Summary
וזמינותו האי הוא חדש יחסית, חסכונית assay יכול לשמש כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות בסיסי melanogaster דרוזופילה. כתב יד זה מתאר אלגוריתמים עיבוד נתונים אוטומטי, כימות אובייקטיבי של האי assay נתונים, שהופך את assay readout רגיש, תפוקה גבוהה במסכים גדולים גנטית או תרופתי.
Abstract
ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי לתרום זיהוי גנים מחלה (מועמד) הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות במהירות גוברת. עם זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפרעות אלה. ארגז הכלים הגנטי המולקולרי, התנהגותיות של דרוזופילה melanogaster הופך את זה אורגניזם מודל שימושי במיוחד לאפיון גנים מחלה חדשה ומנגנונים באופן תפוקה גבוהה. למרות זאת, תפוקה גבוהה מסכי לדרוש מבחני יעיל ואמין כי, באופן אידיאלי, הם חסכוניים ולא לאפשר כימות automatized של תכונות רלוונטיות להפרעות אלה. האי וזמינותו היא חסכונית בקלות הגדרת שיטה להערכת התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . ב הזה assay, זבובים נזרקים על גבי פלטפורמה של גובה קבוע. זה גורם תגובה מוטורית הטבועה, המאפשרת את הזבובים להימלט מן הרציף בתוך שניות. בזמן הנוכחי, כמותני של האי מצולם מבחני נעשים באופן ידני, וזו משימה מייגעת, במיוחד בעת ביצוע במסכים גדולים.
כתב יד זה מתאר את האלגוריתמים"דרוזופילה האי Assay" ו- "האי Assay ניתוח" תפוקה גבוהה, עיבוד נתונים אוטומטי של כימות של האי assay נתונים. בכיוונון, פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נישא אוסף סדרות תמונה של פלטפורמת בזמן ביצוע וזמינותו. האלגוריתם"דרוזופילה האי Assay" שפותחה עבור תוכנת קוד פתוח פיג'י תהליכים אלה סדרת תמונות, מכמתת, עבור כל תנאי הניסוי, המספר של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן. התסריט של "האי Assay ניתוח", תואם את התוכנה חינם R, פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי לחשב אם טיפולי/אחרים שונים מבחינה סטטיסטית. זה מאוד משפר את היעילות של האי וזמינותו, מקל על הבדיקה עוצמה ומכניקה בסיסית והתנהגות טיסה. ניתן להחיל אותו ובכך למסכים גדולים חוקרים גינקולוגיות היכולת לעוף, דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, יעילות התרופה.
Introduction
בשנים האחרונות, ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי תרמו במידה רבה הזיהוי של גנים שבבסיס הפרעות תנועה ניווניות של המוח (למשל, אסטרוציטומה אטקסיה, פרקינסון), של העצבית ההיקפית המקור (למשל, נוירודגנרטיביות, גפיים ספסטית תורשתי), ושל שרירי המקור (למשל, שרירים דושן, ניוון חולים myotonic)1,2,3,4 . למרות זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס רוב ההפרעות האלה. הבנה טובה יותר של מנגנונים אלה חיוני לפיתוח טיפולים.
כמו אצל בני אדם, תנועה אורגניזמים מודל, כגון טיסה, וחיות ב דרוזופילה, נשלטת על ידי מרכזי המוח, מערכת העצבים ההיקפית, והשרירים. בנוסף, הדור מהיר והזמן גנטי בארגז הכלים של דרוזופילה להפוך את זה אורגניזם מודל מתאים במיוחד עבור ההקרנה תפוקה גבוהה של גנים המעורבים בהפרעות תנועה עבור5,6 בדיקות סמים . עקב מספר משמעותי של תנאי זה צריך להיבדק ב כגון מסכי, אמין, חסכוני, מבחני פשוטה יחסית, וכן כלים לכמת את התוצאות בצורה אוטומטית, הם רצוי מאוד.
שמידט. et al. (2012) 7 תיאר מבחן נמוכים שנקרא "וזמינותו האי" כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . וזמינותו האי שימש בהצלחה ב הקרנות בקנה מידה גדול לזיהוי גנים עם פונקציות ייחודיות עכשיו, דונלד7, בהערכה של דרוזופילה מודלים של מוגבלות8, וגם עבור הערכת כללי לטוס התנהגות מוטורית9. העיצוב עיקרון של וזמינותו האי מורכב פלטפורמה מוגבהת שעליו נזרקים כמה זבובים. זה גורם של התנהגות מוטורית מולדת המאפשרת זבובים בריא להימלט מן הרציף בתוך שניות. וזמינותו מודד את מספר זבובים שנותרו על הרציף נגמר הזמן7,8,9. כל התכונות הללו מציינים כי וזמינותו האי עשוי להיות כלי סינון רב עוצמה עבור גנים המעורבים בהפרעות תנועה.
כיום, ניתוח כמותי של האי מצולם assay נתונים מתבצעת באופן ידני7,8,9. כדי לשפר את היעילות של וזמינותו, פותחה שיטה בעלות נמוכה באופן אוטומטי למחצה לכמת הבריחה של זבובים מן הרציף. הגדרת משתמש פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נייד כדי לאסוף את הזמן התמונה סדרה של הפלטפורמה, עם מסגרות רכשה כל 0.1 מסגרות ס' מעובדים אז עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מכמת את המספר של זבובים על פלטפורמת מעל הגיע הזמן. המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מחולק שלוש פקודות מאקרו עצמאיות משנה: (I) "מחסנית צור, הקרנה," המשנה מאקרו מזהה אי אחר ניסויים המאוחסנים בתיקיות שונות ויוצר ערימה והקרנה של כל אחד סדרת זמן. (II) המאקרו המשנה "פלטפורמה להגדיר" יפתח ברציפות כל "Projection_image_name.tif" קבצים הממוקמים בתיקיות המשנה בודדים ניסיוני, ובשלב המשתמש הוא מתבקש להגדיר באופן ידני פלטפורמת האי אזור בעל עניין (ROI). (III) "ניתוח" מכמתת באופן אוטומטי את המספר של זבובים שנותרו על הבמה במהלך סדרת הזמן. ניתן להפעיל את פקודות המאקרו משנה ברציפות (בהפעלה אחת) או באופן עצמאי. עבור ניתוח נתונים סטטיסטיים, תסריט פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי להחיל מבחן סטטיסטי כדי לקבוע אם טיפולי/אחרים מתנהגים שונה באופן משמעותי מזו (איור 1). בסופו של דבר, הוכח כי תוכנית התקנה זו ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את היכולת גינקולוגיות aberrant של מודל דרוזופילה תסמונת של אטקסיה טלנגיאקטזיה (ב).
Protocol
1-בניית תיבת Assay האי
- להכין מגש עשוי חומר עמיד, כגון פולי חומצתי (PMMA), להכיל שכבה של מים (דהיינו אמבטיה). להבטיח כי החומר הוא לא לבן.
