Summary
La isla es un ensayo novedoso y rentable que puede utilizarse para evaluar el comportamiento locomotor básico de Drosophila melanogaster. Este manuscrito describe algoritmos para el procesamiento automático de datos y cuantificación objetiva de los datos de ensayo isla, haciendo de este ensayo una lectura sensible, de alto rendimiento para grandes pantallas genéticos o farmacológicos.
Abstract
Avances en tecnologías de secuenciación de última generación contribuyen a la identificación de genes de la enfermedad (candidatos) para trastornos del movimiento y otras enfermedades neurológicas a una velocidad cada vez mayor. Sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos moleculares que subyacen a estos trastornos. La caja de herramientas genética, molecular y comportamiento de Drosophila melanogaster hace este organismo modelo especialmente útil para caracterizar nuevos genes implicados en la enfermedad y los mecanismos de un modo de alto rendimiento. Sin embargo, pantallas de alto rendimiento requieren análisis eficientes y confiables que, idealmente, son rentables y permiten la cuantificación automatizada de rasgos relevantes para estos trastornos. La isla es una rentable y fácilmente instalación método para evaluar el comportamiento locomotor de Drosophila . En este ensayo, moscas se lanzan en una plataforma de altura fija. Esto induce una respuesta de motor innata que permite a las moscas escapar de la plataforma dentro de segundos. En la actualidad, los análisis cuantitativos de ensayos filmados de la isla se hacen manualmente, que es una tarea laboriosa, especialmente al realizar grandes pantallas.
Este manuscrito describe los algoritmos"Drosophila isla ensayo" y "Análisis de ensayo de isla" para alto rendimiento, procesamiento automático de datos y cuantificación de los datos de ensayo de la isla. En la configuración, una simple webcam conectada a un ordenador portátil recoge una serie de imágenes de la plataforma mientras se realiza el ensayo. El algoritmo de"Drosophila isla ensayo" desarrollado por el software de la abrir-fuente Fiji procesa estas series imagen y cuantifica para cada condición experimental, el número de moscas en la plataforma con el tiempo. El guión de "Análisis de ensayo de la isla", compatible con el software libre R, fue desarrollado para procesar automáticamente los datos obtenidos y calcular si genotipos de tratamientos son estadísticamente diferentes. Esto en gran medida mejora la eficacia de la prueba de isla y hace una lectura de gran alcance para locomoción básica y comportamiento de vuelo. Por lo tanto puede aplicarse a grandes pantallas investigando la mosca capacidad locomotor, modelos de Drosophila de trastornos del movimiento y eficacia de los medicamentos.
Introduction
En los últimos años, avances en tecnologías de secuenciación de última generación han contribuido a la identificación de los genes subyacentes a trastornos del movimiento degenerativas del cerebro (p. ej., ataxia cerebelosa y Parkinson), del periférico neuronal origen (p. ej., esclerosis de lateral amyotrophic y paraplegia espástica hereditaria) y de origen muscular (por ejemplo, la distrofia muscular de Duchenne y distrofia miotónica)1,2,3,4 . A pesar de esto, poco se sabe sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la mayoría de estos trastornos. Una mejor comprensión de estos mecanismos es esencial para el desarrollo de terapias.
Como en los seres humanos, movimiento en organismos modelo, como el vuelo y locomoción en Drosophila, es controlado por el cerebro central, sistema nervioso periférico y los músculos. Además, el tiempo de generación rápido y caja de herramientas genética de Drosophila que este organismo modelo particularmente adecuado para el cribado de alto rendimiento de genes involucrados en trastornos del movimiento y para5,6 de pruebas de drogas . Debido a la cantidad sustancial de las condiciones que deben ser probados en tales pantallas, confiables, rentables y relativa ensayos sencillos, así como herramientas para cuantificar los resultados de salida de forma automatizada, son altamente deseables.
Schmidt et al. (2012) 7 se describe una prueba de bajo costo llamada el "ensayo de la isla" para evaluar el comportamiento locomotor de Drosophila . El ensayo de la isla ha sido utilizado exitosamente en proyecciones a gran escala para identificar genes con funciones específicas de la glia7, en la evaluación de los modelos de Drosophila de discapacidad intelectual8y para la evaluación general de volar el comportamiento motor9. El diseño del principio de la prueba de la isla consiste en una plataforma elevada sobre la cual se lanzan varias moscas. Esto induce un comportamiento motor innato que permite moscas sanas escapar de la plataforma dentro de segundos. El ensayo mide la cantidad de moscas restantes en la plataforma más tiempo7,8,9. Todas estas características indican que el ensayo de la isla puede ser una herramienta de detección de gran alcance para genes involucrados en trastornos del movimiento.
En la actualidad, el análisis cuantitativo de los datos de ensayo filmado de la isla se realiza manualmente7,8,9. Para mejorar la eficiencia del ensayo, se desarrolló un método de bajo costo para cuantificar semiautomática el escape de las moscas de la plataforma. La instalación emplea una simple webcam conectada a un ordenador portátil para recoger tiempo de imagen de la plataforma, con los marcos de la serie adquirió cada 0.1 s. Marcos entonces se procesan con la macro"Drosophila isla ensayo" que cuantifica el número de moscas en la plataforma sobre tiempo. La macro"Drosophila isla ensayo" se divide en tres sub-macros independientes: (I) el "crear pila y la proyección," macro sub identifica experimentos diferentes isla almacenados en las diferentes subcarpetas y crea una pila y una proyección de cada uno series de tiempo. (II) la macro sub "Definir plataforma" consecutivamente abrirá todos los archivos "Projection_image_name.tif" en las subcarpetas experimentales individuales, momento en el que se solicita el usuario para definir manualmente la plataforma de la isla como la región de interés (ROI). (III) "análisis" automáticamente cuantifica el número de moscas restantes en la plataforma durante la serie de tiempo. Pueden ejecutar las macros sub consecutivamente (en una carrera) o de forma independiente. Para el análisis estadístico de datos, un script fue desarrollado para procesar automáticamente los datos obtenidos y aplicar una prueba estadística para determinar si los tratamientos/genotipos se comportan significativamente diferentes entre sí (figura 1). Finalmente, está demostrado que esta configuración puede utilizarse para evaluar y cuantificar la capacidad locomotor aberrante de un modelo de Drosophila de la ataxia-telangiectasia (AT).
