Summary
Die Insel-Assay ist ein relativ neuer, kostengünstiger Assay, der verwendet werden, um der Bewegungsorgane Grundverhalten von Drosophila Melanogasterzu bewerten. Dieses Manuskript beschreibt Algorithmen für die automatische Datenverarbeitung und objektive Quantifizierung der Insel Assay Daten, so dass dies eine sensible, Hochdurchsatz-Auslesen für große genetische oder pharmakologische Bildschirme assay.
Abstract
Fortschritte in der Next Generation Sequencing Technologien dazu beitragen, die Identifizierung von Krankheitsgenen (Kandidat) für Bewegungsstörungen und anderen neurologischen Erkrankungen mit einer zunehmenden Geschwindigkeit. Jedoch ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die diese Störungen zugrunde liegen. Die genetische, molekulare und Verhaltensstörungen Toolbox von Drosophila Melanogaster macht dieses Modellorganismus besonders nützlich, um neue Krankheitsgene und Mechanismen in gewissem Sinne Hochdurchsatz-charakterisieren. Trotzdem, Hochdurchsatz-Bildschirme benötigen effiziente und zuverlässige Assays, die im Idealfall sind kostengünstige und ermöglichen die automatisierte Quantifizierung der Merkmale relevant für diese Erkrankungen. Die Insel-Assay ist eine kostengünstige und einfach Setup Methode, Drosophila lokomotorische Verhalten zu bewerten. In diesem Test sind fliegen auf einer Plattform aus eine feste Höhe ausgelöst. Dies führt zu eine angeborene motorische Reaktion, die die fliegen zu entkommen, die Plattform innerhalb von Sekunden ermöglicht. Zur Zeit sind Quantitative Analysen von gefilmten Insel Assays manuell, erfolgt die eine mühsame Aufgabe, besonders bei großen Bildschirmen.
Dieses Manuskript beschreibt die"Drosophila Insel Assay" und "Insel-Assay-Analyse" Algorithmen für Hochdurchsatz-, automatisierte Datenverarbeitung und Quantifizierung der Insel Assay Daten. Im Setup sammelt eine einfache Webcam an einen Laptop angeschlossen eine Bilderserie der Plattform, während der Test durchgeführt wird. Der"Drosophila Insel Assay" Algorithmus entwickelt für Open-Source-Software Fidschi verarbeitet diese Bildserien und quantifiziert, für jede experimentelle Bedingung, die Anzahl der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit. Das "Insel-Assay-Analyse"-Skript, kompatibel mit der kostenlosen Software R, entwickelte sich die gewonnenen Daten automatisch zu verarbeiten und zu berechnen, ob Behandlungen/Genotypen statistisch unterschiedlich sind. Dies verbessert die Effizienz des Insel-Assays und macht es eine leistungsfähige Auslesen für grundlegende Fortbewegung und Flugverhalten. Es kann somit auf großen Bildschirmen Untersuchung fliegen Bewegungsorgane Fähigkeit, Drosophila Modelle von Bewegungsstörungen und Wirksamkeit von Arzneimitteln angewendet werden.
Introduction
In den letzten Jahren haben Fortschritte in der nächsten Generation Sequenziertechnologien zur Identifizierung von Genen, die zugrundeliegenden degenerativen Bewegungsstörungen des Gehirns (z.B., zerebelläre Ataxie und Parkinson), des peripheren neuronalen wesentlich beigetragen. Herkunft (z.B. Amyotrophe Lateralsklerose und erbliche spastische Paraplegie), und von muskulären Ursprungs (z. B. Duchenne-Muskeldystrophie und myotonische Dystrophie)1,2,3,4 . Trotz dieser bekannt wenig über die molekularen Mechanismen, die meisten dieser Störungen zugrunde liegen. Ein besseres Verständnis dieser Mechanismen ist wichtig, Therapien zu entwickeln.
Wie beim Menschen ist Bewegung in Modellorganismen wie Flug und Fortbewegung in Drosophila, die zentrales Gehirn, peripheren Nervensystem und Muskeln gesteuert. Darüber hinaus machen die schnelle Generationsdauer und genetischen Werkzeugkasten von Drosophila diesem Modellorganismus besonders geeignet für den Hochdurchsatz-Screening von Genen beteiligt in Bewegungsstörungen und für Drogentests5,6 . Aufgrund der erheblichen Zahl von Bedingungen, die in solche Bildschirme, zuverlässige, kostengünstige, und relativ einfache Assays sowie Werkzeuge, um die Ausgabeergebnisse in automatisierter Weise quantifizieren geprüft werden müssen, sind höchst wünschenswert.
Schmidt Et al. (2012) 7 beschrieben einen Low-Cost-Test genannt "Insel-Assay", Drosophila lokomotorische Verhalten zu bewerten. Die Insel-Assay wurde erfolgreich in großen Vorführungen eingesetzt Gene zu identifizieren, mit Glia-spezifische Funktionen7, bei der Bewertung der Drosophila -Modelle von geistiger Behinderung8und für die allgemeine Bewertung des Fliegen Sie motor Verhalten9. Prinzip besteht des Insel-Assays aus einer erhöhten Plattform, auf der mehrere fliegen geworfen werden. Dies führt zu eine angeborene motor Verhalten, die gesunde fliegen zu entkommen, die Plattform innerhalb von Sekunden ermöglicht. Der Test misst die Anzahl der fliegen noch auf der Plattform über Zeit7,8,9. Diese Eigenschaften zeigen, dass die Insel-Assay ein leistungsfähiges Screening-Tool für Bewegungsstörungen beteiligten Gene sein kann.