הערה: מידות 40 x 35 x 2.5 ס מ 3 מומלץ ( איור 1 א'). - להכין תיבה (42 x 38 x 25 ס מ 3) עשוי חומר עמיד, שקוף, כגון PMMA, שימוקמו סביב האמבטיה כדי למנוע את הזבובים לברוח לתוך שטח הבניין. במקום חור (20 x 30 ס מ 2) על הצד הלטראלי גדול מספיק עבור הנסיין בקלות להתמודד עם הבקבוקונים עם זבובים ושחרר אותם על האי ( איור 1 א').
- להכין על פלטפורמה מוגבהת 10 x 15 x 2.5 ס"מ 3 בממד, עשוי מחומר אטום (PMMA או פלסטיק) היא אטומה למים.
הערה: פלטפורמה זו נדרשת כדי לקבל משטח לבן אחיד כדי להבטיח קונטרסט טוב לניתוח תמונה. הגודל הוא לא בהכרח קבוע, אבל זה צריך להיות גדול מספיק כדי לוודא כי כל הזבובים בתחילה לנחות על הרציף, לקבל את ההזדמנות ללכת על זה ( איור 1 א'). - לתקן את הפלטפורמה על-ידי הדבקה זה לאמבטיה או הצבת משקולות או חפצים כבדים אחרים בתוך הקופסה פלטפורמה כדי למנוע שינויים לפי מיקום של פלטפורמת במהלך ההפעלה הניסיונית/לצלם.
2. דרישות התוכנה והתקנה
- התקנה של תוכנה לצריבת תמונה.
- להורדה בתוכנה לצריבת תמונה כדי להקליט את הסדרה האי תמונה (ראה טבלת חומרים), להתקין את התוכנה על מחשב-
הערה: תוכנת הדמיה-הצריבה שמתואר פרוטוקול זה נתמך רק על-ידי Windows. חלופה עבור משתמשים אחרים נוספה טבלה חומרים.
- להורדה בתוכנה לצריבת תמונה כדי להקליט את הסדרה האי תמונה (ראה טבלת חומרים), להתקין את התוכנה על מחשב-
- " Assay האי דרוזופילה " מאקרו ההתקנה.
- להוריד " דרוזופילה Assay האי " מאקרו לבין פיג'י תואם את גירסה 10 (1.4 ומעלה) מתוך אתר האינטרנט הבאים: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- להזיז את הסמן " assay האי " מדריך, לחץ על " בתצוגת. "
- לחץ על " להוריד את כל. " תוכן התיקיה יורדו כקובץ zip; פרוס את הקובץ שהורד.
- עותק " Assay.ijm האי דרוזופילה " קובץ לתוך " Fiji.app/plugins/directory. "
הערה: כאשר החל פיג'י, " דרוזופילה Assay האי " מאקרו יופיע בחלק התחתון של התפריט הנפתח תוספים.
- " האי Assay ניתוח " סקריפט ההתקנה ולהוריד.
- R הורד 11 מפני הבאות באתר האינטרנט: https://cran.rstudio.com. להתקין אותו במחשב. סטודיו
- R להוריד מהאתר הבא: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. להתקין אותו במחשב.
הערה: " האי מבחן ניתוח " סקריפט ניתן להפעיל עם R בלבד. סטודיו R, עם הממשק-המשתמש קל, מוצג כשלב חלופי עבור משתמשים מנוסים עם ר' - להורדה " האי Assay ניתוח " סקריפט של " Assay האי דרוזופילה " המדריך באתר הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
הערה: לאחר ביצוע שלב 2.2, " האי Assay ניתוח " התסריט ניתן למצוא גם רוכסן מכנסיו תיקיה בשם " האי assay. "
3. הכנת הזבובים להיבדק ב וזמינותו האי
- לאסוף מבוים זבובים עבור כל תנאי ניסויית תחת קר או הרדמה פחמן דו-חמצני (CO 2), כפי שתואר לעיל 13 (על פני תקופה של 1 - 2 ימים).
- הכן מינימום של 3 בקבוקים מדגם לכל תנאי הניסוי, שכל אחד מהם מכיל כ-15 מבוים זבובים. רק להשתמש טס עם כנפיים ללא פגע וממוקמים למין וגיל דומה.
הערה: עבור הניסויים המתוארים כאן, מדגם 5 שבקבוקי המכיל זבובים זכרים 15 של אחרים w –; אקטין-Gal4 / + (בקרה) ו- w –; אקטין-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) היו שנאספו ביום של וגיחתו, התיישן במשך 4 ימים, שימשו כדי לבצע את הבדיקה האי. RNAi, שליטה זנים, והנהג אקטין-gal4, התקבלו פרסומת מקור (ראה טבלת חומרים).
- הכן מינימום של 3 בקבוקים מדגם לכל תנאי הניסוי, שכל אחד מהם מכיל כ-15 מבוים זבובים. רק להשתמש טס עם כנפיים ללא פגע וממוקמים למין וגיל דומה.
- לתת את הזבובים לשחזר כדי למנוע תופעות חומרי הרדמה (לפחות יום אחד בעת שימוש CO 2) לפני בדיקות זבובים שנאספו וזמינותו האי בגיל של ריבית.
4-הגדרת הניסוי
הערה: ראה איור 1B.
- להוסיף מים קרים עם כמות קטנה של סבון אל מגש אמבט ומקם את הפלטפורמה באמצע.
הערה: הסבון מקטין את מתח הפנים של המים; זבובים לגעת במים יטבעו. פעולה זו מונעת כמויות הולכות וגדלות של זבובים עפים בתיבת במהלך ההתקדמות של ההפעלה הניסיונית. - למקם את התיבה שקוף על גבי המגש, להאיר את הפלטפורמה מלמעלה בעזרת מנורה.
הערה: תאורה של פלטפורמת נדרש בעיקר כדי להבטיח חדות וידאו נאותה. נורית LED 12-V רגיל מתאים לזה. - הצב מצלמת האינטרנט ישירות מעל הרציף (מחוץ לקופסא) ולחברו למחשב.
- ליצור תיקיות חדשות במחשב כדי לאחסן את הנתונים ניסיוני שונים לפני הניסויים.
- בצע המבנה של הדוגמה מאויר באיורים 2A איור כדי ליצור את התיקיות. לדוגמה, אם הנבחנים דורש בדיקה אחרים שני עם חמש משכפל כל, תחילה ליצור תיקיה הראשי המכילה את התאריך של הניסוי. בתוך התיקיה הראשית, ליצור תיקיות משנה שני (אחד לכל גנוטיפ). בתוך התיקיות גנוטיפ, ליצור תיקיות משנה חדשות חמש, אחד לכל שכפול.