Protocol
1. construcción de la caja de ensayo isla
- preparar una bandeja hecha de un material sólido, como el poli metacrilato de metilo (PMMA), que contiene una capa de agua (es decir, un baño). Asegurar que el material no es blanco.
Nota: Dimensiones de 40 x 35 x 2,5 cm 3 se recomiendan ( figura 1A). - Preparar una caja (42 x 38 x 25 cm 3) de un material sólido, transparente, como el PMMA, a colocarse alrededor de la bañera para evitar que las moscas escapan en el espacio de laboratorio. Ponga un agujero (20 x 30 cm 2) en el lado lateral que es suficientemente grande para que el experimentador fácilmente manejar los frascos con moscas y soltarlos en la isla ( figura 1A).
- Preparar una plataforma elevada 10 x 15 x 2,5 cm 3 en dimensión, hecho de un material impermeable (plástico o PMMA) que es hermético.
Nota: Esta plataforma es necesaria para tener una superficie blanca uniforme para garantizar buen contraste para el análisis de la imagen. El tamaño no es necesariamente fija, pero debe ser lo suficientemente grande para que todas moscas inicialmente la tierra en la plataforma y la oportunidad de caminar en él ( figura 1A). - Fijar la plataforma pegando al baño o colocación de pesas u otros objetos pesados dentro de la caja de la plataforma para evitar cambios posicionales de la plataforma durante la sesión experimental, película.
2. Requisitos de software y la instalación
- instalación de software de grabación de imagen.
- Descargar software de grabación de imágenes a grabar la serie de imagen de la isla (ver la Tabla de materiales) e instalar el software en un ordenador.
Nota: El software de grabación de imágenes que se describe en este protocolo sólo es soportado por Windows. Una alternativa para que otros usuarios ha sido añadida a la Tabla materiales.
- Descargar software de grabación de imágenes a grabar la serie de imagen de la isla (ver la Tabla de materiales) e instalar el software en un ordenador.
- " Ensayo isla de drosophila " instalación macro.
- Descargar el " Drosophila ensayo isla " macro y el Fiji compatible versión 10 (1.4 o superior) desde el siguiente sitio web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- Mover el cursor a la " ensayo de isla " directorio y haga clic en " vista. "
- Clic en " para descargar todas. " el contenido de la carpeta se descargará como un archivo .zip, descomprima el archivo descargado.
- Copia la " Drosophila isla Assay.ijm " archivo en " Fiji.app/plugins/directory. "
Nota: Cuando a partir de Fiji, el " Drosophila ensayo isla " macro aparecerá en la parte inferior del menú desplegable plugins.
- " Isla ensayo análisis " de la escritura de instalación y descargar.
- R descargar 11 desde el siguiente sitio web: https://cran.rstudio.com. Instalar en un ordenador.
- Descargar R studio desde el siguiente sitio web: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Instalar en un ordenador.
Nota: El " Análisis de prueba de isla " secuencia de comandos se puede ejecutar con R solamente. Estudio de R, con su interfaz de usuario más fácil, se presenta como paso alternativo para los usuarios inexpertos con R. - Descargar el " isla ensayo análisis " de la escritura de la " ensayo isla de Drosophila " directorio en la siguiente página web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
Nota: después de realizar el paso 2.2, la " Análisis de ensayo de isla " script también puede encontrarse en la carpeta descomprimida llamada " isla análisis. "
3. Preparación de las moscas para ser probado en el ensayo de isla
- recoger en escena moscas para cada condición experimental bajo frío o dióxido de carbono (CO 2) anestesia, como se describió anteriormente 13 (durante un período de 1 - 2 días).
- Preparar un mínimo de 3 frascos de la muestra por condición experimental, cada una con aproximadamente 15 escena vuela. Use solamente vuela con las alas intactas y que son de similar edad y sexo.
Nota: Para los experimentos descritos aquí, muestra 5 frascos con moscas macho 15 genotipos w –; Actinia-Gal4 / + (control) y w –; Actinia-Gal4/GD11950 (tefu ARNi) fueron recogidos en el día de la eclosión, envejecido durante 4 días y fueron utilizados para realizar el ensayo de la isla. Arni, cepas de control y el controlador de la actinia-gal4 se obtuvieron de un comercial de la fuente (ver la Tabla de materiales).
- Preparar un mínimo de 3 frascos de la muestra por condición experimental, cada una con aproximadamente 15 escena vuela. Use solamente vuela con las alas intactas y que son de similar edad y sexo.
- Deje que las moscas recuperarse para evitar los efectos de los anestésicos (al menos 1 día al utilizar CO 2) antes de probar las moscas recogidas en el ensayo de la isla en la edad de interés.
4. Montaje experimental
Nota: ver figura 1B.
- Añadir agua fría y con una pequeña cantidad de jabón a la bandeja de baño y colocar la plataforma en el centro.
Nota: El jabón disminuye la tensión superficial del agua; moscas que tocan el agua se ahogan. Esto evita que crecientes cantidades de moscas volando en la caja durante la progresión de la sesión experimental. - Coloque la caja transparente encima de la bandeja y se iluminan la plataforma desde arriba usando una lámpara de.
Nota: Iluminación de la plataforma es principalmente necesaria para asegurar el adecuado contraste de video. Una luz de LED 12 V ordinario es apropiada para esto. - Colocar la webcam directamente encima de la plataforma (fuera de la caja) y conectarlo a un ordenador.
- Crear nuevas carpetas en el ordenador para almacenar los datos experimentales diferentes antes de los experimentos de.
