Summary
島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。
Abstract
次世代シーケンシング技術の進歩は、運動障害の増加速度で他の神経学的な病気 (候補者) 疾患遺伝子の同定に貢献します。しかし、少しはこれらの疾患の根底にある分子メカニズムについて知られています。キイロショウジョウバエの遺伝、分子のおよび行動のツールボックスは、このモデル生物を高スループット方法で新しい病気の遺伝子のメカニズムを特徴付けるに特に便利になります。それにもかかわらず、高スループットの画面を理想的には、これらの疾患に関連する形質の自動化の定量化を可能にする、コスト効率の高い効率的かつ信頼性の高いアッセイが必要です。島の試金は費用対効果と簡単にセットアップ方法ショウジョウバエの歩行動作を評価します。このアッセイでハエはプラットフォーム上に固定の高さからスローされます。これは、プラットフォームから秒以内に脱出する飛ぶことができる生得的な運動反応を誘導します。現在、撮影島アッセイの定量分析は、手動で行うが、大画面を実行する場合は特に骨の折れる作業であります。
この原稿では、高スループット、自動データ処理島アッセイ データの定量化に「ショウジョウバエ島アッセイ」と「島の試金分析」のアルゴリズムについて説明します。セットアップでノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラは試金の実行はプラットフォームのイメージのシリーズを収集します。フィジーのオープン ソース ソフトウェアの開発「ショウジョウバエ島アッセイ」アルゴリズムは、これらイメージ シリーズを処理し、、実験条件ごと時間の経過と共にプラットフォーム ハエ数を定量化。自動的に得られたデータを処理し、治療および遺伝子型が統計的に有意に異なるかどうかを計算します、「島の試金分析」スクリプト、フリー ソフトウェア R と互換性が開発されました。これは大幅島アッセイの効率を向上させ、基本的な歩行や飛行行動の強力な読み出しになります。それはこうして調査飛ぶ運動能力運動障害と薬効のショウジョウバエモデルの大型スクリーンに適用できます。
Introduction
脳 (例えば、小脳性運動失調とパーキンソン病)、末梢神経の変性疾患が根底にある遺伝子の同定に、近年、次世代シーケンシング技術の進歩が大きく貢献してください。(例えば、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺) の起源と筋の起源 (例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー)1,2,3,4.それにもかかわらず、これらの疾患のほとんどの根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られています。治療法の開発には、これらのメカニズムの理解が欠かせません。
人間のようにフライトやショウジョウバエ、歩行などのモデル生物の動きは、中央脳、末梢神経系と筋肉によって制御されます。さらに、高速生成時間とショウジョウバエの遺伝のツールボックスを作るこのモデル生物遺伝子の高スループット スクリーニングに適して関与運動障害、薬物検査の5,6.このような画面は、信頼性が高く、コスト効率の高いと相対的なシンプルなアッセイとして自動化された方法で出力結果を定量化するためのツールでテストする必要がある条件のかなりの数のため、非常に望ましい。
シュミットら(2012 年)7 「島の試金」と呼ばれる低コスト テストを説明したショウジョウバエの歩行動作を評価します。島アッセイがグリア細胞に固有の機能と7、ショウジョウバエモデル知的障害8との一般的な評価のための評価の遺伝子を識別するために正常に大規模な上映で使用されてモーター動作9を飛ぶ。島の試金の原則の設計は、いくつかのハエのスローを高架のプラットフォームで構成されます。これは健全なハエのプラットフォームから秒以内に脱出することができる生得的な運動行動を誘導します。アッセイは、時間7,8,9以上のプラットフォームで残りのハエの数を測定します。これらすべての機能は、島アッセイが運動障害に関与する遺伝子の強力なスクリーニング ツールであることを示します。
現在、撮影島アッセイ データの量的分析は7、8,9を手動で行われます。アッセイの効率を向上させる、半自動的にプラットフォームからハエのエスケープを定量化する低コストの方法を開発しました。セットアップ上のプラットフォームでのハエの数を定量化する一連のフレームを持つ、プラットフォームの取得ごとに 0.1 s. フレームは「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで処理して画像時間を収集するためにノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラを使用してください。時間。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロは 3 つの独立したサブ マクロに分かれています: (I)「作成スタックと投影」サブのマクロは別々 のサブフォルダーに格納されている別の島実験を識別し、スタックとそれぞれの投影を作成しますタイム シリーズ。(II)「定義プラットフォーム」サブ マクロが連続して利益 (率 ROI) の領域として島式ホームを手動で定義するその時点でユーザーが要求される個々 実験サブフォルダーにあるすべての"Projection_image_name.tif"ファイルを開きます。(III)「分析」は、自動的にプラットフォームで残りの時間シリーズ間ハエ数を定量化します。連続 (実行) でサブのマクロを実行できるまたは独立。統計的データ解析のための治療および遺伝子型動作お互い (図 1) と大幅に異なるかどうかを決定する統計テストを適用して自動的に得られたデータを処理するスクリプトが開発されました。最後に、(AT) 失調症毛細血管拡張症ショウジョウバエモデルの異常な運動能力を定量化して評価このセットアップが使えることを示した。
Protocol
1。 島アッセイ ボックスの建設
- 水 (すなわち 風呂) の層を含むポリメタクリル酸メチル (PMMA) などの堅牢な素材で作られたトレイの準備。材料は白ではないことを確認します
。 注: 2.5 cm 3 x 35 x 40 の寸法は、( 図 1 a) をお勧めします 。
- は、ハエの研究室スペースに脱出を防ぐためにお風呂の周りに PMMA など、堅牢な透明な素材で作られたボックス (42 x 38 x 25 cm 3) を準備します。簡単にハエとバイアルを処理し ( 図 1 a) 島ドロップ実験者に対して十分な大きさである、側面の穴 (20 x 30 cm 2) を配置します 。
- 準備は水を通さない不透水性材料 (アクリルやプラスチック) 製の次元で高架のプラットフォーム 10 × 15 × 2.5 cm 3.
