Hög genomströmning analys av rörelseapparaten beteende i Drosophila ön analysen

Summary

Ön analysen är en relativt ny, kostnadseffektiv analys som kan användas för att utvärdera grundläggande rörelseapparaten beteendet hos Drosophila melanogaster. Detta manuskript beskrivs algoritmer för automatisk databehandling och objektiv kvantifiering av ön test data, vilket gör detta test en känslig, hög genomströmning avläsning för stora genetiska eller farmakologiska skärmar.

Abstract

Framsteg i nästa generations sekvensering teknik bidra till identifieringen av sjukdomsgener (kandidat) för rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar med ökande hastighet. Men är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa sjukdomar. Genetiska, molekylär och beteendemässiga verktygslådan för Drosophila melanogaster gör denna modellorganism särskilt användbart att karaktärisera nya sjukdomsgener och mekanismer på ett sätt som hög genomströmning. Dock kräver hög genomströmning skärmar effektiva och tillförlitliga analyser som helst är kostnadseffektiva och möjliggöra automatiserade kvantifiering av drag relevanta för dessa sjukdomar. Den ön-analysen är ett kostnadseffektivt och enkelt set-up metod att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. I denna analys kastas flugor på en plattform från en fast höjd. Detta framkallar en medfödd motoriska respons som gör flugorna till fly från plattformen inom sekunder. För närvarande görs kvantitativa analyser av filmade ön analyser manuellt, vilket är ett mödosamt företag, särskilt när du utför stora skärmar.

Detta manuskript beskriver ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” algoritmer för hög genomströmning, automatisk databehandling och kvantifiering av ön assay data. I setup samlar en enkel webbkamera ansluten till en laptop en bild serie av plattformen medan analysen utförs. ”Drosophila ön Assay” algoritmen utvecklades för programvaran öppen källkod Fiji bearbetar dessa bild-serier och kvantifierar, för varje experimentella villkor, antalet flugor på plattform över tid. ”Ön Assay analys” skriptet, förenlig med den fria programvaran R, utvecklades till automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och för att beräkna om behandlingar/genotyper skiljer sig statistiskt. Detta kraftigt förbättrar effektiviteten i ön analysen och gör det en kraftfull avläsning för grundläggande locomotion och flykt beteende. Det kan således tillämpas på stora skärmar undersöker flyga motorisk förmåga, Drosophila modeller av rörelsestörningar och läkemedlet effekt.

Introduction

Under de senaste åren har framsteg inom nästa generations sekvensering teknik i hög grad bidragit till identifiering av gener bakom degenerativa rörelsestörningar av hjärnan (t.ex., cerebellär ataxi och Parkinson), av perifer neuronala ursprung (t.ex. amyotrofisk lateralskleros och hereditär spastisk paraplegi), och av muskulär ursprung (t.ex. Duchennes muskeldystrofi och internationellt dystrofi)^1,2,3,4 . Trots detta är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom de flesta av dessa sjukdomar. En bättre förståelse av dessa mekanismer är viktigt att utveckla terapier.

Som hos människor styrs rörelse i modellorganismer, såsom flyg och förflyttning i Drosophila, av centrala hjärnan, perifera nervsystemet och musklerna. Dessutom gör snabb generationstid och genetiska uppsättning Drosophila denna modellorganism särskilt lämplig för high-throughput screening av gener involverade i rörelsestörningar och för drogtester^5,6 . På grund av det betydande antalet villkor som måste testas i sådana skärmar, pålitlig, kostnadseffektiv, och relativt enkla analyser, samt verktyg för att kvantifiera produktionen resultaten på ett automatiserat sätt, är mycket önskvärda.

Schmidt m.fl. (2012) ⁷ beskrivs en låg kostnad test som kallas ”ön analysen” att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. Ön analysen har använts framgångsrikt i storskaliga filmvisningar för att identifiera gener med glia-specifika funktioner⁷, i utvärderingen av Drosophila modeller av utvecklingsstörning⁸och för den allmänna utvärderingen av flyga motor beteende⁹. Principen om utformningen av ön analysen består av en förhöjd plattform där flera flugor kastas. Detta framkallar en medfödd motoriska beteende som gör att friska flugor att fly från plattformen inom sekunder. Analysen mäter antalet flugor kvar på plattformen över tid^7,8,9. Alla dessa funktioner visar att ön analysen kan vara ett kraftfullt screeningverktyg för genernas rörelsestörningar.

För närvarande, görs kvantitativ analys av filmade ön assay data manuellt^7,8,9. För att förbättra effektiviteten i analysen, utvecklades en billig metod för att kvantifiera halvautomatiskt flykten av flugor från plattformen. Inställningen använder en enkel webbkamera ansluten till en bärbar dator att samla in bild, tid serie av plattformen, med ramar förvärvade varje 0,1 s. bildrutorna behandlas sedan med makrot ”Drosophila ön Assay” som kvantifierar antalet flugor på plattform över tid. Makrot ”Drosophila ön Assay” är uppdelad i tre oberoende sub makron: (I) ”skapa stack och projektion”, sub makro identifierar olika island experiment lagras i olika undermappar och skapar en stack och en projektion av varje tidsserier. (II) ”definiera plattform” sub makro öppnas konsekutivt alla ”Projection_image_name.tif”-filer som finns i enskilda experimentella undermappar, vid vilken punkt ombeds användaren manuellt definiera ön plattformen som regionen av intresse (ROI). (III) ”analys” kvantifierar automatiskt antalet flugor kvar på plattformen under tidsserierna. Sub makron kan köras efter varandra (i en kör) eller självständigt. För statistisk dataanalys utvecklades ett skript automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och tillämpa ett statistiskt test för att avgöra om behandlingar/genotyper beter sig signifikant från varandra (figur 1). Slutligen, är det visat att denna inställning kan användas för att utvärdera och kvantifiera en Drosophila modell för ataxi-telangiektasi (AT) avvikande motorisk förmåga.

