Summary
De bepaling van het eiland is een relatief nieuwe, rendabele test die kan worden gebruikt voor het evalueren van de fundamentele motorische gedrag van Drosophila melanogaster. Dit manuscript wordt beschreven algoritmen voor automatische gegevensverwerking en objectieve kwantificering van eiland assay gegevens, waardoor dit een gevoelige en high-throughput uitlezing voor grote genetische of farmacologische schermen assay.
Abstract
Vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijdragen tot de identificatie van de (kandidaat-) ziekte genen voor bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten met een toenemende snelheid. Echter, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze aandoeningen. De genetische, moleculaire en behavioral werkset van Drosophila melanogaster maakt dit model-organisme bijzonder nuttig te karakteriseren van nieuwe genen van de ziekte en mechanismen in een high-throughput wijze. High-throughput schermen vereisen echter efficiënte en betrouwbare tests, die idealiter kosteneffectiever zijn en zorgen voor de geautomatiseerde kwantificering van eigenschappen relevant zijn voor deze aandoeningen. De bepaling van het eiland is een kosteneffectieve en gemakkelijk set-up method to evaluate methode Drosophila locomotor gedrag. In deze test, worden vliegen geworpen op een platform van een vaste hoogte. Dit induceert een aangeboren motor antwoord waarmee de vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. Op dit moment zijn kwantitatieve analyses van gefilmd eiland tests handmatig gedaan, dat is een moeizame onderneming, met name bij het uitvoeren van grote schermen.
Dit manuscript wordt de"Drosophila eiland Assay" en "Eiland Assay Analysis" algoritmen voor hoge-doorvoer geautomatiseerde gegevensverwerking en kwantificering van eiland assay gegevens beschreven. In het configuratiemenu verzamelt een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop een afbeelding-reeks van het platform, terwijl de bepaling wordt uitgevoerd. De"Drosophila eiland Assay" algoritme ontwikkeld voor de open-sourcesoftware Fiji verwerkt deze afbeelding serie en kwantificeert, experimentele voorwaarde, het aantal vliegen op het platform na verloop van tijd. Het "Eiland Assay Analysis" script, compatibel met de gratis software R, werd ontwikkeld voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en om te berekenen of behandelingen/genotypen statistisch verschillend zijn. Dit aanzienlijk verbetert de efficiency van de bepaling van het eiland en maakt het een krachtige uitlezing voor fundamentele motoriek en vlucht gedrag. Het kan dus worden toegepast op grote schermen onderzoeken vliegen locomotor vermogen, Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en werkzaamheid van het geneesmiddel.
Introduction
In de afgelopen jaren hebben vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijgedragen tot de identificatie van genen onderliggende degeneratieve bewegingsstoornissen van de hersenen (bijvoorbeeld cerebellaire ataxie en Parkinson), apparaat neuronale oorsprong (bijvoorbeeld Amyotrofische laterale sclerose en erfelijke spastische dwarslaesie), en gespierde oorsprong (bijvoorbeeld de spierdystrofie van Duchenne en de myotone dystrofie)1,2,3,4 . Ondanks dit, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het merendeel van deze aandoeningen. Een beter begrip van deze mechanismen is essentieel voor de ontwikkeling van therapieën.
Zoals mensen, in wordt beweging in modelorganismen, zoals vlucht en motoriek in Drosophila, beheerd door de centrale hersenen perifeer zenuwstelsel en de spieren. Bovendien, maken de snelle generatietijd en genetische toolbox van Drosophila dit model-organisme bijzonder geschikt voor de high-throughput screening van genen betrokken in bewegingsstoornissen en voor drugstests5,6 . Wegens het aanzienlijke aantal voorwaarden die worden getest in dergelijke schermen, betrouwbare, rendabele, en relatief eenvoudige tests, alsmede de instrumenten moeten te kwantificeren van de uitvoerresultaten op een geautomatiseerde manier, zijn zeer wenselijk.
Schmidt et al. (2012) 7 beschreven een low cost-test genoemd de "eiland assay" om te evalueren van Drosophila locomotor gedrag. De bepaling van het eiland is met succes in grootschalige screenings gebruikt om genen te identificeren met glia-specifieke functies7, bij de evaluatie van Drosophila modellen van verstandelijke beperking8, en voor de algemene evaluatie van motor probleem9vliegen. Het ontwerp van het principe van de bepaling van het eiland bestaat uit een verhoogde platform waarop verschillende vliegen zijn gegooid. Dit induceert een aangeboren motor gedrag waarmee gezonde vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. De test meet het aantal vliegen nog op het platform over tijd7,8,9. Al deze functies aangeven dat de bepaling van het eiland een krachtige screening tool voor genen betrokken bij bewegingsstoornissen kan zijn.
Op dit moment is de kwantitatieve analyse van gefilmd eiland assay gegevens handmatig7,8,9gedaan. Ter verbetering van de efficiëntie van de test, werd een goedkope methode ontwikkeld om semi-automatisch het kwantificeren van het ontsnappen van vliegt vanaf het platform. De setup een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop gebruikt voor het verzamelen van beeld destijds serie van het platform, met frames verworven elke 0,1 s. Frames worden vervolgens verwerkt met de macro"Drosophila eiland Assay" kwantificeert het aantal vliegen op het platform over tijd. De macro"Drosophila eiland Assay" is verdeeld in drie onafhankelijke sub macro's: (I) de "maken stack en projectie," sub macro identificeert verschillende eiland experimenten in verschillende submappen opgeslagen en creëert een stack en een projectie van elk tijdreeksen. (II) de "Definiëren Platform" sub macro verschijnt achtereenvolgens alle bestanden van de "Projection_image_name.tif" gelegen in de individuele experimentele submappen, op dat moment wordt de gebruiker gevraagd het eilandstation handmatig te definiëren als de regio van belang (ROI). (III) "analyse" kwantificeert automatisch het aantal vliegen tijdens de tijdreeksen op het platform blijven. De sub macro's kunnen worden uitgevoerd achter elkaar (in een punt) of onafhankelijk. Voor statistische gegevensanalyse ontstond een script voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en toe te passen van een statistische toets om te bepalen of behandelingen/genotypen beduidend verschillend van elkaar (Figuur 1 gedragen). Tot slot wordt aangetoond dat deze opstelling kan worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van de afwijkende locomotor vermogen van een model van de Drosophila voor Ataxie-Teleangiëctasie (AT).