注: このプラットフォームは、画像解析の良好なコントラストを確保するため均一な白い面を持っている必要です。サイズは必ずしも固定されていない、しかし、それはすべてのハエは最初プラットフォーム上で土地し、( 図 1 a) それの上を歩くチャンスを得るかどうかを確認するのに十分な大きさにする必要があります 。
- お風呂に接着することでまたは実験・撮影セッション中にプラットフォームの位置変更を防ぐために [プラットフォーム] ボックスの中の重みまたは他の重いオブジェクトを配置することによって、プラットフォームを修正します 。
2。ソフトウェアの要件とインストール
- 画像記録ソフトウェアのインストール。
- 島イメージのシリーズが (表 を参照) を記録し、コンピューターにソフトウェアをインストールするダウンロード画像記録ソフトウェア
。 注: このプロトコルで記述されているイメージング記録ソフトウェアは、Windows でサポートされるだけ。他のユーザーのための代替 材料表 に追加されました 。
- 島イメージのシリーズが (表 を参照) を記録し、コンピューターにソフトウェアをインストールするダウンロード画像記録ソフトウェア
- " ショウジョウバエ 島アッセイ " マクロ インストール。
- ダウンロード、" ショウジョウバエ 島アッセイ " マクロと互換性のあるフィジー 10 バージョン (1.4 またはそれ以降) 次のウェブサイトから: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1 です 。
- にカーソルを移動、" 島の試金 " をクリックしてディレクトリ " ビュー "
- をクリックして " ダウンロードすべて " フォルダーの内容を .zip ファイルとしてダウンロードされますダウンロードしたファイルを解凍します。 。
- コピー、" ショウジョウバエ 島 Assay.ijm " ファイル " Fiji.app/plugins/directory. "
注: 起動時にフィジー、" ショウジョウバエ 島アッセイ " マクロはプラグイン ドロップ ダウン メニューの下部に表示されます 。
- " 島の試金分析 " インストールのスクリプトを作成し、ダウンロードします。
- 以下からダウンロード R 11 ウェブサイト: https://cran.rstudio.com。コンピューターにインストールします 。 次の web サイトから
- をダウンロード R スタジオ: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/。コンピューターにインストールします
。 注: " 島テスト分析 " スクリプトを R でのみ実行できます。R スタジオ、その簡単にユーザー インターフェイスは r. を経験の浅いユーザーのための代替手順として提示 - ダウンロード、" 島の試金分析 " からスクリプト、" ショウジョウバエ 島アッセイ " 次の web サイトでディレクトリ: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1 です
。 注: 手順 2.2 を実行後、" 島の試金分析 " スクリプトと呼ばれる解凍したフォルダーで見つけることができます " 島アッセイ。 "
3。島の試金のテストするハエの準備
- 収集は、上記 13 (の期間として各風邪や二酸化炭素 (CO 2) 麻酔の実験条件のハエを上演1 - 2 日).
1 つの実験条件
- 準備 3 の最小サンプル バイアル、それぞれ約 15 上演を含む飛ぶ。のみを使用してそのままの翼と同じような年齢、性別のあるハエします
。 注: ここで説明した実験 5 サンプル バイアル遺伝子 w -; 含む 15 男性のハエアクチン Gal4/+ (コントロール) と w -;アクチン-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) は 4 日間熟成羽化の日に収集された、島の分析を実行する使用されました。RNAi、コントロール系統とアクチン gal4 ドライバーはコマーシャルから得られた (表 を参照) をソースします 。
- 準備 3 の最小サンプル バイアル、それぞれ約 15 上演を含む飛ぶ。のみを使用してそのままの翼と同じような年齢、性別のあるハエします
- ハエが麻酔からの影響を避けるために回復 (少なくとも 1 日 CO 2 を使用する場合) 興味の年齢で島のアッセイで採集されたハエをテストする前にします
4 実験のセットアップ
注: 図 1 b を参照してください。
。- 洗面台に石鹸の少量の冷たい水を追加し、プラットフォームの中間の位置します
。 注: 石鹸水の表面張力を低下します。水に触れるハエが紛らすされます。これにより、実験的セッションの進行中にボックスで飛び回る蠅の量が増加します 。
- トレイの上に透明のボックスを配置し、上記のランプを使用してプラットフォームを照らすです
。 注: プラットフォームの照明は主に適切なビデオのコントラストを確保するため必要です。これに普通の 12 V LED ライトが適しています 。
- (外箱) プラットフォーム上に直接カメラを置き、それをコンピューターに接続します 。
- 実験前に異なる実験的データを格納するコンピューターに新しいフォルダーを作成します。
- フォロー例の構造は、フォルダーを作成する 図 2 a に示します。たとえば、実験的なデザインは、5 つの複製を持つ 2 つの遺伝子型のテストを必要とする場合まず実験の日付を含む主なフォルダーを作成します。メインのフォルダー内 (遺伝子型 1) 2 つのサブフォルダーを作成します。遺伝子型フォルダー内に複製ごとに 1 つ、5 つの新しいサブフォルダーを作成します
。 注意: 詳細な分析が重要です個々 の実験に対応するイメージ シリーズは一意の名前を持つフォルダーに保存されます 。
- フォロー例の構造は、フォルダーを作成する 図 2 a に示します。たとえば、実験的なデザインは、5 つの複製を持つ 2 つの遺伝子型のテストを必要とする場合まず実験の日付を含む主なフォルダーを作成します。メインのフォルダー内 (遺伝子型 1) 2 つのサブフォルダーを作成します。遺伝子型フォルダー内に複製ごとに 1 つ、5 つの新しいサブフォルダーを作成します