Protocol

1. byggandet av rutan ön Assay

1. Förbered en bricka gjord av ett robust material, exempelvis poly polymetylmetakrylat (PMMA), innehåller ett lager av vatten (dvs. badkar). Se till att materialet inte vit.
   Obs: Måtten 40 x 35 x 2,5 cm ³ rekommenderas ( figur 1A).
2. Förbereda en låda (42 x 38 x 25 cm ³) gjord av ett robust, transparenta material, exempelvis PMMA, placeras runt badet att förhindra flugor från att fly in i laboratoriet. Placera ett hål (20 x 30 cm ²) på den laterala sidan som är tillräckligt stort för att försöksledaren att enkelt hantera rören med flugor och släppa dem på ön ( figur 1A).
3. Förbereda en förhöjd plattform 10 x 15 x 2,5 cm ³ i dimension, gjord av ett ogenomträngligt material (PMMA eller plast) som är vattentäta.
   Obs: Denna plattform krävs att ha en enhetlig vit yta att säkerställa bra kontrast för bildanalys. Storleken är inte nödvändigtvis fast, men det bör vara tillräckligt stor för att se till att alla flugor initialt landa på plattformen och får chansen att gå på det ( figur 1A).
4. Fixa plattformen genom antingen limma den i badet eller placera vikter eller andra tunga föremål i rutan plattform att förhindra positionella ändringar av plattformen under experimentell/Filmning sessionen.

2. Krav på programvara och Installation

1. Installation av bild-inspelning programvara.
   1. Ladda ner bild-inspelning programvara registrera ön bild serien (se Material tabell) och installera programvaran på en dator.
      Obs: Den imaging-inspelning programvara som beskrivs i detta protokoll stöds endast av Windows. Ett alternativ för andra användare har lagts till i Material tabell.
2. " Drosophila ön Assay " makro installation.
   1. Ladda ner den " Drosophila ön Assay " makro och Fijis kompatibel ¹⁰ version (1.4 eller högre) från följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Flytta markören till den " ön assay " katalog och klicka på " Se. "
   3. Klicka på " Hämta alla. " innehållet i mappen kommer att laddas ner som en zip-fil, packa upp den nedladdade filen.
   4. Kopia den " Drosophila ön Assay.ijm " fil till " Fiji.app/plugins/directory. "
      Obs: När du startar Fiji, den " Drosophila ön Assay " makro visas längst ned på menyn plugins.
3. " Ön Assay analys " skript installation och ladda ner.
   1. Hämta R ¹¹ från följande webbplats: https://cran.rstudio.com. Installera det på en dator.
   2. Hämta R studio från följande webbplats: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installera det på en dator.
      Obs: Den " ön test analys " skriptet kan köras med R endast. R-studio, med sin enklare användargränssnitt, presenteras som alternativa steg för användare som är oerfarna med R.
   3. Ladda ner den " ön Assay analys " skript från den " Drosophila ön Assay " katalog på följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Obs: när du utför steg 2.2, den " ön Assay analys " script kan också hittas i den uppackade mappen som heter " ön assay. "

3. Beredning av flugorna ska testas i ön analysen

1. samla iscensatt flugor för varje experimentella villkor under förkylning eller koldioxid (CO ₂) anestesi, som tidigare beskrivits ¹³ (under en period av 1 - 2 dagar).
   1. Förbered minst 3 ampuller per experimentella villkor i prov, vardera innehållande ca 15 iscensatt flyger. Använd bara flyger med intakt vingar och som är av liknande ålder och kön.
      Obs: För de experiment som beskrivs här, 5 prov injektionsflaskor innehållande 15 manliga flugor av genotyper w ^-, Aktin-Gal4 / + (kontroll) och w ^-, Aktin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) samlades på dagen för eclosion, åldern för 4 dagar, och användes för att utföra ön analysen. RNAi, kontroll stammar och aktin-gal4 föraren erhölls från en kommersiell källa (se Material tabell).
2. Låt flugorna återställa för att undvika effekter från anestetika (minst 1 dag när CO ₂) innan du testar de insamlade flugorna i ön analysen vid en ålder av intresse.

4. experimentell Setup

Obs: se figur 1B.

1. Lägga till kallvatten med en liten mängd tvål till bad facket och placera plattformen i mitten.
   Obs: Tvål minskar ytspänningen i vattnet. flugor som rör vattnet kommer att drunkna. Detta förhindrar ökande mängder av flugor som flyger i rutan under utvecklingen av den experimentella sessionen.
2. De transparenta ovanpå facket och belysa plattformen från ovan med hjälp av en lampa.
   Obs: Belysning av plattformen krävs främst att säkerställa korrekt Videokontrast. En vanlig 12 V LED-ljus är lämpligt för detta.
3. Placera webbkameran direkt ovanför plattformen (utanför rutan) och Anslut den till en dator.
4. Skapa nya mappar på datorn för att lagra olika experimentella data innan experimenten.
   1. Följ strukturen i exemplet illustreras i figur 2A för att skapa mappar. Till exempel om experimentell design kräver provning två genotyper med fem replikat varje, först skapa en huvudmapp som innehåller datum för experimentet. Inuti huvudmappen, skapa två undermappar (en per genotyp). Inuti den genotyp mappar, skapa fem nya undermappar, en per replikat.
      Obs: För vidare analys, är det viktigt att bilden serien motsvarar enskilda experiment sparas i mappar med unika namn.

