Høj overførselshastighed analyse af bevægeapparatet adfærd i Drosophila ø Assay

Summary

Ø-analysen er en relativt ny, omkostningseffektive assay, der kan bruges til at evaluere grundlæggende bevægeapparatet funktionsmåden for Drosophila melanogaster. Dette manuskript beskriver algoritmer til automatisk databehandling og objektiv kvantificering af øen assay data, hvilket gør dette assay en følsom, høj overførselshastighed udlæsning til store genetiske eller farmakologiske skærme.

Abstract

Fremskridt i næste generation sequencing teknologier bidrager til identifikation af (kandidat) sygdomsgener for bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme med en øget hastighed. Dog er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse lidelser. Genetiske, molekylære og adfærdsmæssige værktøjskassen af Drosophila melanogaster gør denne model organisme især nyttigt at karakterisere nye sygdomsgener og mekanismer på en måde, høj overførselshastighed. Ikke desto mindre, høj overførselshastighed skærme kræver effektive og pålidelige assays, der ideelt set er omkostningseffektive og giver mulighed for automatiseret kvantificering af træk relevante for disse lidelser. Ø-analysen er en omkostningseffektiv og let set-up metode til at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. I denne analyse, er fluer kastet på en platform fra en fast højde. Dette fremkalder en medfødte motoriske svar, der muliggør fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. I øjeblikket, er kvantitative analyser af filmet ø assays udført manuelt, som er en omstændelig virksomhed, navnlig når du udfører store skærme.

Dette manuskript beskriver de"Drosophila ø analyse" og "Ø Assay analyse" algoritmer for høj overførselshastighed, edb og kvantificering af øen assay data. I opsætningen indsamler en simpel webcam tilsluttet en laptop en billed serie af platformen mens analysen udføres. "Drosophila ø Assay" algoritme udviklet til open source-software Fiji behandler disse billede serie og kvantificerer antallet af fluer på platform over tid for hver eksperimentelle betingelse. "Øen Assay analyse" script, kompatibel med den gratis software R, blev udviklet til automatisk behandle de fremkomne data og til at beregne, om behandlinger/genotyper er statistisk forskellig. Dette væsentligt forbedrer effektiviteten af øen analysen og gør det en kraftfuld udlæsning til grundlæggende bevægelse og flight adfærd. Det kan således anvendes til store skærme undersøger flyve bevægeapparatet evne, Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser, og medicin effektivitet.

Introduction

I de seneste år, fremskridt i næste generation sequencing teknologier har i høj grad bidraget til identifikation af gener underliggende degenerative bevægelsesforstyrrelser af hjernen (fx cerebellare ataksi og Parkinsons), af perifere neuronal oprindelse (fx, Amyotrofisk lateral sklerose og arvelig spastisk paraplegi), og af muskulære oprindelse (fx, Duchenne muskeldystrofi og født dystrofi)^1,2,3,4 . På trods af dette, er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger bag de fleste af disse lidelser. En bedre forståelse af disse mekanismer er afgørende for at udvikle behandlingsformer.

Som mennesker, er bevægelse i modelorganismer, såsom fly og bevægelse i Drosophila, kontrolleret af central hjerne, perifere nervesystem og muskler. Derudover gør hurtig generationstid og genetiske værktøjskasse af Drosophila denne model organisme særligt velegnet til high throughput screening af gener involveret i bevægelsesforstyrrelser og for drug test^5,6 . På grund af det betydelige antal betingelser, der skal afprøves i sådanne skærme, pålidelige, omkostningseffektive, og relativ simpel assays, samt værktøjer til at kvantificere outputresultater i en automatiseret måde, er særdeles ønskværdige.

Schmidt et al. (2012) ⁷ beskrevet en billig test kaldet "island assay" at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. Øen analysen har været anvendt med succes i storstilet screeninger til at identificere gener med glia-specifikke funktioner⁷, i evalueringen af Drosophila modeller af intellektuelle handicap⁸, og for den generelle evaluering af flyve motor adfærd⁹. Princippet om design af øen analysen består af en ophøjet platform, som flere fluer er kastet. Dette fremkalder en medfødte motoriske adfærd, der gør det sunde fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. Analysen måler antallet af fluer resterende på platformen over tid^7,8,9. Alle disse funktioner viser, at øen analysen kan være en kraftfuld screeningsværktøj for gener involveret i bevægelsesforstyrrelser.

I øjeblikket, er kvantitativ analyse af filmet ø assay data udført manuelt^7,8,9. For at forbedre effektiviteten af analysen, blev en low-cost-metoden udviklet til semi-automatisk kvantificere udslip af fluer fra platformen. Opsætningen bruger en simpel webcam tilsluttet en laptop til at indsamle billede tid serie af platformen, med rammer erhvervet hver 0,1 s. rammer behandles derefter med makroen"Drosophila ø Assay", der kvantificerer antallet af fluer på platformen over tid. Makroen"Drosophila ø Assay" er opdelt i tre uafhængige sub makroer: (I) "Opret stak og projektion," sub makro identificerer forskellige ø eksperimenter gemt i forskellige undermapper og skaber en stak og en projektion af hver tidsserier. (II) den "Definere Platform" sub makro åbnes fortløbende alle "Projection_image_name.tif" filer placeret i de enkelte eksperimentelle undermapper, hvorefter brugeren anmodes om at definere manuelt ø-perron som region af interesse (ROI). (III) "analyse" kvantificerer automatisk antallet af fluer resterende på platformen i løbet af tidsserien. Sub makroerne kan køres efter hinanden (i en køre) eller selvstændigt. For statistisk dataanalyse, blev et script udviklet til at automatisk behandle de fremkomne data og anvende en statistisk test for at afgøre, om behandlinger/genotyper opfører sig væsentligt forskellige fra hinanden (figur 1). Endelig er det påvist, at denne opsætning kan bruges til at evaluere og kvantificere afvigende bevægeapparatet evne til Drosophila model for ataksi telangiectasia (AT).