5。ビデオ設定セットアップ、" キャプチャ デバイス " インターフェイスのセクション
- 画像記録ソフトウェアを開くと、下、" キャプチャ "] タブでをクリックして、" 低速度撮影画像 … " として適切な web カメラを選択し、"キャプチャ デバイス "
- 島で死んだハエを配置; クリックしてビデオ設定を調整、" ビデオ設定 " ボックス。明るさ、コントラスト、ツール バーをスクロールし、死んだハエが表示されます ( 図 2 b)、白地に黒などの方法で色します。調整が完了したらをクリックして " ok] "
6。録音およびビデオで設定セットアップの保存、" コマ " インターフェイスのセクション
< ol>注: ビデオ ファイルはデータの定量化のため使用されません; しかし、それは全体的なアイデアを得るために便利かもしれない。実験について
- 圧縮ボックスで選択 " Intel IYUV コード " ビデオ圧縮の選択と " 0.1 秒ごとに 1 つのフレームを取る " で、" 再生速度 (1 秒あたりの画像): " 10 で 。
- をクリックして .bmp フレームとして実験時間シリーズを保存 " 詳細 … " 選択 " 各キャプチャ フレーム .bmp イメージを作成 " をクリックして " 参照。 " で同じディレクトリを選択、" 中に AVI ムービー キャプチャ " ウィンドウとして。6.1 のステップで選択)、クリック " オープン、" キーを押します " Ok。 "
注: 実験中にフレームを (データの分析に必要) の .bmp ファイルとして保存。プログラム名としてフレーム " A " フレーム キャプチャ シーケンスに対応する番号順 (例えば、 " A_number.bmp ") ( 図 2)。以前に記録した画像は上書きされないことを確保するための新しいフォルダーにさまざまな実験に属する画像を常に保存します。注意してください、画像自動保存されないビデオ ファイルと同じフォルダーにこのフォルダーを選択しない限り、" 参照 … " をクリックすると、" 高度な " ボックス 。
7。島の分析とデータ収集
- 録音を開始する画像記録ソフトウェアのタイムラプス映像インタ フェースの開始ボタンを押します 。
- タップ ハエ (ステップ 3) を含む実験バイアル 2-3 回ハエをバイアルの底で確実にします。すぐにバイアルのプラグを削除し、すべてのハエが同時に ( 図 1) プラットフォームの上に落ちるように精力的に動きとプラットフォームでバイアルをタップします 。
- 約 30 後 s、プレス、" 停止 "] ボタンをクリックすると、録音を停止します
。 注: する場合すべてのハエは、プラットフォームから消える、録音停止できます以前 。
- 30 は、ハエを削除画像記録を停止した後の手でプラットフォームの s.
- 次の実験を記録する前に、.bmp ファイルや映画 (セクション 6 を参照) のターゲット ディレクトリに変更します 。
8。データ処理: を実行して、" ショウジョウバエ 島アッセイ " マクロ
注: 図 1 を参照してください
。- 実行、" スタックと投影を作成 " サブ マクロ私スタックと収集した画像シリーズの予測を生成する。
- スタート フィジー、つけ " プラグイン " ツールバーと選んだ " ショウジョウバエ 島アッセイ " ドロップ ダウン メニューに新しいウィンドウが表示されます 。
- 入力、" 最初時系列識別子のイメージ " マクロのグラフィカルなインターフェイスで設定します
。 注: 記録された画像フレームとして保存されます " A number.bmp " 画像が得られる順序に従って。" 最初のフレーム識別子 " マクロ インターフェイス、設定プログラムで最初のフレームに指定された番号とファイルの拡張子を入力します。記入 " 最初のフレーム識別子 " と "-0001.bmp、" 以来、最初のフレームと呼ばれる " A 0001.bmp " ( 図 2)。に備えて (.tiff または .jpeg) などの他の画像形式は、ウェブカメラのソフトウェアによって生成される、指定の最初のイメージの正しいファイル拡張子 " 最初画像時系列識別子 " - のみを選択、" スタックと投影を作成 "。サブのマクロをクリックして " Ok、" 各島アッセイ実験とすべてのサブフォルダーが含まれているメインのディレクトリを選択します
。 注: 個々 の .bmp ファイル実験が含まれているフォルダー、" 最初のフレーム識別子 " 処理後。既定の名前のファイルは各実験の各サブフォルダーの表示されます 2 つの新しい " Stack_image_name.tif "、" Projection_image_name.tif " ( 図 1)。この手順を実行するは、.bmp ファイルを削除できます。さらなる分析のための十分なスタックと投影の .tif ファイルのすべてのデータが含まれています 。
- 実行、" を定義するプラットフォーム " サブ マクロ II プラットフォームの正確な場所を選択します。
- のグラフィカルなインターフェイスを開き、" ショウジョウバエ 島アッセイ、" のみ」を選択、" 定義プラットフォーム " チェック ボックス、押し " Ok "
- で、" ディレクトリを選択 " ウィンドウ、メイン ディレクトリを選択どこ。実験的サブフォルダーが格納され、キーを押します " 選択します。 "
注:、" プラットフォームの定義 " サブ マクロを自動的に検索 " Projection_image_name.tif " メイン ディレクトリに格納されているすべてのサブフォルダー内のファイル。" Projection_image_name.tif " 一緒に 2 つのウィンドウ、最初のフォルダーに格納されている画像 — " プラットフォームを定義する " と " ROI マネージャー " — が開きます 。
- を選択、" のポリゴン選択 " 島のプラットフォームに一致する選択範囲を描画ツールバーのツール
。 注: プラットフォームの境界線を選択範囲から除外する非常に重要です。 図 2 D を参照してください 。