Protocol
1. bouw van het eiland Assay vak
- voorbereiden een lade gemaakt van een robuust materiaal, zoals poly-methylmethacrylaat (PMMA), bevatten een laagje water (dat wil zeggen een bad). Zorg ervoor dat het materiaal niet wit.
Opmerking: Afmetingen van 40 x 35 x 2,5 cm 3 worden aanbevolen ( figuur 1A). - Bereiden een vak (42 x 38 x 25 cm 3) gemaakt van een robuuste, transparant materiaal, zoals PMMA, rond het bad om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen in de ruimte van het laboratorium worden geplaatst. Plaats een gat (20 x 30 cm 2) aan de laterale kant die groot genoeg is voor de experimentator te gemakkelijk hanteren de flesjes met vliegen en drop ze op het eiland ( figuur 1A).
- Bereiden een verhoogde platform 10 x 15 x 2.5 cm 3 in dimensie, gemaakt van een ondoordringbaar materiaal (PMMA of plastic) dat is waterdicht.
Opmerking: Dit platform is nodig om een uniforme witte oppervlak om een goed contrast voor beeldanalyse. De grootte is niet noodzakelijkerwijs vast, maar het moet groot genoeg zijn om ervoor te zorgen dat alle vliegen in eerste instantie het land op het platform en de kans krijgen te lopen op het ( figuur 1A). - Fix het platform door het in te lijmen om het bad of plaatsen van gewichten of andere zware voorwerpen binnen het platform vak positionele om wijzigingen te voorkomen van het platform tijdens de sessie experimental/filmen.
2. Softwarevereisten en installatie
- installatie van beeld-opnamesoftware.
- Download beeldopname software te registreren van de eiland afbeelding serie (Zie de Tabel van de materialen) en installeer de software op een computer.
Opmerking: De imaging-opname-software beschreven in dit protocol wordt alleen ondersteund door Windows. Een alternatief voor andere gebruikers is toegevoegd aan de Materialen tabel.
- Download beeldopname software te registreren van de eiland afbeelding serie (Zie de Tabel van de materialen) en installeer de software op een computer.
- " Drosophila eiland Assay " macro installatie.
- Downloaden de " Drosophila eiland Assay " macro- en de compatibele Fiji 10 versie (1.4 of hoger) op de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- De cursor naar de " eiland assay " directory en klik op " weergeven. "
- Klik op " Download all. " inhoud van de map worden gedownload als een zip-bestand, unzip het gedownloade bestand.
- Kopie de " Drosophila eiland Assay.ijm " file naar " Fiji.app/plugins/directory. "
Opmerking: Tijdens het starten van Fiji, de " Drosophila eiland Assay " macro zal verschijnen aan de onderkant van de plugins-dropdown menu.
- " Eiland Assay analyse " script installatie en te downloaden.
- Downloaden 11 vanaf de volgende website: https://cran.rstudio.com. Installeren op een computer. Studio van de
- R downloaden vanaf de volgende website: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installeren op een computer.
Opmerking: De " eiland test analyse " script kan worden uitgevoerd met R alleen. R-studio, met zijn gemakkelijker-gebruikersinterface, wordt gepresenteerd als alternatieve stap voor gebruikers onervaren met R. - Download het " eiland Assay analyse " script vanaf de " Drosophila eiland Assay " directory op de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
Opmerking: na het uitvoeren van stap 2.2, het " eiland Assay analyse " script kan ook worden gevonden in de uitgepakte map met de naam " eiland assay. "
3. Voorbereiding van het vliegen te beproeven in de bepaling van het eiland
- Collect geënsceneerd vliegen voor elke experimentele voorwaarde onder koude of kooldioxide (CO 2) anesthesie, als eerder beschreven 13 (over een periode van 1 - 2 dagen).
- Voorbereiden een minimum van 3 monster flesjes per experimentele voorwaarde, elk met ongeveer 15 geënsceneerd vliegt. Gebruik alleen vliegt met intact vleugels en zijn van dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht.
Opmerking: Voor de experimenten die hier worden beschreven, 5 monster flesjes met 15 mannelijke vliegen van de genotypen w -; Actin-Gal4 / + (controle) en w -; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) werden verzameld op de dag van eclosion, leeftijd voor 4 dagen, en werden gebruikt voor het uitvoeren van de bepaling van het eiland. RNAi, stammen van de controle en de actine-gal4 bestuurder werden verkregen uit een commerciële bron (Zie de Tabel van de materialen).
- Voorbereiden een minimum van 3 monster flesjes per experimentele voorwaarde, elk met ongeveer 15 geënsceneerd vliegt. Gebruik alleen vliegt met intact vleugels en zijn van dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht.
- Laat de vliegen herstellen om te voorkomen dat de effecten van de verdoving (minimaal 1 dag bij het gebruik van CO 2) voor het testen van de verzamelde vliegen in de bepaling van het eiland op de leeftijd van belang.
4. experimentele opzet
Opmerking: Zie figuur 1B.
- Koud water met een kleine hoeveelheid zeep toevoegen aan het Dienblad van het bad en de positie van het platform in het midden.
Opmerking: De zeep vermindert de oppervlaktespanning van het water; vliegen die het water raken zal verdrinken. Hiermee voorkomt u dat de stijgende hoeveelheden van vliegen vliegen in het vak tijdens de progressie van de experimentele sessie. - Plaats van de transparante doos op de top van de lade en het platform boven met behulp van een lamp verlicht.
Opmerking: De verlichting van het platform is vooral nodig om de juiste video contrast. Een gewone 12-V LED-verlichting is geschikt voor dit. - Plaatst u de webcam direct boven het platform (buiten het vak) en het verbinden van een computer.
- Maak nieuwe mappen op de computer voor het opslaan van de verschillende experimentele gegevens vóór de experimenten.
- Volgen de structuur van het voorbeeld geïllustreerd in figuur 2A te maken van de mappen. Bijvoorbeeld, als de proefopzet testen van twee genotypen met vijf wordt gerepliceerd vereist, eerst maken een hoofdmap met de datum van het experiment. Maak twee submappen (één per genotype) in de hoofdmap. In de mappen van het genotype, het maken van vijf nieuwe submappen, één per repliceren.