Protocol

1. opførelsen af boksen ø Assay

1. Forbered en bakke, lavet i et robust materiale, såsom poly methyl methacrylat (PMMA), indeholder et lag af vand (dvs. et bad). Sikre, at materialet ikke er hvid.
   Bemærk: Dimensionerne 40 x 35 x 2,5 cm ³ anbefales ( figur 1A).
2. Udarbejde en boks (42 x 38 x 25 cm ³) lavet af robust, transparent materiale, som PMMA, skal placeres omkring Bad til at forhindre, at fluerne flygter ind i laboratoriet rummet. Placere et hul (20 x 30 cm ²) på den laterale side, der er stor nok til eksperimentatoren at nemt håndtere hætteglas med fluer og slippe dem på øen ( figur 1A).
3. Udarbejde en ophøjet platform 10 x 15 x 2,5 cm ³ i dimension, lavet af et uigennemtrængeligt materiale (PMMA eller plast), der er vandtætte.
   Bemærk: Denne platform er forpligtet til at have en ensartet hvid overflade til at sikre god kontrast til billedanalyse. Størrelse ikke nødvendigvis er fast, men det bør være stor nok til at sikre at alle fluer i første omgang lander på perronen og få chancen for at gå på det ( figur 1A).
4. Fix platformen ved enten at lime det i til bad eller placere vægte eller andre tunge genstande inde i boksen platform til at forhindre positionelle ændringer af platformen under den eksperimenterende/filme session.

2. Softwarekrav og Installation

1. Installation af billede-optagelse software.
   1. Download billede-optagelse software til at optage ø billede serie (Se Materialer tabel) og installere softwaren på en computer.
      Bemærk: Imaging-optagelse software i denne protokol beskrevne understøttes kun af Windows. Et alternativ til andre brugere er blevet føjet til Materialer tabel.
2. " Drosophila ø Assay " makro installation.
   1. Dataoverføre den " Drosophila ø Assay " makro og den kompatible Fiji ¹⁰ version (1,4 eller højere) fra følgende websted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Flytter markøren til de " ø assay " register og klik på " Se. "
   3. Klik på " Download alle. " mappe indholdet hentes som en .zip-fil, unzip den downloadede fil.
   4. Kopi til " Drosophila øen Assay.ijm " fil i " Fiji.app/plugins/directory. "
      Bemærk: Når du starter Fiji, den " Drosophila ø Assay " makro vises nederst i menuen plugins dropdown.
3. " Ø Assay analyse " script installation og downloade.
   1. Download R ¹¹ fra følgende websted: https://cran.rstudio.com. Installere det på en computer.
   2. Download R studio fra følgende websted: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installere det på en computer.
      Bemærk: Den " ø test analyse " script kan køre med R kun. R studio, med dens lettere brugergrænseflade, præsenteres som alternative trin for brugere uerfarne med R.
   3. Download den " ø Assay analyse " script fra den " Drosophila ø Assay " bibliotek på følgende websted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Bemærk: når du har udført trin 2.2, de " øen Assay analyse " script kan også findes i den udpakkede mappe kaldet " ø assay. "

3. Forberedelse af fluer skal testes i Island Assay

1. indsamle iscenesat fluer for hver eksperimentelle betingelse under kolde eller kuldioxid (CO ₂) anæstesi, som tidligere beskrevet ¹³ (over en periode på 1 - 2 dage).
   1. Forbered mindst 3 prøve hætteglas pr. eksperimentelle betingelse, hver indeholder ca 15 iscenesat flyver. Kun bruge flyver med intakt vinger og som er af tilsvarende alder og køn.
      Bemærk: For eksperimenter beskrevet her, 5 prøve hætteglas indeholdende 15 mandlige fluer af genotyper w ^-; Aktin-Gal4 / + (kontrol) og w ^-; Aktin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) blev indsamlet på dagen for eclosion, alderen for 4 dage, og blev brugt til at udføre ø assay. RNAi, kontrol stammer og Actin-gal4 driver blev indhentet fra en kommerciel (Se Materialer tabel).
2. Lad fluerne Genskab for at undgå effekter fra anæstetika (mindst 1 dag ved brug af CO ₂) før testning indsamlede fluer i island analysen i en alder af interesse.

4. eksperimentel opsætning

NOTE: Se figur 1B.

1. Tilføje koldt vand med en lille mængde sæbe i badet bakken og Placer platformen i midten.
   Bemærk: Sæbe nedsætter overfladespænding vand; fluer, der rører vandet vil drukne. Dette forhindrer stigende mængder af fluer flyver i boksen under progression af de eksperimentelle session.
2. Placere den gennemsigtige boks på toppen af bakken og belyse platform fra oven ved hjælp af en lampe.
   Bemærk: Belysning af platformen er først og fremmest kræves at sikre ordentlig video kontrast. En almindelig 12 V LED lys er passende for denne.
3. Placer webcam direkte over platformen (udenfor boksen) og slutte den til en computer.
4. Opret nye mapper på computeren for at gemme forskellige eksperimentelle data, før forsøgene.
   1. Følge strukturen i eksemplet illustreret i figur 2A for at oprette mapper. For eksempel, hvis den eksperimentelle design kræver test to genotyper med fem replikater, først oprette en vigtigste mappe, der indeholder datoen for eksperimentet. Inde i de vigtigste mappe, oprette to undermapper (én pr. genotype). I genotype-mapperne, oprette fem nye undermapper, én pr. replikat.
      Bemærk: For yderligere analyse, er det afgørende at billede serie svarer til individuelle eksperimenter er gemt i mapper med unikke navne.

