Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación

Summary

Presentados aquí son dos técnicas de investigación de interacción de proteínas anticuerpo-basado: la inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación. Estas técnicas son convenientes para el estudio de interacciones físicas entre proteínas para el descubrimiento de nuevos componentes de vías de señalización celulares y para la dinámica de la proteína de comprensión.

Abstract

Las interacciones proteína-proteína son importantes cascadas de señalización celular de comprensión identificación vía nuevos componentes y dinámica de proteínas. La mayoría de las actividades celulares requiere interacciones físicas entre proteínas. Para analizar y mapear estas interacciones, se desarrollaron varias técnicas experimentales como herramientas bioinformáticas. La autofagia es un celular reciclado mecanismo que permite a las células hacer frente a diferentes factores de estrés, incluyendo hipoxia, productos químicos y privación de nutrientes. Para entender mejor la autofagia-eventos relacionados con señalización y descubrir nuevos factores que regulan los complejos proteicos en la autofagia, realizamos pantallas de interacción proteína-proteína. Validación de estos resultados requiere el uso de técnicas de inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia. En este sistema, interacciones proteína-proteína relacionada con la autofagia específico que descubrimos fueron probadas en Neuro2A (N2A) y líneas de células HEK293T. Detalles de los procedimientos técnicos utilizados se explican en este artículo experimento visualizado.

Introduction

Macroautophagy (autofagia, aquí) es un mecanismo de estrés celular que se caracteriza por el secuestro de citoplasma grueso, proteínas y organelos en vesículas de doble membrana llamados vesículas autofágicas. A través de la fusión de la capa externa de la membrana doble, vesículas autofágicas y su carga se entregan a los lisosomas y degradación en ella¹. Autofagia ocurre en bajos niveles basales en todos los tipos celulares y en todos los organismos, realizando funciones homeostáticas como degradación de las proteínas y organelas (p. ej., mitocondrias) facturación. Bajo condiciones de estrés celular, como el hambre, la autofagia es rápidamente alza y permite a la célula mantener los niveles de energía y metabolismo básico^1,2,3.

Alrededor de 30 genes de autofagia han sido clonados de la levadura y sus productos de proteína fueron demostrados para desempeñar un papel en las distintas etapas del proceso de autofagia, incluyendo nucleación de vesícula, expansión, fusión de la vesícula al último endosome/lisosoma y degradación de la carga ^{4 , 5}. se han identificado ortólogos de la mayoría de estos genes y estudios en distintos organismos confirmaron la preservación de sus funciones celulares⁶. Estudios en la última década demostraron que varios autofagia relacionadas existen complejos de la proteína y las interacciones proteína-proteína y que gobiernan las vías autofagia de manera intrincada y controlada. Existen intersecciones, copias de seguridad, retroalimentación y mecanismos de feedforward, y permiten que la célula de coordinación de la autofagia con otros eventos relacionados (tales como secreción vesicular, biogénesis del lisosoma, endosomal clasificación y transporte⁷, etc.) En una pantalla de imparcial híbrido de levadura-dos utilizando la proteína autofagia ATG5 como cebo (ATG5 es una proteína de autofagia clave implicados en el sistema de conjugación como E2 que media lipidation LC3 en inanición inducida por autofagia), hemos identificado del Receptor activado C-kinasa 1 (RACK1; GNB2L1) como un fuerte interactor y un componente de autofagia novela⁸. Lo importante, la pantalla mostró que la interacción ATG5-RACK1 fue indispensable para la inducción autofagia por inductores de autofagia clásica (inhibición, es decir, hambre y mTOR).