הערה: לצורך ניתוח נוסף, הכרחי כי הסדרה התמונה המתאימה ניסויים בודדים שמורים בתיקיות עם שמות ייחודיים.
- בצע המבנה של הדוגמה מאויר באיורים 2A איור כדי ליצור את התיקיות. לדוגמה, אם הנבחנים דורש בדיקה אחרים שני עם חמש משכפל כל, תחילה ליצור תיקיה הראשי המכילה את התאריך של הניסוי. בתוך התיקיה הראשית, ליצור תיקיות משנה שני (אחד לכל גנוטיפ). בתוך התיקיות גנוטיפ, ליצור תיקיות משנה חדשות חמש, אחד לכל שכפול.
5. הגדרת הגדרות וידאו ב " התקן לכידת " מקטע של הממשק
- פתח תוכנת צריבת תמונה ומטה, " לכידת " טאב, לחץ על " Time-Lapse תמונות … " ובחר את מצלמת אינטרנט המתאימים כמו " לכידת המכשיר. "
- במקום זבוב מת על האי; להתאים את הגדרות הווידאו על-ידי לחיצה על " הגדרות וידאו " התיבה. לגלול סרגלי כלים, כוונון בהירות, ניגודיות, וצבע באופן כזה כי הזבוב מת מופיע שחור על רקע לבן ( איור 2B). לאחר שתשלים ההתאמות, לחץ על " אישור. "
6. הקלטה של הסרטונים שמירת הגדרות ההתקנה ב " זמן לשגות " מקטע של הממשק
< ol>הערה: קובץ הווידאו אינו בשימוש עבור כימות של נתונים; עם זאת, יהיה שימושי לקבל מושג כללי לגבי הניסוי.
- בתיבה דחיסה, בחר " אינטל IYUV קוד " עבור דחיסת וידאו ובחרו " לקחת מסגרת אחת כל 0.1 שניות, " עם " חזרה לשחק קצב (תמונות לשנייה): " ב-10.
- להציל את הסדרה זמן הניסוי כמסגרות. bmp על ידי לחיצה על " מתקדם … " בחר " ליצור תמונת. bmp עבור כל אחד נתפס מסגרת. " לחץ על " עיון. " בחר באותה הספריה ב " לכידת סרט AVI במהלך " חלון (as הנבחר בשלב 6.1), לחץ על " פתוח, " והקש " אישור. "
הערה: שימו לב, במהלך הניסוי, המסגרות מאוחסנים קבצי bmp (נדרש לניתוח נתונים). התוכנית שמות המסגרות כמו " A " ואחריו במספר התואם רצף לכידת מסגרת (למשל, " A_number.bmp ") ( איור 2C). תמיד לשמור תמונות השייכים ניסויים שונים בתיקייה חדשה כדי להבטיח כי סדרת תמונות טלוויזיה שהוקלטה מראש לא יוחלף. להיות מודע כי התמונות לא נשמרים באופן אוטומטי באותה תיקיה שבה נמצא קובץ וידאו אלא אם תיקיה זו נבחרה תחת " עיין … " בעת לחיצה " מתקדם " תיבת.
7. האי Assay ואיסוף נתונים
- לחצו על לחצן start בממשק תמונות בצילום מואץ של תוכנת צריבת תמונה כדי להתחיל בהקלטה.
- הקש על המבחנה ניסיוני המכיל זבובים (שלב 3) 2 - 3 פעמים כדי להבטיח כי זבובים בתחתית המבחנה. הסר את התקע של הבקבוקון ובמהירות, עם תנועה נמרצת, הקש על המבחנה על פלטפורמת כך כל הזבובים נופלים על הפלטפורמה באותו זמן ( איור 1C).
- לאחר כ-30 s, הקש " להפסיק " כפתור כדי לעצור את ההקלטה.
הערה: אם כל הזבובים מעלי הפלטפורמה, ההקלטה ניתן לעצור מוקדם יותר. - להסיר את הזבובים שנותרו ב-30 s על פלטפורמת ביד לאחר שעצרה את ההקלטה התמונה.
- לפני שתמשיך כדי להקליט את הניסוי הבא, לשנות את תיקיית היעד עבור קבצי bmp וסרטים (ראו סעיף 6).
8. עיבוד נתונים: מפעיל " Assay האי דרוזופילה " מאקרו
הערה: ראה איור 1D.
- להפעיל " ליצור מחסנית והקרנה " המשנה מאקרו כדי לייצר ערימות ותחזיות של סדרת תמונות שנאספו.
- פיג'י התחלה, לחץ על " תוספים " הכלים, וכן בחרה " Assay האי דרוזופילה " בתפריט הנפתח; יופיע חלון חדש.
- Enter " תמונה ראשונה מזהה זמן-סדרת " הגדרת בממשק גרפי של מאקרו.
הערה: מסגרות תמונות מוקלטות נשמרות " A-number.bmp " לפי הסדר שבו מתקבלים התמונות. ב " קודם למסגר המזהה " מאקרו ממשק, מלאו הגדרת המספר הנתון על המסגרת הראשונה על-ידי התוכנית, עם סיומת הקובץ. מילוי " קודם למסגר המזהה " עם "-0001.bmp, " מאז המסגרת הראשונה נקראת " A-0001.bmp " ( איור 2C). במקרה אחר תבניות תמונה (כגון .tiff או קבצי jpeg) מופקים על ידי התוכנה מצלמת אינטרנט, ציון סיומת הקובץ הנכון של התמונה הראשונה ב- " תמונה ראשונה זמן-סדרת המזהה. " - בחר רק " ליצור מחסנית והקרנה " המשנה מאקרו, לחץ על " טוב, ", בחר את הספרייה הראשית, המכיל את כל תיקיות המשנה עם האי בודדים assay ניסויים.
הערה: קבצי. bmp כל אדם ניסוי התיקיה המכילים " קודם למסגר המזהה " לאחר מכן יעובדו. שניים חדשים הקבצים יופיעו בתיקיית משנה כל ניסוי בודדות, בשם כברירת מחדל " Stack_image_name.tif ", " Projection_image_name.tif " ( איור 1D). לאחר שלב זה מבוצע, ניתן למחוק את קבצי bmp. מחסנית והקרנה. tif להכיל כל הנתונים והקבצים מספיקים לצורך ניתוח נוסף.
- להפעיל " פלטפורמה להגדיר " מאקרו המשנה השני כדי לבחור את המיקום המדויק של פלטפורמת ה-
- לפתוח את הממשק הגרפי של " דרוזופילה האי Assay, " בחר רק " הגדר פלטפורמה " תיבת סימון, ולחץ " אישור. "
- ב " לבחור הספרייה " חלון, בחר את הספרייה המרכזית איפה ניסיוני תיקיות משנה מאוחסנים והקש " בחר. "
הערה: " פלטפורמה להגדיר " מאקרו המשנה יחפש באופן אוטומטי עבור " Projection_image_name.tif " קבצים בתיקיה ובכל תיקיות המשנה לאחסן בספריה המרכזית. " Projection_image_name.tif " התמונה מאוחסן בתיקיה הראשונה, יחד עם שני חלונות — " להגדיר את הפלטפורמה " ו- " רועי מנהל " — יפתח. - בחר " מצולע בחירות " הכלי בסרגל הכלים כדי לצייר בחירה התואמת את הפלטפורמה האי.