Derzeit erfolgt die Quantitative Analyse der gefilmten Insel Assay Daten manuell7,8,9. Zur Verbesserung der Effizienz des Assays wurde eine Low-Cost-Methode entwickelt, um semi-automatisch die Flucht von fliegen von der Plattform zu quantifizieren. Das Setup verwendet eine einfache Webcam an einen Laptop angeschlossen Bild Zeit Reihe von der Plattform, mit Frames pro 0,1 erwarb S. Bilder dann mit dem"Drosophila Insel Assay" Makro verarbeitet werden zu sammeln, die die Anzahl der fliegen auf der Plattform über quantifiziert Zeit. Das Makro"Drosophila Insel Assay" gliedert sich in drei unabhängige Sub Makros: (I) die "Create Stack und Projektion," Sub-Macro identifiziert verschiedene Insel Experimente in verschiedenen Unterordnern gespeichert und schafft einen Stapel und eine Projektion der einzelnen Zeitreihen. (II) die "Plattform definieren" Sub-Macro öffnet nacheinander alle "Projection_image_name.tif" Dateien in den einzelnen experimentellen Unterordnern, an welcher, die Stelle der Benutzer angefordert wird, um manuell den Inselbahnsteig als der Region of Interest (ROI) zu definieren. (III) "Analyse" wird automatisch die Anzahl der fliegen bleibt auf der Plattform während der Zeitreihe quantifiziert. Die Sub-Makros ausgeführt werden können, nacheinander (in einem Durchgang) oder unabhängig. Für statistische Datenanalyse wurde ein Skript entwickelt, die gewonnenen Daten automatisch zu verarbeiten und anzuwenden einen statistischen Test um festzustellen, ob Behandlungen/Genotypen signifikant verschieden von einander (Abbildung 1) Verhalten. Schließlich wird gezeigt, dass diese Einrichtung zu bewerten und zu quantifizieren die aberrante Bewegungsorgane Fähigkeit eines Drosophila -Modells für Ataxia Telangiectasia (AT) verwendet werden kann.
Protocol
1. Bau der Insel-Assay-Box
- bereiten Sie ein Tablett, hergestellt aus einem robusten Material, wie Poly-Methyl-Methacrylat (PMMA), eine Schicht des Wassers (d.h. ein Bad) enthalten. Stellen Sie sicher, dass das Material nicht weiß ist.
Hinweis: Abmessungen von 40 x 35 x 2,5 cm 3 sind zu empfehlen ( Abbildung 1A). - Bereiten Sie eine Box (42 X 38 X 25 cm 3) aus eine robuste, transparente Material wie PMMA, um das Bad zu verhindern, dass die fliegen Flucht in den Labor-Raum platziert werden. Legen Sie ein Loch (20 x 30 cm 2) an der lateralen Seite, die groß genug für den Experimentator leicht handhaben die Fläschchen mit fliegen und Ablegen auf der Insel ( Abbildung 1A).
- Bereite eine erhöhte Plattform 10 x 15 x 2,5 cm 3 Dimension, gemacht aus einem undurchlässigen Material (PMMA oder Plastik), die wasserdicht ist.
Hinweis: Diese Plattform ist erforderlich, um eine gleichmäßige weiße Oberfläche für guten Kontrast zur Bildanalyse zu gewährleisten haben. Die Größe ist nicht unbedingt festgelegt, aber es sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass alle fliegen zunächst auf der Plattform landen und die Chance erhalten, darauf ( Abbildung 1A) laufen. - Die Plattform zu beheben, indem entweder kleben es in dem Bad oder platzieren Gewichte oder andere schwere Gegenstände innerhalb der Plattform Box Positionsänderungen der Plattform bei der experimentellen/Dreharbeiten Sitzung zu verhindern.
2. Software-Voraussetzungen und Installation
- Installation von Bild-Recording-Software. Download Bild-Aufnahme-Software zum Aufzeichnen der Insel Bildreihe (siehe Materialtabelle) und installieren Sie die Software auf einem Computer
- .
Hinweis: Die Imaging-Recording-Software beschrieben in diesem Protokoll wird nur von Windows unterstützt. Eine Alternative für andere Benutzer wurde hinzugefügt, um die Materialtabelle.
- Download der " Drosophila Insel Assay " Makro und die kompatiblen Fidschi 10-Version (1.4 oder höher) von der folgenden Website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- Bewegen Sie den Cursor auf der " Insel Assay " Verzeichnis und klicken Sie auf " Blick. "
- Klicken Sie auf " herunterladen alle. " der Inhalt des Ordners wird als ZIP-Datei heruntergeladen werden, entpacken Sie die heruntergeladene Datei.
- Kopie der " Drosophila Insel Assay.ijm " Datei in " Fiji.app/plugins/directory. "
Hinweis: Beim Start Fidschi, die " Drosophila Insel Assay " Makro erscheint am unteren Rand das Dropdown-Menü Plugins.
- Download R 11 von der folgenden Website: https://cran.rstudio.com. Auf einem Computer zu installieren.
- Download R-Studio von der folgenden Website: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Auf einem Computer zu installieren.
Hinweis: Die " Insel Testauswertung " Skript nur mit R ausgeführt werden kann. R-Studio, mit seinen einfachere Benutzeroberfläche präsentiert sich als alternative Schritt für Benutzer unerfahren mit R. - Download der " Insel Assay Analyse " Skript aus der " Drosophila Insel Assay " Verzeichnis auf der folgenden Website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
Hinweis: nach Schritt 2.2, die " Insel Assay Analyse " Skript finden Sie auch in den entpackten Ordner mit dem Namen " Insel Assay. "
3. Vorbereitung der fliegen, in der Insel-Assay getestet werden
- sammeln inszeniert fliegen für jede experimentelle Bedingung unter kalten oder Kohlendioxid (CO 2) Anästhesie, wie zuvor beschrieben 13 (über einen Zeitraum von 1 - 2 Tage).