Métodos de inmunofluorescencia se utilizan para controlar las interacciones proteína-proteína. Estas técnicas están principalmente basados en anticuerpos y ayudan a visualizar las interacciones y confirmar localizaciones celulares. En esta técnica fluorescente etiqueta conjugados anticuerpos que son específicos de las proteínas de interés se utilizan generalmente para la tinción específica. Cada proteína puede etiquetarse con anticuerpos acoplados a tintes fluorescentes diferentes. Usando los anticuerpos específicos de proteína, una superposición de la señal cuando se combinan imágenes indica la colocalización de proteínas bajo microscopia confocal. La técnica es aplicable a células o tejidos incluso. Técnicas de inmunofluorescencia proporcionan pistas sobre la dinámica de interacción y ayudar a identificar el tamaño y distribución de complejos proteicos, y seguimiento de los cambios generales en la morfología celular bajo diferentes condiciones⁹. La inmunoprecipitación es otra técnica utilizada basados en anticuerpos que permite el análisis de las interacciones entre dado proteínas¹⁰. Usando esta técnica, proteínas de interés se aíslan de células o tejido extractos utilizando anticuerpos específicos, dando por resultado la precipitación de proteínas que se encuentran en un complejo o en contacto con una proteína de interés. Co-inmunoprecipitación, donde se detectaron la proteína y su interactor Co, revela no sólo la interacción entre dos proteínas, pero puede medir su intensidad de interacción bajo diferentes circunstancias¹¹.

Este protocolo se describe en técnicas clave de detalle que se utilizaron para confirmar y caracterizar la interacción ATG5-RACK1 y RACK1-LC3. El enfoque es sobre técnicas de inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación con énfasis de pasos críticos y las dificultades para la investigación de la autofagia, así como sugerencias de solución de problemas.