5. Video inställningar Setup i den " Capture Device " avsnitt av gränssnittet

1. Öppna bild-inspelningsprogrammet och, under den " Capture " tab, klick på " Time-Lapse bilder … " och välj lämplig webbkameran som den " Fånga enhet. "
2. Placera en död fluga på ön; justera videoinställningar genom att klicka på den " videoinställningar " rutan. Bläddra igenom verktygshållarna, justera ljusstyrka, kontrast, och färg på ett sätt så att döda flugan visas svart på en vit bakgrund ( figur 2B). Klicka på när justeringarna är komplett, " Ok. "

6. Inspelningen och spara inställningar Videoinst i den " Time-lapse " avsnitt av gränssnittet

< ol>

Justera inställningarna i den " Time-Lapse film Setup " Spara experimentet som en AVI-fil. Klicka på " Titta igenom …, " Välj katalogen där filmen ska lagras, definiera namnet på video, och tryck på " Spara. "
Obs: videofilen inte används för kvantifiering av data, men det kan vara nyttigt att få en övergripande uppfattning Om experimentet.

Justera inställningarna i den " Time-Lapse film Setup " avsnitt.

1. Komprimering i rutan Välj " Intel IYUV kod " för videokomprimering och välja " ta en bildruta varje 0,1 sekunder, " med den " uppspelning hastighet (bilder per sekund): " 10.
2. Spara experiment tidsserien som .bmp ramar genom att klicka på " Avancerat … " Välj " skapa en BMP-bild för varje fångat ram. " Klicka på " Bläddra. " Välj samma katalog i den " under AVI movie capture " fönster (som som valts i steg 6.1) Klicka " öppen, " och tryck på " Ok. "
   Obs: märker att under experimentet, lagras ramarna som .bmp-filer (krävs för dataanalys). Programmet namn ramar som " A " följt av den siffra som motsvarar sekvensen frame capture (t.ex. " A_number.bmp ") ( figur 2 c). Spara alltid bilderna tillhör olika experiment i en ny mapp för att säkerställa att tidigare inspelade bilden serien inte kommer att skrivas över. Tänk på att bilderna inte sparas automatiskt i samma mapp som videofilen om mappen är markerad under " bläddra … " när du klickar på den " Avancerat " låda.

7. Ön analys och insamling av Data

1. Tryck på startknappen i gränssnittet time-lapse bild av programvaran image-inspelning för att starta inspelningen.
2. Tryck på experimentell injektionsflaskan med flugor (steg 3) 2 - 3 gånger så att flugorna är på botten av injektionsflaskan. Snabbt ta bort pluggen på injektionsflaskan och, med en kraftig rörelse, knacka på injektionsflaskan på plattformen så att alla flugor falla på plattformen samtidigt ( figur 1 c).
3. Efter cirka 30 s, tryck på den " stoppa " knappen för att stoppa inspelningen.
   Obs: Om alla flugor försvinna från plattformen, inspelningen stoppas tidigare.
4. Ta bort flugorna som återstår för 30 s på plattformen för hand efter avslutad bildinspelningen.
5. Innan du fortsätter att spela in nästa experimentet, ändra målkatalog för .bmp-filer och filmer (anges i avsnitt 6).

8. Databearbetning: Kör den " Drosophila ön Assay " makro

Obs: se figur 1 d.