- Seguir la estructura del ejemplo ilustrado en la figura 2A para crear las carpetas. Por ejemplo, si el diseño experimental requiere pruebas dos genotipos con cinco repeticiones, primero cree una carpeta principal que contiene la fecha del experimento. Dentro de la carpeta principal, crear dos subcarpetas (una por genotipo). Dentro de las carpetas de genotipo, crear subcarpetas nuevas cinco, uno por cada repetición.
Nota: Para su posterior análisis, es esencial que la imagen de la serie correspondiente a los experimentos individuales se guarda en carpetas con nombres únicos.
- Seguir la estructura del ejemplo ilustrado en la figura 2A para crear las carpetas. Por ejemplo, si el diseño experimental requiere pruebas dos genotipos con cinco repeticiones, primero cree una carpeta principal que contiene la fecha del experimento. Dentro de la carpeta principal, crear dos subcarpetas (una por genotipo). Dentro de las carpetas de genotipo, crear subcarpetas nuevas cinco, uno por cada repetición.
5. Vídeo configuración de ajustes en el " dispositivo de captura " sección de la interfaz
- Abra el software de grabación de imágenes y, bajo la " captura " ficha, haga clic en " Time-Lapse imágenes … " y seleccionar la webcam correspondiente como la " Dispositivo de captura "
- colocar una mosca muerta en la isla, ajustar la configuración de vídeo haciendo clic en el " configuración de vídeo " caja. Desplácese a través de las barras de herramientas, ajuste de brillo, contraste y color de una manera tal que la mosca muerta aparece negra sobre un fondo blanco ( figura 2B). Cuando haya completado los ajustes, haga clic en " Ok. "
6. Grabación y Video guardar ajustes de configuración en el " Time-lapse " sección de la interfaz
< ol>Nota: el archivo de vídeo no se utiliza para la cuantificación de datos, sin embargo, podría ser útil tener una idea general sobre el experimento de.
- En el cuadro de compresión, seleccione " código IYUV Intel " para compresión de vídeo y elija " tomar un fotograma cada 0.1 segundos, " con el " tasa de reproducción (imágenes por segundo): " 10.
- Guardar la serie de tiempo del experimento como .bmp marcos haciendo clic en " avanzado … " seleccionar " crear una imagen .bmp cada uno capturado marco. " clic en " examinar. " seleccionar el mismo directorio en el " captura de película en AVI " ventana (como elegido en el paso 6.1), haga clic en " abiertas, " y pulse " Ok. "
Nota: Observe que, durante el experimento, los marcos se almacenan como archivos .bmp (requeridos para análisis de datos). El programa nombra los marcos como " A " seguido por el número correspondiente a la secuencia de la captura de marco (por ejemplo, " A_number.bmp ") ( figura 2). Siempre guardar las imágenes que pertenecen a diferentes experimentos en una nueva carpeta para que no se sobrescriban serie imagen previamente grabada. Ten en cuenta que las imágenes no son guardadas automáticamente en la misma carpeta que el archivo de vídeo a menos que esta carpeta está seleccionada en " ver … " al hacer clic en el " avanzado " caja.
7. Análisis y recopilación de datos de la isla
- Presione el botón de inicio en la interfaz de Time-lapse de la imagen del software de grabación de imágenes para iniciar la grabación de.
- Toque el frasco experimental que contiene moscas (paso 3) 2 - 3 veces para asegurarse de que las moscas son en el fondo del frasco. Rápidamente Quite el tapón del frasco y, con un vigoroso movimiento, toque el frasco en la plataforma para que todas moscas caen en la plataforma al mismo tiempo ( figura 1).
- Después de aproximadamente 30 s, prensa de la " dejar de " botón para detener la grabación.
Nota: Si todas moscas desaparecen de la plataforma, la grabación se puede detener antes. - Quitar las moscas que permanecen durante 30 s en la plataforma a mano después de parar la grabación de la imagen.
- Antes de proceder a grabar el siguiente experimento, cambiar el directorio de destino para los archivos .bmp y las películas (véase sección 6).
8. Procesamiento de datos: Ejecuta el " ensayo de isla de Drosophila " Macro
Nota: ver figura 1.
- Ejecutar el " crear pila y proyección " sub-macro I para producir pilas y proyecciones de la serie de imágenes recogidas de.
- Fiji de inicio, haga clic en " Plugins " en la barra de herramientas y elegir " Drosophila isla ensayo " en el menú desplegable; aparecerá una nueva ventana.
- Entrar el " primera imagen identificador de la serie de tiempo " en la interfaz gráfica de macro.
Nota: Los cuadros de la imagen grabada se guardan como " A number.bmp " según el orden en que se obtienen las imágenes. En el " marco primero el identificador " interfaz de macro, llenar el escenario con el número dado hasta el primer fotograma por el programa y con la extensión de archivo. Llenar " marco primero el identificador " con "-0001.bmp, " desde el primer fotograma se llama " A-0001.bmp " ( figura 2). En el caso de otros formatos de imagen (como .tiff o .jpeg) son generados por el software de cámara web, especifique la extensión de archivo correcto de la primera imagen de " primera imagen identificador de series de tiempo. " - seleccionar sólo el " crear pila y proyección " Sub-macro, haga clic en " Ok, " y seleccione el directorio principal que contiene todas las subcarpetas con los experimentos de ensayo individuales de la isla.
Nota: Los archivos .bmp en cada experimentan de carpeta que contienen el " marco primero el identificador " se procesará posteriormente. Dos nuevos archivos aparecerán en cada subcarpeta de cada experimento, el nombre por defecto " Stack_image_name.tif " y " Projection_image_name.tif " ( figura 1). Una vez realizado este paso, se pueden eliminar los archivos de .bmp. Archivos de .tif pila y proyección contienen todos los datos y son suficientes para su posterior análisis.
- Ejecutar el " definir plataforma " macro sub II para seleccionar la ubicación exacta de la plataforma de.