5. Video indstillinger Setup i den " Capture enhed " del af grænsefladen

1. åben billedet-optagelse software og under den " fange " fanen, klik på " Time-Lapse billeder … " og vælg den passende webcam som den " Capture enhed. "
2. placere en død flue på øen; justere videoindstillingerne ved at klikke på den " videoindstillinger " boks. Rul gennem de værktøj bars, justere lysstyrke, kontrast, og farve på en måde, sådan at den døde flyve vises sort på hvid baggrund ( figur 2B). Når tilpasningerne er fuldført, skal du klikke på " Ok. "

6. Optagelse og Video lagring af indstillinger Setup i den " Time-lapse " del af grænsefladen

< ol>

Justere indstillingerne i den " Time-Lapse film Setup " gemme eksperimentet som en .avi-fil. Klik på " gennemse …, " Vælg den mappe, hvor filmen skal gemmes, definere navnet på video, og tryk på " Gem. "
Bemærk: videofilen er ikke anvendes til kvantificeringen af data, men det kan være nyttigt at få en overordnet idé om eksperimentet.

Justere indstillingerne i den " Time-Lapse film Setup " afsnit.

1. Vælg i boksen kompression " Intel IYUV kode " for video kompression og vælge " tage én ramme hver 0,1 sekunder, " med den " Play-back sats (billeder pr. sekund): " på 10.
2. Gemme tidsserier eksperiment som .bmp rammer ved at klikke på " avanceret … " Vælg " oprette en .bmp-billede for hver fanget ramme. " Klik på " Gennemse. " vælge den samme mappe i den " under AVI film fange " vindue (som valgt i trin 6.1), klik " åben, " og tryk på " Ok. "
   NOTE: Bemærk, at under eksperimentet, gemmes rammerne som .bmp-filer (kræves til analyse af data). Programmet navne rammer som " A " efterfulgt af det nummer, der svarer til rammen fange sekvens (f.eks. " A_number.bmp ") ( figur 2 c). Altid gemme billederne tilhører forskellige eksperimenter i en ny mappe til at sikre, at tidligere registrerede billede-serien ikke overskrives. Vær opmærksom på at billederne ikke gemmes automatisk i samme mappe som filen video medmindre denne mappe er markeret under " gennemse … " ved at klikke på den " avanceret " boks.

7. Ø-analyse og dataindsamling

1. Tryk på startknappen i grænsefladen time-lapse billede i billede-optagelse software til at starte optagelsen.
2. Trykke den eksperimentelle hætteglas indeholdende fluer (trin 3) 2 - 3 gange at fluer er i bunden af hætteglasset. Hurtigt fjerne plug af hætteglasset, og tryk på hætteglasset på platformen med en kraftig bevægelse, således at alle fluer falder på platformen på samme tid ( figur 1 c).
3. Efter ca 30 s, tryk på den " Stop "-knappen for at stoppe optagelsen.
   Bemærk: Hvis alle fluer forsvinde fra platformen, optagelsen kan være stoppet tidligere.
4. Fjerne fluer, der resterer for 30 s på platformen i hånden efter stoppe billede optagelse.
5. Før man går videre til at indspille den næste eksperiment, ændre destinationsmappen for .bmp-filer og film (Se afsnit 6).

8. Databehandling: Kører den " Drosophila ø Assay " makro

NOTE: Se figur 1 d.