הערה: חשוב מאוד לשלול הגבול של פלטפורמת מהקטע הנבחר. ראה איור דו-ממדי. - לאחר בחירת פלטפורמת בתמונה הראשונה, לחץ על " הוספה ", " רועי מנהל " חלון; הרצון האזור שנבחר מופיעות בחלון מנהל רועי כערכה של ערכים ( איור דו-ממדי). העיתונות " בסדר ", " להגדיר את הפלטפורמה " חלון. המאקרו ימשיך ההקרנה הבאה.
- לחץ על המספרים ( איור דו-ממדי) מאוחסנים " רועי מנהל " חלון; הרצון הבחירה הקודם ואז יופיעו באופן אוטומטי התחזית הנוכחית התמונה.
הערה: מאז האי פלטפורמה סביר שיש באותו גודל ובאותו מיקום כאשר ניסויים מבוצעים ברציפות (כל עוד המיקום של מצלמת אינטרנט, האי נותרים ללא שינוי), זה שימושי לאחסן את רועי הגדרת פלטפורמות שונות " רועי למנהל. " על ידי כך המשתמש יחסוך זמן; ההקרנות הקרובות, זה רק צורך ללחוץ על הבחירה מאוחסנות באופן זמני במנהל רועי. - אם המיקום של האי עברה מעט בהשוואה הניסוי הקודם, לכוונן את המיקום הנבחר על-ידי לחיצה שמאלית במרכז הבחירה וגרירה האזור שנבחר לעמדת הנדרש.
- אם הבחירה אינו תואם עם הפלטפורמה, שמאל מחוץ הבחירה, ניסחו בחירה חדשה עבור פלטפורמה באמצעות " מצולע הבחירה " בכלי. לאחסן הבחירה החדשה במנהל רועי על-ידי לחיצה על " להוסיף; " בחירה חדשה יופיעו " רועי מנהל " חלון שניתן להשתמש בהם ללא הרף.
- בעת הבחירה מותאמת, לחץ על " טוב " ב " להגדיר את הפלטפורמה " חלון, חזור על התהליך עד הפלטפורמות מוגדרים.
הערה: שים לב כי תמונה בינארית של פלטפורמת המתאים לאזור רועי מוגדרים היטב לבן על רקע שחור, בשם " Platform_image_name.tif, " הופיע עבור כל תמונה המעובדים בתיקיית המשנה ניסיוני באותו מחסנית, הקרנה תמונות שנוצרו בצעד 8.1.3 ( איור 1D).
- להגדיר את הגודל המינימלי לעוף.
הערה: הגדרה זו מגדיר את גודל מינימלי לטוס בפיקסלים. חלקיקים קטנים יותר מהגודל המינימלי שצוין ייכללו הניתוח כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות בעקבות הרעש.- לפתוח אוסף תמונות שנוצרו על-ידי " ליצור מחסנית והקרנה " המשנה מאקרו א
- להמיר את אוסף תמונות כדי 8 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה > > סוג > > 8-bit.
- ללכת לתפריט, לחץ על התמונה > > התאם > > הסף, לוודא " רקע כהה " תיבת בחירה, והקש " להחיל; " חלון שני שנקרא " הסף " יופיע. לחץ על " backgro כההund " והקש " אישור. "
הערה: ערימה תמונה בינארי ייווצר שבו הזבובים מוגדרים ב הרציף לבן לשחור. כאשר זה לא המקרה, להחיל " ' היפוך ' " פונקציה על-ידי לחיצה על ערוך > > היפוך > > לרוץ. - קבע את קנה המידה לזהות את מספר הפיקסלים על-ידי לחיצה על נתח > > לקבוע קנה מידה. להחיל את ההגדרות הבאות: מרחק בפיקסלים = 1, ידוע מרחק = 1, יחסי גודל של פיקסל = 1 ויחידת אורך = פיקסל. העיתונות " אישור. "
- בחר " שרביט " (מעקב) הכלי סרגל כלים, לחץ על זבוב (נקודה שחורה) נוכח על הבמה. הקש ctrl + m (למשתמשי חלונות) או cmd + m (משתמשי Mac); חדש " תוצאות " חלון יציין את האזור של המקום הנבחר בפיקסלים. לעשות את זה ברצף כמה זבובים ולקבוע הגודל המינימלי לעוף.
הערה: בעת הפעלת המאקרו, להגדיר " בגודל זבוב מינימום " הגדרת לגודל הקטן ביותר שנצפה לטוס מינוס שוליים של 10%. ( איור 2E).
- להפעיל " ניתוח " מאקרו המשנה השלישי לכמת זבובים בריחה מן הרציף.
- ללכת הכלים, בחר " תוספים, " בחרה " Assay האי דרוזופילה. "
- התאם " מינימום גודל לטוס " הגדרת בהתאם לערך שהוגדר בשלב 8.3.
הערה: שימוש הערך המוגדר שלב 8.3 רק אם הגדרת סטנדרט של " מינימום גודל לטוס " גורם אי-הכללה של זבובים שהיו בהווה על הרציף, או אם המאקרו מזהה אות רקע כמו זבובים. - , " מספר זבובים לכל מבחנה " הגדרת, למלא את המספר המרבי של זבובים נוכח הבקבוקונים במהלך הניסוי מלאה. לדוגמה, אם ניסוי אחד יש מבחנות שמכילות את הזבובים 15, אחרים המכילים 20 זבובים ואחרים המכילים זבובים 23, " מספר זבובים לכל מבחנה " חייב להיות המצוין כ 23.
- בחר " נתח " תיבת הסימון הקש " טוב; " חדש " לבחור הספרייה " יופיע חלון. בחר את הספריה המרכזית (עם כל תיקיות המשנה והקבצים בתוך) והקש " בחר. "
הערה: המאקרו תנתח כל התמונות המאוחסנות בתיקיות המשנה, כל עוד הם מכילים " stack_image_name, " " Projection_image_name, ", " Platform_image_name " קבצים. המאקרו יעבד תמונה אחרי תמונה. הפלט המאקרו מורכב ערימה תמונת תוצאה בינארית בשם “ result_stack_subfolder_name.tif ” קובץ טקסט התוצאה בשם " result_subfolder_name.txt, " אשר יופיעו כל הנתונים תיקייה. קובץ טקסט (. txt) והתוצאה מכיל מדידות כמותיים המתאים לתמונה מחסנית והוא מכיל עמודות 9. התוכן של עמודות אלה מסוכם בטבלה 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " מקביל תמונה-סדרת הזמן של ניסוי אחד, בו מיוצגות זבובים שזוהו במהלך הניסוי כמו נקודות שחורות על רקע לבן ( איור 1E). - בדקו בקפדנות הערימה תוצאה כדי לוודא כי אין ממצאים התרחשו המאקרו עבד בצורה מדויקת ( איור 2F).