Opmerking: Voor verdere analyse, is het essentieel dat de serie van de afbeelding overeenkomt met afzonderlijke experimenten worden opgeslagen in mappen met unieke namen.
- Volgen de structuur van het voorbeeld geïllustreerd in figuur 2A te maken van de mappen. Bijvoorbeeld, als de proefopzet testen van twee genotypen met vijf wordt gerepliceerd vereist, eerst maken een hoofdmap met de datum van het experiment. Maak twee submappen (één per genotype) in de hoofdmap. In de mappen van het genotype, het maken van vijf nieuwe submappen, één per repliceren.
5. Video instellingen Setup in de " vangen apparaat " sectie van de Interface
- Open de beeldopname software en, onder de " vangen " tab, klik op " tijd-tijdspanne beelden … " en selecteer de juiste webcam als de " Vastleggen apparaat. "
- een dode vlieg plaatsen op het eiland, de video-instellingen aanpassen door te klikken op de " Video-instellingen " vak. Blader door de tool bars, helderheid, contrast, aanpassen en kleur op een manier zodat de dode vlieg zwart op een witte achtergrond ( figuur 2B verschijnt). Wanneer de wijzigingen voltooid zijn, klikt u op " Ok. "
6. Opname en Video opslaan instellingen Setup in de " Time-lapse " sectie van de Interface
< ol>Opmerking: de video-bestand wordt niet gebruikt voor het kwantificeren van gegevens; het kan echter zinvol zijn om een algemeen idee te krijgen over het experiment.
- Selecteer in het vak compressie " Intel IYUV code " voor videocompressie en kies " nemen één frame om de 0,1 seconden, " met de " afspelen snelheid (beelden per seconde): " aan 10.
- De tijdreeks experiment als .bmp frames opslaan door te klikken op " Geavanceerd … " Selecteer " een BMP-afbeelding maken voor elk frame gevangen. " Klik op " bladeren. " Selecteer dezelfde map in de " tijdens AVI film opname " venster (als gekozen in stap 6.1), klik op " Open, " en druk op " Ok. "
Opmerking: merk op dat tijdens het experiment, de frames worden opgeslagen als BMP-bestanden (vereist voor data-analyse). Het programma namen de frames als " A " gevolgd door het nummer dat overeenkomt met de framereeks vastleggen (bijvoorbeeld, " A_number.bmp ") ( figuur 2C). Altijd sla de afbeeldingen die behoren tot verschillende experimenten in een nieuwe map om ervoor te zorgen dat eerder opgenomen beeld-serie worden niet overschreven. Let erop dat de beelden niet automatisch in dezelfde map als het videobestand opgeslagen worden tenzij deze map is geselecteerd onder " bladeren … " op het te klikken op de " Geavanceerd " vak.
7. Eiland Assay en gegevensverzameling
- Druk op de startknop in de interface van de time-lapse beeld van de beeldopname software om de opname te starten.
- Tik op de experimentele flacon met vliegen (stap 3) 2 - 3 keer om ervoor te zorgen dat de vliegen aan de onderkant van de flacon zijn. Snel verwijderen van de stekker van de flacon en met een krachtige beweging, tik op het flesje op het perron zodat alle vliegen op het platform op hetzelfde moment ( Figuur 1 c vallen).
- Na ongeveer 30 s, druk op de " stoppen " knop opnemen te stoppen.
Opmerking: Als alle vliegen uit het platform verdwijnen, de opname kan worden gestopt eerder. - Verwijderen van de vliegen die 30 gedurende s op het platform met de hand na het stoppen van de beeldopname.
- Wijzigen voordat u voor het opnemen van het volgende experiment, de folder van het doel voor de BMP-bestanden en films (zie punt 6).
8. Gegevensverwerking: Uitvoeren van de " Drosophila eiland Assay " Macro
Opmerking: Zie Figuur 1 d.
- Lopen de " maken van de stack en projectie " sub macro ik stapels en prognoses van de verzamelde foto-serie te produceren.
- Start Fiji, klik op " Plugins " in de werkbalk en koos " Drosophila eiland Assay " in het dropdown menu; een nieuw venster zal verschijnen.
- Enter de " eerste beeld tijdreeksen id " instellen in de grafische interface van macro.
Opmerking: De opgenomen beeld frames worden opgeslagen als " A-number.bmp " volgens de volgorde waarin de beelden worden verkregen. In de " eerste frame id " macro interface, vul in de instelling met het getal dat het eerste frame van het programma en met de extensie. Vul " eerste frame id " met "-0001.bmp, " aangezien het eerste frame heet " A-0001.bmp " ( figuur 2C). In het geval dat andere beeldformaten (zoals .tiff of .jpeg) worden gegenereerd door de webcamsoftware, geef de juiste bestandsextensie van de eerste afbeelding in " eerste beeld tijdreeksen id. " - selecteert u alleen de " maken van de stack en projectie " sub macro, klik op " Ok, " en selecteer de hoofdmap waarin alle submappen met individuele eiland assay experimenten.
Opmerking: De BMP-bestanden in elk individu experimenteren map waarin de " eerste frame id " zal vervolgens worden verwerkt. Twee nieuwe bestanden worden weergegeven in elke afzonderlijke experiment submap, standaard de naam " Stack_image_name.tif " en " Projection_image_name.tif " ( Figuur 1 d). Zodra deze stap wordt uitgevoerd, kunnen de BMP-bestanden worden verwijderd. Stack en projectie .tif-bestanden bevatten alle gegevens en zijn voldoende voor verdere analyse.
- Lopen de " definiëren Platform " sub macro II de exacte locatie van het platform selecteren.
- Openen van de grafische interface van de " Drosophila eiland Assay, " selecteert u alleen de " definiëren platform " checkbox en druk op " Ok. "
- In de " Kies een map " venster, selecteer de hoofdmap waar experimentele submappen zijn opgeslagen en druk op " Select. "
Opmerking: de " definiëren Platform " sub macro zoekt automatisch naar " Projection_image_name.tif " bestanden in alle submappen in de hoofdmap opgeslagen. De " Projection_image_name.tif " afbeelding die is opgeslagen in de eerste map, samen met twee vensters — " bepalen het platform " en " ROI manager " — zal openen. - Selecteer de " veelhoek selecties " gereedschap op de werkbalk Tekenen een selectie die overeenkomt met het eilandstation.