1. Køre den " oprette stak og projektion " sub makro jeg at producere stakke og fremskrivninger af den indsamlede billede serie.
   1. Start Fiji, klik på " Plugins " i værktøjslinjen, og valgte " Drosophila ø Assay " i dropdown-menuen; vises et nye vindue.
   2. Enter i " første billede tidsserier id " indstilling i makro anskuelighed grænseflade.
      Bemærk: Optaget billedrammer gemmes som " A-number.bmp " i den rækkefølge, som billederne er fremstillet. I den " første ramme id " makro interface, fyld i indstillingen med antallet givet til det første billede af programmet og filtypenavnet. Fylde " første ramme id " med "-0001.bmp, " siden den første ramme kaldes " A-0001.bmp " ( figur 2 c). I tilfælde af andre billedformater (såsom .tiff eller .jpeg) er genereret af webcam software, angive den korrekte fil forlængelse af det første billede i " første billede tidsserier id. "
   3. Marker kun de " oprette stak og projektion " sub makro, skal du klikke på " Ok, " og vælge vigtigste mappe, der indeholder alle undermapper med individuelle ø assay eksperimenter.
      Bemærk: .bmp-filer i hver enkelt eksperiment mappe, der indeholder de " første ramme id " vil efterfølgende blive behandlet. To nye filer vises i hver enkelte eksperiment undermappe, hedder som standard " Stack_image_name.tif " og " Projection_image_name.tif " ( figur 1 d). Når dette trin er udført, kan .bmp-filer slettes. Stakken og projektion .tif-filer indeholde alle data og er tilstrækkelig for yderligere analyse.
2. Køre den " definere Platform " sub makro II at vælge den nøjagtige placering af platformen.
   1. Åbner den grafiske brugerflade af den " Drosophila ø Assay, " Vælg kun den " Definer platform " checkhæfte, og tryk på " Ok. "
   2. i den " vælge en mappe " vindue, Vælg de vigtigste bibliotek hvor eksperimentelle undermapper, gemmes og tryk på " Vælg. "
      NOTE: den " definere Platform " sub makro søger automatisk efter " Projection_image_name.tif " filer i alle undermapper gemt i de vigtigste bibliotek. Den " Projection_image_name.tif " billedet er gemt i den første mappe, sammen med to windows — " definere platformen " og " ROI manager " — åbnes.
   3. Vælg den " Polygon valg " værktøj i værktøjslinjen for at tegne en markering, der passer til ø-perron.
      Bemærk: Det er meget vigtigt at udelukke grænsetilfælde af platformen fra udvælgelsen. Se figur 2D.
   4. Efter at vælge platformen i det første billede, skal du klikke på " Tilføj " i den " ROI Manager " vindue; det valgte område vil vises i vinduet ROI manager som et sæt af værdier ( figur 2D). Tryk på " Ok " i den " definere platformen " vindue. Makroen vil fortsætte til den næste fremvisning.
   5. Klik på tal ( figur 2D) gemt i den " ROI manager " vindue; det tidligere udvalg vil så automatisk vises i den aktuelle billedprojektion.
      Bemærk: siden øen platform er tilbøjelige til at have den samme størrelse og placering, når forsøg er udført i en række (så længe webcam og øen stilling forbliver uændrede), det er nyttigt at gemme ROI definere platform i den " ROI manager. " af dermed vil brugeren spare tid; i de kommende fremskrivninger, er det kun nødvendigt at klikke på den midlertidigt lagrede udvalg i ROI manager.
   6. Hvis placeringen af øen er lidt flyttet i forhold til den tidligere eksperiment, justere placeringen af udvælgelsen af venstreklikke midt i markeringen og trække det markerede område til den ønskede position.
   7. Hvis udvælgelsen ikke stemmer overens med platformen, Venstreklik uden for udvælgelse og afgrænse et nyt udvalg for platform ved hjælp af den " Polygon udvalg " værktøj. Gemme den nye markering i ROI manager ved at klikke på " tilføje; " et nyt udvalg vil blive vist i den " ROI manager " vindue, der kan anvendes kontinuerligt.
   8. Når udvælgelsen er justeret, skal du klikke på " Ok " i den " definere platformen " vindue og Gentag proceduren, indtil alle platforme er defineret.
      Bemærk: Bemærk, at et binært billede af platformen svarende til hvid på sort baggrund, afgrænsede ROI i området opkaldt " Platform_image_name.tif, " optrådte for hver forarbejdede billedet i den samme eksperimentelle undermappe som stak og projektion billeder genereret i trin 8.1.3 ( fig. 1 d).
3. Definerer den flyve mindstemål.
   Bemærk: Denne indstilling definerer den minimale flyve størrelse i pixels. Partikler, der er mindre end den angivne minimale størrelse vil blive udelukket fra analyse til at undgå falske positiver på grund af støj.
   1. Åbne en billedstak, lavet af den " oprette stak og projektion " sub makro I.
   2. Konvertere billedstak til 8-bit ved at klikke på billede > > Type > > 8-bit.
   3. Gå til menuen, tryk på billede > > Juster > > tærskel, Sørg for, at den " mørk baggrund " boks er markeret, og tryk på " gælde; " et andet vindue kaldet " tærskel " vises. Klik på " mørk baggrundund ", og tryk på " Ok. "
      Bemærk: en binær billedstak vil blive oprettet, hvor fluerne er defineret i sort og platform i hvid. Når dette ikke er tilfældet, anvende den " inverter " funktion ved at klikke på Rediger > > invertere > > køre.
   4. Indstille omfang til at registrere antallet af pixels ved at klikke på analyser > > sat skala. Anvende følgende indstillinger: afstanden i pixel = 1, kendt afstand = 1, pixelstørrelsesforhold = 1 og enhed af længde = pixel. Tryk på " Ok. "
   5. Vælg den " Wand " (sporing) værktøj i værktøjslinjen, og klik på en flue (sort prik) til stede på perronen. Tryk på ctrl + m (Windows-brugere) eller cmd + m (Mac-brugere); en ny " resultaterne " vinduet angiver området af det valgte stedet i pixel. Gøre dette fortløbende for flere fluer og fastlægger den flyve minimumsstørrelse.
      Bemærk: Når du kører makroen, indstille den " Minimum flyve størrelse " indstilling til den mindste observerede flyve størrelse minus en margen på 10%. ( figur 2E).
4. Køre den " analyse " sub makro III at kvantificere flyver flygter fra platformen.
   1. Gå til værktøjslinjen, skal du vælge " Plugins, " og valgte den " Drosophila ø Assay. "
   2. Juster den " Minimum flyve størrelse " indstilling ud fra værdien defineret i trin 8.3.
      Bemærk: Brug værdien defineret i trin 8.3, hvis indstillingen standard af " Minimum flyve størrelse " medfører udelukkelse af fluer, der var gældende på platformen eller hvis makroen registrerer baggrund signal som fluer.
   3. i det " antal fluer per vial " indstilling, udfylde det maksimale antal fluer i hætteglassene under hele forsøget. For eksempel, hvis et eksperiment har hætteglas indeholdende 15 fluer, andre indeholdende 20 fluer, og andre der indeholder 23 fluer, det " antal fluer per vial " angives som 23.
   4. Vælg den " analyser " afkrydsningsfelt, og tryk på " Ok; " en ny " vælge en mappe " vindue vises. Vælg de vigtigste bibliotek (med alle undermapper og filer inde) og tryk på " Vælg. "
      Bemærk: makroen vil analysere alle billeder gemt i undermapper, så længe de indeholder de " stack_image_name, " " Projection_image_name, " og " Platform_image_name " filer. Makroen vil behandle billede efter billede. Makro output består af en binær resultat billedstak opkaldt “ result_stack_subfolder_name.tif ” og et resultat tekstfil kaldet " result_subfolder_name.txt, " som vises i hver data mappe. den resulterende tekstfil (.txt) indeholder kvantitative målinger svarer til billedet stable og består af 9 kolonner. Indholdet af disse kolonner er opsummeret i tabel 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " svarer til billede-tidsserier af et eksperiment, hvor fluer registreret under eksperimentet er repræsenteret som sorte prikker på en hvid baggrund ( figur 1E).
   5. Omhyggeligt inspicere resultatet stakken for at sikre at ingen artefakter er forekommet, og at makroen arbejdet præcist ( figur 2F).
      Bemærk: Eksempler på artefakter kan være billedelementer, der ikke flyver men der registreres som sådan af billede segmentering algoritme (falske positiver). Dette kan for eksempel skyldes påvisning af baggrunden signal på grund af en unøjagtig markering af ROI.