הערה: דוגמאות של חפצים ניתן רכיבי התמונה כי הם לא טס, אבל זה מזוהים ככאלה על ידי האלגוריתם פילוח של התמונה (תוצאות חיוביות שגויות). לדוגמה, ייתכן שהדבר נובע זיהוי של רקע אות בגלל מבחר לא מדויק של רועי.
9. ניתוח נתונים באמצעות " האי Assay ניתוח "
- מבנה הנתונים כאמור דמות 2A כדי לאפשר ניתוח עם " האי Assay ניתוח " סקריפט. צור ספריה הראשי עם תיקיות משנה, איפה כל תיקיית משנה מקביל תנאי ניסויי אחד כדי להיות מנותח.
- בתיקיות המשנה, ליצור תיקיות המכילות את עצמאית ניסיוני משכפל ( איור 2 א) ואת הקבצים results.txt המיוצר על ידי " assay האי דרוזופילה " מאקרו.
הערה: " האי Assay ניתוח " מאקרו יעבד בכל תנאי ניסויי הנמצא בספריית הראשי בעת ובעונה אחת.
סטודיו להתחיל או R - . לחץ על הקובץ > > פתח קובץ … הכלים, בחר " האי Assay ניתוח " script.
- להתקין ggplot2 ואת matrixStats חבילות בעת הפעלת " האי Assay ניתוח " סקריפט בפעם הראשונה. הקלד את השורה הבאה בחלון המסוף:
> install.packages("ggplot2"), הזן
> install.packages("matrixStats"), הזן.
- להתקין ggplot2 ואת matrixStats חבילות בעת הפעלת " האי Assay ניתוח " סקריפט בפעם הראשונה. הקלד את השורה הבאה בחלון המסוף:
- ציין המיקום של הפלט נתונים וניתוח קבצים בקובץ ה-script. הוספת שורות ה-script שלהלן:
- שורה 16: הוסף את הנתיב אל הספריה הראשית המכילה את הניסויים להיות מנותח, בהשוואה (ב- איור 2A, זהו הנתיב בימוי " Assay האי " התיקיה).
- שורה 19: הוסף את הנתיב אל התיקיה שבה מאוחסנים קבצי הפלט ניתוח.
הערה: המדריך המצוין שורה 16 יכול להכיל רק את התיקיות כדי להיות מנותח. קובץ ה-script גם לא תפעל כראוי אם הנתיבים מוכנס 16 ושורה 19 זהים.
- להפעיל את קובץ ה-script על-ידי לחיצה על קוד > > להפעיל אזור > > להפעיל את כל הכלים.
הערה: שים לב שלושה קבצי csv וכתוצאה מכך, קובץ. txt וכתוצאה מכך אחד ( איור 1E) מופיעים במדריך הכתובות המוגדרים שורה 19. אלה הם: (I) " data_all_conditions.csv " הקובץ מכיל את הנתונים מעובדים המתאים לכל תנאי הניסוי ומשוכפלת ניסיוני, מאורגן כפי שמתואר בטבלה 2. (II) " summary.csv סטטיסטיקה " קובץ מסכם הממוצע, סטיית התקן (SD), השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) של האחוזים של זבובים על הפלטפורמה עבור כל תנאי הניסוי. (III) " AUC.csv " הקובץ מכיל את האזור מתחת העקומה עבור כל שכפול ניסיוני. (IV) בהתאם למספר תנאים נוכח בתיקייה הראשית, התסריט יהיה ייצוא " Welch_t-test_results.txt " קובץ (2 התנאים) או " AUC_anova_results.txt " קובץ (יותר מ 2 התנאים), איפה התוצאות המבחן ה-t או אנובה משווה את האזור תחת עקומת בין תנאי הניסוי מצוינים. שים לב כי ארבעה סוגים של קבצי תמונות .tiff ( איור 1E) מופיעים בנתיב המוגדר שורה 19. אלה נקראים: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (איפה Name_Of_Data_Folder מייצג את שם התיקיה שניתנו על-ידי המשתמש), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, ", " AUC_anova.tiff. " מידע מפורט באשר לתוכן של גרפים אלה ניתן למצוא בתוצאות נציג של כתב יד זה באיור 3.
Representative Results
ב פרוטוקול המתואר, דרוזופילה האי assay נתונים רכשה, מעובד בשלושה צעדים. ראשית, תגובת הבריחה טיסה דרוזופילה נזרק על הפלטפורמה איילנד נרשמים עם מצלמת אינטרנט ומאוחסנים כתמונות בודדות. bmp (סעיפים 1-7 לפרוטוקול). שנית, המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (שלב 8) תהליכי המסגרות, יצירת "result" של. טקסט txt (טבלה 1), בו מסוכם מספר האובייקטים זוהה בכל מסגרת, ואוסף תמונות "Result_stack.tiff", אשר מציג האובייקטים אותר בתוך האזור של פלטפורמת בכל מסגרת. שלישית, התסריט "האי Assay ניתוח" (פרוטוקול סעיף 9) מעבד את נתוני מאקרו המאוחסן בתוך הקבצים "results.txt" של ניסויים בודדים. מספר צעדים משולבים בקובץ ה-script כדי לסנן ולשלב את הנתונים לניתוח סטטיסטי. המסגרת הראשונה שבה הזבובים נזרקים על פלטפורמת זוהה ונחשב כנקודת זמן 1. מסגרות קודמות מסולקות החל ערכת הנתונים. 100 מסגרות בעקבות הזמן נקודה 1 (המקביל 10 s) נבחרו לניתוח. ניסויים שבהם המספר הראשוני של זבובים זוהה על הרציף הוא קטן יותר 5 מושמטים אוטומטית מניתוח, ביטול לא אמין תוצאות של ניסויים חלשה. ניסויים בהם המספר הראשוני של זבובים זוהה על פלטפורמת חורגת ההגדרה "מספר זבובים לכל מבחנה" פלוס סובלנות של 3 לא יכללו גם. פעולה זו מבטלת datasets איזה רעש חלקיקים זוהו בטעות כמו זבובים. קובץ ה-script מחשב את אחוז זבובים זוהה עבור כל נקודת זמן לעומת המספר הגבוה ביותר של זבובים זוהה בסדרה. שגיאות ב- datasets הנגרמת על ידי זבובים הליכה ויוצאים רועי (מזוהה כמו ירידה ואחריו עלייה באחוזים של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן) באופן אוטומטי מתוקנות על ידי ביחס אליהם כפי שהוא נוכח באופן עקבי על פלטפורמת בשלבים מוקדמים יותר . כל datasets שכפל עבור תנאי ניסויי ספציפי שהיו קיימים בספריה הראשית בשילוב, מיוצאים לקובץ ה-"data_all_conditions.csv". העמודות מייצגות המשתנים המתוארות בטבלה 2. קובץ ה-script ייצא גם גרף קווים עבור כל תנאי הניסוי, שמות בהתאם התיקייה המכילה את הנתונים. גרף זה מראה האחוזים של זבובים שנותרו על פלטפורמת לאורך זמן (טיסה לברוח תגובה) ניסיוני משכפל נוכח בתיקיה בהתאמה (איור 3A-B). אומרת, SD ו- SEM עבור כל תנאי הניסוי הם מחושבים ומסוכם בקובץ "סטטיסטיקה summary.csv". גרף קו הנקרא "Escape_response_all_conditions.tiff" מציגה את התגובה לברוח טיסה ממוצע עד 12 ניסיוני תנאים להציג התיקיה הראשית (איור 3C). בסופו של דבר, האזור מתחת העקומה עבור כל התנאים הניסיונית הנוכחית בתיקייה הראשית מחושב, סיכם בקובץ ה-"AUC.csv". בהתאם למספר תנאים נוכח בתיקייה הראשית, קובץ ה-script או יבצע דו-זנבית אינטראקצית ולש מבחן t של (2 התנאים) או של אנובה עם תיקון Tukey עבור מספר בדיקות (תנאי יותר מ-2) לקבוע אם ניסיוני תנאים שונים באופן משמעותי אחד מהשני. תוצאות אלה מסוכמות "Welch_t-test_results.txt" או "AUC_anova_results.txt". בעת ביצוע מקרה ANOVA, התסריט גם תייצא קובץ "AUC_anova.tiff" מציגה את ההבדל בין הממוצע חאן אל ומרווחי בטחון 95% מהמצבים ניסיוני מושווים. הערכים של אזור מוחלטת מתחת העקומה של משכפל ניסיוני עבור כל התנאים ניסיוני מוצגים כנקודות נתונים נפרדים עם medians ב "AUC.tiff" (דמות תלת-ממד).