- Abrir la interfaz gráfica de la " ensayo isla de Drosophila, " seleccionar sólo la " definir plataforma " casilla de verificación y pulse " Ok. "
- en el " elegir un directorio " ventana, seleccione el directorio principal donde subcarpetas experimentales se almacenan y presione " Select. "
Nota: el " definir plataforma " sub macro busca automáticamente el " Projection_image_name.tif " archivos en todas las subcarpetas en el directorio principal. La " Projection_image_name.tif " imagen almacenado en la primera carpeta, junto con dos ventanas — " definir la plataforma de " y " Gerente de ROI " — abrirá. - Seleccione el " selecciones polígono " herramienta en la barra de herramientas para dibujar una selección que coincide con la plataforma de la isla.
Nota: Es muy importante excluir a los límites de la plataforma de la selección. Ver Figura 2D. - Después de seleccionar la plataforma en la primera imagen, haga clic en " Add " en la " ROI Manager " ventana; la voluntad de área seleccionada aparecen en la ventana de administrador de ROI como un conjunto de valores ( Figura 2D). Prensa " Ok " en el " definir la plataforma " ventana. La macro se procederá a la proyección siguiente.
- Haga clic en los números ( Figura 2D) almacenado en la " administrador de ROI " ventana; la voluntad de selección anteriores aparecen automáticamente en la proyección de imagen actuales.
Nota: desde la isla plataforma es probable que tenga el mismo tamaño y posición cuando se realizaron experimentos en una fila (como la posición de la webcam y la isla permanece sin cambios), es útil almacenar el ROI definiendo la plataforma en la " ROI manager. " por al hacerlo, el usuario ahorrará tiempo; en las próximas proyecciones, sólo es necesario hacer clic en la selección temporalmente almacenada en el administrador de ROI. - Si la posición de la isla ha movido ligeramente en comparación con el experimento anterior, ajuste la posición de la selección con el botón izquierdo en el centro de la selección y arrastrar el área seleccionada a la posición requerida.
- Si la selección no coincide con la plataforma, haga clic fuera de la selección y delinear una nueva selección de la plataforma usando la " selección de polígono " herramienta. Almacenar la nueva selección en el gestor del retorno de la inversión haciendo clic " agregar; " una nueva selección aparecerá en la " administrador de ROI " ventana que se puede utilizar continuamente.
- Cuando se ajusta la selección, haga clic en " Ok " en el " definir la plataforma " ventana y repita el procedimiento hasta que todas las plataformas se definen.
Nota: Aviso que el nombre de una imagen binaria de la plataforma correspondiente a la zona ROI delineada en blanco sobre un fondo negro, " Platform_image_name.tif, " apareció para cada imagen procesada en la misma subcarpeta experimental como la pila y la proyección imágenes generadas en paso 8.1.3 ( figura 1).
- Definir el tamaño mínimo de la mosca.
Nota: Esta configuración define el tamaño mínimo de la mosca en píxeles. Partículas que son más pequeñas que el tamaño mínimo especificado se excluirán del análisis para evitar falsos positivos debido al ruido.- Abrir una pila de imágenes creada por el " crear pila y proyección " I. macro sub
- Convertir la pila de la imagen a 8 bits haciendo clic en la imagen > > tipo > > 8-bit.
- Ir al menú, pulse imagen > > ajuste > > umbral, asegúrese de que la " fondo oscuro " cuadro está seleccionado y pulse " aplicar; " una segunda ventana llamada " umbral " aparecerán. Haga clic en " centrico oscuround " y pulse " Ok. "
Nota: se creará una pila de imagen binaria en el que las moscas se definen en la plataforma en blanco y negro. Cuando éste no es el caso, aplicar el " invertir " función haciendo clic en Edit > > invertir > > ejecutar. - Establecer la escala para detectar el número de píxeles haciendo clic en analizar > > establecer escala. Aplicar los siguientes valores: distancia en píxeles = 1, conocida la distancia = 1, proporción de aspecto de píxeles = 1 y la unidad de longitud = pixel. Prensa " Ok. "
- seleccionar la " varita " herramienta (trazo) en la barra de herramientas y haga clic en una mosca (punto negro) presentes en la plataforma. Pulse ctrl + m (usuarios de Windows) o cmd + m (usuarios de Mac); un nuevo " resultados " ventana indicará la zona del spot seleccionado en píxeles. Hacerlo consecutivamente para varias moscas y determinar el tamaño mínimo de la mosca.
Nota: Cuando se ejecuta la macro, configure el " tamaño mosca mínimo " para el más pequeño tamaño mosca observado menos un margen del 10%. ( Figura 2E).
- Ejecutar el " Análisis " macro sub III cuantificar vuela escapando de la plataforma de.
- Ir a la barra de herramientas, seleccione " Plugins, " y el " Drosophila isla análisis. "
- ajuste el " tamaño mosca mínimo " ajuste según el valor definido en el paso 8.3.
Nota: Uso el valor definido en sólo si paso 8.3 el ajuste estándar de " tamaño mosca mínimo " causas de exclusión de las moscas que estaban presentes en la plataforma o si la macro detecta la señal de fondo como moscas. - En el " número de moscas por frasco " ajuste, completar el número máximo de moscas presentes en los frascos durante el experimento completo. Por ejemplo, si un experimento tiene frascos de 15 moscas, otros que contienen 20 moscas y otros que contiene 23 moscas, el " número de moscas por frasco " debe indicarse como 23.
- Seleccionar la " analizar " casilla de verificación y pulse " Ok; " un nuevo " elegir un directorio " aparecerá en la ventana. Seleccione el directorio principal (con todas las subcarpetas y archivos) y presione " select. "
Nota: la macro analizará todas las imágenes almacenadas en las subcarpetas que contienen los " stack_image_name, " " Projection_image_name, " y " Platform_image_name " archivos. La macro procesará imagen tras imagen. La salida de macro consiste en una pila de imagen resultado binario llamada “ result_stack_subfolder_name.tif ” y un archivo de texto de resultado llamado " result_subfolder_name.txt, " que aparecen en cada carpeta de datos el archivo texto (.txt) contiene mediciones cuantitativas correspondientes a la imagen de la pila y consta de 9 columnas. El contenido de estas columnas se resume en la tabla 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " corresponde a la serie de tiempo de imagen de un experimento, donde vuela detectado durante el experimento se representa como puntos negros sobre un fondo blanco ( Figura 1E). - Inspeccione cuidadosamente la pila de resultado para asegurarse de que no hay artefactos han ocurrido y que la macro funcionaba con precisión ( figura 2F).