Protocol

1. inmunofluorescencia

1. mantener HEK293T riñón embrionario humano células en medio de la glucosa alta de DMEM, y células de neuroblasto de ratón N2A en DMEM bajo medio de glucosa, 5% CO ₂-incubador humedecido a 37 ° C. Complementar los medios de cultivo con suero bovino fetal inactivado por calor de 10% (FBS), antibióticos (50 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL) y L-glutamina (2 mM).
2. Separar las células utilizando tripsina 0.25%. Primero quitar los medios de cultivo celular y luego lavar las células con solución salina 10 mL estéril tamponada con fosfato (PBS) e incubar con 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min Inactivate tripsina mediante la adición de medio DMEM de 2 mL.
3. Lavar la placa bien mediante pipeteo. Extraiga 10 μl de solución de la célula y se mezcla con 10 μl de azul tripán. Contar el número de células vivas usando un hemocitómetro.
4. HEK293T ambos y N2A es líneas de células adherentes, sin embargo, las células HEK293T separan de la placa fácilmente. Por lo tanto, si se trabaja con la línea de células HEK293T, capa la coverslides con estéril filtrado 0.01% poly-L-lisina antes de sembrar las células.
   1. Coverslides estéril de lugar en una placa de Petri de 10 cm. Añadir la cantidad apropiada de solución de poli-l-lisina en cada coverslide. Incubar coverslides con solución de poli-l-lisina durante 10 minutos
   2. Quitar la solución de poli-l-lisina.
      Nota: Poly-L-lisina es reutilizable; es opcional recopilar y reutilizar para otros experimentos. Desde poly-L-lisina es tóxico, espere hasta que toda la solución en el coverslides se evapora completamente y luego recuperar la poli-l-lisina.
   3. Lave coverslides con PBS estéril.
5. Agregar 1 mL de DMEM en cada pocillo de una placa de 12 pozos. Colocar un coverslide en cada pocillo.
6. Semilla 20.000 células/pozo, gota a gota agitando la placa a la vez una distribución homogénea de las células de la coverslides. Mantener las células en el CO ₂ incubadora a 37 ° C y agregar la droga por lo que el tiempo de incubación total no exceda de 48 horas, es decir, para 3 h tratamiento de Torin, añadir el medicamento a 45 h post siembra. Estudios de interacción de
   1. de RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina y hambre fueron utilizados como inductores de la autofagia. Las células fueron incubadas con Torin 1 durante 3 h (250 nM concentración final); con rapamicina durante 16 h (200 nM concentración final); y con Earle ' s balanceado sal solución (EBSS) por 2 h para las células de morir de hambre.
      Nota: Incubación en DMEM con 10% FBS fue utilizado como la condición control.
7. Después de 48 h de incubación total, eliminar los medios de comunicación en la coverslides y lavarlas con 1 mL de PBS.
8. Para fijar las células, incubar las células con 1 mL hielo frío estéril filtrada paraformaldehído al de 4% (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4), por 20 min a temperatura ambiente sin ninguna agitación.
   PFA es sensible a la luz, mantener (importante) la placa en la oscuridad durante el período de incubación; cubrir la placa con papel de aluminio puede ayudar. Por otra parte, PFA es tóxico, por lo tanto, trabajar bajo una campana de humos mientras que las células de fijación.
   Nota: Ten en cuenta que la fijación en los experimentos de inmunofluorescencia debe ser optimizado, como los anticuerpos específicos pueden trabajar mejor utilizando agentes de fijación diferentes y condiciones.
9. Después de 20 min de incubación de la PFA, primero retire la solución de la PFA en el coverslides y lavar cada muestra 3 veces con PBS filtrado estéril de 1 mL. En este paso, (importante) lavar los pocillos uno por uno para que no se deje secar. Evitar que se sequen ya que se interfieren con las reacciones posteriores de las células, cambiar la morfología de la célula y aumentar señales inespecíficas.
10. Cuando el lavado es completado, mantener las muestras en 1 mL de PBS en hielo.
11. Prepare la solución de bloqueo: PBS con 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) y 0.1% saponina.
12. Cubre una placa de 6 pozos con la película de parafina. Asegúrese de que la placa inferior es suave después de la cubierta de la película de parafina. Etiqueta de la placa de la pozo 6.
13. Con unas pinzas, transferencia de la coverslides de las placas 12-bien a las placas de 6 pozos cubiertos con la película de parafina.
14. Descartar el PBS en coverslides y agregue 100 μl de solución en cada coverslide para permeabilización de bloqueo. Incubar las muestras en hielo durante 30 minutos
15. Preparar el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Antes de los experimentos, optimizar las diluciones de anticuerpo para definir las mejores concentraciones de trabajo para la tinción de.
    Nota: por ejemplo, LC3 anticuerpo se utiliza en una dilución 1: 100 en solución de bloqueo.
16. Después de la incubación de 30 minutos, desechar la solución de bloqueo y lavar las muestras con 1 mL de PBS una vez.
17. Agregar 100 μl de solución de anticuerpo primario para cada coverslide. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h, en un agitador.
    Nota: Tiempo de incubación con el anticuerpo primario debe ser optimizado. Dependiendo de los anticuerpos, una incubación durante la noche a 4 ° C puede ser preferible. Es mejor a incubar en un agitador suavemente (100 vueltas/min) para distribuir igualmente el anticuerpo en el coverslides.
18. Después de la incubación con el anticuerpo primario, lavar las muestras individualmente, 3 veces con 1 mL de PBS.
19. Prepare 1: 500 de anticuerpo secundario en el bloqueo de solución (optimizaciones de diluciones del anticuerpo secundario pueden ser necesarias). Aquí, anti-conejo IgG Alexa Fluor 568 fue utilizado como un anticuerpo secundario anti-conejo.
    1. Incubar las muestras con 100 μl de solución de anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en un agitador. Puesto que los anticuerpos secundarios fluoróforo sensible a la luz, (importante) mantener la solución en la oscuridad. Coloque las muestras en la oscuridad durante y después de la incubación del anticuerpo secundario.
20. Después de la incubación del anticuerpo secundario, lave la placa 3 veces con PBS.
    Nota: Baed experiencia, algunos anticuerpos tienen señales de alto fondo que no pueden ser eliminadas por el PBS lava. Si trata con tal un anticuerpo, después paso 1.21, mantener las muestras en PBS a 4 ° C por 6 h puede ayudar.
    1. Si es necesario, las células con un colorante de unión al ADN, como Hoechst, con motivo de los núcleos de la mancha.
21. Para teñir más de una proteína, aplicar el mismo procedimiento a partir de paso 1.16 para la proteína segunda.
    1. Asegúrese de que no hay ninguna reactividad de especies entre los anticuerpos cuando se realiza la coloración con más de un anticuerpo (por ejemplo, el uso del ratón y conejo anticuerpos).
       Nota: Aquí, RACK1 se mancha como la segunda proteína con anticuerpos primarios anti-RACK1 y usando las mismas concentraciones mencionadas de secundarios anticuerpos anti-ratón IgG Alexa Fluor 488.
22. Preparar la solución de montaje: 50% glicerol en PBS 1 x. Filtro a través de un filtro de 22 μm.
23. Limpiar los portaobjetos con el etanol usando un paño libre de pelusas y agregar solución de montaje de 10 μl a cada diapositiva. Utilizando una pinza, coloque el coverslides en cada dropso que el lado con las células está en contacto directo con el medio de montaje. Deseche la solución de montaje de exceso con la ayuda de trapos sin pelusa.
24. Sello coverslides con un esmalte de uñas transparente. En primer lugar, estabilizar la coverslides añadiendo gotas de esmalte de uñas en los 4 bordes y luego sellarlas completamente.
25. Analizar las muestras bajo un microscopio fluorescente o confocal tan pronto como sea posible, ya que la señal fluorescente puede blanquear después de algunas horas.

