Summary
Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.
Abstract
Yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler (aday) hastalık genleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların artan bir hızda tanımlaması katkıda bulunur. Ancak, bu bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Drosophila melanogaster genetik, moleküler ve davranışsal araç bu model organizma yeni hastalık genler ve mekanizmaları bir yüksek-den geçerek şekilde karakterize etmek özellikle kullanışlıdır. Yine de, yüksek üretilen iş ekranlar bu, ideal olarak, düşük maliyetli ve özellikleri automatized miktar için bu bozuklukları için ilgili izin verimli ve güvenilir deneyleri gerektirir. Ada tahlil bir maliyet-etkin olduğunu ve kolayca kurulum yöntemi Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Bu tahlil, sinekler bir platform üzerine sabit bir yükseklikten atılır. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sinek sağlar doğuştan gelen bir motor yanıt neden olmaktadır. Şu anda, kantitatif analiz filme Adası deneyleri el ile özellikle büyük ekran gerçekleştirirken zahmetli bir girişim olduğu yapılır.
Bu el yazması"Drosophila Adası tahlil" ve "Ada tahlil analiz" algoritmaları yüksek üretilen iş, otomatik bilgi işlem ve ada tahlil veri miktar için açıklar. Tahlil yapılır iken kurulumunda bir laptop için bağlı basit bir web kamerası bir görüntü serisi platformu toplar. Açık kaynak yazılım Fiji için geliştirilen"Drosophila Adası tahlil" algoritması bu görüntü serisi işler ve quantifies, deneysel her koşul için sinekler zamanla platformda sayısı. R, özgür yazılımla uyumlu "Ada tahlil analiz" komut dosyası, otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip istatistiksel olarak farklı olup hesaplamak için geliştirilmiştir. Bu büyük ölçüde Adası tahlil verimliliğini artırır ve temel hareket ve uçuş davranış için güçlü bir okuma yapar. Böylece sinek Lokomotor yeteneği, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve ilaç etkinliğini araştıran büyük ekranlara uygulanabilir.
Introduction
Son yıllarda, yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler büyük ölçüde dejeneratif hareket bozuklukları beyin (Örneğin, serebellar ataksi ve Parkinson), periferik nöronal, altta yatan genlerin tanımlaması için katkıda bulunmuştur Kaynak (Örneğin, amyotrofik lateral skleroz ve herediter Spastik parapleji) ve kas kökenli (Örneğin, Duchenne kas distrofisi ve miyotonik Distrofi)1,2,3,4 . Buna rağmen bu bozuklukların çoğunun altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Bu mekanizmalar daha iyi anlaşılmasını tedaviler geliştirmek için önemlidir.
İnsanlar olduğu gibi canlılar, uçuş ve Drosophila, hareket gibi hareket orta beyin, periferik sinir sistemi ve kas tarafından kontrol edilir. Ayrıca, hızlı oluşturma süresi Drosophila genetik alet bu model organizma genler ile yüksek-den geçerek taranması için özellikle uygun yapmak ilgili ve hareket bozuklukları ve uyuşturucu testi5,6 için . Böyle ekranlar, güvenilir, uygun maliyetli ve göreli basit deneyleri gibi araçlar otomatik bir şekilde çıktı sonuçları ölçmek için test edilebilir için gereken koşulları önemli sayıda nedeniyle, son derece arzu edilir.
Schmidt vd. (2012) 7 açıklanan "ada tahlil" adında bir düşük maliyetli testiniz Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Ada tahlil başarıyla büyük ölçekli gösterimleri glia özgü işlevleri ile7, Drosophila modelleri Fikri Engellilik8ve genel değerlendirilmesi için değerlendirilmesinde genlerin tanımlamak için kullanılmıştır motor davranış9sinek. Ada tahlil ilke tasarımını yükseltilmiş bir platform üzerine birkaç sinek atılır oluşur. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sağlıklı sinek sağlar doğuştan gelen bir motor davranış neden olmaktadır. Tahlil platformda saat7,8,9üzerinde kalan sinek sayısını ölçer. Tüm bu özellikler Adası tahlil hareket bozuklukları ilgili genler için güçlü tarama aracı olabilir gösterir.
Şu anda, kantitatif analiz filme Adası tahlil verilerin el ile7,8,9yapılır. Tahlil verimliliğini artırmak için yarı otomatik olarak sinekler platform kaçış ölçmek için bir düşük maliyetli yöntem geliştirilmiştir. Kur üzerinde sinekler platformunda sayısı quantifies platformu çerçeveler ile dizi s. çerçeveler sonra"Drosophila Adası tahlil" makro ile işlenen her 0.1 alınan görüntü zaman toplamak için bir dizüstü bilgisayar için bağlı basit bir web kamerası kullanır zaman. "Drosophila Adası tahlil" makro üç bağımsız alt makro ayrılmıştır: (I) ve "Create yığını ve projeksiyon," alt makro farklı alt klasörlerinde depolanan farklı ada deneyler tanımlar ve bir yığın ve her bir projeksiyon oluşturur saat serisi. (II "Platformu Define" alt makro arka arkaya bu noktada el ile ada platformu faiz (ROI) bölgesi olarak tanımlamak için kullanıcı talep deneysel alt klasörleri bireysel içinde bulunan tüm "Projection_image_name.tif" dosyaları açılır. (III) "analiz" otomatik olarak saat serisi sırasında platform üzerinde kalan sinek sayısı quantifies. Art arda (bir çalışma) alt makroları çalıştırabilirsiniz veya bağımsız olarak. İstatistiksel veri analizi için bir komut dosyası otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip önemli ölçüde birbirinden farklı (şekil 1) davranır olup olmadığını belirlemek için bir istatistiksel test uygulamak için geliştirilmiştir. Son olarak, bu kurulum değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi (AT) için bir Drosophila model anormal Lokomotor yeteneği ölçmek için kullanılabilir uygulaması gösterilmiştir.
Protocol
1. ada tahlil kutusunun inşaat
- hazırla (Yani banyo) su tabakası içerecek şekilde Poli metil metakrilat (PMMA), gibi sağlam bir malzemeden yapılmış bir tepsi. Malzeme beyaz olmadığından emin olun.