1. Kör den " skapa stack och projektion " sub makro jag producera stackar och projektioner av insamlade bild serien.
   1. Start Fiji, klicka på " Plugins " i verktygsfältet, och valde " Drosophila ön Assay " på menyn, ett nytt fönster visas.
   2. RETUR den " första bilden tidsserier identifierare " inställning i det grafiska gränssnittet i makrot.
      Obs: De inspelade bildrutorna sparas som " A-number.bmp " enligt den ordning som bilderna erhålls. I den " först Rama identifierare " makro gränssnitt, Fyll i inställningen med numret till den första bildrutan i programmet och med filtillägget. Fyll " först Rama identifierare " med "-0001.bmp, " eftersom den första bildrutan kallas " A-0001.bmp " ( figur 2 c). Om andra bildformat (till exempel TIFF eller .jpeg) genereras av webcam-programmet, ange rätt filnamnstillägget för den första bilden i " första bilden tidsserier identifierare. "
   3. Välj endast de " skapa stack och projektion " sub makro, klicka på " Ok, " och välj huvudkatalogen som innehåller alla undermappar med enskilda ön assay experiment.
      Obs: .bmp filerna i varje individ experimentera mapp som innehåller de " först Rama identifierare " kommer därefter att behandlas. Två nya filer visas i varje enskilt experiment undermapp, namnet som standard " Stack_image_name.tif " och " Projection_image_name.tif " ( figur 1 d). När detta steg utförs, kan de .bmp-filerna raderas. Stack och projektion TIF-filer innehåller alla data och räcker för vidare analys.
2. Kör den " definiera plattform " sub makro II till välja den exakta platsen för plattformen.
   1. Öppna det grafiska gränssnittet av den " Drosophila ön Assay, " Välj endast de " definiera plattform " kryssrutan och tryck på " Ok. "
   2. i den " välja en katalog " fönster, Välj huvudkatalogen där experimentell undermappar lagras och tryck på " Välj. "
      Obs: den " definiera plattform " sub makro söker automatiskt efter " Projection_image_name.tif " filer i alla undermappar lagras i katalogen. Den " Projection_image_name.tif " bild lagras i den första mappen, tillsammans med två windows — " definiera plattformen " och " ROI manager " — kommer att öppna.
   3. Välj det " Polygon Val " verktyg i verktygsfältet Rita ett urval som matchar den ön plattformen.
      Obs: Det är mycket viktigt att utesluta gränsen av plattformen från urvalet. Se figur 2D.
   4. Väljer du plattformen i den första bilden, klicka på " Lägg till " i den " ROI Manager " fönster, som markerade området ska visas i fönstret ROI manager som en uppsättning värden ( figur 2D). Tryck på " Ok " i den " definiera plattformen " fönster. Makrot kommer att fortsätta till nästa projektionen.
   5. Klicka på siffrorna ( figur 2D) lagras i den " ROI manager " fönster; tidigare urval kommer sedan visas automatiskt i den aktuella bildprojektion.
      Obs: sedan ön plattform sannolikt har samma storlek och placering när experiment utförs i rad (så länge placeringen av webbkamera och ön oförändrade) är det praktiskt att lagra ROI definiera plattformen i den " ROI manager. " av därigenom kommer användaren att spara tid; i kommande prognoser, det är endast nödvändigt att klicka på tillfälligt lagrade valet i ROI chefen.
   6. Om läget för ön har något flyttat jämfört till det tidigare experimentet, justera markeringen genom att vänsterklicka i mitten av markeringen och dra det markerade området till önskad position.
   7. Om valet inte matchar med plattformen, vänsterklicka utanför markeringen och avgränsa ett nytt urval för plattform med den " Polygon urval " verktyg. Lagra den nya markeringen i ROI manager genom att klicka på " Lägg till; " ett nytt urval visas i den " ROI manager " fönster som kan användas kontinuerligt.
   8. När markeringen justeras, klicka " Ok " i den " definiera plattformen " fönster och upprepa proceduren tills alla plattformar definieras.
      Obs: Lägg märke till att en binär bild av plattformen motsvarande det avgränsade ROI-området i vitt på svart bakgrund, heter " Platform_image_name.tif, " visades för varje bearbetade bilden i samma experimentella undermapp som stack och projektion bilder som genereras i steg 8.1.3 ( figur 1 d).
3. Definiera flyga minimistorleken.
   Obs: Den här inställningen definierar minimal flyga storlek i pixlar. Partiklar som är mindre än den angivna minimal storleken kommer att uteslutas från analysen för att undvika falsklarm på grund av buller.
   1. Öppna en bildstapel skapad av den " skapa stack och projektion " sub makro I.
   2. Konvertera bilden stacken till 8-bitars genom att klicka på bilden > > typ > > 8-bitars.
   3. Gå till menyn, tryck på bild > > justera > > tröskel, se till att den " mörk bakgrund " rutan är markerad och tryck på " tillämpas, " ett andra fönster kallas " tröskel " visas. Klicka på " mörka background " och tryck på " Ok. "
      Obs: en binär bild stack kommer att skapas som flugorna definieras i svart och plattformen i vitt. När detta inte är fallet, tillämpas den " Invertera " funktion genom att klicka på Redigera > > Invertera > > köra.
   4. Ställa in skalan för att identifiera antalet pixlar genom att klicka på analysera > > ange skala. Tillämpa följande inställningar: avståndet i pixlar = 1, känt avstånd = 1, pixelproportioner = 1 och enhet av längden = pixel. Tryck på " Ok. "
   5. Välj de " Wand " (spårning) verktyg i verktygsfältet och klicka på en fluga (svart prick) närvarande på plattformen. Tryck på ctrl + m (Windows-användare) eller cmd + m (Mac-användare); en ny " resultat " fönster visar området av den valda platsen i pixlar. Gör detta i följd för flera flugor och bestämma den minsta storleken som flyga.
      Obs: När du kör makrot, ställa den " Minimum flyga storlek " inställning till minsta observerade flyga storlek minus en marginal på 10%. ( figur 2E).
4. Kör den " analysen " sub makro III att kvantifiera flyger flyr från plattformen.
   1. Gå till verktygsfältet, Välj " Plugins, " och valde den " Drosophila ön Assay. "
   2. Justera den " Minimum flyga storlek " inställning enligt värdet som definieras i steg 8,3.
      Obs: Användning värdet som definieras i steg 8,3 endast om inställningen standard av " Minimum flyga storlek " medför uteslutning av flugor som var närvarande på plattformen eller om makrot upptäcker bakgrund signal som flugor.
   3. i de " antal flugor per injektionsflaska " inställning, fyll det maximala antalet flugor i injektionsflaskorna under hela experimentet. Till exempel, om ett experiment har injektionsflaskor innehållande 15 flugor, andra som innehåller 20 flugor, och andra som innehåller 23 flugor, de " antal flugor per injektionsflaska " måste anges som 23.
   4. Välj det " analysera " kryssrutan och tryck " Ok; " en ny " välja en katalog " fönster visas. Välj huvudkatalogen (med alla undermappar och filer inuti) och tryck på " Välj. "
      Obs: makrot kommer att analysera alla bilder lagras i undermappar så länge de innehåller den " stack_image_name, " " Projection_image_name, " och " Platform_image_name " filer. Makrot kommer att bearbeta bild efter bild. Makro utdata består av en binär bild av resultatstacken som heter “ result_stack_subfolder_name.tif ” och ett resultat textfil som heter " result_subfolder_name.txt, " som visas i varje data mapp. den resulterande textfilen (.txt) innehåller kvantitativa mätningar motsvarar bilden stack och består av 9 kolumner. Innehållet i dessa kolumner sammanfattas i tabell 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " motsvarar bild-tidsserierna för ett experiment, där flugor som upptäckts under experimentet visas som svarta prickar på vit bakgrund ( figur 1E).
   5. Inspektera noggrant resultatstacken för att säkerställa att inga artefakter har inträffat och att makrot arbetat korrekt ( figur 2F).
      Obs: Exempel på artefakter kan bildelement som inte flyger men som identifieras som sådan av den bild segmentering algoritmen (falskt positiva). Det kan till exempel vara på grund av upptäckt av bakgrund signal på grund av en felaktig urval av ROI.