9. Data analyse ved hjælp af " ø Assay analyse "

1. struktur data som angivet i figur 2A-giver mulighed for analyse med den " ø Assay analyse " script. Generere en vigtigste mappe med undermapper, hvor hver undermappe svarer til en eksperimentel tilstand til analyseres.
2. i undermapper, generere mapper, der indeholder de uafhængige eksperimentelle flergangsbestemmelser ( figur 2A) og results.txt filer produceret af den " Drosophila ø assay " makro.
   Bemærk: Den " ø Assay analyse " makro vil behandle alle forsøgsbetingelser beliggende i de vigtigste bibliotek på én gang.
3. Starte Rasmussen eller Rasmussen studio. Klik på filen > > åbne filen … i værktøjslinjen og vælge den " ø Assay analyse " scriptet
   1. Installere ggplot2 og matrixStats pakker når du kører den " ø Assay analyse " script for første gang. Skriv følgende i konsollen vindue:
      > install.packages("ggplot2"), Angiv
      > install.packages("matrixStats"), Angiv.
4. Angiv placeringen af data og analyse output filer i scriptet. Indsæt i følgende script rækker:
   1. række 16: indsætte stien til de vigtigste bibliotek, der indeholder eksperimenter for at blive analyseret og sammenlignet (i figur 2A, det er den vej, der leder til den " ø Assay " mappe).
   2. Row 19: indsætte stien til den mappe hvor analyse outputfiler gemmes.
      Bemærk: Den mappe, der er angivet i række 16 kan kun indeholde mapper der skal analyseres. Scriptet vil også ikke fungerer ordentligt, hvis de stier, indsat i række 16 og række 19 er det samme.
5. Køre scriptet ved at klikke på kode > > køre Region > > Kør alt fra værktøjslinjen.
   Bemærk: Bemærk, at tre resulterende .csv-filer og en deraf følgende .txt fil ( figur 1E) vises i den mappe, der er defineret i række 19. Disse er: (I) den " data_all_conditions.csv " fil indeholder den forarbejdede data svarende til hver eksperimentelle tilstand og eksperimenterende replikater, organiseret som beskrevet i tabel 2. (II) den " statistik summary.csv " fil opsummerer middelværdien, standardafvigelse (SD) og standardafvigelsen på middelværdien (SEM) procent af fluer på platform for hver eksperimentelle betingelse. (III) den " AUC.csv " fil indeholder arealet under kurven for hver eksperimentelle replikeres. (IV) med afhængig af antallet af betingelser i de vigtigste mappe, skriptet vil enten eksport en " Welch_t-test_results.txt " fil (2 betingelser) eller en " AUC_anova_results.txt " fil (mere end 2 betingelser), hvor resultaterne af en t-test eller ANOVA sammenligne arealet under kurven mellem forsøgsbetingelser er angivet. Bemærk, at fire forskellige typer af .tiff billedfiler ( figur 1E) vises i den sti, der er defineret i række 19. Disse kaldes: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (hvor Name_Of_Data_Folder repræsenterer den mappenavn givet af brugeren), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " og " AUC_anova.tiff. " detaljerede oplysninger om indholdet af disse grafer kan findes i de repræsentative resultater af dette manuskript og i figur 3.