Not: 40 x 35 x 2.5 cm 3 boyutları ( şekil 1A) tavsiye edilir. - Etrafında sinekler laboratuvar uzaya kaçmasını önlemek için banyo yerleştirilmesini PMMA gibi bir sağlam, saydam malzemeden yapılmış bir kutu (42 x 38 x 25 cm 3) hazırlayın. Yan tarafındaki kolayca şişeleri sinekler ile işlemek ve onları adada ( şekil 1A) damla deneyci için yeterince büyük bir delik (20 x 30 cm 2) yerleştirin.
- Hazırlamak 3 boyut, bu su geçirmez bir geçirimsiz (PMMA veya plastik) malzemeden bir yükseltilmiş platform 10 x 15 x 2.5 cm.
Not: Bu platform görüntü analizi için iyi kontrast sağlamak için Tekdüzen bir beyaz yüzey olması gerekir. Boyutu mutlaka sabit değildir, ama tüm sinekler başlangıçta iniş platformu üzerinde ve şans ( şekil 1A) yürümek için emin olmak için yeterince büyük olmalıdır. - Platform içinde banyoya yapıştırma veya platformu pozisyonel değişiklikler deneysel/filme oturumu sırasında önlemek için platform kutusunun içindeki ağırlıkları veya ağır nesneler yerleştirerek sabitleyin.
2. Yazılım gereksinimleri ve yükleme
- görüntü kaydı yazılımının yüklenmesini.
- (Bkz: Malzemeler tablo) Adası görüntü dizi kaydetmek ve bir bilgisayara yazılım yüklemek için download görüntü kayıt yazılımı.
Not: Bu protokol için açıklanan görüntüleme-kayıt yazılımı yalnızca Windows tarafından desteklenir. Diğer kullanıcılar için bir alternatif Malzemeler tablo eklenir.
- (Bkz: Malzemeler tablo) Adası görüntü dizi kaydetmek ve bir bilgisayara yazılım yüklemek için download görüntü kayıt yazılımı.
- " Drosophila Adası tahlil " makro yükleme.
- Download " Drosophila Adası tahlil " makro ve uyumlu Fiji 10 sürümünden (1.4 veya daha yüksek) aşağıdaki Web sitesi: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- İlerletmek " Adası tahlil " dizin ve tıkırtı üstünde " görünümü. "
- Tıklayın " all. Download " klasör içerik bir .zip dosyası olarak yüklenir; indirilen dosyayı unzip.
- Kopya " Drosophila Adası Assay.ijm " içine dosya " Fiji.app/plugins/directory. "
Not: Fiji, yeniden başlatırken " Drosophila Adası tahlil " makro eklentileri açılır menüsünün alt kısmında görünecektir.
- " Ada tahlil analiz " komut dosyası yükleme ve indirme.
- Download R 11 aþaðýdaki Web sitesi: https://cran.rstudio.com. Bir bilgisayara yükleyin.
- Download R studio aşağıdaki Web sitesi: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Bir bilgisayara yükleyin.
Not: " Island testi analiz " komut dosyası çalıştırılabilir R ile sadece. R stüdyo, onun daha kolay kullanıcı arabirimi, R. ile deneyimsiz kullanıcılar için alternatif adım olarak sunulan - Download " Adası tahlil analiz " üzerinden komut dosyası " Drosophila Adası tahlil " dizin aşağıdaki Web sitesi: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
Not: adım 2.2, yaptıktan sonra " Adası tahlil analiz " komut dosyası de denilen unzipped klasöründe bulunabilir " ada tahlil. "
3. Ada tahlil test edilebilir gider hazırlanması
- toplamak olarak yukarıda açıklanan 13 (bir süre içinde sinekler soğuk veya karbondioksit (CO 2) anestezi altında deneysel her koşul için sahnelenen 1 - 2 gün).
- Hazırla 3 en az örnek şişeleri deneysel koşul başına, her biri yaklaşık 15 sahnelenen içeren uçar. Tek Kullanım sinekler sağlam kanatları ve benzer yaş ve cinsiyet vardır.
Not: Burada açıklanan deneyler için 5 örnek şişe içeren 15 erkek sinek genotip w -; Aktin-Gal4 / + (kontrol) ve w -; Aktin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) eclosion, 4 gün boyunca yaşlı gününde toplanmıştır ve ada tahlil gerçekleştirmek için kullanılmıştır. RNAi, kontrol suşları ve aktin-gal4 sürücü bir ticari elde (Malzemeler tablo bakın) kaynak.
- Hazırla 3 en az örnek şişeleri deneysel koşul başına, her biri yaklaşık 15 sahnelenen içeren uçar. Tek Kullanım sinekler sağlam kanatları ve benzer yaş ve cinsiyet vardır.
- Anestezi etkilerinden kaçınmak için kurtarmak sinekler izin (en az 1 gün CO 2 kullanılırken) Adası tahlil ilgi yaşta toplanan sinekler test önce.
4. deneysel kurulum
Not: bkz: şekil 1B.
- Soğuk su küçük bir miktar sabun ile banyo tepsisi ve platform ortasında konumlandırın.
Not: Sabun suyun yüzey gerilimi azalır; su dokunmak sinekler boğulacak. Bu kutuya deneysel oturum ilerlemesi sırasında uçan sinekleri miktarda artan engeller. - Üstünde tepe-in belgili tanımlık tepsi şeffaf kutu yerleştirin ve bir lamba kullanarak yukarıdan platformu aydınlatmak.
Not: Aydınlatma platformu esas olarak uygun video kontrast sağlamak için gereklidir. Sıradan bir 12-V LED ışık bunun için uygundur. - (Dışarıdan) web kamerası tam platform üzerinde konumlandırın ve bir bilgisayara bağlayın.
- Bilgisayarda deneyler önce farklı deneysel verileri depolamak için yeni klasörler oluşturun.
- Takip örnek yapısını klasörleri oluşturmak için şekil 2A gösterildiği. Deneysel tasarım iki genotip ile beş çoğaltır sınama gerektirir, örneğin, ilk deneme tarihini içeren bir ana klasörü oluşturun. Ana klasörünün içinde iki alt klasörler (genotip başına bir adet) oluşturun. Genotip klasörlerde beş yeni alt klasörler, çoğaltma her bir tane oluşturmak.
Not: daha fazla çözümleme için bireysel deneyler için karşılık gelen görüntü serisi klasörler benzersiz adlarla kaydedilir önemlidir.