Opmerking: Het is zeer belangrijk uit te sluiten van de grens van het platform van de selectie. Zie figuur 2D. - Na het selecteren van het platform in de eerste afbeelding, klik op " toevoegen " in de " ROI Manager " venster, het geselecteerde gebied wordt weergegeven in het venster van de manager ROI als een set van waarden ( figuur 2D). Druk op " Ok " in het " definiëren van het platform " venster. De macro zal overgaan tot de volgende projectie.
- Klik op de nummers ( figuur 2D) opgeslagen in de " ROI manager " venster, de vorige selectie wordt vervolgens automatisch weergegeven in de huidige afbeelding projectie.
Opmerking: sinds het eiland platform dreigt te doen hetzelfde formaat en dezelfde positie wanneer experimenten worden uitgevoerd in een rij (zolang de positie van de webcam en het eiland ongewijzigd blijven), is het nuttig om op te slaan van de ROI definiëren van het platform in de " ROI manager. " door Hierdoor bespaart de gebruiker tijd; in de aankomende projecties, het is alleen noodzakelijk om te klikken op de tijdelijk opgeslagen selectie in de manager van de ROI. - Als de positie van het eiland iets ten opzichte van naar het vorige experiment verplaatst heeft, de positie van de selectie aanpassen door links in het midden van de selectie te klikken en te slepen het geselecteerde gebied naar de gewenste positie.
- Als de selectie niet met het platform overeen komt, klik met de linkermuisknop buiten de selectie te doen en een nieuwe selectie voor het gebruik van het platform af te bakenen de " veelhoek selectie " gereedschap. De nieuwe selectie opslaan in de ROI-manager door te klikken op " toevoegen; " een nieuwe selectie verschijnt in het " ROI manager " venster die kan worden gebruikt voortdurend.
- Wanneer de selectie is aangepast, klik op " Ok " in het " definiëren van het platform " venster en herhaal de procedure totdat alle platformen zijn gedefinieerd.
Opmerking: Merk op dat een binaire image van het platform dat overeenkomt met het afgebakende gebied van ROI in wit op een zwarte achtergrond, met de naam " Platform_image_name.tif, " verscheen voor elke verwerkte beeld in dezelfde experimentele submap als de stack en projectie afbeeldingen gegenereerd stap 8.1.3 ( Figuur 1 d).
- Definiëren de vliegen minimumgrootte.
Opmerking: Deze instelling bepaalt de minimale vliegen grootte in pixels. Deeltjes die kleiner dan de opgegeven minimale grootte zijn zal worden uitgesloten van de analyse om te voorkomen dat valse positieven als gevolg van lawaai.- Open een afbeeldingsstapel gemaakt door de " maken van de stack en projectie " sub macro I.
- Converteren de afbeeldingsstapel naar 8-bit door te klikken op afbeelding > > Type > > 8-bit.
- Ga naar het menu, drukt u op afbeelding > > aanpassen > > drempel, zorg ervoor dat de " donkere achtergrond " vak is geselecteerd en druk op " toepassen; " een tweede venster genaamd " drempel " zal verschijnen. Klik op " donkere background " en druk op " Ok. "
Opmerking: een binaire afbeeldingsstapel ontstaat waarin de vliegen zijn gedefinieerd in het platform in wit en zwart. Wanneer dit niet het geval, van toepassing de " omkeren " functie door te klikken op bewerken > > omkeren > > uitvoeren. - Stel de schaal om het aantal pixels kan worden opgespoord door te klikken op analyseren > > schaal instellen. De volgende instellingen toe te passen: afstand in pixels = 1, bekend van afstand = 1, pixelverhouding = 1, en de eenheid van lengte = pixel. Druk op " Ok. "
- Selecteer de " Wand " (tracing) gereedschap in de werkbalk en klik op een vlieg (zwarte) aanwezig op het perron. Druk op ctrl + m (Windows-gebruikers) of cmd + m (Mac-gebruikers); een nieuwe " resultaten " venster geeft het gebied van de geselecteerde plek in pixels. Hiervoor achtereenvolgens voor verschillende vliegen en bepalen de vliegen minimumgrootte.
Opmerking: Wanneer u de macro uitvoert, stelt u de " vliegen minimumformaat " instelt op de kleinste waargenomen vliegen grootte minus een marge van 10%. ( figuur 2E).
- Lopen de " analyse " sub macro III te kwantificeren vliegt het platform ontsnappen.
- Ga naar de werkbalk, selecteer " Plugins, " en koos de " Drosophila eiland Assay. "
- aanpassen de " vliegen minimumformaat " instellen volgens de waarde die is gedefinieerd in stap 8.3.
Opmerking: Gebruik de waarde gedefinieerd in stap 8.3 alleen als de standaard instelling van " vliegen minimumformaat " zorgt ervoor dat uitsluiting van vliegen die waren aanwezig op het platform of als de macro achtergrond signaal speurder zoals vliegen. - In de " aantal vliegen per flacon " instellen, vult u het maximum aantal vliegen in de flesjes aanwezig tijdens het volledige experiment. Als een experiment heeft flesjes met 15 vliegen, anderen met 20 vliegen en anderen met 23 vliegen, bijvoorbeeld de " aantal vliegen per flacon " moet worden vermeld als 23.
- Selecteer de " analyseren " checkbox en druk op " Ok; " een nieuwe " Kies een map " venster zal verschijnen. Selecteer de hoofdmap (met alle submappen en bestanden binnen) en druk op " select. "
Opmerking: de macro zal analyseren alle afbeeldingen in de submappen opgeslagen zolang ze bevatten de " stack_image_name, " " Projection_image_name, " en " Platform_image_name " bestanden. De macro zal het verwerken van beeld naar beeld. De macro uitvoer bestaat uit een binair resultaat afbeeldingsstapel genaamd “ result_stack_subfolder_name.tif ” en een resultaat-tekstbestand genaamd " result_subfolder_name.txt, " die worden weergegeven in elke map gegevens. het resulterende tekstbestand (.txt) bevat kwantitatieve metingen overeenkomt met de afbeelding stack en bestaat uit 9 kolommen. De inhoud van deze kolommen is samengevat in tabel 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " komt overeen met de afbeelding-tijdreeksen van een experiment, waar vliegen gedetecteerd tijdens het experiment worden weergegeven als zwarte stippen op een witte achtergrond ( figuur 1E). - Zorgvuldig inspecteren de stack resultaat om ervoor te zorgen dat er geen artefacten hebben plaatsgevonden en dat de macro nauwkeurig gewerkt ( figuur 2F).