9. Data analys med " ön Assay analys "

1. struktur data som anges i figur 2A för analys med den " ön Assay analys " skript. Generera en huvudkatalog med undermappar, där varje undermapp motsvarar ett experimentella villkor ska analyseras.
2. i undermappar, skapa mappar som innehåller replikerar den oberoende experimentella ( figur 2A) och resultat.txt filer produceras av den " Drosophila ön assay " makro.
   Obs: Den " ön Assay analys " makro kommer att bearbeta alla experimentella villkor som finns i katalogen på en gång.
3. Börja R eller R studio. Klicka på filen > > öppna filen … i verktygsfältet och välj den " ön Assay analys " script.
   1. Installera den ggplot2 och matrixStats paket när du kör den " ön Assay analys " skript för första gången. Skriv följande i fönstret:
      > install.packages("ggplot2"), ange
      > install.packages("matrixStats"), ange.
4. Ange platsen för data och analys utdata filer i skriptet. Infoga följande skript rader:
   1. rad 16: Infoga sökvägen till katalogen som innehåller de experiment för att analyseras och jämförs (i figur 2A, detta är sökvägen till den " ön Assay " mappen).
   2. Rad 19: Infoga sökvägen till den mapp där analys utdatafiler är lagrade.
      Obs: Katalogen som anges i rad 16 kan endast innehålla mappar att analyseras. Skriptet också inte fungerar ordentligt om stigarna in i rad 16 och rad 19 är detsamma.
5. Kör skriptet genom att klicka på kod > > kör Region > > kör allt från verktygsfältet.
   Obs: Observera att tre resulterande CSV-filer och en resulterande txt-fil ( figur 1E) visas i den katalog som anges i rad 19. Dessa är: (I) den " data_all_conditions.csv " filen innehåller de behandlade uppgifterna motsvarar varje experimentella villkor och experimentella replikat, organiserade som beskrivs i tabell 2. (II) " statistik summary.csv " fil sammanfattar medelvärdet, standardavvikelsen (SD) och standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av procent av flugor på plattformen för varje experimentella villkor. (III) " AUC.csv " filen innehåller arean under kurvan för varje experimentella replikat. (IV) beroende på antalet villkor i huvudmappen, skriptet kommer antingen exportera en " Welch_t-test_results.txt " fil (2 villkor) eller en " AUC_anova_results.txt " fil (mer än 2 villkorar), där resultaten av t-test eller ANOVA jämföra arean under kurvan mellan experimentella förhållanden anges. Tillkännagivande som fyra olika typer av TIFF-bildfiler ( figur 1E) visas i banan som definieras i rad 19. Dessa kallas: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (där Name_Of_Data_Folder representerar namnet på mappen som anges av användaren), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " och " AUC_anova.tiff. " detaljerad information om innehållet i dessa diagram kan hittas i representant resultaten av detta manuskript och i figur 3.