- をクリックしてプラットフォームを選択すると最初の画像で後、" 追加 " で、" ROI マネージャー " ウィンドウ; 値 ( 図 2 D) のセットとして ROI マネージャー] ウィンドウに表示されます選択した領域は。プレス " [ok] を " の " プラットフォームを定義する " ウィンドウ。マクロは、次の投影に進みます 。
- に格納されている番号 ( 図 2 D) をクリックして、" ROI マネージャー " ウィンドウ; 現在のイメージの投影に自動的に表示前の選択遺言
。 注: 島以来プラットフォームは (としてウェブカメラと島の位置は変更されません)、行で実験を実行すると同じサイズと同じ位置を持っている可能性が、それはのプラットフォームを定義する投資収益率を保存すると便利、" ROI マネージャー " で。そうことで、ユーザーは時間を保存します。今後の予測では、ROI マネージャーで一時的に保存の選択をクリックする必要があるだけです 。
- 島の位置が若干比較前の実験に移動された場合、選択の中心で左クリックし、選択した領域を必要な位置にドラッグすることで選択範囲の位置を調整します 。
- ではプラットフォームの選択範囲が一致しない場合選択範囲外をクリックし、プラットフォームを使用しての新しい選択を描く、" ポリゴン選択 " ツール。クリックして ROI マネージャーで新しい選択を保存 " 追加 " に新しい選択範囲が表示されます、" ROI マネージャー " 継続的に使用することができますウィンドウ 。 選択範囲を調整すると、
- をクリックして " Ok " で、" プラットフォームを定義 " ウィンドウとすべてのプラットフォームが定義されるまで手順を繰り返します
。 メモ: 黒の背景に白の線引きの ROI 領域に対応するプラットフォームのバイナリ イメージという注意 " Platform_image_name.tif、" スタック投影と同じ実験サブフォルダー内の各加工画像の登場8.1.3 ( 図 1) のステップで生成されるイメージ 。
- フライの最小サイズを定義します
。 注: この設定は、ピクセル単位で最小限のフライのサイズを定義します。指定した最小サイズより小さい粒子は、ノイズによる誤検出を避けるために分析から除外されます。- によって作成された画像のスタックを開く、" スタックと投影を作成 " サブ マクロ i.
- 変換する画像のスタック 8 ビット画像をクリックして > > 型 > > 8 ビットします 。 画像を押してメニューに
- 行く > > 調整 > > しきい値、ことを確認、" 暗い背景 " ボックスが選択されているしを押します " 適用; " 2 番目のウィンドウと呼ばれる " しきい値 " が表示されます。クリックして " 暗い backgroウント " 押し " Ok。 "
注: ハエが黒と白のプラットフォームで定義されているバイナリ画像のスタックが作成されます。これは場合ではない、適用、" 反転 " 編集機能 > > 反転 > > 実行します 。
- は、分析をクリックしてピクセル数を検出する尺度を設定 > > スケールを設定します。次の設定を適用: ピクセル単位の距離 = 1、距離を知られている 1、ピクセル縦横比を = = 1、および長さの単位 = ピクセル。プレス " Ok。 "
- を選択、" の杖 " (トレース) ツール プラットフォームで現在フライ (ブラック ドット) をクリックしてツールバーの。プレス ctrl + m (Windows の場合) またはコマンド + m (Mac の場合)。新しい " 結果 " ウィンドウはピクセル単位で、選択した場所の地域を示します。連続してこれを行うにいくつかのハエと最小のフライのサイズを決定します
。 注: マクロを実行すると、設定、" 最小飛ぶサイズ " 率 10% マイナスで観測フライのサイズが最小に設定します。( 図 2 e).
- 実行、" 解析 " を定量化するサブ マクロ III 飛ぶプラットフォームからの脱出です。
- ツールバー、選択に行く " プラグイン、" と選んだ、" ショウジョウバエ 島アッセイ "
- 調整、" 最小飛ぶサイズ " 8.3 のステップで定義されている値に従って設定。
。 注: 場合にのみ手順 8.3 で定義された値を使用しての標準設定 " 最小飛ぶサイズ " プラットフォーム上に存在する、マクロがハエとしてバック グラウンド信号を検出かどうかでもハエの除外が発生します 。
- で、" バイアルあたりハエの数 " 完全な実験中にバイアルにハエの最大数を入力を設定する。たとえば、1 つの実験はバイアル 15 ハエ 20 ハエを含む他、23 のハエを含む他の人を含む、" バイアルあたりハエの数 " 23 として示す必要があります 。
- 選択、" 分析 " チェック ボックスを押し " Ok; " 新しい " ディレクトリを選択 " ウィンドウが表示されます。メイン ディレクトリ (とすべてのサブフォルダー内のファイル) を選択してを押します " 選択します "
注: マクロが含まれている限り、サブフォルダーに格納されているすべての画像を分析し、" stack_image_name、" " Projection_image_name、" と。" Platform_image_name " ファイル。マクロはイメージの後に画像を処理します。マクロの出力はという結果はバイナリ画像のスタックで構成されています “ result_stack_subfolder_name.tif ”、結果のテキスト ファイルと呼ばれる " result_subfolder_name.txt、" 各データ フォルダーで生成されたテキスト ファイル (.txt) に表示されるが含まれていますイメージに対応する定量的測定は、スタックし、9 列で構成されます。これらの列の内容は、表 1 のとおりです。" Result_stack_subfolder_name.tif "、ハエの実験中に検出された ( 図 1E) 白い背景に黒い点として表されます 1 つの実験の画像時系列に対応します 。
- 慎重にアーティファクトが発生していないことと、マクロが正確に機能したように結果履歴の調査 ( 図 2 f).