Opmerking: Voorbeelden van artefacten kunnen beeldelementen die niet vliegt maar die als zodanig worden gedetecteerd door de afbeelding segmentatie algoritme (valse positieven). Dit kan, bijvoorbeeld, zijn als gevolg van detectie van achtergrond signaal vanwege een onjuiste selectie van de ROI.
9. Data analyse met behulp " eiland Assay analyse "
- structuur de gegevens zoals aangegeven in de figuur 2A tot analyse met de " eiland Assay analyse " script. Genereren van een hoofdmap met submappen, waarbij elke submap die overeenkomt met een experimentele voorwaarde te analyseren.
- In de submappen, het genereren van mappen die bevatten de onafhankelijke experimentele replicatieonderzoeken ( figuur 2A) en de bestanden van de results.txt geproduceerd door de " Drosophila eiland assay " macro.
Opmerking: De " eiland Assay analyse " macro zal alle proefomstandigheden, gelegen in de hoofddirectory tegelijk verwerken. - Start R of R-studio. Tikken voort vijl > > Open bestand … in de werkbalk en selecteer de " eiland Assay analyse " script.
- Install pakketten bij het uitvoeren van de ggplot2 en de matrixStats de " eiland Assay analyse " script voor de eerste keer. Typ het volgende in het consolevenster:
> install.packages("ggplot2"), Voer
> install.packages("matrixStats"), voer.
- Install pakketten bij het uitvoeren van de ggplot2 en de matrixStats de " eiland Assay analyse " script voor de eerste keer. Typ het volgende in het consolevenster:
- Geef de locatie van de gegevens en analyses output-in het script bestanden. In het volgende script rijen invoegen:
- rij 16: invoegen van het pad naar de hoofdmap waarin de experimenten worden geanalyseerd en vergeleken (in figuur 2A, dit is het pad leiden naar de " eiland Assay " map).
- Rij 19: invoegen van het pad naar de map waarin de analyse output bestanden zijn opgeslagen.
Opmerking: De map aangegeven in rij 16 kan alleen bevatten de mappen moeten worden geanalyseerd. Het script ook werkt niet goed als hetzelfde zijn de paden ingevoegd in de rij 16 en rij 19.
- Het script uitvoeren door te klikken op de Code > > uitvoeren regio > > alle uitvoeren op de werkbalk.
Opmerking: Merk op dat de drie resulterende CSV-bestanden en een daaruit voortvloeiende txt-bestand ( figuur 1E) in de directory gedefinieerd in rij 19 verschijnen. Dit zijn: (I) de " data_all_conditions.csv " bestand bevat de verwerkte gegevens die overeenstemmen met elk experimentele conditie en experimentele replicaten, georganiseerd zoals beschreven in tabel 2. (II) de " statistieken summary.csv " bestand bevat een overzicht van de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van het percentage van vliegen op het platform voor elke voorwaarde die experimentele, het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). (III) de " AUC.csv " bestand bevat het oppervlak onder de kromme voor elke experimentele repliceren. (IV) afhankelijk van het aantal voorwaarden aanwezig in de hoofdmap, zal het script een export een " Welch_t-test_results.txt " bestand (2 voorwaarden) of een " AUC_anova_results.txt " bestand (meer dan 2 voorwaarden), waar de resultaten van de t-toets of ANOVA vergelijken het oppervlak onder de kromme tussen experimentele omstandigheden worden aangegeven. Merk op dat vier verschillende soorten TIFF-afbeeldingsbestanden ( figuur 1E) in het pad gedefinieerd in rij 19 weergegeven. Deze heten: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (waarbij Name_Of_Data_Folder staat voor de naam van de map die de gebruiker), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " en " AUC_anova.tiff. " gedetailleerde informatie over de inhoud van deze grafieken kunnen worden gevonden in de resultaten van de vertegenwoordiger van dit manuscript en in Figuur 3.
Representative Results
In het protocol beschreven zijn Drosophila eiland assay gegevens verkregen en verwerkt in drie stappen. Eerst is de vluchtreactie ontsnappen van Drosophila gegooid op het eilandstation opgenomen met een webcam en opgeslagen als afzonderlijke BMP-afbeeldingen (protocol afdelingen 1-7). Ten tweede, de"Drosophila eiland Assay" macro (stap 8) verwerkt de frames, het genereren van een "result.txt" tekstbestand (tabel 1), waarin het aantal objecten aangetroffen in elk frame wordt samengevat, en een afbeeldingsstapel "Result_stack.tiff," waaruit blijkt de objecten binnen het gebied van het platform in elk frame wordt gedetecteerd. Ten derde, het "Eiland Assay Analysis" script (protocol sectie 9) verwerkt de macro gegevens opgeslagen in de bestanden "results.txt" van individuele experimenten. Verschillende stappen worden verwerkt in het script om te filteren en de gegevens voor statistische analyse combineren. Het eerste frame waarin de vliegen zijn geworpen op het platform is gedetecteerd en beschouwd als tijdstip 1. Eerdere frames worden geëlimineerd uit de dataset. 100 frames na tijd punt 1 (overeenkomt met 10 s) zijn geselecteerd voor analyse. Experimenten waarin het oorspronkelijke aantal vliegen aangetroffen op het platform kleiner dan 5 is worden automatisch uitgesloten van de analyse, het elimineren van onbetrouwbare resultaten van ondermaatse experimenten. Experimenten waarin het oorspronkelijke aantal vliegen aangetroffen op het platform groter is dan de instelling van de "Number of vliegen per flacon" plus een tolerantie van 3 zijn eveneens uitgesloten. Dit elimineert datasets in welke lawaai geconstateerd deeltjes ten onrechte als vliegen. Het script berekent vervolgens het percentage van vliegen gedetecteerd voor elk punt van de tijd in vergelijking met het hoogste aantal vliegen gedetecteerd in de serie. Fouten in datasets veroorzaakt door vliegen lopen in en uit de ROI (gedetecteerd als een daling gevolgd door een toename van het percentage van vliegen op het platform na verloop van tijd) worden automatisch gecorrigeerd door ten aanzien van hen als consequent aanwezig op het perron in eerdere stadia . Alle repliceren datasets voor een specifieke experimentele aandoening die aanwezig in de hoofdmap waren zijn gecombineerd en geëxporteerd naar het bestand "data_all_conditions.csv". De kolommen vertegenwoordigen de variabelen beschreven in tabel 2. Het script zal een lijndiagram experimentele voorwaarde, genoemd naar de map met de gegevens ook exporteren. Deze grafiek toont het percentage van vliegen op het platform blijven na verloop van tijd (escape vluchtreactie) voor de experimentele repliceert aanwezig zijn in de desbetreffende map ()figuur 3A-B). De gemiddelde, SD en SEM voor elke experimentele voorwaarde worden berekend en samengevat in het bestand "Statistieken summary.csv". Een lijndiagram genaamd "Escape_response_all_conditions.tiff" toont de gemiddelde vlucht vluchtreactie voor maximaal 12 experimentele voorwaarden aanwezig in de hoofdmap ()Figuur 3 c). Tot slot is het oppervlak onder de kromme voor alle proefomstandigheden die aanwezig zijn in de hoofdmap berekend en samengevat in het bestand "AUC.csv". Afhankelijk van het aantal voorwaarden aanwezig in de hoofdmap, het script zal ofwel het uitvoeren van een tweezijdige ongepaarde Welch t-test (2 voorwaarden) of een ANOVA met Tukey correctie voor meerdere testen (meer dan 2 voorwaarden) om te bepalen of de experimentele voorwaarden verschillen aanzienlijk van elkaar. Deze resultaten zijn samengevat in "Welch_t-test_results.txt" of "AUC_anova_results.txt." Bij het uitvoeren van de ANOVA, zal het script een "AUC_anova.tiff"-bestand waarin het verschil in de gemiddelde AUC en de 95%-betrouwbaarheidsintervallen van de experimentele omstandigheden die worden vergeleken ook exporteren. De waarden van de absolute oppervlak onder de kromme van de experimentele replicatieonderzoeken voor alle proefomstandigheden worden weergegeven als afzonderlijke gegevenspunten met medianen in "AUC.tiff" (figuur 3D).
