблюдаемых взаимодействий. Действительно в Рисунок 1, было отмечено частичного совместного локализации RACK1 и LC3 белков, которые могут быть признаком их взаимодействия; Однако прямой привязки тесты, такие как в vitro раскрывающемся assays с помощью рекомбинантных белков или микроскопии флуоресцирования передачи энергии резонанса (ЛАДА) могут быть использованы для установления ли наблюдаемые взаимодействия являются прямыми или нет. С другой стороны методы, такие как фильтрация гель поможет раскрыть сложных белковых взаимодействий с участием более чем двух белков более убедительно. Более тщательный анализ результатов иммунофлюоресценции с точки зрения autophagy бы контролировать autophagy индукции, подсчитывая количество точек, которые являются позитивными для LC3 autophagy маркера в каждую ячейку, поскольку увеличение числа LC3 позитивные точки коррелирует с числом autophagosomes. Использование коэффициент Пирсона, ли метод или Manders коэффициенты тесты предоставляют лучше количественной и сравнительной оценки экспериментальных результатов.
Другим важным моментом является проверка взаимодействий с использованием независимых методов и различных клеточных линий. Некоторые взаимодействия могут быть артефактов, которые связаны с липкость белки или гиперэкспрессия белка. Если не тщательно промывают, ATG5 белок также склонны придерживаться бусины, которые используются в immunoprecipitations (агарозы или sepharose бусины). Кроме того в тестах иммунофлюоресценции, гиперэкспрессия белка могут образовывать агрегаты, которые выглядят как autophagosomes или autolysosomes. Таким образом при выполнении временной transfections, использование совместно transfected флуоресцентные белки как элемент управления эффективность трансфекции, в иммуноблотов, уровни выражения протеинов интереса можно сравнить с уровнями флуоресцентный белок в экстрактах с помощью специфические антитела, предоставляя метод нормализации.
Во всех этих тестах воспроизводимость результатов имеет первостепенное значение. Мы предпочитаем, чтобы повторить каждый эксперимент по крайней мере 3 - 4 раза чтобы убедиться полученных результатов. Мы также проводим подобные эксперименты в по крайней мере двух различных клеточных линий, чтобы доказать, что наши наблюдения не являются клетки определенного типа. Кроме того следует планировать правильный положительной и отрицательной контроля (например, бусины самостоятельно или управления антитела плюс сыворотки для иммунопреципитации тестов) делать правильные выводы. В процессе оптимизации методов иммунофлюоресценции полезно иметь вторичное антитело только контроль, где основное антитело опущен. Этот элемент управления убедитесь в том, что наблюдается сигналы исходят от первичного антитела связывая к протеину интереса, а не от привязки неспецифических вторичных антител.
Количество белковых комплексов, регулирующие autophagy и другие биологические мероприятия растут в обнаружения, но исследования является далеко не полной картины. Хотя высок объём таких методов, как масс-спектрометрии или на основе биоинформатики прогнозов по-прежнему показывают сетей взаимодействия для нескольких связанных с autophagy белков, подтверждения этих взаимодействий с использованием классических биохимии и методы микроскопии имеет важное значение для того, чтобы раскрыть функциональные и динамических свойств этого основных и важных клеточных пути.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана науки и технологических исследований Совет Турции (ТУБИТАК) 1001 Грант 107T153, университета Сабанчи. SEB и НМК поддерживаются TUBITAK BIDEB 2211 стипендии кандидат исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