Representative Results

I den beskrevne protokol, Drosophila ø assay data erhvervet og behandlet i tre trin. Første er flyvning undslippe svar af Drosophila smidt på ø-perron optaget med et webcam og gemt som individuelle .bmp-billeder (protokollen afsnit 1-7). For det andet behandler"Drosophila ø Assay" makro (trin 8) rammer, genererer en "result.txt" tekstfil (tabel 1), hvor antallet af objekter fundet i hver ramme er summeret, og en billedstak "Result_stack.tiff," som viser objekter fundet inden for platformen i hver ramme. Tredje, "Island Assay analyse" script (protokollen afsnit 9) behandler makro dataene i filerne "results.txt" af individuelle eksperimenter. Flere trin er indarbejdet i scriptet til at filtrere og kombinere data til statistiske analyser. Det første billede, hvor fluerne er kastet på platformen er opdaget og betragtes som tidspunkt 1. Tidligere rammer er elimineret fra datasættet. 100 frames efter tid punkt 1 (svarende til 10 s) er udvalgt til analyse. Eksperimenter som det oprindelige antal fluer blev fundet på platformen er mindre end 5 er automatisk udelukket fra analysen, at fjerne upålidelige resultater fra underdimensioneret eksperimenter. Eksperimenter som det oprindelige antal fluer blev fundet på platformen overstiger indstillingen "Antal fluer per vial" plus en tolerance på 3 er også udelukket. Dette eliminerer datasæt i hvilken støj partikler blev fejlagtigt registreret som fluer. Scriptet derefter beregnes procentdelen af fluer registreret for hvert tidspunkt, i forhold til det højeste antal fluer blev fundet i serien. Fejl i DataSet forårsaget af fluer gå ind og ud af ROI (påvises som et fald, efterfulgt af en stigning i procentdelen af fluer på platformen over tid) rettes automatisk af vedrørende dem som konsekvent nuværende på platformen på tidligere stadier . Alle Repliker datasæt for en specifik eksperimentel betingelse, der var til stede i de vigtigste bibliotek er kombineret og eksporteret til filen "data_all_conditions.csv". Dens kolonner repræsenterer de variabler, der er beskrevet i tabel 2. Scriptet eksporterer også en linjegraf for hver eksperimentelle betingelse, navngivet efter den mappe, der indeholder dataene. Denne graf viser procentdelen af fluer resterende på platformen over tid (flight undslippe svar) for den eksperimentelle replikater findes i mappen respektive ()figur 3A-B). Middelværdi, SD og SEM for hver eksperimentelle betingelse er beregnet og opsummeret i filen "Statistik summary.csv". En Linjegraf, kaldet "Escape_response_all_conditions.tiff" viser den gennemsnitlige flyvning flugt reaktion for op til 12 eksperimentelle betingelser er til stede i hovedmappen ()figur 3 c). Endelig arealet under kurven for alle forsøgsbetingelser, der findes i hovedmappen beregnes og opsummeret i filen "AUC.csv". Afhængigt af antallet betingelser til stede i de vigtigste mappe, scriptet vil enten udføre en to-sidede uparret Welch t-test (2 betingelser) eller en ANOVA med Tukey korrektion for flere test (mere end 2 betingelser) for at afgøre om den eksperimenterende betingelser, der afviger betydeligt fra hinanden. Disse resultater er sammenfattet i "Welch_t-test_results.txt" eller "AUC_anova_results.txt." Når du udfører ANOVA, eksporterer scriptet også et "AUC_anova.tiff" fil, der viser forskellen i gennemsnitlige AUC og konfidensintervaller 95% af de eksperimentelle betingelser, der sammenlignes. Værdierne af absolutte arealet under kurven for de eksperimentelle flergangsbestemmelser for alle forsøgsbetingelser vises som individuelle datapunkter med medianerne i "AUC.tiff" (figur 3D).

Ataksi Telangiectasia (AT) er en autosomal recessiv bevægelse lidelse karakteriseret ved tidlig debut af cerebellare ataksi på grund af mutationer i ataksi Telangiectasia muteret (ATM) gen¹⁴. Mutanter af Drosophila orthologue ATM, tefu, vise defekter i mobilitet og lang levetid¹⁵. For at evaluere makroen"Drosophila ø Assay", en Drosophila model i ATT blev testet i island assay, og data output af makroen blev sammenlignet med manuelle data tæller. Resultaterne viser, at allestedsnærværende tefu knockdown (w^-; Actin-Gal4/GD11950) betydeligt reducerer disse fluer evne til at forlade den platform i forhold til deres genetiske baggrund kontrol (w^-; Actin-Gal4/+) ()figur 4). Efter 1 s, 50% af kontrol fluer var undsluppet platform, i modsætning til den < 1% af tefu- RNAi flyver. Vigtigere, at oplysninger indhentet med makroen trofast gengivet oplysninger indhentet ved manuel optælling, der angiver, at makroen er et pålideligt værktøj, der kan bruges til kvantificering af øen assay data og evaluering af bevægelse fejl ( Figur 4 A-B).

Figur 1: Flowchart beskriver kravene, eksperimentel procedure og analyse af øen assay. (A) ø assay udstyr. (B) eksperimentelle setup for øens assay. (C) ø assay. (D) behandling af øen assay data med makroen"Drosophila ø Assay". Makroen"Drosophila ø Assay" er sammensat af 3 sub makroer: 1) gøre stak og projektion, 2) Definer platform, og 3) analyse. (E) forarbejdning og statistisk vurdering af data ved hjælp af scriptet "Øen Assay analyse". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: eksempler på forskellige justeringer kræves under protokollen. (A) den nødvendige mappestruktur i hvilken ø assay eksperimenter skal opbevares for databehandling og analyse. (B) når du justerer indstillingerne for video, fluer skal vises sort på hvid baggrund. (C) billedramme outputfilerda reddet af billede-optagelse software beskrevet i dette håndskrift. (D) gule skitse viser platform udvælgelse. Lagrede platform udvælgelsen i "ROI Manager" er fremhævet med blåt. (E) fluer er repræsenteret som hvide prikker under justeringen af "Minimum flyve størrelse indstilling." Resultatvinduet viser området af fluer i pixels. (F) eksempel på en enkelt optaget billedramme (til venstre) og den tilsvarende ramme i den resulterende billedstak, fremstillet med makroen"Drosophila ø Assay" (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: resultat billeder fremstillet efter databehandling med "Øen Assay analyse" script. (A) Line graf, der viser flyvning undslippe svar for hver kontrol eksperimentelle replikeres. (B) linje graf viser flyvning undslippe svar for hver tefu RNAi eksperimentelle replikeres. (C) gennemsnitlige flyvning undslippe svar for angivne forsøgsbetingelser; fejllinjer udgør SEM. (D) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og mutant betingelser. Eksperimentelle flergangsbestemmelser for begge tefu RNAi og kontrol betingelser vises som individuelle datapunkter (i sort) med medianerne (rød linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Allestedsnærværende tefu knockdown fluer Vis en betydeligt nedsat evne til at forlade platformen. Data repræsenterer procentdelen af fluer på platformen over tid (s) til kontrol (w^-; Actin-Gal4/+) og tefu RNAi (w^-; Actin-Gal4/GD11950) flyver. (antal flergangsbestemmelser = 5; fejllinjer repræsenterer SEM). (A) rå data indhentet med makroen"Drosophila ø Assay". (B) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og tefu RNAi betingelser opnås med makroen"Drosophila ø Assay" (Welch parrede t-test, ** p < 0,01). (C) rå data opnået ved manuelt tælle antallet af fluer findes på øen pr. sekund. (D) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og Tefu RNAi betingelser opnås ved optælling af hånd (Welch parrede t-test, ** p < 0,01). Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Kolonnenavnet	Beskrivelse
Skive	Rammenavn.
Grev	Antallet af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI).
Samlet areal	Samlet areal af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.
Gennemsnitlige størrelse	Samlet areal af de objekter, der er opdaget i den indramme, divideret med antallet objekter inden for rammerne af platform (ROI).
% Område	Procentdelen af området besat af objekter med hensyn til det samlede areal af platform (ROI).
Perim.	Samlede omkredsen af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.
Min. flyve størrelse	Mindst flyve størrelsesindstilling defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay" (i pixel).
Området ROI	Området af platform (ROI) defineres af brugeren under kørsel af makroen sub definere platform (i pixel).
Antallet af fluer	Antallet af fluer anvendes pr. eksperiment defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay".