Ataxie Teleangiëctasie (AT) is een autosomaal recessieve bewegingsstoornis gekenmerkt door vroege begin van de cerebellaire ataxie als gevolg van mutaties in het gen ataxie Telangiectasia gemuteerd (ATM)14. Mutanten van de Drosophila orthologue van ATM, tefu, weergeven defecten in mobiliteit en levensduur15 Om te evalueren van de macro"Drosophila eiland Assay", een Drosophila model van AT is getest in de bepaling van het eiland, en de uitvoer van de gegevens van de macro werd vergeleken met handmatige gegevens graven. Uit de resultaten blijkt dat alomtegenwoordige tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) aanzienlijk vermindert het vermogen van deze vliegen te vertrekken het platform ten opzichte van hun genetische achtergrond controles (w-; Actin-Gal4/+) (,Figuur 4). Na 1 s, 50% van de vliegen controle ontsnapt waren het platform, in tegenstelling tot de < 1% van de tefu- RNAi vliegt. Nog belangrijker is, de gegevens die zijn verkregen met de macro trouw gereproduceerd de gegevens die zijn verkregen door handmatig tellen, die aangeeft dat de macro is een betrouwbaar hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor de kwantificering van eiland assay gegevens en de evaluatie van verkeer gebreken ( ) Figuur 4 A-B).
Figuur 1: stroomdiagram waarin de vereisten, experimentele procedure en analyse van de eiland-assay. (A) eiland assay apparatuur. (B) experimentele opstelling voor de bepaling van het eiland. (C) eiland assay. (D) verwerking van eiland assay gegevens gekoppeld aan de macro"Drosophila eiland Assay". De"Drosophila eiland Assay" macro is samengesteld uit 3 sub macro's: 1) het maken van stapel en projectie, 2) definiëren platform, en 3) analyse. (E) verwerking en statistische evaluatie van gegevens met behulp van het script "Eiland Assay Analysis". Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeelden van verschillende aanpassingen die nodig zijn tijdens het protocol. (A) de vereiste directory-structuur in welke eiland assay experimenten moeten worden opgeslagen voor gegevensverwerking en -analyse. (B) bij het aanpassen van de video-instellingen, vliegen moeten verschijnen zwart op een witte achtergrond. (C) Image frame uitvoerbestandenzoals gered door de beeldopname software beschreven in dit manuscript. (D) de gele overzicht toont de platform-selectie. De selectie van de opgeslagen platform in de "ROI-Manager" is gemarkeerd in blauw. (E) vliegen zijn als witte stippen vertegenwoordigd tijdens de aanpassing van de "minimale vliegen grootte instellen." Het venster geeft het gebied van de vliegen in pixels. (F) voorbeeld van een enkele opgenomen beeld frame (aan de linkerkant) en het bijbehorende frame in de resulterende afbeelding stack, verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay" (aan de rechterkant). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: resultaat beelden verkregen na verwerking van de gegevens met de "Eiland Assay Analysis" script. (A) lijn grafiek waarin de vluchtreactie ontsnappen voor elke controle experimentele repliceren. (B) lijn grafiek toont de vluchtreactie ontsnappen voor elke tefu RNAi experimentele repliceren. (C) gemiddelde ontsnappen vluchtreactie voor aangegeven experimentele omstandigheden; de foutbalken vertegenwoordigen de percelen van de SEM. (D) Dot het gebied onder de curve verdeling voor controle en mutant voorwaarden vertegenwoordigen. Experimentele replicatieonderzoeken voor beide tefu RNAi en de controlevoorwaarden worden weergegeven als afzonderlijke gegevenspunten (in zwart) met medianen (rode lijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Alomtegenwoordige tefu vechtpartij vliegen tonen een aanzienlijk verminderde capaciteit om te vertrekken het platform. De gegevens vertegenwoordigen het percentage van vliegen op het platform na verloop van tijd (s) voor controle (w-; Actin-Gal4/+) en tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) vliegt. (aantal replicatieonderzoeken = 5; de foutbalken vertegenwoordigen de SEM). (A) onbewerkte gegevens verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay". (B) Dot percelen die vertegenwoordigt het oppervlak onder de kromme-verdeling voor de controle en tefu RNAi omstandigheden verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay" (Welch ongepaarde t-test, ** p < 0,01). (C) onbewerkte gegevens verkregen door handmatig tellen het aantal vliegen die aanwezig zijn op het eiland per seconde. (D) Dot percelen die vertegenwoordigt het oppervlak onder de kromme verdeling voor controle en Tefu RNAi omstandigheden verkregen door het tellen van de hand (Welch ongepaarde t-test, ** p < 0,01). De foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kolomnaam | Beschrijving | ||
| Segment | De naam van het frame. | ||
| Graaf | Het aantal objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI). | ||
| Totale oppervlakte | Totale oppervlakte van de objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels. | ||
| Gemiddelde grootte | Totale oppervlakte van de objecten aangetroffen in het frame gedeeld door het aantal objecten binnen de grenzen van het platform (ROI). | ||
| % Gebied | Het percentage van ruimte bezet door de objecten ten opzichte van de totale oppervlakte van het platform (ROI). | ||
| Perim. | Totale omtrek van de objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels. | ||
| Min. grootte vliegen | Het minimum vliegen grootte instelling die is gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" (in pixels). | ||
| Gebied ROI | Het gebied van het platform (ROI), gedefinieerd door de gebruiker tijdens de duur van de sub macro definiëren platform (in pixels). | ||
| Aantal vliegen | Het aantal vliegen per experiment gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" gebruikt. | ||
Tabel 1: Parameters gemeten door de macro"Drosophila eiland Assay". De parameters die worden beschreven in deze tabel wordt weergegeven in het bestand "results.txt" tijdens het uitvoeren van de macro"Drosophila eiland Assay".