- Takip örnek yapısını klasörleri oluşturmak için şekil 2A gösterildiği. Deneysel tasarım iki genotip ile beş çoğaltır sınama gerektirir, örneğin, ilk deneme tarihini içeren bir ana klasörü oluşturun. Ana klasörünün içinde iki alt klasörler (genotip başına bir adet) oluşturun. Genotip klasörlerde beş yeni alt klasörler, çoğaltma her bir tane oluşturmak.
5. Video ayarları kurulumunda " yakalama aygıtı " arabirimi bölümünü
- Açık görüntü kayıt yazılımı ve küçük " yakalama " sekmesinde, tıklayın " Time-Lapse görüntüleri … " ve uygun web kamerası olarak seçin " Aygıtı. yakalama "
- ölü bir sinek adada yer; yanında tıkırtı üstünde video ayarlarını " Video ayarları " kutusu. Parlaklık, kontrast, ayarlama araç çubukları ile kaydırma ve öyle ki ölü sinek beyaz bir arka plan üzerinde ( şekil 2B) siyah görünüyor bir şekilde renk. Ayarlar tamamlandığında tıklatın " Tamam. "
6. Kayıt ve Video kaydetme ayarları kurulumunda " hızlandırılmış " arabirimi bölümünü
< ol>Not: video dosyası veri miktar için kullanılmaz; ancak, genel bir fikir edinmek yararlı olabilir denemeyle ilgili.
- Sıkıştırma kutusunda " Intel IYUV kod " için video sıkıştırma ve seçin " 0.1 saniyede bir kare almak " ile " oynatma oranı (saniyede kare): " 10. .Bmp çerçeveleri olarak yanında tıkırtı üstünde deney saat serisi
- kurtarmak " gelişmiş … " seçin " her çerçeve. yakalanan bir .bmp görüntü oluşturma " tıklayın " Gözat. " aynı dizinden seçin " avı sırasında film yakalama " pencere (a.s. Seçilen adım 6.1), tıklayın " açık, " ve basın " Tamam. "
Not: deneme sırasında çerçeveleri (veri analizi için gerekli) .bmp dosyaları olarak depolanır, dikkat edin. Program çerçeveleri olarak adlandırır " A " çerçeve yakalama dizisine karşılık gelen numarayı tarafından takip (Örneğin, " A_number.bmp ") ( şekil 2C). Her zaman önceden kaydedilmiş görüntü serisi yazılmaz emin olmak için yeni bir klasör içinde farklı deneyler ait görüntüleri kaydetmek. Bu klasörün altında seçili olmadıkça görüntüleri otomatik olarak video dosyasıyla aynı klasöre kaydedilmediğine dikkat edin " göz … " üzerine tıklayarak " gelişmiş " kutusu.
7. Ada tahlil ve veri toplama
- Kayýt iþlemini baþlatmak için görüntü kayıt yazılımı hızlandırılmış görüntü arayüzü Başlat düğmesine basın.
- İçeren sinekler (Adım 3) deneysel şişe dokunun 2 - 3 kez sinekler şişe dibinde olduğundan emin olmak için. Hızlı bir şekilde şişe fişini çıkarın ve böylece tüm sinekler platform üzerine aynı anda ( şekil 1 c) ile güçlü bir hareketi, şişeyi platformunda dokunun.
- Yaklaşık 30 s, basın " durdurmak " kaydı durdurmak için düğmesini.
Not: tüm sinekler platformdan kaybolur Eğer kayıt daha önce durdurulabilir. - Kaldırmak için 30 kalır sinekler s görüntü kaydı durdurma sonra elle platformda.
- Sonraki deneme kaydı için devam etmeden önce .bmp dosyalarını ve Film (bakınız Bölüm 6) için hedef dizini değiştirmek.
8. Veri işleme: Çalışan " Drosophila Adası tahlil " makro
Not: bkz: şekil 1 d.
- Çalıştırmak " oluşturmak yığını ve projeksiyon " alt makro ben yığınlar ve projeksiyonlar toplanan resim serisi üretmeye.
- Başlangıç Fiji, tıkırtı üstünde " eklentileri " seçti ve araç " Drosophila Adası tahlil " açılan menüden; yeni pencere-ecek gözükmek.
- Enter " ilk görüntü zaman serileri tanımlayıcı " makro grafik arabiriminde ayarlama.
Not: Kaydedilen görüntü kareleri olarak kaydedilir " A-number.bmp " görüntüleri elde sırasına göre. İçinde " ilk çerçeve tanımlayıcısı " makro arabirimi, dolgu ile ilk kareye program tarafından verilen sayı ve dosya uzantısına sahip bir ortamda. Doldurun " ilk çerçeve tanımlayıcısı " ile "-0001.bmp, " ilk kare aradığından beri " A-0001.bmp " ( şekil 2C). Diğer görüntü biçimleri (örneğin, .tiff veya .jpeg) webcam yazılımı tarafından oluşturulan durumunda, ilk görüntüde doğru dosya uzantısı belirtmek " ilk görüntü zaman serileri tanımlayıcı. " - sadece seçin " oluşturmak yığını ve projeksiyon " alt makro,'ı tıklatın " Ok, " ve bireysel Adası tahlil deneyleri ile tüm alt klasörleri içeren ana dizini seçin.
Not: Her bireyin .bmp dosyaları içeren klasörün deneme " ilk çerçeve tanımlayıcısı " daha sonra işlenir. İki yeni dosyalar her bireysel deneme alt klasöründe görünecektir adlı varsayılan olarak " Stack_image_name.tif " ve " Projection_image_name.tif " ( şekil 1 d). Bu adımı yürütüldükten sonra .bmp dosyaları silinebilir. Yığın ve projeksiyon .tif dosyaları tüm verileri içeren ve daha fazla analiz için yeterlidir.
- Çalıştırmak " platformu Define " platform tam konumunu seçmek için alt makro II.