- Bereiten Sie ein Minimum von 3 Probenfläschchen pro Versuchsbedingung, fliegt jeweils ca. 15 inszeniert. Verwenden Sie nur fliegt mit intakten Flügel und sind ähnlich wie Alter und Geschlecht.
Hinweis: Für die hier beschriebenen Experimente 5 Probe Fläschchen mit 15 männlichen fliegen der Genotypen w -; Aktin-Gal4 / + (Kontrolle) und w -; Aktin-Gal4/GD11950 (Tefu RNAi) wurden am Tag des Bewegungsapparate, im Alter von 4 Tagen abgeholt und wurden verwendet, um die Insel-Test durchführen. RNAi, Vergleichslinien und der Aktin-gal4-Fahrer wurden von einem kommerziellen erhalten (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie ein Minimum von 3 Probenfläschchen pro Versuchsbedingung, fliegt jeweils ca. 15 inszeniert. Verwenden Sie nur fliegt mit intakten Flügel und sind ähnlich wie Alter und Geschlecht.
- Die fliegen zu erholen, um Effekte aus der Anästhetika zu vermeiden lassen (mindestens 1 Tag bei der Verwendung von CO 2) vor der Prüfung der gesammelten Flies in der Insel-Test im Alter von Interesse.
4. Versuchsaufbau
Hinweis: siehe Abbildung 1 b.
- Der Bad-Behälter kaltes Wasser mit einer kleinen Menge Seife hinzu und positionieren Sie die Plattform in der Mitte.
Hinweis: Die Seife verringert die Oberflächenspannung des Wassers; fliegen, die das Wasser berühren werden ertrinken. Dies verhindert, dass größere Mengen von Fliegen fliegen im Feld während der Progression der experimentellen Session. - Platzieren Sie die transparente Box auf den Behälter und die Plattform von oben mit einer Lampe zu beleuchten.
Hinweis: Beleuchtung der Plattform ist vor allem erforderlich, um richtige video Kontrast sicherzustellen. Eine normale 12-V-LED-Leuchte eignet sich dafür. - Position der Webcam direkt über der Plattform (außerhalb der Box) und an einen Computer anschließen.
- Erstellen Sie neue Ordner auf dem Computer zum Speichern der verschiedenen experimentellen Daten vor den Experimenten.
- Folgen verdeutlicht die Struktur des Beispiels in Abbildung 2A um den Ordner zu erstellen. Beispielsweise wenn das experimentelle Design zwei Genotypen mit fünf Wiederholungen Tests erfordert, zuerst erstellen Sie einen Haupt-Ordner mit dem Datum des Experiments. Erstellen Sie in den Hauptordner zwei Unterordner (einer pro Genotyp). In den Genotyp-Ordnern erstellen fünf neue Unterordner pro replizieren.
Hinweis: Zur weiteren Analyse, es ist wichtig, dass die Bildserie entspricht der einzelnen Experimente in Ordnern mit eindeutigen Namen gespeichert werden.
- Folgen verdeutlicht die Struktur des Beispiels in Abbildung 2A um den Ordner zu erstellen. Beispielsweise wenn das experimentelle Design zwei Genotypen mit fünf Wiederholungen Tests erfordert, zuerst erstellen Sie einen Haupt-Ordner mit dem Datum des Experiments. Erstellen Sie in den Hauptordner zwei Unterordner (einer pro Genotyp). In den Genotyp-Ordnern erstellen fünf neue Unterordner pro replizieren.
5. Video Einstellungen Setup in die " Capture-Gerät " Abschnitt des Interface
- öffnen die Bild-Aufnahme-Software und unter die " Capture " Registerkarte, klicken Sie auf " Time-Lapse Bilder … " und wählen Sie die entsprechende Webcam als die " Capture-Gerät. "
- legen Sie eine tote Fliege auf die Insel, passen Sie die video-Einstellungen durch Klicken auf die " Video-Einstellungen " Feld. Blättern Sie durch die Werkzeugleisten, Helligkeit, Kontrast, und Farbe in einer Art und Weise, dass die tote Fliege schwarz auf weißem Hintergrund ( Abb. 2 b) angezeigt wird. Wenn die Einstellungen abgeschlossen sind, klicken Sie " Ok. "
6. Aufnahme und Video speichern Einstellungen Setup in der " Time-Lapse " Abschnitt des Interface
< Ol>Hinweis: die video-Datei wird nicht für die Quantifizierung von Daten verwendet, aber es könnte nützlich sein, einen Überblick zu bekommen über das Experiment.
- Wählen Sie im Feld Kompression " Intel IYUV Code " für video-Kompression und wählen Sie " nehmen einen Frame alle 0,1 Sekunden, " mit der " Wiedergabe-Rate (Bilder pro Sekunde): " um 10.
- Speichern die Experiment-Zeitreihen als .bmp Bilder durch Anklicken " Advanced … " wählen Sie " eine BMP-Bild zu erstellen, denn jeder Frame erfasst " klicken Sie auf " durchsuchen. " wählen Sie im gleichen Verzeichnis die " Filmaufnahmen während AVI " Fenster (wie gewählt wird in Schritt 6.1), klicken Sie auf " offen, ", und drücken Sie " "OK". "
Hinweis: Beachten Sie, dass während des Versuchs, die Frames als BMP-Dateien (erforderlich für die Datenanalyse) gespeichert sind. Das Programm benennt die Frames als " A " gefolgt von der Nummer entsprechend der Frame Capture Reihenfolge (z. B. " A_number.bmp ") ( Abbildung 2). Immer speichern Sie die Bilder, die Zugehörigkeit zu verschiedenen Experimenten in einem neuen Ordner, um sicherzustellen, dass die zuvor aufgenommenen Bildserien nicht überschrieben werden. Beachten Sie, dass die Bilder im selben Ordner wie die Videodatei nicht automatisch gespeichert werden, es sei denn, dieser Ordner unter ausgewählt ist " durchsuchen … " beim Anklicken der " Advanced " Box.