< clase p = "Japane_title "> 2. Inmunoprecipitación

1. separar y contar las células como se describen en los pasos 1.2 y 1.3.
2. Si se trabaja con células HEK293T, 4 millones de células para cada condición en cajas Petri de 15 cm de la semilla. Si trabaja con las células N2A, 5 millones de células en cajas Petri de 15 cm de la semilla. Incubar las células en una incubadora de CO ₂ a 37 ° C hasta el final del experimento.
3. Tratar las células con los medicamentos pertinentes o las condiciones para una duración definida por lo que el tiempo total de incubación de las células no exceda de 48 h.
   Nota: Para las pruebas de inmunoprecipitación en este estudio, las células fueron tratadas durante 3 horas con Torin 1 (250 nM), 16 h con rapamicina (200 nM) y 2 h con EBSS. DMEM con 10% FBS se agregó a las células como el control de.
4. Después de 48 h de incubación total, eliminar los medios de comunicación y cosechar las células. Puesto que las células HEK293T separan fácilmente de la placa, lavar la placa con hielo PBS frío puede ser adecuada para la cosecha. Sin embargo, las células N2A son más resistentes a la separación; uso de raspadores de células para ayudar a las células de la cosecha.
   1. Recoger todas las células en los tubos de microcentrífuga.
5. Muestras de centrifugar a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C. descarte el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de PBS suspendiendo nuevamente mediante pipeteo.
6. Centrífuga repetir, pero a la máxima velocidad de centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos, descartar el sobrenadante.
7. Buffer preparar ensayo Radio de inmuno-precipitación (RIPA) antes de comenzar el experimento.
   Nota: Hay 3 tipos de almacenador intermediario de RIPA; elegir según la intensidad de la interacción de las proteínas siendo investigado (ver fórmulas a continuación).
   1. Si hay una interacción de proteínas fuerte, elegir el almacenador intermediario RIPA regular.
   2. Si la interacción es débil, seleccione suave RIPA o RIPA más.
      Nota: Las recetas de estas reservas están en los siguientes pasos. Deben completarse todos los búferes que se utilizan en las pruebas de inmunoprecipitación con inhibidores de la proteasa.
      1. Preparar regular almacenador intermediario de RIPA usando 1% NP-40 150 mM NaCl, desoxicolato de sodio 0.5% y 0.1% sulfato de dodecil de sodio en 50 mM de Tris pH 8.
      2. Preparar el almacenador intermediario de RIPA suave usando 1% NP-40 y 150 mM NaCl, 0,25% desoxicolato de sodio en 50 mM de Tris pH 7.5.
      3. Preparar el Buffer de RIPA más leves en 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glicerol y ortovanadato de sodio 1 mM, 50 mM de Tris pH 7.4.
8. Después de elegir el tampón apropiado de RIPA, complementar el búfer con inhibidores de la proteasa (RIPA +). Entonces, lyse las células con 3 x el volumen de la pastilla celular en RIPA +.
9. Vortex la suspensión por 15 s. mantenerlo en hielo por 5 minutos Repita el vórtice y Glas 5 veces y luego centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
10. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y centrifugar para eliminar restos de células remanentes. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
11. Diluir la proteína lysates de la 1:50 y prepare una placa de 96 pocillos con espacio en blanco y las normas. Diluir las muestras de.
    1. Las muestras de mezcla con Bradford solución 1:20. Incubar por 15 min en la oscuridad.
    2. Medir la densidad óptica en longitud de onda de 595 nm. Calcular la concentración de proteína con valores de absorbancia para cada muestra.
12. El día antes de la cosecha de las células, pareja granos A Plus proteína con anticuerpos que son específicos a la proteína de interés.
    1. Corte el borde de una punta de 200 μL con unas tijeras y use 25 μl de la mezcla de grano para cada condición de.
    2. Lave los granos una vez con 1 mL de PBS, una vez con 1 mL de tampón de RIPA y una vez con 1 mL RIPA +. Llevar a cabo los pasos de lavado en 3.300 x g, 4 º C durante 1 minuto
    3. Después del último lavado, añadir 300 μL de RIPA + en las cuentas y añadir 1,5 anticuerpo μg que es específico a la proteína que se tirará.