- Grafik arayüzü açın " Drosophila Adası tahlil, " sadece seçin " tanımla platformu " onay kutusu ve basın " Tamam. "
- içinde " bir dizin seçin " pencere, ana dizini seçin nerede deneysel alt klasörlere depolanır ve basın " seçin. "
Not: " platformu Define " alt makro otomatik olarak arar " Projection_image_name.tif " ana dizinde depolanan tüm alt klasörlerdeki dosyaları. " Projection_image_name.tif " ile birlikte iki pencere ilk klasöründe depolanan görüntü — " platformu Define " ve " ROI Yöneticisi " — açılacak. - Select " çokgen seçim " Adası platformu ile eşleşen bir seçim çizin için araç çubuğundaki araç.
Not: Platform sınır seçimden çıkarmak çok önemlidir. şekil 2B bkz. - Platform ilk resimdeki seçtikten sonra tıklayın " Ekle " içinde " ROI Yöneticisi " window; değerleri ( şekil 2B) kümesi olarak ROI Yöneticisi penceresinde görünür seçili alanı olacak. Basın " Ok " içinde " platformu Define " pencere. Makro sonraki projeksiyon devam edecek.
- Depolanan tıklayın ( şekil 2B) numaraları " ROI Yöneticisi " window; daha sonra otomatik olarak görünür geçerli görüntü projeksiyon önceki seçimi olacak.
Not: beri adanın platformu (webcam ve ada konumunu olduğu sürece değişmeden) üst üste deneyler gerçekleştirildiğinde aynı boyutta ve konumda olma ihtimali, platform tanımlama ROI depolamak yararlıdır " ROI Yöneticisi. " tarafından Bunu yaparken, kullanıcı zaman kazandıracak; yaklaşan projeksiyonları yalnızca ROI Yöneticisi'nde geçici olarak saklı seçimi tıklayın gereklidir. - Adanın konumunu biraz göre önceki deneme götürmüş olsaydı, seçimin konumu seçimi ortasında sağ ve seçili alanı gereken konuma sürükleyerek ayarlayın.
- Seçimi platformu ile eşleşmezse, sol tıklatın seçim dışında ve platformu kullanmak için yeni bir seçim betimlemek " çokgen seçim " aracı. Tıklatarak ROI Yöneticisi'nde yeni seçim depolamak " ekleyin; " yeni bir seçim görünür " ROI Yöneticisi " sürekli olarak kullanılabilir pencere. Seçimi ayarlandığında,
- 'ı tıklatın " Ok " içinde " platformu Define " pencere ve tekrar kadar tüm platformlarda tanımlanmış olan yordamı.
Not: dikkat siyah bir arka plan üzerine beyaz belirlendi ROI alanına karşılık gelen platform ikili bir görüntüsünü adlı " Platform_image_name.tif, " aynı deneysel alt yığın ve projeksiyon olarak işlenmiş her resim için ortaya çıktı görüntüler oluşturuldu 8.1.3 ( şekil 1 d) adım.
- En az sinek boyutunu define.
Not: Bu ayar en az sinek boyutunu piksel cinsinden tanımlar. Belirtilen en az boyuttan daha küçük parçacıklar gürültü nedeniyle yanlış pozitif durumlar önlemek için analiz dışlanır.- Tarafından oluşturulan görüntü yığını açmak " oluşturmak yığını ve projeksiyon " alt makro ı.
- Görüntü yığını dönüştürmek 8-bit görüntü tıklayarak > > türü > > 8 bitlik.
- Git menüsüne görüntü basın > > ayarla > > eşik, emin olun " koyu arka plan " kutusunun seçili olduğundan ve basın " geçerlidir; " ikinci bir pencere olarak adlandırılan " eşik "-ecek gözükmek. Tıkırtı üstünde " koyu background " ve basın " Tamam. "
Not: ikili görüntü yığını-ecek var olmak mahluk içinde sinekler siyah ve beyaz platform tanımlanır. Durumda olduğunda uygulamak " ters çevir'i " Düzenle'yi tıklatarak by işlevi > > ters > > çalıştırmak. - Analiz tıklatarak piksel sayısını tespit etmek için ölçeği ayarlayın > > ölçeği ayarla. Aşağıdaki ayarlar uygulanır: uzaklığını piksel = 1, mesafe bilinen = 1, piksel boyut oranı = 1 ve birim uzunluktaki piksel =. Basın " Tamam. "
- seçin " asa " (izleme) aracı araç ve bir sineği (siyah nokta) mevcut platform üzerine tıklayın. Basın ctrl + m (Windows kullanıcıları) ya da cmd + m (Mac kullanıcıları); yeni bir " sonuçları " pencere piksel seçili yer alan belirtmek. Bunu arka arkaya birkaç sinekler için yapmak ve en küçük sinek boyut belirlemek.
Not: makroyu çalıştırırken, ayarla " en küçük sinek boyut " eksi % 10 bir kenar boşluğu en küçük gözlenen sinek boyutu ayarlama. ( şekil 2E).
- Çalıştırmak " analiz " ölçmek için alt makro III uçar platformdan kaçan.
- Araç çubuğuna gidin " eklentileri, " ve " Drosophila Adası tahlil. "
- ayarlama " en küçük sinek boyut " 8.3. adımda tanımlanan değere göre ayarlama.
Not: Kullanım değeri adım 8.3 tek Eğer standart ayarı tanımlı " en küçük sinek boyut " hediye platform ya da makroyu arka plan sinyal sinekler algılar Eğer sinekler dışlanması neden olur. - İçinde " şişe başına sinekler sayısı " ayarlama, sinekler şişeleri mevcut maksimum sayısını tam deneme sırasında doldurun. Örneğin, bir deney tüpleri 15 sinekler, diğerleri 20 sinekler içeren ve diğer 23 sinekler, içeren içeren varsa " şişe başına sinekler sayısı " 23 belirtilmelidir.
- Select " analiz " onay kutusu ve basın " Ok; " yeni bir " bir dizin seçin " pencere-ecek gözükmek. (Tüm alt klasörler ve içindeki dosyaları ile) ana dizini seçin ve tuşuna basın " seçin. "
Not: makro içerdikleri sürece alt klasörlerinde depolanan tüm görüntüleri analiz eder " stack_image_name, " " Projection_image_name, " ve " Platform_image_name " dosyaları. Makro görüntü görüntü sonra işleyecektir. Makro çıkış adında bir ikili sonuç görüntü yığınını oluşur “ result_stack_subfolder_name.tif ” ve bir sonuç metin dosyası adı verilen " result_subfolder_name.txt, " hangi görünür her veri klasörü. elde edilen metin dosyası (.txt) içerir nicel ölçümler görüntüye karşılık gelen yığını ve 9 sütunlarından oluşur. Bu sütunların içeriği Tablo 1 ' de özetlenmiştir. " Result_stack_subfolder_name.tif " karşılık gelen görüntü zaman serileri nerede deneme sırasında tespit sinekler ( 1E rakam) beyaz zemin üzerine siyah noktalar olarak gösterilir bir denemenin. - Dikkatle incelemek yok eserler ortaya çıkan ve makro doğru bir şekilde çalıştığından emin olmak için sonuç yığını ( şekil 2F).