7. Insel-Assay und Datenerfassung
- drücken Sie die Schaltfläche "Start" im Zeitraffer Bild Interface der Bild-Aufnahme-Software um die Aufnahme zu starten.
- Tippen Sie auf die experimentelle Fläschchen mit fliegen (Schritt 3) 2 - 3 Mal um sicherzustellen, dass die fliegen an der Unterseite der Flasche sind. Schnell ziehen Sie den Netzstecker des Fläschchens und mit einer kräftigen Bewegung, klopfen Sie das Fläschchen auf der Plattform, so dass alle fliegen zur gleichen Zeit ( Abbildung 1) auf die Plattform fallen.
- Nach ca. 30 s, drücken Sie die " beenden " Taste zum Beenden der Aufnahme.
Hinweis: Wenn alle fliegen von der Plattform verschwinden, die Aufzeichnung kann gestoppt werden früher. - Entfernen, die fliegen, die bleiben für 30 s auf der Plattform von Hand nach dem Absetzen der Bildaufzeichnung.
- Vor der Aufnahme des nächsten Versuch, ändern Sie das Zielverzeichnis für die BMP-Dateien und Filme (siehe Abschnitt 6).
8. Datenverarbeitung: Läuft die " Drosophila Insel Assay " Makro
Hinweis: siehe Abbildung 1.
- Laufen die " erstellen Sie Stapel und Projektion " Sub-Macro ich, Stacks und Projektionen von den gesammelten Bildserien zu produzieren.
- Start Fidschi, klicken Sie auf " Plugins " in der Symbolleiste, und wählen Sie " Drosophila Insel Assay " im Dropdown-Menü, erscheint ein neues Fenster.
- Geben Sie die " erstes Bild Zeitreihen Bezeichner " Einstellung in der grafischen Oberfläche Makro.
Hinweis: Die aufgezeichneten Bildrahmen werden gespeichert als " A-number.bmp " entsprechend der Reihenfolge in der die Bilder stammen. In der " zuerst Rahmen Bezeichner " Makro-Schnittstelle, füllen Sie die Einstellung mit der Nummer, die das erste Bild vom Programm und mit der Dateierweiterung. Füllen " erster frame ID " mit "-0001.bmp, " Da der erste Frame heißt " A-0001.bmp " ( Abbildung 2). Für den Fall, dass andere Bildformate (z.B. TIFF oder JPEG) von der Webcam-Software generiert werden, geben Sie die richtige Datei-Endung des ersten Bildes in " erstes Bild Zeitreihen Bezeichner. " - Wählen Sie nur die " erstellen Sie Stapel und Projektion " Sub-Macro, klicken Sie auf " Ok, ", und wählen Sie das Hauptverzeichnis, das alle Unterordner mit einzelnen Insel Assay Experimente enthält.
Hinweis: Die BMP-Dateien in jedem einzelnen experimentieren Ordner, enthalten die " zuerst Rahmen Bezeichner " nachträglich bearbeitet werden. Zwei neue Dateien erscheinen in jeder einzelnen Experiment Unterordner namens standardmäßig " Stack_image_name.tif " und " Projection_image_name.tif " ( Abbildung 1). Nachdem Sie diesen Schritt ausgeführt haben, können die BMP-Dateien gelöscht werden. Stack und Projektion .tif-Dateien enthalten alle Daten und sind ausreichend für die weitere Analyse.
- Laufen die " definieren Plattform " Sub-Macro II um die genaue Lage der Plattform auszuwählen.
- Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche von der " Drosophila-Insel-Assay, " wählen Sie nur die " definieren Plattform " Kontrollkästchen, und drücken Sie " "OK". "
- In der " wählen Sie ein Verzeichnis " Fenster, wählen Sie das Hauptverzeichnis wo experimentelle Unterordnern gespeichert sind, und drücken Sie " Select. "
Hinweis: die " definieren Plattform " Sub-Macro sucht automatisch nach " Projection_image_name.tif " Dateien in alle Unterordner im Hauptverzeichnis gespeichert. Die " Projection_image_name.tif " in den ersten Ordner, zusammen mit zwei Windows gespeichertes Bild — " definieren die Plattform " und " ROI-Manager " — öffnet sich. - Wählen Sie die " Polygon-Selektionen " Werkzeug in der Werkzeugleiste, um eine Auswahl zu zeichnen, die den Inselbahnsteig entspricht.
Hinweis: Es ist sehr wichtig, die Grenze der Plattform von der Auswahl ausschließen. Siehe Abbildung 2D. - Nach der Auswahl der Plattform im ersten Bild, klicken Sie auf " hinzufügen " in die " ROI Manager " Fenster; der ausgewählte Bereich wird als eine Reihe von Werten ( Abb. 2D) im ROI-Manager-Fenster angezeigt. Presse " Ok " in die " definieren die Plattform " Fenster. Das Makro wird fortgesetzt, um die nächste Projektion.
- Klicken Sie auf die Zahlen ( Abb. 2D) gespeichert den " ROI-Manager " Fenster; die vorherige Auswahl wird dann automatisch in das aktuelle Bildprojektion erscheinen.