| Kolomnaam | Beschrijving | ||
| Segment | Framenummer. | ||
| Graaf | Het aantal vliegen gedetecteerd in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI). | ||
| X.Area | Totale oppervlakte van het vliegen gedetecteerd in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels. | ||
| Min. grootte vliegen | Het minimum vliegen grootte ingang instelling die is gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" (in pixels). | ||
| Gebied ROI | Het gebied van het platform (ROI, in pixels), gedefinieerd door de gebruiker wanneer de sub macro definieert"platform". | ||
| Aantal vliegen | Het aantal vliegen per experiment gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" gebruikt. | ||
| X.Count | % vliegt aanwezig op het perron in het respectieve segment/frame ten opzichte van het hoogste aantal vliegen aangetroffen op het platform tijdens experiment. | ||
| Timepoint | Tijdstip 1 vertegenwoordigt van het eerste frame worden geanalyseerd en komt overeen met het frame waar de vliegen voor het eerst op het platform verschijnen. Er zijn een totaal van 100 beelden per repliceren geanalyseerd (overeenkomt met 10 s, bij het gebruik van de beschreven instellingen. | ||
| Experiment | Aantal replicatieonderzoeken per voorwaarde. | ||
| Voorwaarde | Geeft de naam van de experimentele conditie (volgens de gebruiker gedefinieerde naam van de map met de gegevens). | ||
Tabel 2: beschrijving van de variabelen verkregen na verwerking van de gegevens met de "Eiland Assay Analysis" script. De parameters die worden beschreven in deze tabel worden weergegeven in het bestand "data_all_conditions.csv" bij het verwerken van de gegevens met het script "Eiland Assay Analysis".
Discussion
Dit protocol beschrijft de"Drosophila eiland Assay" macro die kwantitatief Drosophila motor gedrag tijdens de bepaling van het eiland beoordeelt. De macro telt nauwkeurig de vliegen op het platform na verloop van tijd, waardoor het eiland assay zeer gevoelig en geschikt voor kwantitatieve evaluatie van de high-throughput van motorische defecten. De methodologie voorziet de vergelijking van enige voorwaarde, met vliegen gegroeid onder verschillende genetische en/of milieu-omstandigheden, met inbegrip van drug blootstelling. Deze uitlezing is dus vooral handig als ontdekkingshulpmiddel bij het uitvoeren van grote genetische of farmaceutische schermen, bij de studie van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten, of bij het onderzoek van motoriek of vlucht gedrag.
Het eiland assay protocol gepresenteerd in dit manuscript biedt voordelen ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden. Video-tracking motoriek is bijvoorbeeld veel meer tijd in beslag en minder geschikt voor het testen van grote steekproeven. De bepaling van het eiland is een high-throughput screening tool, en, in die zin is vergelijkbaar met de snelle interactieve negatieve geotaxis (RING) assay16. Het verschil tussen de twee is dat het eiland testen mogelijk maakt voor de detectie van een breder scala van motorische problemen; het onvermogen van vliegen om te vertrekken het platform kan worden veroorzaakt door gebreken in vlucht, springen, of wandelen gedrag veroorzaakt door vleugel (spier/neuronale) en/of been (spier/neuronale) gebreken. Aan de andere kant, beoordeelt de RING assay gebreken in beklimmen/wandelen gedrag veroorzaakt door gebreken van het been (spier/neuronale). In het geval dat gebruikers zijn geïnteresseerd in meerdere gedrags uitlezingen, kan de bepaling van het eiland ook gemakkelijk gecombineerd worden met andere testen, zoals de bepaling van de RING. Bovendien, lasers vereist voor optogenetics kunnen gemakkelijk geinstalleerd worden in het eiland assay vak, en de installatie is zo eenvoudig dat het gemakkelijk kan worden verplaatst naar een kamer waar temperatuur en licht kunnen worden gecontroleerd.
Om ervoor te zorgen het succes en de reproduceerbaarheid van de test van de eiland hier beschreven, moeten verscheidene aanbevelingen worden opgevolgd. Aliquot en overdracht de vliegen op de experimentele proef flesjes op ten minste één dag voor het experiment om de effecten van CO2 of koude anesthesie te voorkomen. Niet de experimentele flesjes doen overcrowd (gebruik 10-15 vliegen per flacon; het is het beste om altijd hetzelfde aantal vliegen per flacon). Houd de vliegen op vers voedsel te allen tijde. Als dit niet nog vertrouwd zijn met het uitvoeren van de bepaling, praktijk gooien vliegt op het platform te maximaliseren van het rendement. Ook de praktijk snel intrekken de hand vlak daarna, zoals het interfereert met de data-analyse (beeldanalyse en vlieg tellen start pas na de hand uit het beeld). Houden van de milieu- en experimentele voorwaarden identiek in experimenten die moeten worden vergeleken (bijvoorbeeld besturingselementen versus mutanten of een genotype getest op verschillende leeftijden). Altijd op hetzelfde moment van de dag uit te voeren van de experimenten en onderhouden van de flesjes onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Test voor statistisch onderscheidingsvermogen, ten minste drie technische replicatieonderzoeken per biologische repliceren.