Representative Results

I protokollet beskrivs, Drosophila ön assay data förvärvas och bearbetas i tre steg. Det första flyg flykt svar Drosophila kastas på ön plattformen registreras med en webbkamera och lagras som enskilda .bmp bilder (protokoll avsnitt 1-7). Det andra bearbetar makrot ”Drosophila ön Assay” (steg 8) de ramar, genererar en ”result.txt” textfil (tabell 1), där summeras antalet objekt som upptäcks i varje bildruta, och en bildstapel ”Result_stack.tiff”, som visar de objekt som upptäcks inom plattformen i varje bildruta. Det tredje bearbetar skriptet ”ön Assay analys” (avsnitt 9 protocol) de makrodata som lagras i filerna ”resultat.txt” individuella experiment. Flera steg införlivas i skriptet att filtrera och kombinera data för statistisk analys. Den första bildrutan där flugorna kastas på plattformen upptäcks och anses som tidpunkt 1. Tidigare ramar elimineras från datamängden. 100 bildrutor efter tid punkt 1 (motsvarande 10 s) väljs för analys. Experiment där det ursprungliga antalet flugor upptäcks på plattformen är mindre än 5 är automatiskt undantagna från analysen, eliminera otillförlitliga resultat från underpowered experiment. Experiment där det ursprungliga antalet flugor upptäcks på plattformen överskrider inställningen ”antal flugor per injektionsflaska” plus en tolerans på 3 undantas också. Detta eliminerar datauppsättningar där buller identifierades felaktigt partiklar som flugor. Skriptet beräknar sedan andelen flugor upptäckts för varje tidpunkt jämfört med det högsta antalet flugor som upptäckts i serien. Fel i datamängder som orsakas av flugor som går in och ut ur ROI (upptäcks som en minskning följt av en ökning av andelen flugor på plattform över tid) rättas automatiskt av om dem som ständigt närvarande på plattformen i tidigare skeden . Alla replikera datamängder för ett visst experimentella villkor som var närvarande i huvudkatalogen kombineras och exporteras till filen ”data_all_conditions.csv”. Dess kolumnerna representerar de variabler som beskrivs i tabell 2. Skriptet kommer också exportera ett linjediagram för varje experimentella villkor, namnges enligt den mapp som innehåller data. Denna graf visar procent av flugor kvar på plattformen över tiden (flykt escape svar) för den experimentella replikerar finns i mappen respektive ()figur 3A-B). Det menar, SD, och SEM för varje experimentella villkor beräknas och summeras i filen ”statistik summary.csv”. Ett linjediagram som kallas ”Escape_response_all_conditions.tiff” visar den genomsnittliga flykt escape Svaren för upp till 12 experimentella villkor i huvudmappen ()figur 3 c). Slutligen, arean under kurvan för alla experimentella förhållanden i huvudmappen beräknas och summeras i filen ”AUC.csv”. Beroende på antalet villkor i huvudmappen, kommer skriptet antingen utföra ett tvåsidiga oparade Welch t-test (2 villkor) eller en ANOVA med Tukey korrigering för flera test (mer än 2 villkor) för att avgöra huruvida de experimentella förutsättningarna skiljer sig avsevärt från varandra. Dessa resultat sammanfattas i ”Welch_t-test_results.txt” eller ”AUC_anova_results.txt”. När du utför ANOVA, kommer skriptet också exportera en ”AUC_anova.tiff”-fil som visar skillnaden i genomsnittlig AUC och 95% konfidensintervallen de experimentella betingelser som jämförs. Värdena för absoluta arean under kurvan för de experimentella replikat för alla experimentella förhållanden visas som enskilda datapunkter med medianer i ”AUC.tiff” (figur 3D).

Ataxia Telangiectasia (AT) är en autosomalt recessiv rörelse sjukdom som kännetecknas av tidig debut av cerebellär ataxi på grund av mutationer i genen Ataxia Telangiectasia muterat (ATM)¹⁴. Mutanter av den Drosophila orthologue av ATM, tefu, Visa defekter i rörlighet och livslängd¹⁵. Utvärdera makrot ”Drosophila ön Assay”, en Drosophila modell at testades i ön analys och data utdata för makrot var jämfört med manuell data räknar. Resultaten visar att allestädes närvarande tefu knockdown (w^-, Actin-Gal4/GD11950) avsevärt minskar möjligheten för dessa flugor att lämna plattformen jämfört med deras genetiska bakgrund kontroller (w^-, Actin-Gal4/+) ()figur 4). Efter 1 s, 50% av kontroll flugorna hade undgått plattformen, i kontrast till den < 1% av tefu- RNAi flugor. Allt data som erhållits med makrot troget återges uppgifter som erhållits av manuell räknar, som anger att makrot är ett pålitligt verktyg som kan användas för kvantifiering av ön assay data och utvärdering av rörelse fel ( ) Figur 4 A-B).

Figur 1: flödesschema beskriver de krav, experimentell förfarande och analys av ön analysens. (A) ö assay utrustning. (B) experiment för ön analysen. (C) ön assay. (D) behandlingen av ön assay uppgifter med makrot ”Drosophila ön Assay”. Makrot ”Drosophila ön Assay” består av 3 sub makron: 1) göra stack och projektion, 2) definiera plattform och 3) analys. (E) bearbetning och statistisk utvärdering av data med hjälp av skriptet ”ön Assay analys”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: exempel på olika justeringar som krävs under protokollet. (A) önskad katalogstruktur i vilken ö assay experiment måste lagras för databehandling och analys. (B) när du justerar inställningarna för video, flugor måste visas svart på en vit bakgrund. (C) bildram utdatafilersom sparats av den bild-inspelning programvara som beskrivs i detta manuskript. (D), gula disposition visar de val av plattform. Lagrade plattform valet i ”ROI Manager” markeras i blått. (E) flugor är representerade som vita prickar under justering av den ”minsta flyga storlek inställningen”. Resultatfönstret visar området Flugornas i pixlar. (F) exempel på en enda inspelade bildram (till vänster) och den motsvarande ram i den resulterande bilden stack, erhålls med makrot ”Drosophila ön Assay” (på rätten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: resultat bilder erhålls efter databehandling med ”ön Assay analys” script. (A) linje diagram som visar den flykt escape Svaren för varje kontroll experimentella replikera. (B) linje graf visar den flykt escape Svaren för varje tefu RNAi experimentella replikat. (C) genomsnittliga flykt escape svar för angivna experimentella förhållanden; felstaplar representera SEM. (D) Dot tomterna som representerar området under kurvan fördelningen för kontroll och muterade villkor. Experimentell replikat för båda tefu RNAi och kontroll villkor visas som enskilda datapunkter (i svart) med medianer (röda linjen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Allestädes närvarande tefu knockdown flugor visar en betydligt minskad förmåga att lämna plattformen. Data representerar procenten av flugor på plattformen över tid (s) för kontroll (w^-, Actin-Gal4/+) och tefu RNAi (w^-, Actin-Gal4/GD11950) flyger. (antal replikat = 5; felstaplar representera SEM). (A) rå data som erhållits med makrot ”Drosophila ön Assay”. (B) Dot tomter som representerar arean under den kurva distributionen för kontroll och tefu RNAi villkor som erhålls med makrot ”Drosophila ön Assay” (Welch oparade t-test, ** p < 0,01). (C) Raw-data som erhållits genom manuellt räkna antalet flugor närvarande på ön per sekund. (D) Dot tomter som representerar arean under den kurva distributionen för kontroll och Tefu RNAi-villkor som erhålls genom att hand-räkna (Welch oparade t-test, ** p < 0,01). Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kolumnnamn	Beskrivning
Skiva	Ramnamn.
Greve	Antalet objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI).
Total yta	Total yta på de objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.
Genomsnittlig storlek	Total yta på de objekt som upptäcks i ramen dividerat med antalet objekt inom ramen för plattformen (ROI).
% Område	Andelen areal som upptas av objekt med avseende på den totala arealen av plattformen (ROI).
Perim.	Totala omkretsen av de objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.
Min. flyga storlek	Minst flyga inställning definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay” (i bildpunkter).
Området ROI	Området av plattformen (ROI) definieras av användaren under körningen av makrot sub definiera plattform (i bildpunkter).
Antal flugor	Antal flugor som används per experiment som definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay”.