Hinweis: seit der Insel Plattform wird voraussichtlich haben die gleiche Größe und Position, wenn Experimente hintereinander ausgeführt werden (solange die Position der Webcam und der Insel bleiben unverändert), es empfiehlt sich, den ROI definieren die Plattform in speichern die " ROI Manager. " durch auf diese Weise spart der Benutzer Zeit; in den kommenden Projektionen, es ist nur notwendig, die temporär gespeicherten Auswahl im ROI-Manager klicken Sie auf. - Wenn die Position der Insel leicht im Vergleich zum vorherigen Experiment verschoben, passen Sie die Position der Markierung in der Mitte der Auswahl mit der linken Maustaste und ziehen den ausgewählten Bereich in die gewünschte Position.
- Entspricht die Auswahl nicht mit der Plattform mit der linken Maustaste außerhalb der Markierung und Abgrenzung für die Nutzung der Plattform eine neue Selektion der " Polygonauswahl " Werkzeug. Speichern Sie die neue Auswahl in der ROI-Manager durch Klicken auf " hinzufügen; " eine neue Auswahl erscheint der " ROI-Manager " Fenster, die ständig verwendet werden kann.
- Wenn die Auswahl eingestellt ist, klicken Sie " Ok " in die " definieren die Plattform " Fenster und wiederholen Sie die Prozedur, bis alle Plattformen definiert sind.
Hinweis: Beachten Sie, die ein binäres Bild der entsprechende Bereichs abgegrenzten ROI in weiß auf schwarzem Hintergrund, Plattform namens " Platform_image_name.tif, " für jedes bearbeitete Bild in der gleichen experimentellen Unterordner als Stapel und Projektion erschienen Bilder Schritt 8.1.3 ( Abbildung 1).
- Definieren die Mindestgröße fliegende.
Hinweis: Diese Einstellung definiert die minimale fliegende Größe in Pixeln. Partikel, die kleiner als die angegebene minimale Größe werden von der Analyse, Fehlalarme durch Lärm zu vermeiden ausgeschlossen.- Ein Bildstapel erstellt durch Öffnen der " erstellen Sie Stapel und Projektion " Sub-Macro I.
- Konvertieren den Bildstapel zu 8-Bit durch Klick auf Bild > > Art > > 8-Bit.
- Gehen Sie zum Menü, drücken Sie auf Bild > > Adjust > > Schwelle, stellen sicher, dass die " dunklen Hintergrund " Feld ausgewählt ist, und drücken Sie " anwenden; " ein zweites Fenster namens " Schwelle " erscheint. Klicken Sie auf " dunkle HintergUnd ", und drücken Sie " Ok. "
Hinweis: ein binäres Bildstapel erstellt werden, in der die fliegen in schwarz und in weiß-Plattform definiert sind. Wenn dies nicht der Fall ist, gelten die " umkehren " Funktion durch Klicken auf Edit > > invertieren > > laufen. - Legen Sie den Maßstab, die Anzahl der Pixel zu erkennen, indem Sie auf Analyze > > Skala festgelegt. Wenden Sie die folgenden Einstellungen: Abstand in Pixel = 1, bekannt Distanz = 1, Pixel-Seitenverhältnis = 1 und Längeneinheit = Pixel. Presse " Ok. "
- Wählen Sie die " Wand " (Tracing)-Tool in der Symbolleiste und klicken Sie auf eine Fliege (schwarzer Punkt), auf der Plattform vorhanden. Drücken Sie Strg + m (Windows-Benutzer) oder Cmd + m (Mac-Nutzer); eine neue " Ergebnisse " Fenster zeigt den Bereich der ausgewählten Stelle in Pixel. Hierzu nacheinander für mehrere fliegen und bestimmen die Mindestgröße fliegende.
Hinweis: Wenn Sie das Makro ausführen, setzen die " fliegen Mindestgröße " auf die kleinste Größe der beobachteten fliegen abzüglich einer Marge von 10 %. ( Abb. 2E).
- Laufen die " Analyse " Sub-Macro III zu quantifizieren fliegt der Plattform zu entkommen.
- Gehen Sie auf der Symbolleiste, wählen Sie " Plugins, " und wählte die " Drosophila Insel Assay. "
- Anpassen der " Fliege Mindestgröße " Einstellung entsprechend dem Wert in Schritt 8.3 definiert.
Hinweis: Verwenden Sie den Wert definiert in Schritt 8.3 nur, wenn die standard-Einstellung der " Fliege Mindestgröße " führt zu Ausgrenzung von fliegen, die waren heute auf der Plattform oder wenn das Makro Hintergrundsignal als fliegen erkennt. - In der " Zahl der fliegen pro Vial " Einstellung, die maximale Anzahl von fliegen in die Fläschchen vorhanden während des kompletten Tests zu füllen. Zum Beispiel, wenn ein Experiment Ampullen mit 15 fliegen, andere mit 20 fliegen und wieder andere mit 23 fliegen, hat die " Zahl der fliegen pro Vial " angegeben werden, wie 23.
- Wählen Sie die " Analyze " Kontrollkästchen, und drücken Sie " Ok; " eine neue " wählen Sie ein Verzeichnis " Fenster erscheint. Wählen Sie das Hauptverzeichnis (mit allen Unterordnern und Dateien im Inneren) und drücken Sie " auswählen. "
Hinweis: das Makro analysiert alle Bilder in den Unterordnern gespeichert, solange sie enthalten die " Stack_image_name, " " Projection_image_name, " und " Platform_image_name " Dateien. Das Makro wird nach Bild Bild bearbeiten. Die Makro-Ausgabe besteht aus einer binären Ergebnis Bildstapel benannt “ result_stack_subfolder_name.tif ” und eine Ergebnis-Textdatei namens " result_subfolder_name.txt, " die in jedem Daten-Ordner. erscheinen die resultierende Textdatei (.txt) enthält quantitative Messungen entspricht das Bild stapeln und besteht aus 9 Spalten. Der Inhalt dieser Spalten in Tabelle 1 zusammengefasst. " Result_stack_subfolder_name.tif " entspricht das Bild Zeit-Reihe von einem Experiment, wo fliegen während des Experiments erkannt werden als schwarze Punkte auf einem weißen Hintergrund ( Abbildung 1E) dargestellt. - Überprüfen Sie sorgfältig den Ergebnis-Stapel, um sicherzustellen, dass keine Artefakte aufgetreten sind und das Makro genau gearbeitet ( Abb. 2F).