    4. Incubar los tubos durante la noche a 4 ° C en un agitador (20 vueltas/min).
       Nota: Aquí, ATG5 fue immunoprecipitated usando los anticuerpos específicos anti-ATG5.
13. Después de la incubación durante la noche de granos con el anticuerpo, lavar los granos una vez con PBS, una vez con RIPA y una vez con RIPA + como se describe en el paso 2.12.2.
14. Añadir 2 mg de proteína lisada en las cuentas para cada condición y completa el volumen total a 300 μL con RIPA + tubo de solución tampón. Incubar los tubos durante la noche en un agitador a 4 ° C.
15. Después de la incubación, lavar los granos como se describió anteriormente (paso 2.12.2).
    1. Después del último lavado, utilice una punta de la pipeta más pequeña para eliminar el sobrenadante sin tocar los granos de.
    2. Añadir 10 μl de 3 x tinte de carga: 6%, 30% glicerol, 16% β-mercaptoetanol y SDS 0.1% azul de bromofenol 1M Tris-HCl pH 6.8.
16. Preparar los controles de entrada con al menos 100 μg proteína lisada para cada condición. Igualar los volúmenes de la muestra con agua y añadir el volumen adecuado de 3 x carga tinte.
17. Hervir las muestras a 95 ° C durante 10 minutos
    Nota: Generalmente cuando hierva las muestras, las tapas de los tubos pueden abrir espontáneamente y las muestras son perdidas. Evitar esto mediante la celebración de las tapas de cerrado con un bloqueador específico cap.
18. Vuelta abajo las muestras y la carga en geles de SDS-PAGE para separar las proteínas según su tamaño usando protocolos estándar de.
    Nota: En este estudio sobre RACK1 y ATG5, las muestras se corrieron a través de geles de poliacrilamida 12% 80 V por 30 min y luego a 120 V durante aproximadamente 90 minutos. Sin embargo, para las más pequeñas proteínas como LC3, utilizando geles de poliacrilamida de 15% es más conveniente.
19. Después del gel corriendo, transferir las proteínas a nitrocelulosa o PVDF membranas utilizando cualquiera de los dos métodos de transferencia húmedo o semiseco. Entonces, bloquear las membranas por la incubación en leche descremada de 5% en PBS con 0,05% Tween 20 (SAFT) a temperatura ambiente para membranas de 1 h. lavado 3 veces con SAFT para 5 min
20. Incubar las membranas con anticuerpos primarios en las concentraciones de trabajo por 1 h a temperatura ambiente. Para las diluciones del anticuerpo primario, utilizar BSA que contenga soluciones rojo (5% BSA fracción de V de Cohn, 0,02% azida sódica en SAFT, pH 7,5; añade rojo fenol añadido como un marcador de pH) para permitir la reutilización de los anticuerpos a.
    Nota: por ejemplo, diluir ATG5 x 2.000 de anticuerpo en la solución de rojo.
    1. Al final del tiempo de incubación, lavar las membranas 3 veces con SAFT.
21. Incubar las membranas con anticuerpos secundarios HRP-conjugado que se prepararon en solución de leche descremada de 5% (aquí se utilizó anti-IgG de conejo en el 1: 10.000). Luego lavar las membranas 3 x con SAFT para 5 min
22. Que la solución de ECL: 25 mM luminol, Ácido hidroxicinámico 9 mM, 3 x 10 ^-4% H ₂ O ₂ en 70 mM Tris-HCl de pH 8.8. Uso fresco H ₂ O ₂ para cada experimento.
    Nota: La reacción comienza después de H 2 < /sub > adición de O ₂ y continúa por aproximadamente 20 minutos.
    1. Incubar las membranas y radiografía películas por 20 min en ECL. Desarrollar y fijar en una habitación oscura.
23. Para comprobar la co-inmunoprecipitación de proteínas con cierre o superposición de pesos moleculares, puede que sea necesario quitar los anticuerpos de las membranas por incubación de las membranas a 60 ° C por 30 min en el buffer de extracción: (pH 25 mM Tris-HCl 2 y 1% SDS).
24. 2.20 a 2.23 Repita los pasos para verificar la co-inmunoprecipitación con anticuerpos diferentes. Por ejemplo, siguiendo ATG5 detección y desmontaje de las membranas, proteínas RACK1 fue probado en las membranas mismo usando un anticuerpo primario anti-RACK1 (1:1, 000) y los anticuerpos secundarios (1:10, 000). Fue utilizado β-actina como control de carga; y señal de IgG fue utilizado como el control de carga para las muestras immunoprecipitated.