Tabell 1: Parametrar mäts av makrot ”Drosophila ön Assay”. De parametrar som beskrivs i den här tabellen visas i filen ”resultat.txt” vid kör makrot ”Drosophila ön Assay”.

Kolumnnamn	Beskrivning
Skiva	Bildrutenummer.
Greve	Antal flugor som identifieras i ramen inom ramen för plattformen (ROI).
X.Area	Total yta på de flugor som identifieras i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.
Min. flyga storlek	Minst flyga posten inställning definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay” (i bildpunkter).
Området ROI	Området av plattformen (ROI, i pixlar) definieras av användaren när du kör makrot sub ”definiera plattform”.
Antal flugor	Antal flugor som används per experiment som definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay”.
X.Count	% flyger närvarande på plattformen i respektive segment/ramen i förhållande till det högsta antalet flugor upptäcks på plattformen under experimentet.
Tidpunkt för	Tidpunkt 1 representerar den första bildrutan som analyseras och motsvarar ramen där flugorna först visas på plattformen. Det finns totalt 100 bildrutor per replikat analyseras (motsvarande 10 s, när de beskrivna inställningarna.
Experiment	Antal replikat per tillstånd.
Villkor	Anger namnet på det experimentella villkoret (enligt användardefinierade namnet på mappen som innehåller data).

Tabell 2: Beskrivning av variabler erhålls efter behandling av uppgifterna med ”ön Assay analys” script. De parametrar som beskrivs i den här tabellen visas i filen ”data_all_conditions.csv” vid databehandlingen med skriptet ”ön Assay analys”.

Discussion

Det här protokollet beskriver makrot ”Drosophila ön Assay”, som kvantitativt bedömer Drosophila motoriska beteende under ön analysen. Makrot räknar exakt flugorna på plattformen över tid, vilket gör ön analysen mycket känsliga och lämpar sig för kvantitativa hög genomströmning utvärdering av rörelseapparaten defekter. Metoden möjliggör jämförelse av alla tillstånd, med flugor som odlas under olika genetiska och/eller miljömässiga förhållanden, inklusive läkemedelsexponering. Denna avläsning är således särskilt användbar som upptäckt verktyg när du utför stora genetiska eller farmaceutiska skärmar, när man studerar Drosophila modeller av rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar eller vid prövningen av förflyttning eller flyg beteende.

Protokollet ön analys presenteras i detta manuskript har fördelar jämfört med befintliga/alternativa metoder. Video-tracking locomotion är exempelvis mycket mer tidskrävande och mindre lämplig för att testa stora urvalsstorlekar. Ön analysen är en high-throughput screeningverktyg, och i denna mening, är jämförbar med den snabba interaktiva negativa geotaxis (RING) assay¹⁶. Skillnaden mellan två är att ön analyserna möjliggör upptäckt av ett bredare spektrum av rörelseapparaten problem; flugor oförmåga att lämna plattformen kan orsakas av defekter i flykt, hoppning, eller promenader beteende orsakas av wing (muskel/neuronala) och/eller ben (muskel/neuronala) defekter. Däremot, bedömer RING analysen defekter i klättring/vandring beteende orsakas av benet (muskel/neuronala) defekter. Om användare är intresserad av flera behavioral utläsningar, kan ön analysen också lätt kombineras med andra analyser, såsom RING analysen. Dessutom lasrar krävs för optogenetik kan enkelt installeras i rutan ön assay, och installationen är så enkel att den enkelt kan flyttas till ett rum där temperatur och ljus kan kontrolleras.