Hinweis: Beispiele für Artefakte können sein Image-Elemente, die nicht fliegen aber, die vom Bild Segmentierungsalgorithmus (Fehlalarme) als solche erkannt werden. Dies kann beispielsweise durch Erkennung von Hintergrundsignal durch eine falsche Auswahl der ROI sein.
9. Daten Analyse mittels " Insel Assay Analyse "
- Struktur der Daten wie in Abbildung 2A ermöglicht Analyse mit der " Insel Assay Analyse " Skript. Erzeugen ein Hauptverzeichnis mit Unterordnern, wo jeder Unterordner einem Versuchsbedingung entspricht zu analysierenden.
- In den Unterordnern erzeugen Ordner, die die unabhängige experimentelle Wiederholungen ( Abbildung 2A) und die results.txt Dateien enthalten die " Drosophila Insel Assay " Makro.
Hinweis: Die " Insel Assay Analyse " Makro werden alle experimentelle Bedingungen befindet sich im Hauptverzeichnis auf einmal verarbeiten. - -Starten Sie R oder R-Studio. Klicken Sie auf Datei > > Datei öffnen … in der Symbolleiste und wählen Sie die " Insel Assay Analyse " Skript
- Installation ggplot2 und MatrixStats-Pakete bei der Ausführung der " Insel Assay Analyse " Skript zum ersten Mal. Geben Sie Folgendes in die Konsole-Fenster:
> install.packages("ggplot2"), geben Sie
> install.packages("matrixStats"), geben Sie.
- Installation ggplot2 und MatrixStats-Pakete bei der Ausführung der " Insel Assay Analyse " Skript zum ersten Mal. Geben Sie Folgendes in die Konsole-Fenster:
- Geben Sie der Speicherort der Daten und Analysen Ausgabe im Skript Dateien. In den folgenden Skript-Zeilen einfügen:
- Zeile 16: Legen Sie den Pfad in das Hauptverzeichnis, das enthält die Experimente um analysiert und verglichen werden ( Abbildung 2A, dies ist der Pfad zu lenken die " Insel Assay " -Ordner).
- Zeile 19: Legen Sie den Pfad zu dem Ordner, wo die Analyse-Output-Dateien gespeichert sind.
Hinweis: Das Verzeichnis angegeben, in Zeile 16 kann nur die zu analysierenden Ordner enthalten. Das Skript auch nicht richtig funktionieren wenn die Pfade eingefügt in Zeile 16 und 19 identisch sind.
- Das Skript ausführen, indem Sie auf Code > > laufen Region > > alle aus der Symbolleiste ausführen.
Hinweis: Beachten Sie, die drei resultierende CSV-Dateien und eine daraus resultierende .txt-Datei ( Abbildung 1E) in das Verzeichnis definiert in Zeile 19 zu erscheinen. Diese sind: (I) die " data_all_conditions.csv "-Datei enthält die verarbeiteten Daten entsprechend jeder Versuchsbedingung und experimentelle repliziert, organisiert wie in Tabelle 2 beschrieben. (II) die " Statistik summary.csv " Datei fasst den Mittelwert, die Standardabweichung (SD) und der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) Prozent der fliegen auf der Plattform für jede experimentelle Bedingung. (III) die " AUC.csv "-Datei enthält die Fläche unter der Kurve für jede experimentelle replizieren. (IV) abhängig von der Anzahl der Bedingungen in den Hauptordner vorhanden, wird das Skript entweder Export einer " Welch_t test_results.txt " Datei (2 Bedingungen) oder eine " AUC_anova_results.txt " Datei (mehr als 2 Bedingungen), wo die Ergebnisse des t-Tests oder Vergleicht man die Fläche unter der Kurve zwischen experimentellen Bedingungen ANOVA sind angegeben. Beachten Sie, die vier verschiedene Arten von TIFF-Bilddateien ( Abbildung 1E) im Pfad definiert in Zeile 19 zu erscheinen. Diese werden genannt: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (wo Name_Of_Data_Folder steht der vom Benutzer angegebener Ordnername), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " und " AUC_anova.tiff. " detaillierte Informationen über den Inhalt von diesen Diagrammen finden Sie in den Ergebnissen der Vertreter dieser Handschrift und in Abbildung 3.