注: アイテムの例としては、イメージ要素がないハエしますが、よう画像分割アルゴリズム (偽陽性) によって検出されたをすることができます。これ、たとえばは、背景信号の検出による ROI の不正確な選択のため 。
9。データ分析を使用して " 島試金分析 "
- 構造データで分析できるように 図 2 a に示すように、" 島の試金分析 " スクリプト。各サブフォルダーが分析対象とする 1 つの実験条件に対応するサブフォルダーのメイン ディレクトリを生成します 。
- サブフォルダーに、独立した実験的複製し ( 図 2 a) とプロデュース results.txt ファイルを含むフォルダーを生成、" ショウジョウバエ 島アッセイ " マクロ
。 注: " 島の試金分析 " マクロは一度にメインのディレクトリにあるすべての実験条件が処理されます 。
- 開始 R または R スタジオ。ファイルをクリックして > > ファイルを開く … でツールバーを選択し、" 島の試金分析 " スクリプト
- インストール ggplot2 と matrixStats パッケージを実行しているとき、" 島の試金分析 " 初めてのスクリプト。コンソール ウィンドウに、次を入力:
> install.packages("ggplot2")、入力
> install.packages("matrixStats") を入力します 。
- インストール ggplot2 と matrixStats パッケージを実行しているとき、" 島の試金分析 " 初めてのスクリプト。コンソール ウィンドウに、次を入力:
- 指定スクリプトでファイルのデータと分析の出力の場所。次のスクリプト行を挿入:
- 行 16: 分析し比較実験が含まれているメインのディレクトリへのパスを挿入 ( 図 2 a、これは演出のパス、" 島の試金 "フォルダー).
- 行 19: 解析出力ファイルが保存されるフォルダーへのパスを挿入します
。 注: 行 16 の指定されたディレクトリにのみ分析対象とするフォルダーを含めることができます。スクリプトも正しく行われません行 16 と 19 の行に挿入されたパスが同じ場合 。
- コード] をクリックしてスクリプトを実行 > > 実行地域 > > ツールバーからすべて実行します
。 注: 3 つ生成される .csv ファイルと 1 つの結果の .txt ファイル ( 図 1E) 19 の行で定義されているディレクトリに表示されます注意してください。これらは、: (I)、" data_all_conditions.csv " ファイルには、各実験条件および実験的複製は、表 2 に示すように整理に対応する処理済みのデータが含まれています。(II) " 統計 summary.csv " ファイルは各実験条件のためのプラットフォームにおけるハエの % の平均 (SEM) の標準誤差、標準偏差 (SD)、平均をまとめたもの。(III) の " AUC.csv " ファイルには、各実験複製のための曲線の下の領域が含まれています。(IV)、メインのフォルダーに条件が存在の数に応じて、スクリプトがいずれかの輸出、" Welch_t test_results.txt " ファイル (2 条件) または " AUC_anova_results.txt " ファイルの場所 (以上 2 条件)、t 検定の結果または分散分析実験条件間曲線下面積を比較することが示されます。.Tiff イメージ ファイル ( 図 1E) の 4 種類が 19 の行で定義されているパスに表示されることがわかります。呼ばれます: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (Name_Of_Data_Folder 表しますユーザーによって与えられたフォルダー名) " AUC.tiff、" " Escape_response_all_conditions.tiff、" と " AUC_anova.tiff. " 詳細情報これらのグラフの内容について見つけることができますこの原稿の代表の結果と 図 3.