Nota: Ejemplos de artefactos pueden ser elementos de imagen que no vuela pero que son detectados como tales por el algoritmo de segmentación de imagen (falsos positivos). Esto, por ejemplo, puede deberse a la detección de señal de fondo debido a una incorrecta selección del ROI.
9. Datos mediante análisis " Análisis de ensayo de isla "
- estructura de los datos como se indica en la figura 2A para permitir análisis con el " isla ensayo análisis " script. Generar un directorio principal con subcarpetas, donde cada subcarpeta corresponde a una condición experimental para su análisis.
- Generar en las subcarpetas, carpetas que contienen las repeticiones experimentales independientes ( figura 2A) y los archivos resultados.txt producidos por la " ensayo de isla de Drosophila " macro.
Nota: El " isla ensayo análisis " macro procesará todas las condiciones experimentales ubicadas en el directorio principal a la vez. - Estudio de Inicio R o R. Haga clic en el archivo > > abrir el archivo … en la barra de herramientas y seleccione la " isla ensayo análisis " script
- Instalar el ggplot2 y matrixStats los paquetes cuando se ejecuta el " isla ensayo análisis " script por primera vez. Escriba lo siguiente en la ventana de consola:
> install.packages("ggplot2"), ingrese
> install.packages("matrixStats"), entrar.
- Instalar el ggplot2 y matrixStats los paquetes cuando se ejecuta el " isla ensayo análisis " script por primera vez. Escriba lo siguiente en la ventana de consola:
- Especificar la ubicación de la salida de datos y análisis de archivos en el script. Inserte en las siguientes filas de secuencia de comandos:
- fila 16: Introduzca la ruta al directorio principal que contiene los experimentos para ser analizadas y comparadas (en la figura 2A, este es el camino que se dirige a la " isla de ensayo " carpeta).
- Fila 19: Introduzca la ruta a la carpeta donde se almacenan los archivos de salida análisis.
Nota: El directorio indicado en la fila 16 sólo puede contener las carpetas a analizar. El script también no funcionará correctamente si los caminos en fila 16 y fila 19 son los mismos.
- Ejecutar el script haciendo clic en código > > región ejecute > > ejecutar todo desde la barra de herramientas.
Nota: Observe que aparecen tres archivos .csv resultante y un archivo .txt resultante ( Figura 1E) en el directorio definido en fila 19. Estos son: (I) la " data_all_conditions.csv " archivo contiene los datos correspondientes a cada condición experimental y repeticiones experimentales, organizados como se describe en la tabla 2. (II) el " estadísticas summary.csv " archivo resume la media, la desviación estándar (SD) y el error estándar de la media (SEM) del porcentaje de moscas en la plataforma para cada condición experimental. (III) la " AUC.csv " archivo contiene el área bajo la curva para cada repetición experimental. (IV) dependiendo en el número de condiciones presentes en la carpeta principal, la secuencia de comandos a cualquier exportación a " Welch_t test_results.txt " archivo (2 condiciones) o un " AUC_anova_results.txt " archivo (más de 2 condiciones), donde los resultados de la prueba de t o ANOVA comparando el área bajo la curva entre las condiciones experimentales es los indicados. Aviso que cuatro tipos diferentes de archivos de imagen TIFF ( Figura 1E) aparecen en la ruta definida en fila 19. Éstos se llaman: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (donde Name_Of_Data_Folder representa el nombre dado por el usuario), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " y " AUC_anova.tiff. " información detallada sobre el contenido de estos gráficos pueden encontrarse en los resultados de la representante de este manuscrito y en la figura 3.
Representative Results
En el protocolo descrito, Drosophila isla ensayo datos son adquiridos y procesados en tres pasos. En primer lugar, la respuesta de escape vuelo de Drosophila lanzado en la plataforma de la isla es grabada con una webcam y almacenada como imágenes .bmp individuales (secciones 1 a 7 del Protocolo). En segundo lugar, la macro de "Ensayo de la isla deDrosophila" (paso 8) procesa los marcos, generando un archivo de texto "result.txt" (tabla 1), en el que se resume el número de objetos detectados en cada fotograma y una pila de imágenes "Result_stack.tiff", que muestra los objetos detectados dentro del área de la plataforma en cada fotograma. En tercer lugar, el guión de "Análisis de ensayo de la isla" (Protocolo de la sección 9) procesos de los datos macro almacenados en los archivos de "resultados.txt" de experimentos individuales. Se incorporan varios pasos en la secuencia de comandos para filtrar y combinar los datos para el análisis estadístico. El primer fotograma en el que las moscas se lanzan en la plataforma se detecta y se considera como punto 1. Cuadros anteriores se eliminan del conjunto de datos. 100 marcos, después de tiempo el punto 1 (correspondiente a 10 s) son seleccionados para el análisis. Experimentos en los que el número inicial de moscas detectada en la plataforma es menor que 5 son automáticamente excluidos del análisis, eliminando resultados poco fiables de experimentos underpowered. También se excluyen los experimentos en los que el número inicial de moscas detectada en la plataforma excede la configuración de "Número de moscas por frasco" más una tolerancia de 3. Esto elimina datos en el que ruido partículas fueron detectadas erróneamente como moscas. La secuencia de comandos calcula entonces el porcentaje de moscas que detecta para cada punto de tiempo en comparación con el mayor número de moscas en la serie. Errores en bases de datos causada por moscas caminar dentro y fuera de la ROI (detectado como un descenso seguido de un aumento en el porcentaje de moscas en la plataforma con el tiempo) son automáticamente corregidos por sobre ellos como siempre presente en la plataforma en etapas más tempranas . Todos replicadas bases de datos para una condición experimental específica que estaban presentes en el directorio principal se combinan y se exportan al archivo "data_all_conditions.csv". Las columnas representan las variables descritas en la tabla 2. El script también exportará un gráfico de línea para cada condición experimental, nombrado según la carpeta que contiene los datos. Este gráfico muestra el porcentaje de moscas restantes en la plataforma con el tiempo (respuesta de escape de vuelo) para el experimental Replica presentes en la respectiva carpeta ()Figura 3A-B). La media, SD y SEM para cada condición experimental se calculan y se resume en el archivo "Summary.csv de las estadísticas". Un gráfico de línea llamado "Escape_response_all_conditions.tiff" muestra la respuesta de escape de vuelo promedio de hasta 12 experimental las condiciones presentan en la carpeta ()figura 3). Por último, el área bajo la curva para todas las condiciones experimentales presentes en la carpeta principal se calcula y se resumen en el archivo "AUC.csv". Dependiendo del número de condiciones presentes en la carpeta principal, la secuencia de comandos o realizará una dos colas Welch prueba t (2 condiciones) o un ANOVA con la corrección de Tukey para que múltiples (más de 2 en condiciones de ensayo) determinar si la experimental condiciones difieren significativamente entre sí. Estos resultados se resumen en "Welch_t-test_results.txt" o "AUC_anova_results.txt." Al realizar el ANOVA, el script también exportará un archivo "AUC_anova.tiff" que muestra la diferencia en el promedio AUC y los intervalos de confianza de 95% de las condiciones experimentales que se comparan. Los valores del área bajo la curva de las repeticiones experimentales para todas las condiciones experimentales absoluto se muestran como puntos de datos individuales con medianas en "AUC.tiff" (figura 3D).