Not: Eserler örnekleri-ebilmek var olmak değil çoğu görüntü öğelerini uçar ama bu nedenle görüntü segmentasyonu algoritması (yanlış pozitif) tarafından algılanır. Bu örnek, arka plan sinyal algılama nedeniyle yatırım Getirisi yanlış bir seçim nedeniyle olabilir.
9. Veri analizi ile " Adası tahlil analiz "
- yapısı ile analiz için izin vermek için şekil 2A gösterildiği gibi veri " Adası tahlil analiz " komut dosyası. Alt klasörler, her alt klasörün analiz edilecek bir deneysel durumuna kaynakçalara sahip bir ana dizin oluşturmak.
- Bağımsız deneysel çoğaltır ( şekil 2A) ve tarafından üretilen dosyasýna dosyaları içeren klasörlerin alt klasörleri oluşturmak " Drosophila Adası tahlil " makro.
Not: " Island tahlil analiz " makro bir kez ana dizininde bulunan tüm deneysel koşullar işlemek. - R başlatmak veya R studio. Dosyasında Doula tıklayınız > > Open File … araç çubuğu seçip " Adası tahlil analiz " filmi
- Ggplot2 ve matrixStats paketleri çalışırken yükleme " Adası tahlil analiz " komut dosyası ilk kez. Konsol penceresinde aşağıdaki komutu yazın:
> install.packages("ggplot2"), girmek
> install.packages("matrixStats"), girmek.
- Ggplot2 ve matrixStats paketleri çalışırken yükleme " Adası tahlil analiz " komut dosyası ilk kez. Konsol penceresinde aşağıdaki komutu yazın:
- Veri ve analiz çıkış konumunu dosyaları komut dosyasında belirt. Aşağıdaki komut dosyası satır ekle:
- satır 16: analiz ve karşılaştırıldığında için deneyler içeren ana dizinine yolu Ekle ( şekil 2A yönlendiren yol bu " Adası tahlil " klasör).
- Satır 19: analiz çıkış dosyalarının depolandığı klasörün yolunu ekle.
Not: 16 satırda belirtilen dizin sadece çözümlenmesi için klasörler içerebilir. Satır 16 ve 19 satır eklenen yollar aynı olması durumunda komut dosyası da gerektiği gibi çalışmaz.
- Kodu tıklatarak komut dosyasını çalıştırmak > > çalıştırmak bölge > > çalıştırmak tüm araç çubuğundan.
Not: uyarı 19 satırda tanımlanan dizine üç çıkan .csv dosyaları ve bir sonuç .txt dosyası ( şekil 1E) görünen. Bunlar: (I) " data_all_conditions.csv " dosyası her deneysel durumu ve deneysel çoğaltır, Tablo 2 ' de açıklandığı gibi organize karşılık gelen işlenen verileri içerir. (II) " istatistik summary.csv " dosya özetler ortalama, standart sapma (SD) ve sinekler deneysel her koşul için platform üzerinde yüzde ortalaması (SEM) standart hatası. (III) " AUC.csv " dosya deneysel her çoğaltma için eğri altındaki alan içerir. (IV) ana klasöründe mevcut koşulların sayısını bağlı olarak, komut dosyası ya da ihracat olacak bir " Welch_t test_results.txt " dosya (2 koşulları) veya bir " AUC_anova_results.txt " (2'den fazla koşulları), nerede dosya t-testi sonuçları veya Deneysel koşullar arasında eğri altındaki alan karşılaştırma ANOVA gösterilir. 19 satırda tanımlanan yol .tiff görüntü dosyaları ( şekil 1E) dört farklı türde görünür dikkat edin. Bunlara denir: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (burada Name_Of_Data_Folder kullanıcı tarafından verilen klasör adını temsil eder), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " ve " AUC_anova.tiff. " ayrıntılı bilgi Bu grafikler içeriği hakkında bulunabilir, bu el yazması temsilcisi sonuçlarını ve şekil 3.