Representative Results
In dem beschriebenen Protokoll sind Drosophila Insel Assay Daten erworben und in drei Schritten verarbeitet. Erstens ist Flucht-Flucht-Reaktion von Drosophila auf dem Inselbahnsteig geworfen mit einer Webcam aufgezeichnet und gespeichert als einzelne BMP-Bilder (Protokoll Abschnitte 1 bis 7). Zweitens verarbeitet"Drosophila Insel Assay" Makro (Schritt 8), die Frames, erzeugt eine "result.txt" Textdatei (Tabelle 1), in denen die Anzahl der Objekte in den einzelnen Frames erkannt zusammengefasst werden, und ein Bildstapel "Result_stack.tiff", die zeigt die Objekte innerhalb des Bereichs der Plattform in jedem Frame erkannt. Drittens verarbeitet das Skript "Insel-Assay-Analyse" (Protokoll Abschnitt 9) die Makrodaten im "results.txt" Dateien der einzelnen Experimente. Mehreren Schritten fließen in das Skript zu filtern und die Daten für die statistische Analyse kombinieren. Das erste Bild, in dem die fliegen auf der Plattform geworfen werden, erkannt und als Zeitpunkt 1. Frühere Bilder werden aus dem Dataset eliminiert. 100 Bilder nach Zeit Punkt 1 (entspricht 10 s) sind für die Analyse ausgewählt. Experimente, in denen die ursprüngliche Anzahl der fliegen entdeckt auf der Plattform ist kleiner als 5 automatisch von der Analyse, Beseitigung von unzuverlässigen Ergebnissen aus untermotorisiert Experimenten ausgeschlossen sind. Experimente, bei denen die ursprüngliche Anzahl der fliegen entdeckt auf der Plattform eingestellten "Anzahl der fliegen pro Fläschchen" plus eine Toleranz von 3 überschreitet, sind ebenfalls ausgeschlossen. Dadurch werden Datensätze in welches, die Geräusch Partikel fälschlicherweise als fliegen entdeckt wurden. Das Skript berechnet dann den Prozentsatz von fliegen für jeden Zeitpunkt verglichen mit der höchsten Anzahl von fliegen in der Serie erkannt erkannt. Fehler in Datasets verursacht durch fliegen zu Fuß innerhalb und außerhalb der ROI (erkannt als eine Abnahme, gefolgt von einer Erhöhung des Anteils der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit) werden automatisch über sie als konsequent auf die Plattform in früheren Stadien vorhanden korrigiert . Alle replizieren Datasets für einer bestimmten experimentellen Bedingungen, die im Hauptverzeichnis waren kombiniert und in die Datei "data_all_conditions.csv" exportiert. Die Spalten in Tabelle 2beschriebenen Variablen. Das Skript wird auch ein Liniendiagramm für jede experimentelle Bedingung, benannt nach dem Ordner mit den Daten exportieren. Diese Grafik zeigt den Prozentsatz der fliegen noch auf die Plattform im Laufe der Zeit (Flucht-Flucht-Reaktion) für die experimentelle repliziert in den jeweiligen Ordner ()Abbildung 3Avorhanden-B). Der Mittelwert, SD und SEM für jede experimentelle Bedingung berechnet und in die Datei "Statistik summary.csv" zusammengefasst. Ein Liniendiagramm, genannt "Escape_response_all_conditions.tiff" zeigt die durchschnittliche Flucht-Flucht-Reaktion für bis zu 12 experimentellen Bedingungen in den Hauptordner ()Abbildung 3() zu präsentieren. Schließlich ist die Fläche unter der Kurve für alle experimentellen Bedingungen vorhanden im Hauptordner berechnet und in der Datei "AUC.csv" zusammengefasst. Abhängig von der Anzahl der Bedingungen in den Hauptordner vorhanden, das Skript entweder führt einen zweiseitigen ungepaarte Welch t-Test (2 Bedingungen) oder einer ANOVA mit Tukey-Korrektur zu Testzwecken mehrere (mehr als 2 Bedingungen) um festzustellen, ob die experimentelle Bedingungen unterscheiden sich erheblich voneinander unterscheiden. Diese Ergebnisse sind zusammengefasst in "Welch_t-test_results.txt" oder "AUC_anova_results.txt." Bei der Durchführung der ANOVA wird das Skript auch eine "AUC_anova.tiff"-Datei exportieren, die zeigt den Unterschied in der AUC und der 95 %-Konfidenzintervall der Versuchsbedingungen, die verglichen werden. Die Werte der absoluten Fläche unter der Kurve von der experimentellen Wiederholungen für alle experimentellen Bedingungen werden als einzelne Datenpunkte mit Mittelstreifen in "AUC.tiff" (Abbildung 3D) angezeigt.
Ataxia Telangiectasia (AT) ist eine autosomal rezessive Bewegungsstörung zeichnet sich durch früh einsetzende zerebelläre Ataxie aufgrund von Mutationen in der Ataxia Telangiectasia mutiert (ATM) gen14. Mutanten der Drosophila orthologs ATM, Tefu, anzeigen Mängel in der Mobilität und Langlebigkeit15 Um das Makro"Drosophila Insel Assay" zu bewerten, wurde eine Drosophila -Modell des AT in der Insel-Assay getestet, und die Datenausgabe des Makros war im Vergleich zu manuellen Daten zählt. Die Ergebnisse zeigen, dass allgegenwärtigen Tefu Zuschlag (w-; Actin-Gal4/GD11950) erheblich verringert die Fähigkeit dieser fliegen, lassen Sie die Plattform im Vergleich zu ihren genetischen Hintergrund-Kontrollen (w-; Actin-Gal4/+) ()Abb. 4). Nach 1 s, 50 % der Kontrolle fliegen flüchteten die Plattform im Gegensatz zu den < 1 % des Tefu- RNAi fliegt. Wichtig ist, die Daten mit dem Makro treu reproduziert die Daten manuell zählen, was darauf hinweist, dass das Makro ist ein zuverlässiges Werkzeug für die Quantifizierung der Insel-Assay-Daten und die Auswertung der Bewegung Defekte ( ) verwendet werden kann Abbildung 4 A-B).