Ataxia Telangiectasia (AT) es un desorden de movimiento recesivo autosomal caracterizado por inicio temprano de la ataxia cerebelosa debido a mutaciones en el gen Ataxia Telangiectasia mutado (ATM)14. Mutantes del orthologue Drosophila de ATM, tefu, mostrarán defectos en la movilidad y longevidad15. Para evaluar la macro"Drosophila isla ensayo", un modelo de Drosophila de AT fue probado en el ensayo de la isla, y la salida de datos de la macro se comparó con el conteo manual de datos. Los resultados muestran que omnipresente tefu precipitación (w–; Actin-Gal4/GD11950) disminuye significativamente la capacidad de las moscas para salir de la plataforma en comparación con sus controles de antecedentes genéticos (w–; Actin-Gal4/+) ()figura 4). Después de 1 s, 50% de las moscas control había escapado de la plataforma, en contraste con el < 1% de tefu- ARNi vuela. Lo importante, los datos obtenidos con la macro fielmente reproducción los datos obtenidos por el manual contando, lo que indica que la macro es una herramienta confiable que puede ser utilizada para la cuantificación de los datos de ensayo de la isla y la evaluación de los defectos del movimiento ( ) Figura 4 A-B).
Figura 1: Diagrama de flujo sobre los requisitos, procedimiento experimental y análisis de la prueba de la isla. Equipo de ensayo (A) isla. (B) disposición Experimental para el análisis de la isla. Ensayo de la isla (C). (D) procesamiento de datos de ensayo de la isla con la macro"Drosophila isla ensayo". La macro"Drosophila isla ensayo" se compone de 3 macros sub: 1) hacer pila y proyección, 2) definir la plataforma y 3) el análisis. (E) procesamiento y evaluación estadística de los datos usando el script de "Análisis de ensayo de la isla". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplos de diversos ajustes requeridos durante el protocolo de. (A) la estructura de directorios en que isla se almacenarán experimentos de análisis procesamiento de datos y análisis. (B) cuando se ajusta la configuración de vídeo, deben aparecer moscas negro sobre un fondo blanco. (C) marco de la imagen los archivos de salidacomo salvada por el software de grabación de imágenes descrito en este manuscrito. (D) el amarillo contorno muestra la selección de la plataforma. La selección de la plataforma almacenados en el "Administrador de ROI" está resaltada en azul. Moscas (E) se representan como puntos blancos durante el ajuste de la "mosca tamaño mínimo ajuste." La ventana resultados muestra el área de las moscas en píxeles. (F) ejemplo de un marco de imagen grabada (a la izquierda) y el bastidor correspondiente en la pila de imagen resultante, obtenido con la macro "Ensayo de la isla deDrosophila" (a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultado imágenes obtenidas después de procesar los datos con el texto "Análisis de ensayo de la isla" Línea (A) gráfico que muestra la respuesta de escape de vuelo para cada control repetición experimental. (B) línea gráfico que muestra la respuesta de escape de vuelo para cada repetición experimental tefu ARNi. (C) respuesta de escape de vuelo promedio para las condiciones experimentales indicadas; las barras de error representan las parcelas de SEM. (D) punto que representa el área bajo la curva de distribución para control y condiciones mutantes. Repeticiones experimentales para ambas condiciones tefu ARNi y control se muestran como puntos de datos individuales (en negro) con medias (línea roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ubicua tefu moscas precipitación muestran una significativa disminución de la capacidad para dejar la plataforma. Los datos representan el porcentaje de moscas en la plataforma con el tiempo (s) de control (w–; Actin-Gal4/+) y tefu RNAi (w–; Actin-Gal4/GD11950) vuela. (número de repeticiones = 5; las barras de error representan el SEM). (A) datos brutos obtenidos con la macro "Ensayo de Isla delDrosophila" . Punto (B) parcelas que representa el área bajo la distribución de la curva para control y tefu ARNi condiciones obtenidas con la macro "Ensayo de la isla deDrosophila" (Welch desapareado t-test, ** p < 0.01). (C) datos brutos obtenidos manualmente contando el número de moscas presentes en la isla por segundo. (D) punto parcelas que representa el área bajo la curva de distribución para control y Tefu RNAi condiciones obtenidas por conteo de mano (Welch desapareado t-test, ** p < 0.01). Las barras de error representan el SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la columna | Descripción | ||
| Slice | Nombre de marco. | ||
| Conde | El número de objetos detectados en el marco dentro de los límites de la plataforma (ROI). | ||
| Área total | Área total de los objetos detectados en el marco dentro de los límites de la plataforma (ROI) en píxeles. | ||
| Tamaño promedio de | Área total de los objetos detectados en el marco dividido por el número de objetos dentro de los límites de la plataforma (ROI). | ||
| % Área | El porcentaje de área ocupada por los objetos con respecto al área total de la plataforma (ROI). | ||
| Perim. | Perímetro total de los objetos detectados en el marco dentro de los límites de la plataforma (ROI) en píxeles. | ||
| Mínimo tamaño de la mosca | La mínima vuelan de ajuste de tamaño definido por el usuario en la interfaz gráfica de la macro"Drosophila isla ensayo" (en píxeles). | ||
| Zona de retorno de la inversión | El área de la plataforma (ROI) definida por el usuario durante la ejecución de la sub-macro definir plataforma (en píxeles). | ||
| Número de moscas | El número de moscas por experimento definido por el usuario en la interfaz gráfica de la macro "Ensayo de Isla delDrosophila" . | ||
Tabla 1: Parámetros medidos por la macro "Ensayo de Isla delDrosophila" . Los parámetros descritos en esta tabla aparecerán en el archivo "resultados.txt" al ejecutar la macro "Ensayo de Isla delDrosophila" .