Representative Results

En la figura 1 un ejemplo de una colocalización muestra resultado obtenido mediante este protocolo. Una figura de nuestro reciente libro presenta⁸. Aquí, proteína endógena RACK1 fue manchada en verde, mientras que LC3 endógena fue manchado en rojo. Los puntos amarillos que se observan en los cuadros combinados indican sitios de traslapo entre las señales verdes y rojas. Así los puntos amarillos representan la co-localización parcial de estas dos proteínas.

Figura 1 : Resultados de inmunofluorescencia representante. Las células HEK293T fueron cultivadas en coverslides. Las células fueron tratadas o no tratadas con rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) o Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h), o hambrientos en EBSS (Stv, 2 h). Entonces proteínas endógenas immunostained utilizando anticuerpos primarios anti-RACK1 y anti-LC3. Las células fueron analizadas bajo un microscopio confocal. CNT, las células no tratadas; Fusión, superposición de greenand redsignals. Puntos de yellowcytoplasmic de arrowsshow blanco con RACK1 y LC3 colocalización. Esta investigación fue publicada originalmente por Erbil et al. ⁸ por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la figura 2, se presenta un ejemplo de un resultado endógeno de inmunoprecipitación. En esta figura, ATG5 proteína fue precipitada y RACK1 co-inmunoprecipitación se ha detectado en diferentes condiciones. Suero de conejo normal se utilizó como control negativo.