Representative Results
説明プロトコル、ショウジョウバエ島アッセイ データが取得され、3 つの手順で処理されます。まず、ショウジョウバエ島式ホーム上にスロー フライト脱出応答がウェブカメラを記録、個々 の .bmp 画像 (プロトコル セクション 1-7) として格納されます。第二に、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ (手順 8) 処理"result.txt"テキスト ファイル(表 1)、要約する各フレームで検出されたオブジェクトの数を生成するフレームと画像のスタックを表わす「Result_stack.tiff」各フレームで、プラットフォームの領域内で検知されたオブジェクト。第三に、「島の試金分析」スクリプト (プロトコル セクション 9) は、個々 の実験「results.txt」ファイルに格納されているマクロ データを処理します。いくつかの手順は、フィルター処理および統計分析のためのデータを結合するスクリプトに組み込まれています。プラットフォームにハエがスローされます最初のフレームは、検出され、時間ポイント 1 として考慮されます。以前のフレームは、データセットから削除されます。次の時間 100 フレーム ポイント 1 (10 に対応する s) 分析対象として選択されます。ハエはプラットフォームの検出数の初期値 5 より小さい実験自動的に、パワー不足の実験から信頼性の低い結果を排除すること、分析から除外されます。プラットフォーム上に検出されたハエ数の初期値が「バイアルあたりハエの数」設定プラス 3 の許容範囲を超えている実験も除外されます。これは、ノイズの粒子はハエとして誤って検出されたデータセットを排除します。スクリプトは、ハエ ハエ シリーズの検出の最高数と比較して各時間ポイント検出の割合を計算します。投資収益率 (時間上プラットフォーム上にハエの割合の増加に続いて減少として検出される) ウォーキング ハエによるデータセット内のエラーが自動的に訂正によってそれらに関する以前の段階でプラットフォームに一貫して存在として.特定の実験条件のメイン ディレクトリに存在していたすべてのレプリケート データセットを結合して"data_all_conditions.csv"ファイルにエクスポートします。その列は、表 2に示す変数を表します。スクリプトは、データを含むフォルダー名に従って名前、各実験条件の線グラフもエクスポートされます。このグラフは、ハエを用いた実験 (飛行エスケープ応答) を時間をかけて残りのプラットフォーム上の % 複製(図 3 aのそれぞれのフォルダーに存在を示していますB)。平均、SD、実験条件ごとに SEM で計算され「統計 summary.csv"ファイルにまとめます。線グラフを"Escape_response_all_conditions.tiff"と呼ばれる応答を示しています平均飛行脱出まで 12 の実験的(図 3)のメインのフォルダーに存在する条件。最後に、メインのフォルダーにあるすべての実験条件の曲線下面積は計算され"AUC.csv"ファイルにまとめます。メイン フォルダーに存在の条件の数によってはスクリプトを披露するか 2 尾対ウェルチ t 検定 (2 条件) またはテューキー補正 ANOVA 多重検定 (以上 2 条件) を決定するかどうか実験条件は、お互いから大幅に異なります。これらの結果は"Welch_t-test_results.txt"または"AUC_anova_results.txt"にまとめて分散を実行すると、スクリプトはまた平均 AUC の差との比較実験の条件の 95% 信頼区間を表示する"AUC_anova.tiff"ファイルをエクスポートします。すべての実験条件の実験的複製の曲線の下の絶対領域の値は、"AUC.tiff"(図 3 D) の中央値で個々 のデータ ポイントとして表示されます。
失調症毛細血管拡張症 (AT) は、14失調症毛細血管拡張症変異 (ATM) の遺伝子の突然変異による小脳失調症の発症によって特徴付けられる常染色体優性劣性運動障害です。ATM、 tefu、ショウジョウバエの細胞の突然変異体は、モビリティと長寿の15の欠陥を表示します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを評価するには、ATショウジョウバエモデルを島の試金のテストし、手動でデータ カウント マクロのデータ出力を比較しましたしました。そのユビキタスtefuを示したノックダウン (w-;Actin-Gal4/GD11950)自分の遺伝的背景のコントロール (w-; に比べてプラットフォームを残してこれらのはえの能力が大幅に減少Actin-Gal4/+) (図 4).1 後 s、コントロール ハエの 50% は、対照的に、プラットフォームを逃れていた、< tefuの 1%-RNAi 飛ぶ。忠実にマクロで得られたデータがカウント マクロが島アッセイ データの定量化と動き欠陥(の評価に使用することができます信頼性の高いツールであることを示すマニュアルによって得られたデータを再現する重要なは、図 4A ・ B)。
図 1: 要件、実験の手順、および島の試金の分析の概要を示すフローチャート。(A) 島アッセイ装置。(B) 島の試金のための実験装置。(C) 島の試金します。(D)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで島アッセイ データの処理します。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロ、3 サブ マクロで構成されます: 1) スタックと投影を作る、2) 定義するプラットフォーム、および 3) 分析。(E) 処理と「島の試金分析」スクリプトを使用してデータの統計的評価。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プロトコルの中に必要なさまざまな調整の例です。(A) 必要なディレクトリ構造がどの島でアッセイ実験をデータ処理および分析のため保存必要があります。(B) ハエが表示する必要があります、ビデオ設定を調整するとき白地に黒。(C) 画像フレームの出力ファイル本稿で説明する画像記録ソフトウェアによって保存されます。(D) 黄色のアウトラインは、プラットフォームの選択を示しています。「ROI マネージャー」でストアドのプラットフォームの選択は、青色で強調表示されます。(E) ハエは「最小飛ぶサイズ設定」の調整中の白い点として表されます結果ウィンドウは、ピクセル単位でハエの領域を示しています。(F) 事例 (右側)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた結果の画像のスタックに対応するフレーム (左側) 単一の記録された画像フレーム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:「島の試金分析」スクリプトでデータ処理後に得られる結果画像(A) 行ごと飛行脱出の応答を示すグラフ制御実験複製。(B) 線各 tefu RNAi 実験複製の飛行脱出の応答を示すグラフします。