| Nombre de la columna | Descripción | ||
| Slice | Número de fotograma. | ||
| Conde | El número de moscas en el marco dentro de los límites de la plataforma (ROI). | ||
| X.Area | Área total de las moscas en el marco dentro de los límites de la plataforma (ROI) en píxeles. | ||
| Mínimo tamaño de la mosca | El mínimo volar ajuste de entrada de tamaño definido por el usuario en la interfaz gráfica de la macro"Drosophila isla ensayo" (en píxeles). | ||
| Zona de retorno de la inversión | El área de la plataforma (ROI, en píxeles) definido por el usuario cuando ejecuta la macro sub "define la plataforma". | ||
| Número de moscas | El número de moscas por experimento definido por el usuario en la interfaz gráfica de la macro "Ensayo de Isla delDrosophila" . | ||
| X.Count | % moscas presentes en la plataforma en el respectivo sector/marco en relación con el mayor número de moscas detectada en la plataforma durante el experimento. | ||
| Punto de tiempo | Punto 1 representa la primera imagen a ser analizada y corresponde a la estructura donde las moscas aparecen por primera vez en la plataforma. Hay un total de 100 marcos por repetición analizadas (correspondientes a 10 s, cuando se utiliza la configuración descrita. | ||
| Experimento | Número de repeticiones por condición. | ||
| Condición | Indica el nombre de la condición experimental (según el nombre definido por el usuario de la carpeta que contiene los datos). | ||
Tabla 2: Descripción de las variables obtenidos después de procesar los datos con el texto "Análisis de ensayo de la isla" Los parámetros que se describe en esta tabla aparecen en el archivo "data_all_conditions.csv" al procesar los datos con el script de "Análisis de ensayo de la isla".
Discussion
Este protocolo describe la macro"Drosophila isla ensayo" que evalúa cuantitativamente Drosophila comportamiento motor durante el ensayo de la isla. La macro cuenta con precisión las moscas en la plataforma con el tiempo, haciendo el ensayo de la isla, altamente sensible y adecuado para la evaluación cuantitativa de alto rendimiento de defectos locomotores. La metodología permite la comparación de cualquier condición, con moscas bajo diferentes condiciones genéticas y/o ambientales, incluida la exposición de la droga. Esta lectura es así particularmente útil como herramienta de descubrimiento cuando se realizan grandes pantallas genéticas o la farmacia, al estudiar los modelos Drosophila de trastornos del movimiento y otras enfermedades neurológicas, o al examinar la locomoción o vuelo comportamiento.
El protocolo de ensayo de la isla presentado en este manuscrito ofrece ventajas sobre los métodos existentes y alternativas. Por ejemplo, seguimiento de vídeo locomoción es mucho más lento y menos conveniente para probar los tamaños de muestra grandes. El ensayo de la isla es una herramienta de detección de alto rendimiento y en este sentido, es comparable al análisis rápido geotaxis negativa interactivo (anillo)16. La diferencia entre ambos es que los ensayos de la isla permite la detección de una gama más amplia de problemas del aparato locomotoras; la incapacidad de las moscas para salir de la plataforma puede ser causada por defectos en vuelo, saltando, o caminando comportamiento provocados por el ala (músculo neuronal) o pierna (músculo neuronal) defectos. Por otro lado, el ensayo de anillo evalúa defectos de comportamiento escalar, caminar, causados por defectos de la pierna (músculo neuronal). En caso de que los usuarios están interesados en múltiples lecturas de comportamiento, el análisis de la isla puede combinarse fácilmente con otros ensayos, tales como el ensayo de anillo. Además, láseres para optogenetics pueden instalarse fácilmente en el cuadro de análisis de la isla, y la instalación es tan sencilla que se puede mover fácilmente a una sala donde se pueden controlar la temperatura y la luz.
Para asegurar el éxito y la reproducibilidad del ensayo isla aquí descrito, se deben seguir varias recomendaciones. Alícuota y la transferencia de las moscas a la prueba experimental viales en por lo menos un día antes del experimento para evitar los efectos de CO2 o frío anestesia. No masificar los frascos experimentales (uso moscas 10-15 por el frasco, es mejor hacer siempre el mismo número de moscas por frasco). Mantenga las moscas en los alimentos frescos en todo momento. Si no todavía familiarizado con llevar a cabo el ensayo, práctica lanzando vuela a la plataforma para maximizar el rendimiento. También practicar contrayendo rápidamente la mano derecha luego, como interfiere con el análisis de los datos (análisis de imagen y mosca cuenta Inicio sólo después de que la mano está fuera de la imagen). Mantener las condiciones ambientales y experimentales idénticas en experimentos que deben ser comparados (por ejemplo, controles versus mutantes o un genotipo probaron en diferentes edades). Siempre realizar los experimentos en el mismo momento del día y mantener los frascos en condiciones de humedad y temperatura controlada. Para poder estadístico, la prueba por lo menos tres repeticiones técnicas por repetición biológica.