Tabel 1: Parametre måles af makroen"Drosophila ø Assay". De parametre, der er beskrevet i denne tabel vises i filen "results.txt" efter køre makroen"Drosophila ø Assay".

Kolonnenavnet	Beskrivelse
Skive	Stelnummer.
Grev	Antallet af fluer blev fundet i rammen, inden for rammerne af platform (ROI).
X.Area	Samlet areal af fluer blev fundet i rammen, inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.
Min. flyve størrelse	Mindst flyve post indstilling defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay" (i pixel).
Området ROI	Området af platform (ROI, i pixels) defineres af brugeren, når køre makroen sub "definerer platform".
Antallet af fluer	Antallet af fluer anvendes pr. eksperiment defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay".
X.Count	% flyver til stede på platformen i de respektive skive/ramme i forhold til det højeste antal fluer fundet på platformen under eksperimentet.
Tidspunkt	Tidspunkt 1 repræsenterer den første ramme skal analyseres og svarer til den ramme, hvor fluerne først vises på platformen. Der er ialt 100 frames pr. replikat analyseret (svarende til 10 s, når du bruger indstillingerne beskrevet.
Eksperiment	Antal flergangsbestemmelser pr. betingelse.
Betingelse	Angiver navnet på den eksperimentelle tilstand (ifølge brugerdefinerede navnet på mappen, der indeholder dataene).

Tabel 2: Beskrivelse af variablerne, der opnås efter databehandling med "Øen Assay analyse" script. De parametre, der er beskrevet i denne tabel vises i filen "data_all_conditions.csv" ved databehandling med scriptet "Øen Assay analyse".

Discussion

Denne protokol beskriver makroen"Drosophila ø Assay", der kvantitativt vurderer Drosophila motor adfærd under øen assay. Makroen tæller præcist fluer på platformen over tid, hvilket gør øen assay meget følsomt og egnet til kvantitative høj overførselshastighed evaluering af bevægeapparatet defekter. Metoden giver mulighed for sammenligning af enhver tilstand med fluer dyrkes under forskellige genetiske og/eller miljømæssige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne udlæsning er således især nyttige som opdagelse værktøj, når du udfører store genetiske eller farmaceutiske skærme, når man studerer Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme, eller ved behandlingen af bevægelse eller fly adfærd.

Øen assay protokollen præsenteret i dette håndskrift giver fordele i forhold til eksisterende/alternative metoder. For eksempel, er video-tracking bevægelse langt mere tidskrævende og mindre egnet til at teste store stikprøvestørrelser. Øen assay er en høj overførselshastighed screeningsværktøj, og i denne forstand, kan sammenlignes med hurtige interaktive negative geotaxis (RING) assay¹⁶. Forskellen mellem to er, at øen assays giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af bevægeapparatet problemer; fluer manglende evne til at forlade platformen kan være forårsaget af defekter i flugt, hoppe, eller gå adfærd forårsaget af wing (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) mangler. På den anden side vurderer RING assay defekter i klatring/gående adfærd forårsaget af ben (muskel/neuronal) mangler. I tilfælde af brugere er interesseret i flere adfærdsmæssige udlæsninger, kombineres øen analysen også nemt med andre assays, såsom RING assay. Derudover lasere kræves til optogenetics kan nemt installeres i boksen ø assay, og opsætningen er så simpel, at det nemt kan flyttes til et værelse, hvor temperatur og lys kan reguleres.