Figura 2: Representante inmunoprecipitación resultados. Células HEK293T fueron tratadas o no tratadas con rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) o Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) o hambre en EBSS (2 h). Proteína endógena ATG5 fue immunoprecipitated de extractos celulares con anticuerpos anti-ATG5 que fueron junto a perlas de proteína A Plus. Anticuerpos anti-ATG5 y anti-RACK1 fueron utilizados por immunoblotting. Suero, suero de control de conejo. Esta investigación fue publicada originalmente por Erbil et al. ⁸. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estos resultados indican que RACK1 proteína está implicada en las vías de la autofagia. RACK1 proteína localizada junto con la proteína LC3 en el autophagosome-como las estructuras durante la inducción autofagia. Por otra parte, resultados de co-inmunoprecipitación demostraron que proteínas RACK1 y ATG5 fueron interactuando aún en condiciones basales y aumentaron los niveles de interacción bajo condiciones de activación de la autofagia. Anteriormente se confirmó utilizando p62 degradación y acumulación análisis LC3-II en la presencia o ausencia de inhibidores lisosomales (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) que no se inhibió autophagic flujo bajo las condiciones experimentales⁸. Por lo tanto, los resultados presentaron aquí y en otros lugares mostraron que RACK1 ATG5 interacción es importante para las etapas iniciales de la autofagia.

Discussion

Técnicas de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia son cruciales para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Aunque estas dos técnicas se utilizan y bien establecido, se deben considerar varios criterios para definir la calidad de los experimentos durante el uso de estas técnicas.

En primer lugar, primarios los anticuerpos que se utilizan en estas pruebas deben ser específicos para las proteínas de interés. Para ello, utilizar shRNA caídas o células de nocaut para probar la especificidad del anticuerpo en cuestión. Además, utilizar controles positivos y tratar las células con un conocido inductor de la proteína de interés. Lote a lote también existen variantes de anticuerpos. Además, algunos anticuerpos policlonales o sueros podrían tener alta fondo y bandas no específicos. Aunque algunas de estas bandas pueden ser formas alternativas de la proteína de interés, en general resultan de reactividad cruzada de anticuerpos policlonales con proteínas relacionadas o pueden ser no específicos interactianos. Los anticuerpos monoclonales son en general más específico en este sentido, aunque las señales generadas pueden ser más débiles. La confirmación de la especificidad del anticuerpo etiquetadas proteínas y anticuerpos anti-etiquetas establecidos puede ser útil, pero las interacciones endógenas son todavía más valioso y esencial.

Pruebas de co-inmunoprecipitación co-localización no establecerá definitivamente si las interacciones proteína-proteína son directas. Es posible que otros socios pueden mediar las interacciones observadas. De hecho, en la figura 1, un parcial colocalización de proteínas RACK1 y LC3 se observó, que podría ser un signo de su interacción; sin embargo, atascamiento directo prueba como en vitro desplegable ensayos utilizando proteínas recombinantes o transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET) microscopia puede utilizarse para establecer si las interacciones observadas son directas o no. Por otra parte, técnicas como la filtración de gel le ayudará a descubrir las interacciones de proteínas complejas que involucran más de dos proteínas de manera más convincente. Un análisis más riguroso de los resultados de inmunofluorescencia de una perspectiva de autofagia sería supervisar la inducción autofagia contando el número de puntos que son positivos para el marcador de autofagia LC3 en cada célula, ya que un aumento del número de LC3 puntos positivos se correlaciona con el número de autophagosomes. Uso del coeficiente de Pearson, método de Li o pruebas de coeficientes de Manders proporcionan mejor evaluación cuantitativa y comparativa de los resultados experimentales.