För att säkerställa framgång och reproducerbarhet av ön analysen beskrivs här, bör flera rekommendationer följas. Delprov och överföring flugorna på experimental prov injektionsflaskor på minst en dag innan experimentet att undvika effekterna av CO₂ eller kalla anestesi. Inte överbefolka de experimentella injektionsflaskorna (Använd 10-15 flugor per injektionsflaska, är det bäst att placera alltid samma antal flugor per injektionsflaska). Hålla flugorna på färsk mat hela tiden. Om inte ännu bekant med genomför analysen, praktiken kasta flyger in på plattformen för att maximera avkastningen. Även öva snabbt Upprullningskraften handen rätt efteråt, eftersom det stör dataanalys (bildanalys och flyga räknar start först efter handen är ute ur bilden). Hålla de miljömässiga och experimentella förhållandena identiska i experiment som behöver jämföras (t.ex. kontroller kontra mutanter eller en genotyp testad vid olika åldrar). Alltid utföra experimenten vid samma tid på dagen och underhålla injektionsflaskorna under kontrollerad temperatur och luftfuktighet. För statistisk power, testa minst tre tekniska replikat per biologiska replikat.

Att säkerställa att framgångsrika på det makro som beskrivs här, Webbkamera och bildinställningarna måste justeras för att uppnå maximal kontrast: flugor som visas som svarta objekt på en vit plattform. När antalet flugor inte räknas korrekt av makrot, justera kontrastinställningarna för, om ROI är ordentligt markerad och säkerställa att storleken på flugorna på plattformen är ovan angivna minsta flyga storlek inställning (se steg 8,3 i detta protokoll). Inställningarna behöver bara definieras en gång. De är tillämpliga på alla experiment, så länge som avståndet mellan webbkameran och plattformen inte ändras. Den Circularity_min och max inställningar definierar loopkontroll av partiklarna (partiklar = räknade flugor) som kommer att beaktas för analys (flyger = räknade objekt). 1 representerar en perfekt cirkel och 0 representerar en linje¹⁷. Eftersom flugorna medför alltid en viss grad av rörlighet i båda riktningarna (en fluga inte kan visas som en rak linje), den ”Circularity_max”-inställningen är inställd på 1 och inställningen ”Circularity_min” är inställd på 0,4. Det är osannolikt att användaren behöver justera dessa inställningar.

Makrot gör ibland räkna misstag när en fluga ligger nära gränsen till plattformen. Detta kan inträffa om flugor inte kan flyga men promenad och ur den användardefinierade ROI. I de flesta fall kan förnyad markering ROI (montering det så mycket som möjligt till plattformen) enkelt lösa problemet. Dock ”ön Assay analys” skriptet är kan upptäcka och rätta felaktig data räknar orsakas av flugor som går in och ut ur ROI relativt väl. Även om resolutionen av den webbkamera som presenteras här är tillräckligt hög för att diskriminera flugor i närheten ganska väl, vi har infört ytterligare algoritmer i förfarandet bild bearbetning av ”Drosophila ön Assay” makrot, såsom den vattendelare och urholka funktion¹⁷. Dessa underlättar korrekt avgränsningen av flugor som finns i närheten på plattformen. Makrot är dessutom inte kan skilja mellan flugor som hoppade från plattformen eller flög bort från den. Det är dock allmänt observerats att friska unga flyga stammar flyga bort omedelbart när släpps på plattformen, medan äldre flugor och flugor med rörelseapparaten underskott finns kvar längre på plattformen, och kommer så småningom hoppa eller falla av plattformen. Trots dessa begränsningar ger den analys och analys ett mycket exakt mått på rörelseapparaten beteende.

För att säkerställa lyckade utförandet av skriptet ”ön Assay analys”, har användaren att se till att ange rätt sökvägar för input och output filer i skriptet rader anges i protokollet och tillhandahålla data i formatet rätt mapp (som anges i figur 2). Om användaren finner de kriterier som används för att filtrera ut opålitliga experimentella data för stränga (rad 68: det första värdet i kolumnen ”räknas” är mindre än eller lika med 5; rad 71: det första värdet i kolumnen ”antal” är högre än det totala antalet flugor kastas på plat RM + 3), Stäng av dessa filterinställningar genom att lägga till en # framför texten i rader 68 och 71 i skriptet ”ön Assay analys”. I detta fall inkluderas alla datamängder i analysen. Alternativt kan filterinställningarna ändras genom att justera värdena i raderna 68 och 71 enligt användarnas behov. Möjliga artefakter i räknas värdena i den ”resultat.txt” genereras av makrot ”Drosophila ön Assay” kan också justeras manuellt, och skriptet kan köras igen på justerade data. När användaren är intresserad bearbetning mer än 10 fps, eller mer än 10 s data, antalet ramar som bearbetas av skriptet ”ön Assay analys” börjusteras. Den statistiska analysen kan också ersättas av användardefinierade alternativ.

En mapp som heter ”exempel på ön Assay”, som innehåller exempel med bild tidsserier erhålls med ön analys, kan hittas på följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Ladda ner mappen ”exempel på ön Assay” och följ stegen som beskrivs i detta protokoll för att snabbt bli förtrogna med strukturera av fillagring, bearbetning av bilder med makrot ”Drosophila ön assay”, och ”ön Assay analys” skriptet.

Ön analysen, kan i kombination med den utvecklade makro och analys script, användas för att utvärdera och kvantifiera avvikande rörelse beteendet hos en Drosophila modell av ataxi-telangiektasi. Eftersom analysen kan tillämpas effektivt på olika åldrar, är det väl lämpad att analysera potentiellt progressiva natur av fenotyper.

Sammanfattningsvis är ön analysen, i kombination med makrot ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” skriptet, en kostnadseffektiv, tillförlitlig och mycket effektiv analys att objektivt analysera och kvantifiera rörelseapparaten defekter i Drosophila modeller av rörelsestörningar på ett sätt som hög genomströmning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com