Para garantizar el desempeño exitoso de la macro se describe aquí, configuración de la webcam y la imagen debe ajustarse para lograr contraste máximo: vuela como objetos negros en una plataforma blanca. Cuando no se cuenta correctamente el número de moscas por la macro, ajuste el contraste, compruebe si el ROI es seleccionado adecuadamente y asegurar que el tamaño de las moscas en la plataforma está por encima del mínimo especificado volar tamaño ajuste (ver paso 8.3 del presente Protocolo). La configuración sólo necesita definirse una vez. Son aplicables a todos los experimentos, como la distancia entre la cámara web y la plataforma no se cambia. La configuración máxima y Circularity_min define la circularidad de las partículas (partículas = contados moscas) que se tomarán en cuenta para el análisis (vuela = contados objetos). 1 representa un círculo perfecto, y 0 representa una línea17. Puesto que las moscas siempre presentan un cierto grado de circularidad (una mosca no puede aparecer como una línea recta), el "Circularity_max" está ajustado en 1 y el "Circularity_min" está ajustado en 0.4. Es poco probable que el usuario necesita modificar estos ajustes.
La macro de vez en cuando comete errores cuentas cuando una mosca se encuentra cerca de la frontera de la plataforma. Esto puede ocurrir si las moscas no pueden volar pero a pie y el retorno de la inversión definida por el usuario. En la mayoría de los casos, volver a seleccionar el ROI (acoplamiento lo más posible a la plataforma) fácilmente puede resolver este problema. Sin embargo, el guión de "Análisis de ensayo de la isla" es capaz de detectar y recuentos de datos incorrecta correcta causaron por moscas caminar dentro y fuera del retorno de la inversión relativamente bien. Aunque la resolución de la webcam aquí presentada es suficientemente alta como para discriminar moscas cerca bastante bien, hemos implementado algoritmos adicionales en el procedimiento de procesamiento de imagen de la macro "Ensayo de la isla deDrosophila" , tales como la Cuenca y erosionar la función17. Estos facilitan la correcta delineación de moscas que se encuentran en las proximidades de la plataforma. Además, la macro es incapaz de distinguir entre moscas que saltaban de la plataforma o volaron lejos de ella. Sin embargo, generalmente se observa que las cepas de mosca joven sanas volar inmediatamente cuando se dejó caer en la plataforma, mientras que más viejas moscas y las moscas con déficit locomotor permanecer más tiempo en la plataforma y finalmente saltar o caer de la plataforma. A pesar de estas limitaciones, el análisis y análisis proporcionan una medida muy exacta del comportamiento locomotor.
Para garantizar el desempeño exitoso de la escritura de "Análisis de ensayo de la isla", el usuario debe asegurarse de que para entrar en las rutas correctas para los archivos de entrada y salidos de las filas de la secuencia de comandos indicados en el protocolo y proporcionar los datos en el formato de la carpeta correcta (como se indica en la figura 2). Si el usuario encuentra los criterios utilizados para filtrar datos experimentales confiables demasiado estrictos (fila 68: el primer valor en la columna "Cuenta" es menor o igual a 5; fila 71: el primer valor en la columna "Cuenta" es mayor que el número total de moscas sobre el p RM + 3), apagar estos ajustes de filtro añadiendo un # al texto en filas 68 y 71 en el guión de "Análisis de ensayo de la isla". En este caso, los conjuntos de datos se incluirán en el análisis. Por otra parte, ajustes de filtro pueden cambiarse ajustando los valores de filas 68 y 71 según las necesidades del usuario. Posibles artefactos en los valores de cuenta en el "resultados.txt" generado por la macro"Drosophila isla ensayo" también se pueden ajustar manualmente, y la secuencia de comandos puede volver a ejecutar en los datos ajustados. Cuando el usuario está interesado en procesar más de 10 fps, o más de 10 s de datos, el número de fotogramas procesados por el guión de "Análisis de ensayo de la isla" debeajustarse. El análisis estadístico también puede sustituirse por alternativas definidas por el usuario.
Una carpeta llamada "Ejemplos isla de ensayo", que contiene ejemplos con imagen-series de tiempo obtenidas mediante el análisis de la isla, se puede encontrar en la siguiente página web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Descargar la carpeta "Ejemplos ensayo de isla" y siga los pasos descritos en este protocolo para rápidamente ser familiarizados con la estructura de almacenamiento de archivos, el procesamiento de las imágenes con la macro "Ensayo de Drosophila Island" y el "Análisis de ensayo de isla" secuencia de comandos.
El ensayo de isla, en combinación con la macro desarrollada y el guión de análisis, puede ser usado para evaluar y cuantificar el comportamiento de movimiento aberrante de un modelo de Drosophila de la Ataxia-Telangiectasia. Puesto que el ensayo se puede aplicar eficientemente a diferentes edades, es idóneo para el análisis de la naturaleza potencialmente progresiva de fenotipos.
En Resumen, el análisis de la isla, en combinación con la macro"Drosophila isla ensayo" y el guión de "Análisis de ensayo de la isla", es un ensayo altamente eficiente, confiable y rentable objetivamente analizar y cuantificar defectos locomotores de Drosophila modelos de trastornos del movimiento en forma de alto rendimiento.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Reconocemos el centro de recursos de Drosophila de Viena y el centro de stock de Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) para proporcionar cepas de Drosophila . Agradecemos al laboratorio Klämbt para introducirnos en el análisis de la isla y Martijn Eidhof para la construcción de la instalación de ensayo de la isla. Este estudio fue en parte apoyado por llamar transnacional conjunta E-raro-3 concesión de "Preparación de terapias para las ataxias recesivas autosomal" preparar (ahora 9003037604), por una beca superior (912-12-109) de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO) y por dos becas DCN/Radboud Universidad médica centro PhD. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
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