אטקסיה Telangiectasia (AT) היא הפרעת תנועה הקרים autosomal מאופיין על ידי התפרצות מוקדמת. של אטקסיה אסטרוציטומה עקב מוטציות ב ג'ין אטקסיה Telangiectasia מוטציה (ATM)14. מוטציות של orthologue דרוזופילה של ATM, tefu, להציג פגמים ניידות ואריכות ימים15. כדי להעריך את המאקרו"דרוזופילה האי Assay", מודל דרוזופילה של AT נבדקה ב וזמינותו האי, הפלט נתוני המאקרו היה להשוותו למונים ידנית של נתונים. התוצאות מציגות את בכל מקום tefu נוקאאוט (w–; Actin-Gal4/GD11950) מקטין באופן משמעותי את היכולת של הזבובים האלה לעזוב את הפלטפורמה לעומת שולט הרקע הגנטי שלהם (w–; Actin-Gal4/+) (איור 4). לאחר 1 s, 50% של הזבובים שליטה נמלט הפלטפורמה, בניגוד ל < 1% של tefu- RNAi זבובים. חשוב, נתונים שהושגו עם המאקרו בנאמנות לשכפל את הנתונים שבידי ידני סופר, המציין המאקרו הוא כלי אמין שיכול לשמש עבור כימות של האי assay נתונים והערכת ליקויי תנועה ( איור 4 A-B).
איור 1: תרשים זרימה חלוקה לרמות את דרישות, ניתוח ניסיוני, וניתוח וזמינותו האי. (א) האי assay ציוד. (B) הגדרת הניסוי עבור וזמינותו האי. (ג) האי וזמינותו. (ד) עיבוד של האי assay נתוני המאקרו"דרוזופילה האי Assay". המאקרו"דרוזופילה האי Assay" מורכב מאקרו המשנה 3: 1) להפוך מחסנית והקרנה, 2) מגדירים פלטפורמה, וניתוח 3). (E) עיבוד והערכה סטטיסטי של נתונים באמצעות קובץ ה-script "האי Assay ניתוח". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות של התאמות שונים הדרושים במהלך הפרוטוקול. מבנה הספריות (A) הדרוש באי אילו ניסויים assay מוכרחים להיות מאוחסנים עבור עיבוד נתונים וניתוח. (B) כאשר כוונון הגדרות וידאו, זבובים להופיע שחור על רקע לבן. (ג) תמונת מסגרת פלט קבציםכפי שנשמרו על ידי תוכנת צריבת התמונה המתוארת בכתב היד. חלוקה לרמות (D) הצהוב מציג את בחירת פלטפורמה. בחירת פלטפורמה מאוחסנות במנהל"רועי" מסומן בכחול. זבובים (E) מיוצגים כמו נקודות לבנות במהלך התאמת גודל מזערי לטוס הגדרת." החלון תוצאות מציג את האזור של הזבובים בפיקסלים. דוגמה (F) של מסגרת תמונה בודדת מוקלטות (בצד השמאל), את המסגרת המתאימה במחסנית התמונה המתקבלת, שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בצד ימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונות התוצאה מושגת לאחר עיבוד הנתונים עם script. "האי Assay ניתוח" (א) קו גרף המציג את התגובה לברוח טיסה עבור כל אחד לשלוט שכפול ניסיוני. (B) קו הגרף מציג התגובה לברוח טיסה עבור שכפול ניסיוני RNAi כל tefu. (ג) טיסה ממוצע לברוח בתגובה ל המצוין התנאים ניסיוני; קווי השגיאה מייצגים החלקות Dot ב- SEM (D) המייצג את האזור שמתחת עקומת התפלגות שליטה ומצבים מוטציה. משכפל ניסיוני עבור שני התנאים RNAi ושליטה של tefu מוצגים כנקודות נתונים נפרדים (בשחור) עם medians (הקו האדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זבובים תמונות ציפורים בכל מקום tefu להראות לך היכולת ירד משמעותית לעזוב את הרציף. הנתונים מייצגים את האחוזים של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן (s) עבור פקד (w–; Actin-Gal4/+), tefu RNAi (w–; Actin-Gal4/GD11950) יש טיסות. (מספר משכפל = 5; קווי השגיאה מייצגים SEM). (א) נתונים גולמיים שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay". הנקודה (B) מתווה המייצג את האזור תחת ההתפלגות עקומת עבור פקד tefu RNAi ותנאי שהושג עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (ולש אינטראקצית-t-test, * * p < 0.01). (ג) מתקבל על ידי ספירת המספר באופן ידני נתונים גולמיים זבובים נוכח באי לשניה. (ד) נקודה מתווה המייצג את האזור תחת עקומת התפלגות שליטה ומצבים Tefu RNAi מתקבל על ידי ספירת יד (ולש אינטראקצית-t-test, * * p < 0.01). קווי השגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם עמודה | תיאור | ||
| פרוסה | שם מסגרת. | ||
| ספירה | מספר האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI). | ||
| השטח הכולל | השטח הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים. | ||
| גודל ממוצע | השטח הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת לחלק למספר אובייקטים בתוך הגבולות של פלטפורמת (ROI). | ||
| % שטח | האחוז באזור שנכבשו על ידי האובייקטים ביחס מכלל השטח הרציף (ROI). | ||
| Perim. | ההיקף הכולל של האובייקטים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים. | ||
| גודל לטוס מ | המינימום לטוס הגדרת גודל המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בפיקסלים). | ||
| אזור רועי | האזור של פלטפורמת (ROI) שהוגדרו על-ידי המשתמש במהלך ההפעלה של מאקרו המשנה הגדרת פלטפורמה (בפיקסלים). | ||
| מספר זבובים | המספר של זבובים משמש לכל ניסוי המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay". | ||
טבלה 1: פרמטרים נמדדת המאקרו"דרוזופילה האי Assay". שאר הפרמטרים המתוארים בטבלה זו יופיעו בקובץ ה-"results.txt" בעת הפעלת המאקרו"דרוזופילה האי Assay".