Otro punto importante es la validación de las interacciones utilizando técnicas independientes y diferentes líneas celulares. Algunas interacciones pueden ser artefactos relacionados con la viscosidad de las proteínas o la sobreexpresión de la proteína. Si no cuidadosamente lavados, la proteína ATG5 también es propensa a los granos que se utilizan en immunoprecipitations (perlas de agarosa o sepharose). Además, en pruebas de inmunofluorescencia, sobreexpresión de proteínas puede formar agregados que parecen autophagosomes o autolysosomes. Por lo tanto, al realizar las transfecciones transientes usando Co transfected proteínas fluorescentes como el control de eficacia de transfección, en immunoblots, niveles de expresión de proteínas de interés se pueden comparar con los niveles de la proteína fluorescente en los extractos con anticuerpos específicos, proporciona un método de normalización.

En todas estas pruebas, reproducibilidad de los resultados es de suma importancia. Se prefiere repetir cada experimento por lo menos 3 - 4 veces a estar convencido de los resultados obtenidos. También realizamos experimentos similares en al menos dos diferentes líneas celulares para probar que nuestras observaciones no son específicas del tipo de la célula. Correcto controles positivos y negativos (e.g., granos solo o anticuerpos de control además de suero para pruebas de inmunoprecipitación) deben ser previstos, además, para llegar a conclusiones correctas. Durante la optimización de técnicas de inmunofluorescencia, es útil tener un control único anticuerpo secundario donde se omite el anticuerpo primario. Este control Asegúrese de que observó las señales se originan de la Unión del anticuerpo primario a la proteína de interés y no de una Unión inespecífica del anticuerpo secundario.

El número de complejos de la proteína reguladora autofagia y otros fenómenos biológicos está aumentando en el descubrimiento, sin embargo, la investigación está lejos de tener una imagen completa. Aunque alto rendimiento técnicas como la espectrometría de masas o predicciones basadas en Bioinformática siguen revelando las redes de interacción de varias proteínas relacionadas con la autofagia, confirmación de estas interacciones mediante la bioquímica clásica y métodos de microscopía es importante para descubrir propiedades funcionales y dinámicas de esta vía celular básica e importante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin EDTA Solution A	Biological Industries	BI03-050-1A
PBS	GE Healthcare	SH-30256.01
DMEM (high glucose)	Sigma	5671
DMEM (low glucose)	Sigma	5546
Trypan Blue	Sigma	T8154
Hemocytometer	Sigma	Z359629-1EA
coverslides	Jena Bioscience	CSL-103
slides	Isolab	I.075.02.005
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Torin	Tocris	4247
DMSO	Sigma	VWRSAD2650
EBSS	Biological Industries	BI02-010-1A
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	15812-7
BSA	Sigma	A4503
Saponin	Sigma	84510
LC3 Antibody	Sigma	L7543
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11011
RACK1 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-17754
Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
NP-40	Applichem	A16694.0250
Sodium Chloride	Applichem	A9242.5000
Sodium deoxycholate	Sigma	30970
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Biochemika	A2572
Trizma Base	Sigma	T1503
Triton-X	Applichem	4975
Sodium orthovanadate	Sigma	450243
ATG5 Antibody	Sigma	A0856
Glycerol	Applichem	A4453
β-Mercaptoethanol	Applichem	A1108.0250
Bromophenol blue	Applichem	A3640.0005
Non-Fat milk	Applichem	A0830
Tween 20	Sigma	P5927
Sodium Azide	Riedel de Haen	13412
Phenol red	Sigma	114537-5G
anti-rabbit IgG , HRP conjugated	Jackson Immuno.	1110305144
Luminol	Fluka	9253
Coumeric Acid	Sigma	C9008
Hydrogen Peroxide	Merck	K35522500604
anti mouse IgG, HRP conjugated	Jackson Immuno.	115035003
β-Actin Antibody	Sigma	A5441
Normal rabbit serum	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027
Rapamycin	Sigma	R0395
Protein A-Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2001
fetal bovine serum	Biowest	S1810-500
penicillin/streptomycin solution	Biological Industries	03-031-1B
L-glutamine	Biological Industries	BI03-020-1B
Bradford Solution	Sigma	6916
Nitocellulose membrane	GE Healthcare	A10083108
X-ray Films	Fujifilm	47410 19289
Protease inhibitor	Sigma	P8340