(C) 平均飛行エスケープ応答実験条件を示されている;誤差範囲を表す曲線分布制御と変異条件の下の領域を表す SEM. (D) ドット プロット。Tefu RNAi とコントロールの両方の条件の実験的複製は、中央分離帯 (赤い線) (黒) で個々 のデータ ポイントとして表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ユビキタスtefuノックダウン ハエはプラットフォームを残す能力の大幅低下を示しています。データ コントロール (w-; (s) 時間をかけてプラットフォームにおけるハエの % を表すActin-Gal4/+) と tefu RNAi (w-;Actin-Gal4/GD11950) 飛ぶ。(複製の数 = 5; 誤差範囲を表す SEM)。(A)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られる生データ。(B) ドット プロット曲線分布「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで得られた制御および tefu RNAi 条件の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p < 0.01)。(C) 生データは手動で 1 秒あたりの島に現在ハエの数をカウントすることによって得られます。(D) ドット プロット カーブ コントロール Tefu RNAi 条件手カウントすることによって得られた分布の下の領域を表す (ウェルチの t 検定登録 * * p < 0.01)。誤差範囲を表す SEMこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 列名 | 説明 | ||
| スライス | フレームの名前。 | ||
| カウント | フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内で検出されたオブジェクトの数。 | ||
| 総面積 | プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総面積。 | ||
| 平均サイズ | フレーム (率 ROI) プラットフォームの限界内のオブジェクトの数で割った値で検出されたオブジェクトの総面積。 | ||
| % 領域 | プラットフォーム (ROI) の総面積に対してオブジェクトによって占有されている領域の割合です。 | ||
| Perim。 | プラットフォーム (ROI) ピクセルの範囲内でフレーム内で検知されたオブジェクトの総周長。 | ||
| 分飛ぶサイズ | 最低限は飛ぶ (単位: ピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義したサイズ設定です。 | ||
| ROI の領域 | サブのマクロの実行中に、ユーザーが定義したプラットフォーム (ROI) の領域 (単位: ピクセル) プラットフォームを定義します。 | ||
| ハエの数 | 「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。 | ||
表 1: パラメーター「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで測定。この表で説明されているパラメーターが「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロを実行する時に"results.txt」ファイルで表示されます。
| 列名 | 説明 | ||
| スライス | フレーム番号。 | ||
| カウント | ハエ検出 (率 ROI) プラットフォームの限界内のフレームの数です。 | ||
| X.Area | ピクセルの (ROI) プラットフォームの限界内のフレームに検出されたハエの総面積。 | ||
| 分飛ぶサイズ | 最低限飛ぶサイズ エントリ設定 (単位はピクセル)「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義されています。 | ||
| ROI の領域 | 「プラットフォームの定義」サブのマクロを実行するときに、ユーザーが定義したプラットフォーム (ピクセル単位で、投資収益率) の領域。 | ||
| ハエの数 | 「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロのグラフィカル インターフェイスでユーザーが定義した実験あたり使用されるハエの数です。 | ||
| X.Count | % 飛ぶハエの実験中にプラットフォーム上で検出された数の最大値を基準にしてそれぞれのスライス/フレームのプラットフォーム上に存在。 | ||
| Timepoint | 1 の時点を表し分析する最初のフレーム、ハエがプラットフォーム上で最初表示フレームに対応します。分析あたり 100 フレームの合計がある (10 に対応する s、説明されている設定を使用する場合。 | ||
| 実験 | 1 つの条件複製の数です。 | ||
| 条件 | (ユーザー定義のデータを含むフォルダーの名前) によると実験条件の名前を示します。 | ||
表 2:「島の試金分析」スクリプトを使用してデータを処理して得られた変数の説明この表に記載されているパラメーターは、「島の試金分析」スクリプトによるデータ処理時に"data_all_conditions.csv"ファイルに表示されます。
Discussion
このプロトコルでは、島のアッセイ中ショウジョウバエモーター動作を定量的に評価「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロについて説明します。マクロは、正確に高感度・運動の欠陥の定量的高スループット評価に適した島アッセイを行う時間をかけてのプラットフォームでハエをカウントします。方法論により、任意の条件の比較のためハエ薬曝露を含む、異なる遺伝的または環境条件下で栽培できます。この読み出しは運動障害のショウジョウバエモデルと他の神経疾患を勉強して大きな遺伝的または医薬品の画面を実行するとき、または歩行またはフライトを調べる検出ツールとして特に有用、します。動作です。
この原稿で示される島の試金プロトコルは、既存/代替方法上の利点を提供します。たとえば、ビデオ追跡歩行ははるかに時間がかかり、大規模なサンプル サイズのテストには適して。島の試金は高スループット スクリーニング ツールをあり、この意味で、迅速な対話型負走 (リング) アッセイ16に匹敵します。2 つの違いは、広範な運動の問題を検出するため島の試金ができます。降壇するハエの無力は、ジャンプ、飛行中の欠陥によって生じるまたはによる歩行行動特性 (筋肉・神経) の翼や脚 (筋肉・神経) の欠陥。その一方で、リング アッセイは登山歩行動作脚 (筋肉・神経) 欠陥によって引き起こされる欠陥を評価します。に備えてユーザー複数行動読み出しに興味を持っている、島アッセイはリング法などの他のアッセイでも簡単に結合できます。さらに、光遺伝学に必要なレーザーは島のアッセイでは、簡単にインストールできるし、セットアップがとても簡単なそれすることができます簡単に温度と光を制御できる部屋に移動すること。