| שם עמודה | תיאור | ||
| פרוסה | מספר מסגרת. | ||
| ספירה | המספר של זבובים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI). | ||
| X.Area | השטח הכולל של הזבובים שאותרו במסגרת. במסגרת הפלטפורמה (ROI) בפיקסלים. | ||
| גודל לטוס מ | המינימום לטוס הגדרת ערך גודל המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay" (בפיקסלים). | ||
| אזור רועי | האזור של הפלטפורמה (ROI, בפיקסלים) שהוגדרו על-ידי המשתמש בעת הפעלת המאקרו המשנה "להגדיר פלטפורמה". | ||
| מספר זבובים | המספר של זבובים משמש לכל ניסוי המוגדר על-ידי המשתמש בממשק גרפי של המאקרו"דרוזופילה האי Assay". | ||
| X.Count | % זבובים הנוכחי על פלטפורמת הפרוסה/מסגרת בהתאמה ביחס המספר הגבוה ביותר של זבובים מזוהה על הבמה במהלך הניסוי. | ||
| Timepoint | נקודת הזמן 1 מייצג המסגרת הראשונה כדי להיות מנותח, מתאים למסגרת שבה הזבובים החלו להופיע על הבמה. ישנם בסך הכל 100 מסגרות שכפול ניתח (המקביל 10 s, בעת שימוש בהגדרות המתואר. | ||
| ניסוי | מספר משכפל לכל תנאי. | ||
| תנאי | ציון השם של המצב ניסיוני (לפי השם על-ידי המשתמש של התיקיה המכילה את הנתונים). | ||
בטבלה 2: תיאור של המשתנים שהושג לאחר עיבוד הנתונים עם script. "האי Assay ניתוח" שאר הפרמטרים המתוארים בטבלה זו מופיעים בקובץ ה-"data_all_conditions.csv" בעת עיבוד הנתונים עם התסריט "האי Assay ניתוח".
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את המאקרו"דרוזופילה האי Assay" הבודק באופן כמותי התנהגות מוטורית דרוזופילה במהלך וזמינותו האי. המאקרו במדויק ספירת הזבובים על פלטפורמת לאורך זמן, ביצוע וזמינותו האי רגיש מאוד ומתאים הערכה כמותית תפוקה גבוהה של פגמים גינקולוגיות. המתודולוגיה מאפשר השוואת תנאי כלשהו, עם זבובים גדל תחת מצבים גנטיים או סביבתיים שונים, כולל חשיפה לסמים. המחוון הזה ולכן שימושי במיוחד ככלי גילוי בעת ביצוע מסכי גנטית או תרופות גדולים, כשלמדתי דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות, או כאשר בדיקת גפיים או טיסה התנהגות.
פרוטוקול assay האי שהוצגו בכתב יד זה מספק יתרונות על פני שיטות קיימות/חלופית. לדוגמה, גפיים מעקב וידאו הוא ועתירת פחות מתאים לבדיקה מדגמים גדולים הרבה יותר. וזמינותו האי הוא כלי סינון תפוקה גבוהה, במובן זה, דומה לדקל ה assay מהירה geotaxis שלילי אינטראקטיבי (טבעת)16. ההבדל בין השניים הוא מבחני האי מאפשר איתור של מגוון רחב יותר של בעיות גינקולוגיות; חוסר היכולת של זבובים לעזוב את הפלטפורמה יכולה להיגרם על ידי ליקויים-טיסה, קפיצות, או הליכה להתנהגות הנגרמת על ידי אגף (שריר/עצביים) ו/או הרגל (שריר/עצביים) פגמים. מצד שני, וזמינותו טבעת מעריך פגמים בהתנהגות טיפוס/הליכה הנגרמת על ידי פגמים הרגל (שריר/עצביים). למקרה המשתמשים מעוניינות המפרט התנהגותית מרובים, ניתן לשלב וזמינותו האי בקלות גם עם מבחני אחרים, כגון הטבעת וזמינותו. בנוסף, לייזרים הדרושים עבור optogenetics יכול בקלות להיות מותקן בתיבת האי assay, הסידור הזה כל כך פשוט כי ניתן בקלות להזיז לחדר שבו לטמפרטורה ואור יכול להיות נשלט.