Representative Results
Açıklanan protokolünde, Drosophila Adası tahlil verileri alınan ve üç adımda işlenir. İlk olarak, ada platform üzerine atılmış Drosophila uçuş kaçış tepkisi ile bir web kamerası kaydedilir ve bireysel .bmp görüntü (iletişim kuralı bölümleri 1-7) olarak depolanır. İkinci olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro (Adım 8) üreten bir "result.txt" metin dosyası içinde her çerçevede tespit nesne sayısını özetlenen, (tablo 1), çerçeveler ve görüntü yığını "Result_stack.tiff, gösteren" işler Her çerçeve içinde belgili tanımlık peron alanı içinde tespit nesneler. Üçüncü olarak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası (iletişim kuralı Bölüm 9) bireysel deneyler "dosyasýna" dosyalarında saklanan makro verileri işler. Birkaç adım filtre uygulamak ve verileri istatistiksel analiz için birleştirmek için komut dosyasında dahil edilmiştir. Sinekler platformda atılır ilk kare algılanır ve 1 saat noktası kabul. Önceki çerçeve kümesinden ortadan kalkar. 100 çerçeveler zaman aşağıdaki işaretleyin 1 (10'a karşılık gelen s) analiz için seçilir. Tespit sinekler platformunda ilk sayısı 5'ten küçük olan deneyler güvenilmez sonuçlar yeterince güçlü deneyler ortadan kaldırarak analizi, otomatik olarak dışarıda bırakılır. Hangi "Şişe başına sinekler sayısı" ayarı artı tolerans 3 tespit sinekler platformunda ilk sayısını aşıyor deneyler de dışarıda bırakılır. Bu hangi gürültü parçacıklar yanlışlıkla sinekler algılanan veri kümeleri ortadan kaldırır. Komut dosyası daha sonra dizide tespit sinekler en yüksek sayısına göre her zaman için tespit sinekler yüzdesini hesaplar. Veri kümeleri yürüyüş (sinekler yüzdesi bir artış platformda zamanla ardından bir düşüş olarak tespit) YG içinde ve dışında uçar kaynaklanan hataları otomatik olarak tarafından onları ile ilgili olarak sürekli mevcut platform üzerinde daha önceki aşamalarında düzeltilir . Ana dizinde bulunan tüm çoğaltma veri kümeleri belirli bir deneysel koşulu için birleştirilir ve "data_all_conditions.csv" dosyasına dışa. Onun sütunlar Tablo 2' de açıklanan değişkenleri temsil eder. Komut dosyası da bir çizgi grafik verileri içeren klasörü göre adlı deneysel her koşul için dışa aktaracaktır. Bu grafik sinekler olan deneysel (uçuş kaçış yanıt) zamanla platform üzerinde kalan yüzde çoğaltır kendi klasöründe ()şekil 3Amevcut gösterir-B). Ortalama, SD ve SEM deneysel her koşul için hesaplanır ve "İstatistik summary.csv" dosyasında özetlenmiştir. "Escape_response_all_conditions.tiff" adı verilen bir çizgi grafik ortalama uçuş kaçış yanıt ilâ 12 deneysel koşullar ()şekil 3 c)ana klasöründe mevcut gösterir. Son olarak, tüm deneysel koşullar ana klasöründe için eğri altındaki alan hesaplanan ve "AUC.csv" dosyasında özetlenmiştir. Koşullar ana klasöründe sayısına bağlı olarak, komut dosyası ya da bir iki uçlu unpaired Welch t-Testi (2 koşulları) ya da bir ANOVA Tukey düzeltme ile birden çok (2'den fazla koşullar) belirlemek test etmek için gerçekleştirir olup olmadığını deneysel koşullar önemli ölçüde birbirinden farklı. Bu sonuçlar "Welch_t-test_results.txt" veya "AUC_anova_results.txt." özetlenen ANOVA gerçekleştirirken komut dosyası da demek AUC farklılığı ve % 95 güven aralıkları karşılaştırılır deneysel koşullar görüntüler bir "AUC_anova.tiff" dosyası dışa aktaracaktır. Mutlak alan tüm deneysel koşullar için deneysel çoğaltır eğri altındaki değerleri tek tek veri noktalarını medians içinde "AUC.tiff" (şekil 3D) ile görüntülenir.
Ataksi Telanjiektazi (AT) serebellar ataksi ataksi Telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) gen14mutasyonların nedeniyle erken başlangıçlı ile karakterize bir otozomal resesif hareket bozukluğu var. ATM, tefu, Drosophila orthologue mutantlar kusurları hareketlilik ve uzun ömürlü15içinde görüntüler. "Drosophila Adası tahlil" makro değerlendirmek için Drosophila manken at Adası assay olarak test edilmiş ve makro veri çıkışı el ile veri sayıları için karşılaştırıldı. O her yerde tefu sonuç nakavt (w-; Actin-Gal4/GD11950) Bu sinekler (w-; onların genetik arka plan kontrollere göre platformu terk yeteneğini önemli ölçüde azaltır Actin-Gal4/+) ()şekil 4). 1 sonra s, % 50'sini kontrol sinekler kaçtı platformu, aksine < tefu% 1 - RNAi uçar. Önemlisi, sayma, makroyu Adası tahlil veri miktar ve hareket kusurları () değerlendirilmesi için kullanılan güvenilir bir araç olduğunu belirten el kitabı tarafından elde edilen veriler ile makro sadakatle elde edilen veriler çoğaltılamaz Şekil 4 A-B).
Şekil 1: gereksinimleri, deneysel bir işlem ve analiz Adası testin özetleyen akış çizelgesi. (A)Adası donanımları assay. (B) Adası tahlil için deneysel Kur. (C) Adası tahlil. (D)"Drosophila Adası tahlil" makro ile ada tahlil verilerin işlenmesi. "Drosophila Adası tahlil" makro 3 alt makroları oluşmaktadır: 1) yığını ve projeksiyon yapmak, 2) tanımlamak platformu ve 3) analizi. (E) işleme ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası kullanarak verilerin istatistiksel değerlendirme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: farklı ayarlar iletişim kuralı sırasında gerekli örnekleri. (A) gerekli dizin yapısı hangi Island'da, veri işleme ve analiz için tahlil deneyler depolanmalıdır. (Sinekler görünmesi gerekir video ayarlarını ayarlarkenB) siyah beyaz bir arka plan üzerinde. (C) resim çerçevesi çıktı dosyalarıBu el yazması açıklanan görüntü kayıt yazılımı tarafından kaydedilmiş gibi. (D) sarı anahat platform seçimi gösterir. Saklı platformu seçim "ROI Yöneticisi'nde" mavi renkle vurgulanır. (E) sinekler "en az sinek boyutu ayarını." ayarından sırasında beyaz noktalar gösterilir Sonuçları penceresinde alan "Sineklerin Tanrısı" piksel olarak gösterir. (F) bir tek kaydedilmiş resim çerçevesi (solda) ve"Drosophila Adası tahlil" makro (sağda) ile elde edilen sonuç Görüntü yığınındaki karşılık gelen çerçeve örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: sonuç görüntüleri elde edilen veri işleme "Ada tahlil analiz" filmi ile sonra (A)satırının her biri için uçuş kaçış tepki gösteren grafik kontrol deneysel çoğaltılır. (B) hattı uçuş kaçış yanıt için her tefu RNAi deneysel REPLICATE gösteren grafik. (C) ortalama uçuş kaçış yanıt belirtilen deneysel koşullar için; hata çubukları denetim ve mutant koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden SEM (D) nokta araziler temsil eder. Deneysel çoğaltır koşulların her ikisi de tefu RNAi ve kontrol için tek tek veri noktaları (siyah) olarak medians (kırmızı çizgi) ile görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Her yerde tefu devirme sinekler platformu bırakmak önemli ölçüde azalma yeteneği gösterir. Zaman (s) için denetim (w-; içinde sinekler platformunda yüzde verileri temsil Actin-Gal4/+) ve tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) uçar. (çoğaltır sayısı = 5; hata çubukları SEM temsil eder). "Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen(a)ham veri. (B) nokta çizer"Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen denetim ve tefu RNAi koşulları için eğri dağıtım alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p < 0,01). (C) ham veri elle sayılması tarafından elde edilen mevcut saniyede adada uçar. (D) nokta çizer denetim ve el-sayılarak elde Tefu RNAi koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p < 0,01). Hata çubukları SEM temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Sütun adı | Açıklama | ||
| Dilim | Çerçeve adı. | ||
| Count | Platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin sayısı. | ||
| Toplam alan | Piksel cinsinden platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin toplam alan. | ||
| Ortalama boyutu | Toplam alan platformu (ROI) sınırları içinde nesneleri sayısı bölü çerçevesinde tespit nesneler. | ||
| % Alanı | Alan Toplam alan (ROI) platformu ile ilgili nesneler tarafından işgal yüzdesi. | ||
| Perim. | Toplam çevre platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit nesneler. | ||
| Min. sinek boyutu | En azından uçmak"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu ayarı. | ||
| Alan yatırım Getirisi | Alt makro Çalıştır sırasında kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (ROI) alanını tanımlamak platformu (piksel cinsinden). | ||
| Sinekler sayısı | "Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı. | ||
Tablo 1:"Drosophila Adası tahlil" makro tarafından ölçülen parametreler. Bu tabloda açıklanan parametreleri"Drosophila Adası tahlil" makro çalıştıran üzerine "sonuç.txt" dosyasında görünür.