For at sikre succes og reproducerbarhed af øen analysen beskrives her, bør flere henstillinger følges. Alikvot og overførsel fluer til den eksperimentelle test hætteglas på mindst én dag før forsøget at undgå virkningerne af CO₂ eller kolde anæstesi. Må ikke overcrowd de eksperimentelle hætteglas (brug 10-15 fluer pr hætteglas, det er bedste for altid at placere det samme antal fluer pr hætteglas). Holde fluerne på frisk mad på alle tidspunkter. Hvis ikke endnu kender gennemfører analysen, praksis kaste flyver ind på platformen til at maksimere udbyttet. Også praksis hurtigt tilbagetrækningskraften hånden lige bagefter, da det forstyrrer dataanalyse (billedanalyse og flyve tælle start kun efter hånden er ude af billedet). Holde de miljømæssige og eksperimentelle betingelser identiske i eksperimenter, der skal sammenlignes (fx kontrol versus mutanter eller en genotype testet på forskellige alderstrin). Altid udføre eksperimenter på samme tid af dagen og vedligeholde hætteglas med kontrolleret temperatur og luftfugtighed vilkår. Statistisk power, test mindst tre tekniske replikater pr. biologiske replikeres.

For at sikre vellykket udførelsen af makroen beskrevet her, webcam og billede indstillinger skal ændres for at opnå maksimal kontrast: flyver vises som sorte objekter på en hvid platform. Når antallet af fluer ikke er korrekt optalt af makroen, justere indstillingerne kontrast, tjekke om ROI markeres korrekt og sikre, at størrelsen af fluer på platformen er ovenfor angivne minimum flyve størrelse indstilling (Se trin 8.3 i denne protokol). Indstillingerne skal kun defineres én gang. De er gældende for alle eksperimenter, så længe afstand mellem webcam og platformen ikke er ændret. Circularity_min og max indstillinger definerer cirkularitet af partikler (partikler = optalte fluer) der vil blive taget hensyn til analyse (flyver = optalte objekter). 1 repræsenterer en perfekt cirkel, og 0 repræsenterer en linje¹⁷. Da flyver altid til stede en vis grad af cirkularitet (en flue ikke kan vises som en lige linje), "Circularity_max"-indstilling er sat til 1 og indstillingen "Circularity_min" er indstillet på 0,4. Det er usandsynligt, at brugeren skal justere disse indstillinger.

Makroen gør lejlighedsvis tælle fejl, når en flue ligger tæt på grænsen til platformen. Dette kan forekomme, hvis fluerne ikke kan flyve men gang og ud af den brugerdefinerede ROI. I de fleste tilfælde kan vælge igen ROI (montering det så meget som muligt til platformen) nemt løse problemet. Men "Øen Assay analyse" scriptet er købedygtig opdager og korrekte forkert data tæller forårsaget af fluer gå ind og ud af ROI relativt godt. Selv om løsningen af webcam præsenteres her er høj nok til at diskriminere fluer i umiddelbar nærhed af temmelig godt, vi har gennemført yderligere algoritmer i billedet forædling af makroen"Drosophila ø Assay" som den vandskel og erodere funktion¹⁷. Disse lette den korrekte afgrænsning af fluer, der er i umiddelbar nærhed på platformen. Derudover makroen er ude af stand til at skelne mellem fluer, der sprang fra platformen eller fløj væk fra det. Ikke desto mindre, det generelt bemærkes, at sunde unge flyve stammer flyve væk straks når slippes på platformen, der henviser til, at ældre fluer og fluer med bevægeapparatet underskud forbliver længere på platformen og vil til sidst hoppe eller falde af platformen. På trods af disse begrænsninger giver analyse og analyse en meget nøjagtig måling af bevægeapparatet adfærd.

For at sikre vellykket udførelsen af scriptet "Øen Assay analyse", har brugeren til at sørge for at angive de korrekte stier for input og output filer i script rækker angivet i protokollen og til at levere data i den korrekte mappe format (som angivet i figur 2). Hvis brugeren finder de kriterier, der bruges til at bortfiltrere upålidelige forsøgsdata for strenge (række 68: den første værdi i kolonnen "Tæller" er mindre end eller lig med 5, og række 71: den første værdi i kolonnen "Tæller" er højere end det samlede antal fluer smidt på platfor RM + 3), slukke disse filterindstillinger ved at tilføje en # foran teksten i rækker 68 og 71 i scriptet "Øen Assay analyse". I dette tilfælde medtages alle datasæt i analysen. Alternativt, filterindstillinger kan ændres ved at justere værdierne i rækker, 68 og 71 efter brugernes behov. Muligt artefakter i Tæl værdier i "results.txt" genereret af makroen"Drosophila ø Assay" kan også justeres manuelt og køre scriptet igen på den justerede data. Når brugeren er interesseret i mere end 10 fps, eller mere end 10 s data, antallet af rammer, der behandles af scriptet "Øen Assay analyse" børjusteres. Den statistiske analyse kan også erstattes af brugerdefinerede alternativer.

En mappe kaldet "Eksempler på øen Assay," indeholdende eksempler med billede tidsserier fremstillet ved hjælp af øen assay, kan findes på følgende websted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download mappen "Eksempler på øen Assay" og følg de trin, der beskrives i denne protokol til hurtigt blive fortrolig med strukturen af fil opbevaring, forarbejdning af billederne med makroen "Drosophila ø analyse" og "Ø Assay analyse" script.

Øen assay, kan i kombination med den udviklede makro og analyse script, bruges til at evaluere og kvantificere den afvigende bevægelse opførsel af en Drosophila model af ataksi Telangiectasia. Eftersom analysen kan anvendes effektivt til forskellige aldre, er det velegnet til at analysere den potentielt progressive karakter af fænotyper.

I Resumé er ø-analysen i kombination med"Drosophila ø Assay" makro og scriptet "Øen Assay analyse" en omkostningseffektiv, pålidelig og yderst effektive assay til objektivt at analysere og kvantificere bevægeapparatet defekter af Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser i en høj overførselshastighed måde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com