成功とここで説明島アッセイの再現性を確保するため、いくつかの推奨事項に従ってください。因数と転送実験にハエは CO2か風邪麻酔の影響を避けるために実験の前に少なくとも 1 日でバイアルします。実験バイアルを満杯になるか (バイアルあたり 10-15 ハエを使用; バイアルあたりハエの数が同じを常に配置するが最適です)。生鮮食品にハエを保つため、すべての回で。そうでない場合はまだアッセイを行うに精通して、収率を最大限にプラットフォームに飛ぶ練習を投げます。また手をすぐに取り消し、練習データの解析 (画像解析と画像の手が後にのみ開始をカウントのフライ) と干渉する、その後、右します。環境・実験の条件を比較する必要がある実験で同一に保つ (異なった年齢でテスト対変異または遺伝子型のコントロールなど)。常に同じ時刻で実験を実行し、制御温度と湿度の条件の下でバイアルを維持します。統計的検出力の生物あたり、少なくとも 3 つの技術的なレプリケートをテストします。
説明するマクロのパフォーマンスの成功を確保するためここでは、ウェブカメラとイメージの設定する必要があります調整する最大コントラストを達成するために: 飛ぶ白いプラットフォーム上の黒のオブジェクトとして表示されます。マクロでハエの数を適切にカウントされないときのコントラストの設定を調整、投資収益率が選択が適切かどうかを確認、プラットフォームにおけるハエのサイズが指定した最小値以上であることを確認サイズの設定 (このプロトコルの手順 8.3 参照) を飛ぶ。設定は一度定義するだけです。彼らは、ウェブカメラとプラットフォーム間の距離が変更されない限り、すべての実験に適用されます。Circularity_min と最大の設定を定義、粒子の真円度 (粒子カウント ハエを =) 分析のために考慮するが表示されます (飛ぶカウントが設定されたオブジェクトを =)。1 は完全な円を表し、0 行17。ハエは、循環 (ハエは直線として表示できません) のある程度を常に存在、ので"Circularity_max"設定が 1 で、"Circularity_min"設定が 0.4 で。それはユーザーがこれらの設定を調整する必要があることはできません。
マクロ時折ミス カウント時にハエがプラットフォームの国境近くに位置しています。これは、ユーザー定義の投資収益率のうち徒歩がハエが飛ぶことができない場合に発生します。ほとんどの場合、投資収益率 (プラットフォームに可能な限りそれをフィッティング) を再度選択することによってこの問題が解決する簡単にできます。しかし、「島の試金分析」スクリプトを検出することが、投資収益率を比較的よくウォーキング ハエによる正しい不適切なデータ数。ここで紹介するウェブカメラの解像度が十分に高い近接かなりよくハエを差別するが実施して追加アルゴリズム「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロの画像処理手順のよう、流域関数17をむしばむと。これらはプラットフォームに近接しているハエの適切な描写を促進します。加えて、マクロはプラットフォームから飛び降りまたはそれから離れて飛んでいるハエを区別することができます。それにもかかわらず、健康な若い飛ぶ系統も飛んで古いや歩行の赤字蠅プラットフォームに長く残ると最終的に跳ぶか、またはプラットフォームから落ちるに対し、プラットフォームにドロップしたら直ちにが一般的に観察されます。これらの制限にもかかわらずアッセイと分析は、行動の非常に正確な測定を提供します。
「島の試金分析」スクリプトのパフォーマンスの成功を確保するため、ユーザーがプロトコルで指定されるスクリプト行で入力と出力ファイルの正しいパスを入力すると (示されるように適切なフォルダー形式でデータを提供するかどうかを確認するには図 2)。ユーザーにあまりにも厳しい信頼性の低い実験データをフィルター処理するための条件が検出された場合 (行 68:「数」の列の最初の値が 5 未満; 71 行:「数」の列の最初の値は、プラットフォーム上でスローされたハエの数の合計より高いrm +3) オフ行 68 と 71「島の試金分析」スクリプトでテキスト前に # 追加することによってこれらフィルターの設定。この場合、すべてのデータセットは、分析されます。また、フィルターの設定は、行 68 とユーザーのニーズによると 71 の値を調整することによって変更できます。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロによって生成された"results.txt」のカウント値の可能な成果物も手動で調整することができ、、調整後のデータでスクリプトを再実行することができます。10 fps 以上、または 10 以上の処理中のユーザーの関心とデータの s、「島の試金分析」スクリプトによって処理されるフレーム数が調整します。統計解析は、ユーザー定義の代わりに置き換えることができます。
「例島アッセイは、」島の試金を使用して取得した画像時系列の例を含むをという名前のフォルダーは、次の web サイトで見つけることができます: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。「例島アッセイ」フォルダーをダウンロードし迅速に徹底、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」で画像の処理のファイル ストレージの構造このプロトコルで説明されている手順に従ってくださいスクリプトです。
島アッセイ毛細血管拡張性運動失調のショウジョウバエモデルの異常な挙動を定量化して評価で開発したマクロの分析] スクリプトと組み合わせてを使用できます。アッセイは、様々 な年齢層に効率的に適用できます、ので、表現型の潜在的進歩的な性質を分析する適しています。
「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」スクリプトと組み合わせて島アッセイは要約すると、客観的に分析し、の自発の欠陥を定量化する費用対効果、信頼性、および効率の高いアッセイショウジョウバエ高スループット方法で運動障害のモデル。
Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
我々 は、ウィーンショウジョウバエリソースやショウジョウバエ系統を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センター (NIH P40OD018537) を認めます。島アッセイ セットアップを構築するため島の試金し、Martijn Eidhof に私たちを導入するための Klämbt 研究所に感謝しております。本研究は E 珍しい 3 共同国境を越えた電話でサポートされている一部の許可「常染色体優性劣性 ataxias 療法の準備」科学的研究 (NWO) のため、オランダの組織からトップの助成金 (912-12-109) によって準備 (NWO 9003037604)2 DCN/Radboud 大学医療センター博士フェローシップ。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