| Sütun adı | Açıklama | ||
| Dilim | Çerçeve numarası. | ||
| Count | Sinekler platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit sayısı. | ||
| X.Area | Toplam alan platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit Sineklerin Tanrısı. | ||
| Min. sinek boyutu | En azından"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu giriş ayarı sinek. | ||
| Alan yatırım Getirisi | Alt makro çalıştıran "tanımladığınızda platformu" kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (YG, piksel) alanı. | ||
| Sinekler sayısı | "Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı. | ||
| X.Count | % platformu çerçevesinde ilgili dilim/platform üzerinde deneme sırasında tespit sinekler en yüksek sayısına oranla mevcut uçar. | ||
| Timepoint | Zaman noktası 1 analiz edilecek ilk kareyi temsil eder ve sinekler platformda ilk görüntülendiği çerçevenin karşılık gelir. Var a toplam 100 kare / analiz çoğaltılır (10'a karşılık gelen açıklanan ayarlarını kullanırken s. | ||
| Deney | Koşul başına çoğaltır sayısı. | ||
| Koşul | Deneysel durumuna (göre verileri içeren klasörü kullanıcı tarafından tanımlanan adı) adını gösterir. | ||
Tablo 2: değişkenleri açıklaması elde edilen veri "Ada tahlil analiz" filmi ile işledikten sonra Bu tabloda açıklanan parametreleri "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile veri işleme üzerine "data_all_conditions.csv" dosyasında görünür.
Discussion
Bu iletişim kuralı kantitatif Drosophila motor davranış sırasında ada tahlil değerlendiriyor"Drosophila Adası tahlil" makro açıklar. Makro doğru platform üzerinde sinekler zamanla, son derece hassas ve Lokomotor kusurların nicel yüksek üretilen iş değerlendirme için uygun ada tahlil yapma sayar. Metodoloji uyuşturucu pozlama da dahil olmak üzere farklı genetik ve/veya çevresel koşullar altında yetiştirilen sinekler ile herhangi bir koşulu, karşılaştırma için sağlar. Bu okuma böylece büyük genetik veya ilaç ekranlar, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların okurken gerçekleştirirken veya hareket ya da uçuş incelerken keşif aracı olarak yararlıdır davranış.
Bu el yazması sunulan Adası tahlil iletişim kuralı mevcut/alternatif yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Örneğin, video izleme hareket çok daha zaman alıcı ve örneklerin boyutu büyük test etmek için daha az uygun olacaktır. Ada tahlil yüksek üretilen iş tarama aracı ve bu anlamda hızlı etkileşimli negatif geotaxis (yüzük) tahlil16için karşılaştırılabilir olduğunu. İkisi arasındaki fark Adası deneyleri Lokomotor sorunları geniş bir algılama için sağlanmıştır; sinekler ve yetersizlik platformu terk kusurları uçuşta, Zıplama, neden olabilir veya davranış yürüyüş kanat (kas/nöronal) ve/veya bacak (kas/nöronal) tarafından kaynaklanan kusurlar. Öte yandan, yüzük tahlil kusurları tırmanma/yürüyüş davranış (kas/nöronal) bacak kusurları tarafından neden değerlendiriyor. Kullanıcılar birden fazla davranışsal sonuçlar ilgileniyor musunuz diye, ada tahlil de kolayca RING tahlil gibi diğer deneyleri ile birleştirilebilir. Buna ek olarak, optogenetics için gerekli lazerler Adası tahlil kutusunda kolayca kurulabilir ve belgili tanımlık tertibat o kolayca nerede sıcaklık ve ışık kontrol edilebilir bir oda için hareket edebilir basittir.
Başarı ve tekrarlanabilirlik burada açıklanan Adası testin emin olmak için çeşitli öneriler takip edilmelidir. Aliquot ve transfer deneysel test uçmaktadır sulandırıldığında en az bir gün önce CO2 veya soğuk anestezi etkileri önlemek için deneyin. Deneysel şişeleri kalabalık değil (şişe 10-15 sinekler kullanın; her zaman sinekler aynı sayıda şişe yerleştirmek en iyisi). Taze Gıda sinekler her zaman tutun. Eğer değil henüz tahlil iletken aşina, pratik atma verimi en üst düzeye çıkarmak için bir platform uçar. Aynı zamanda hızlı bir şekilde el geri çeker uygulama ve veri analizi (görüntü analizi ve yalnızca resmin dışında eldir başlangıç saymaya sinek) ile müdahale daha sonra şu. Çevre ve deneysel koşullar aynı karşılaştırılmak üzere gereken deneylerde tutmak (Örneğin, denetimler mutantlar veya bir genotip karşı test farklı yaş). Her zaman günün aynı anda deneyler yapmak ve kontrollü sıcaklık ve nem koşullarında şişeleri korumak. İstatistiksel güç için biyolojik REPLICATE başına en az üç teknik çoğaltır sınama.