כדי להבטיח את ההצלחה ואת הפארמצבטית של האי וזמינותו המתוארים כאן, צריכה להיות מלווה מספר המלצות. Aliquot והעברת שבקבוקי הזבובים במבחן ניסויי לפחות יום אחד לפני הניסוי כדי למנוע את השפעת ההרדמה CO2 או קור. לא overcrowd את הבקבוקונים ניסיוני (השתמש זבובים 10-15 לכל מבחנה; מומלץ תמיד יש להציב מספר זהה של זבובים לכל מבחנה). שמור את הזבובים על מזון טרי בכל עת. אם לא מוכר כבר עם ביצוע וזמינותו, תרגול זריקת זבובים על הפלטפורמה כדי למקסם את התשואה. גם להתאמן במהירות בכדי לבטל את היד מיד לאחר מכן, כפי זה מפריע ניתוח הנתונים (ניתוח תמונות וטיסה ספירת התחלה רק לאחר היד היא מחוץ לתמונה). לשמור על התנאים הסביבתיים וניסויים זהים בניסויים צריך להשוות (למשל, פקדים נגד מוטציות או של גנוטיפ נבדק בגילאים שונים). תמיד לבצע את הניסויים באותו זמן של היום ולתחזק את הבקבוקונים תחת טמפרטורה מבוקרת, בתנאי לחות. עבור עוצמה סטטיסטית, מבחן משכפל טכנית לפחות שלושה לכל שכפול ביולוגי.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של המאקרו המתוארות כאן, מצלמת אינטרנט הגדרות התמונה שתישמר להשגת חדות מירבית: טס להופיע כאובייקטים שחור על משטח לבן. כאשר המספר של זבובים לא נספרת כראוי על-ידי המאקרו, לכוונן את הגדרות החדות, לבדוק אם רועי נבחר כראוי, להבטיח הגודל של הזבובים על הפלטפורמה מעל המינימום שצוין לטוס גודל הגדרת (ראה שלב 8.3 של פרוטוקול זה). ההגדרות רק צריכה להיות מוגדרת פעם אחת. הם חלים על כל הניסויים, כל עוד המרחק בין מצלמת האינטרנט פלטפורמת אינו משתנה. Circularity_min ואת הגדרות מקסימום להגדיר את מעגליות של החלקיקים (חלקיקים = שנספרו זבובים) זה יילקח בחשבון לניתוח (זבובים = שנספרו אובייקטים). 1 מייצג מעגל מושלם ו- 0 מייצג קו17. מאז הזבובים תמיד נוכח מידה מסוימת של מעגליות (זבוב לא יכול להופיע בתור קו ישר), הגדרת "Circularity_max" נקבע על 1, ההגדרה "Circularity_min" מוגדר ב- 0.4. לא סביר כי המשתמש צריך לכוונן הגדרות אלה.
המאקרו מדי פעם עושה טעויות הספירה כאשר זבוב ממוקם בסמוך לגבול של הפלטפורמה. הדבר יכול להתרחש אם הזבובים לא יכולים לעוף אבל הליכה בין רועי על-ידי המשתמש. ברוב המקרים, וטבלה רועי (התאמת זה ככל האפשר פלטפורמת) ניתן בקלות לפתור בעיה זו. אולם, התסריט "האי Assay ניתוח" הוא מסוגל לזהות, הנתונים הנכונים פסולים ספירות הנגרמת על ידי זבובים הליכה ויוצאים רועי בצורה טובה יחסית. למרות הרזולוציה של מצלמת האינטרנט המוצג כאן הוא גבוה מספיק כדי להפלות זבובים בסמיכות יחסית טוב, יישמנו אלגוריתמים נוספים במסגרת ההליך עיבוד התמונה המאקרו"דרוזופילה האי Assay", כגון קו פרשת המים, לשחוק את הפונקציה17. אלה מאפשרים את התיחום נאותה של הזבובים הנמצאים בסמיכות על הרציף. בנוסף, המאקרו אינו מסוגל להבחין בין זבובים קפץ מן הרציף או עף מחוץ לה. למרות זאת, הוא בדרך כלל ציין כי בריא צעיר זנים לעוף לעוף משם מיד כאשר נפל על הפלטפורמה, ואילו זבובים בוגרים וזבובים עם גירעונות גינקולוגיות להישאר זמן רב יותר על הרציף, בסופו של דבר לקפוץ או ליפול הפלטפורמה. למרות מגבלות אלו, וזמינותו של ניתוח לספק מידה מאוד מדויק של התנהגות גינקולוגיות.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של ה-script "האי Assay ניתוח", למשתמש יש לוודא כדי להזין את הנתיבים הנכון עבור קבצי קלט ופלט השורות התסריט המצוין הפרוטוקול וכדי לספק את הנתונים בתבנית של התיקיה הנכונה (כפי שמצוין איור 2). אם המשתמש ימצא את הקריטריונים המשמשים כדי לסנן נתוני הניסוי לא אמין גם מחמירים (שורה 68: הערך הראשון בעמודה "סמוך" הוא קטן או שווה ל- 5; שורה 71: הערך הראשון בעמודה "ספירה" הוא גבוה יותר מאשר המספר הכולל של זבובים הושלכו על משחקי פלטפורמה. rm +3), בטל את הגדרות סינון אלה על-ידי הוספה של # לפני הטקסט בשורות 68, 71 בקובץ ה-script "האי Assay ניתוח". במקרה זה, datasets כל ייכללו בניתוח. לחלופין, ניתן לשנות הגדרות המסנן על-ידי התאמת הערכים של שורות 68, 71 על פי צרכי המשתמש. החפצים האפשריים ב ספירת הערכים "results.txt" שנוצר על-ידי המאקרו"דרוזופילה האי Assay" ניתן גם להתאימם באופן ידני, ניתן להפעיל מחדש התסריט על נתונים מנוכי עונתיות. כאשר המשתמש מעוניין עיבוד יותר מ 10 fps, או יותר מ 10 s של נתונים, צריך מספר המסגרות שעובדו על-ידי קובץ ה-script "האי Assay ניתוח"ניתן להתאים. ניתוח סטטיסטי גם יכול להיות מוחלף על ידי חלופות המוגדרות על-ידי המשתמש.
תיקיה בשם "דוגמאות האי Assay," המכיל דוגמאות עם זמן תמונות-תוך שימוש assay את האי, הסדרה ניתן למצוא באתר הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. הורד את התיקיה "דוגמאות האי Assay" ובצע את השלבים המתוארים פרוטוקול זה כדי במהירות להפוך היכרות עם המבנה של קובץ אחסון, העיבוד של התמונות עם המאקרו "assay דרוזופילה האי", "האי Assay הניתוח" . התסריט.
האי וזמינותו, בשילוב עם מאקרו מפותחת, ניתוח תסריט, ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את אופן הפעולה של תנועה חריגה של מודל דרוזופילה של תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה. מאז וזמינותו ניתן להחיל ביעילות על הגילאים השונים, זה גם מתאים לניתוח אופי פרוגרסיבי פוטנציאל פנוטיפים.
לסיכום, וזמינותו האי, בשילוב עם המאקרו"דרוזופילה האי Assay" התסריט "האי Assay ניתוח", הוא assay חסכוני, אמין ויעיל מאוד לנתח באופן אובייקטיבי לכמת גינקולוגיות פגמים של דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה באופן תפוקה גבוהה.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנו להכיר מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ומרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (NIH P40OD018537) למתן זנים דרוזופילה . אנחנו אסירי תודה למעבדה Klämbt פיבי וזמינותו האי, מרטין Eidhof לבניית הגדרת assay האי מחקר זה היה חלק בתמיכת את E-נדיר-3 משותפת חוצה גבולות להתקשר הענק "הכנת טיפולים ataxias הקרים autosomal" הכן (בתחרות 9003037604), על ידי מענק העליון (912-12-109) מארגון הולנד על מחקר מדעי (בתחרות), ועל -ידי שתי מלגות לתואר שלישי מרכז רפואי של DCN/Radboud האוניברסיטה. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