Voor het succesvol vervullen van de macro beschreven hier, webcam en beeld instellingen moeten worden aangepast om te bereiken maximale contrast: vliegt verschijnen als zwarte objecten op een wit platform. Wanneer het aantal vliegen is niet goed geteld door de macro, aanpassen van de instellingen voor contrast, Controleer of de ROI goed is geselecteerd, en ervoor zorgen dat de grootte van het vliegen op het platform boven het opgegeven minimum vliegen grootte instellen (zie stap 8.3 van dit protocol). De instellingen moeten slechts één keer worden gedefinieerd. Zij gelden voor alle experimenten, zo lang als de afstand tussen de webcam en het platform is niet veranderd. De Circularity_min en max instellingen definiëren de cirkelvormigheid van de deeltjes (deeltjes = getelde vliegen) dat zal worden in aanmerking genomen voor de analyse (vliegt = getelde objecten). 1 staat een perfecte cirkel, en 0 voor een lijn17. Aangezien de vliegen leggen altijd een zekere mate van cirkelvormigheid (een vlieg kan niet worden weergegeven als een rechte lijn), de "Circularity_max" is ingesteld op 1 en de "Circularity_min" is ingesteld op 0.4. Het is onwaarschijnlijk dat de gebruiker moet deze instellingen aanpassen.
De macro maakt af en toe tellen fouten wanneer een vlieg dicht bij de grens van het platform ligt. Dit kan gebeuren als de vliegen niet maar lopen in en uit de door de gebruiker gedefinieerde ROI vliegen. In de meeste gevallen kan u de ROI (montage zo veel mogelijk op het platform) gemakkelijk oplossen zulks uitvaardiging. Echter, het "Eiland Assay Analysis" script is kundig voor speurder en juiste onjuiste gegevens graven veroorzaakt door vliegen lopen in en uit de ROI relatief goed. Hoewel de resolutie van de webcam die hier gepresenteerd hoog genoeg om te vliegen in de nabijheid vrij goed te discrimineren is, hebben wij aanvullende algoritmen in de veredeling van de afbeelding van de"Drosophila eiland Assay" macro, zoals de waterscheiding en eroderen functie17. Dit vergemakkelijkt de juiste afbakening van vliegen die dicht op het platform zijn. Bovendien de macro kan onderscheid maken tussen vliegen die sprong van het platform of vloog weg. Het is echter over het algemeen waargenomen dat gezonde jonge vliegen stammen vliegen weg zodra neergezet op het platform, terwijl oudere vliegen en vliegen met motorische tekorten langer op het platform blijven en zal uiteindelijk springen of vallen van het platform. Ondanks deze beperkingen bieden de bepaling en analyse een zeer nauwkeurige maatstaf van locomotor gedrag.
Om ervoor te zorgen de succesvolle uitvoering van het script "Eiland Assay Analysis", heeft de gebruiker om ervoor te zorgen om de juiste paden voor de input- en output-bestanden in de rijen van de script vermeld in het protocol en de gegevens te verstrekken in de juiste map-indeling (zoals aangegeven in Figuur 2). Als de gebruiker vindt de criteria gebruikt om te filteren op onbetrouwbare experimentele gegevens te streng (rij 68: de eerste waarde in de kolom "Count" is kleiner dan of gelijk aan 5; 71 rij: de eerste waarde in de kolom "Aantal" is hoger dan het totale aantal vliegen geworpen op de platfo RM + 3), zet deze filterinstellingen door toevoeging van een # vóór de tekst in de rijen 68 en 71 in het script van "Eiland Assay Analysis". In dit geval zal alle datasets in de analyse worden meegenomen. U kunt ook kunnen filterinstellingen worden gewijzigd door de waarden in de rijen 68 en 71 volgens de behoeften van de gebruikers aan te passen. Mogelijke artefacten in de waarden in de "results.txt" gegenereerd door de"Drosophila eiland Assay" macro tellen kunnen ook handmatig worden aangepast, en het script opnieuw kan worden uitgevoerd op de gecorrigeerde gegevens. Wanneer de gebruiker is geïnteresseerd in het verwerken van meer dan 10 fps, of meer dan 10 s van gegevens, het aantal frames dat door het "Eiland Assay Analysis" script verwerkt moetworden aangepast. De statistische analyse kan ook worden vervangen door gebruiker gedefinieerde alternatieven.
Een map met de naam "Voorbeelden eiland Assay," met voorbeelden met afbeelding-tijdreeksen verkregen met behulp van het eiland assay, kan worden gevonden op de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download de folder "Voorbeelden eiland Assay" en volg de stappen die worden beschreven in dit protocol te snel vertrouwd worden gemaakt met de structuur van de opslag van het dossier, de verwerking van de beelden met de macro "Drosophila eiland assay" en de "eiland Assay analyse" script.
Het eiland assay, kan in combinatie met de ontwikkelde macro en analyse script, worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van het gedrag van de abnormale beweging van een Drosophila model van ataxie Telangiectasia. Aangezien de bepaling kan efficiënt worden toegepast op verschillende leeftijden, is het zeer geschikt voor het analyseren van de mogelijk progressieve aard van fenotypen.
Kortom is het eiland assay, in combinatie met de macro"Drosophila eiland Assay" en het "Eiland Assay Analysis" script, een zeer efficiënte, kosteneffectieve en betrouwbare test voor objectief analyseren en kwantificeren van motorische defecten van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen in zodanig hoge gegevensdoorvoer.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij erkennen de Vienna Drosophila Resource Center en het Bloomington Drosophila voorraad center (NIH P40OD018537) voor het verstrekken van Drosophila stammen. We zijn dankbaar naar het Klämbt-laboratorium voor het introduceren van ons aan de bepaling van het eiland en Martijn Eidhof voor het bouwen van de eiland assay setup. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de E-zeldzame-3 gemeenschappelijke transnationale oproep verlenen "Voorbereiding van therapieën op autosomaal recessieve Ataxieën" voorbereiden (NWO 9003037604), door een TOP subsidie (912-12-109) van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO), en door twee DCN/Radboud University Medical Center PhD-beurzen. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