Açıklanan makro başarılı performansı elde etmek için burada, web kamerası ve görüntü ayarlarını maksimal kontrast elde etmek için ayarlanması gerekir: siyah beyaz bir platformda nesneleri olarak beliren uçar. Sinekler sayısı düzgün makro tarafından sayılır değildir zaman, kontrast ayarlarını, yatırım Getirisi düzgün seçili olup olmadığını kontrol edin ve platform üzerinde sinekler boyutunu belirtilen en az olduğundan emin olun (bkz. Adım 8.3 Bu protokol) boyutunu ayarlama sinek. Ayarları yalnızca bir kez tanımlanmış olması gerekir. Web kamerası ve platform arasındaki mesafe değişmez sürece tüm deneyler için geçerlidir. Döngüsellik parçacıkların Circularity_min ve max ayarlarını tanımlayın (parçacıklar sayılan sinekler =) analizi için dikkate alınacaktır (uçar sayılan nesneler =). 1 tam bir daire ve bir satır170 gösterir. Sinekler her zaman belirli bir ölçüde (karıncayı düz bir çizgi bulunamaz) circularity mevcut 1'de "Circularity_max" ayarını ayarlayın ve "Circularity_min" ayarı 0,4 ayarlanır. Bu kullanıcının bu ayarları yapmak gereken düşüktür.
Bir sinek platform sınır yakın bulunduktan sonra makro bazen sayım hata yapar. Sinekler güvenli ama buradan girip kullanıcı tanımlı ROI uçamaz oluşabilir. Çoğu durumda, (bu platforma mümkün olduğunca uygun) YG yeniden kolayca bu sorunu çözebilir. Ancak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası tespit edebilmektedir ve doğru yanlış veri sayar içinde ve dışında yatırım Getirisi oldukça iyi yürüme sinekler tarafından neden oldu. Burada sunulan webcam çözünürlüğü sinekler yakın oldukça iyi ayırımcılık için yüksek olsa da, biz diğer algoritmalar"Drosophila Adası tahlil" makro görüntü işleme yordamı gibi hayata geçirdik havza ve işlev17aşındırmak. Bu platform üzerinde birbirine yakın olan sinekler uygun tarif kolaylaştırmak. Ayrıca, makro platformu atladı veya ondan uçtu sinekler arasında ayırt edemiyor. Yine de, bu genellikle sağlıklı genç sinek suşları ise büyük sinek ve sinek Lokomotor açıkları ile platformda daha uzun kalır ve sonunda atlamak veya platformdan düşmek hemen platform üzerine düştü uzaklara uç görülmektedir. Bu sınırlamaları rağmen tahlil ve analiz Lokomotor davranış çok doğru bir ölçü sağlar.
"Island tahlil analiz" komut dosyası başarılı performansı sağlamak için kullanıcının iletişim kuralında belirtilen komut satırında giriş ve çıkış dosyalarının doğru yolu girin ve doğru klasöre biçiminde veri (belirtildiği gibi sağlamak için emin olun gerekir. Şekil 2' de). Kullanıcı güvenilir olmayan deneysel veriler çok sıkı filtre uygulamak için kullanılan ölçüt bulursa (satır 68: "Count" sütunundaki ilk değeri; 5 eşit veya daha az satır 71: sinekler üzerinde platfo atılan toplam sayısı daha yüksek "Sayı" sütununda ilk değerdir RM + 3), 68 ve 71 "Ada tahlil analiz" komut dosyasında satırlardaki metnin önüne # ekleyerek bu filtre ayarları kapat. Bu durumda, tüm veri kümeleri analize dahil. Alternatif olarak, filtre ayarlarını 68 ve kullanıcı ihtiyaçlarına göre 71 satırlardaki değerleri ayarlayarak değiştirebilirsiniz. Olası değerleri say ""Drosophila Adası tahlil"makro tarafından oluşturulan dosyasýna" içinde aktarımında da el ile ayarlanabilir ve komut dosyası yeniden ayarlanan veriler üzerinde çalıştırılabilir. Ne zaman kullanıcı ilgilenen daha--dan 10 kare/sn veya daha--dan 10 işleniyor "Ada tahlil analiz" komut dosyası tarafından işlenen kare sayısı s veri gerekirayarlanabilir. İstatistiksel analiz kullanıcı tanımlı alternatifler tarafından da değiştirilebilir.
"Örnekler Adası tahlil örnekleri içeren görüntü zaman Adası tahlil kullanılarak elde serileri ile" adlı bir klasör-ebilmek bulunmak vasıl ertesi gün website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. "Örnekler Adası tahlil" ─░ndirme ve hızlı bir şekilde dosya depolama, "Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" ile görüntü işleme yapısı ile tanımaya olmak için bu iletişim kurallarını açıklanan adımları izleyin komut dosyası.
Ada tahlil gelişmiş makro ve analiz komut dosyası ile birlikte değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi Drosophila modelinin anormal hareket davranışını ölçmek için kullanılabilir. Tahlil çeşitli yaş için verimli bir şekilde uygulanabilir olduğu, fenotipleri potansiyel olarak ilerici doğa analiz için uygundur.
Özet olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile birlikte Adası tahlil objektif olarak analiz etmek ve Lokomotor kusurlarý ölçmek için düşük maliyetli, güvenilir ve yüksek verimli bir tahlil olduğunu. Drosophila bir yüksek-den geçerek şekilde hareket bozuklukları modelleri.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz Viyana Drosophila Kaynak Merkezi ve Drosophila suşları sağlamak için Bloomington Drosophila stok Merkezi (NIH P40OD018537) kabul edersiniz. Bize ada tahlil ve Martijn Eidhof Adası tahlil kurulum oluşturmak için tanıtmak için Klämbt laboratuvar için sana şükrediyoruz. Bu çalışma yapıldı bölümünde E-nadir-3 Uluslararası arayıp tarafından desteklenen hibe "terapiler otozomal resesif ataxias için hazırlanıyor" hazırlama (NWO 9003037604), Hollanda organizasyon için bilimsel araştırma (NWO) ve tarafından en iyi hibe (912-12-109) iki DCN/Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi Doktora Bursu. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