Abbildung 1: Flussdiagramm, in die Anforderungen, Versuchsdurchführung und Analyse des Insel-Assays. (A) Insel assay Ausrüstung. (B) Versuchsaufbau für die Insel-Assay. (C) Insel assay. (D) Verarbeitung von Insel-Assay-Daten mit dem"Drosophila Insel Assay" Makro. Das Makro"Drosophila Insel Assay" besteht aus 3 Sub-Makros: 1) Stack und Projektion, (2) definieren Plattform und (3) Analyse. (E) Verarbeitung und statistische Auswertung der Daten mit dem Skript "Insel-Assay-Analyse". Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiele für verschiedene Anpassungen während des Protokolls erforderlich. (A) die erforderliche Verzeichnisstruktur in welcher Insel Assay Experimente für Datenverarbeitung und-Analyse gespeichert werden müssen. (B) wenn die Videoeinstellungen anpassen fliegen müssen erscheinen schwarz auf weißem Hintergrund. (C) Bildrahmen Ausgabedateienwie von der Bild-Aufnahme-Software in diesem Manuskript beschrieben gespeichert. (D) die gelben Umriss zeigt die Plattformauswahl. Die gespeicherten Plattformauswahl im "ROI-Manager" ist blau markiert. (E) fliegen werden als weiße Punkte dargestellt, während der Anpassung des "Fly Mindestgröße einstellen." Das Ergebnisfenster zeigt den Bereich der fliegen in Pixel. (F) Beispiel für eine einzelne Aufnahme Rahmen (auf der linken Seite) und den entsprechenden Rahmen in der daraus resultierenden Bildstapel, erhalten mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" (auf der rechten Seite). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Ergebnis Bilder erhalten nach der Datenverarbeitung mit der "Insel-Assay-Analyse" Skript (A) Line Graph zeigt die Flucht-Flucht-Reaktion für jede Kontrolle experimentelle replizieren. (B) Line graph zeigt Flucht-Flucht-Reaktion für jedes Tefu RNAi experimentelle replizieren. (C) durchschnittliche Flucht-Flucht-Reaktion für angegebenen Versuchsbedingungen; Die Fehlerbalken repräsentieren die SEM (D) Punkt plottet, die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontrolle und mutierten Bedingungen darstellt. Experimentelle Wiederholungen für beide Tefu RNAi und Kontrolle Bedingungen werden als einzelne Datenpunkte (in schwarz) mit Mittelstreifen (rote Linie) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Allgegenwärtige Tefu Knockdown fliegen zeigen eine deutlich verminderte Fähigkeit, die Plattform zu verlassen. Die Daten repräsentieren die Prozent der fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit (s) für die Steuerung (w-; Actin-Gal4/+) und Tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) fliegt. (Anzahl der Wiederholungen = 5; Die Fehlerbalken darzustellen das SEM). (A) Raw-Daten mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" erhalten. (B) Dot Grundstücke repräsentiert die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontroll- und Tefu RNAi Bedingungen mit dem Makro"Drosophila Insel Assay" (Welch ungepaarten t-Test, ** p < 0,01). (C) Raw Daten manuell zählen die Anzahl der fliegen auf der Insel pro Sekunde vorhanden. (D) Punkt plottet die Fläche unter der Kurve-Verteilung für Kontrolle und Tefu RNAi Bedingungen von Hand zählen darstellt (Welch ungepaarten t-Test, ** p < 0,01). Die Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Spaltenname | Beschreibung | ||
| Slice | Frame-Name. | ||
| Graf | Die Anzahl der Objekte in den Rahmen innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) erkannt. | ||
| Gesamtfläche | Gesamtfläche der Objekte erkannt im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) in Pixel. | ||
| Durchschnittliche Größe | Gesamtfläche der Objekte in den Rahmen geteilt durch die Anzahl der Objekte innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) erkannt. | ||
| % Bereich | Der Anteil der Fläche, die von den Objekten in Bezug auf die Gesamtfläche der Plattform (ROI). | ||
| Perim. | Gesamtumfang der Objekte erkannt im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) in Pixel. | ||
| Min. Größe fliegen | Die minimale fliegen Größeneinstellung definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des Makros"Drosophila Insel Assay" (in Pixel). | ||
| Bereich ROI | Der Bereich der Plattform (ROI) durch den Benutzer während des Laufs des Sub Makros definiert definieren Plattform (in Pixel). | ||
| Anzahl der fliegen | Die Anzahl der fliegen pro Experiment definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des"Drosophila Insel Assay" Makros verwendet. | ||
Tabelle 1: Parameter durch das Makro"Drosophila Insel Assay" gemessen. Die Parameter in dieser Tabelle beschriebenen erscheint in der Datei "results.txt" beim Ausführen des Makros"Drosophila -Insel-Test".
| Spaltenname | Beschreibung | ||
| Slice | Frame-Nummer. | ||
| Graf | Die Anzahl der fliegen im Rahmen im Rahmen der Plattform (ROI) erkannt. | ||
| X.Area | Gesamtfläche der fliegen in den Rahmen innerhalb der Grenzen der Plattform (ROI) in Pixeln erkannt. | ||
| Min. Größe fliegen | Die minimale fliegen Größeneinstellung Eintrag definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des Makros"Drosophila Insel Assay" (in Pixel). | ||
| Bereich ROI | Der Bereich der Plattform (ROI, in Pixeln) durch den Benutzer definiert, wenn der Sub Makroausführung "Plattform definieren". | ||
| Anzahl der fliegen | Die Anzahl der fliegen pro Experiment definiert durch den Benutzer in der grafischen Oberfläche des"Drosophila Insel Assay" Makros verwendet. | ||
| X.Count | % fliegt in den jeweiligen Slice/Rahmen bezogen auf die höchste Anzahl der fliegen auf der Plattform während Experiment erkannt auf der Plattform vorhanden. | ||
| TimePoint | Zeitpunkt 1 repräsentiert den ersten Frame analysiert werden und entspricht den Rahmen, wo die fliegen zuerst auf der Plattform angezeigt. Es gibt insgesamt 100 Bilder pro replizieren analysiert (entspricht 10 s, wenn die beschriebenen Einstellungen verwenden. | ||
| Experiment | Anzahl der Wiederholungen pro Zustand. | ||
| Zustand | Gibt den Namen der Versuchsbedingung (nach der benutzerdefinierte Name des Ordners mit den Daten). | ||
Tabelle 2: Beschreibung der Variablen nach der Verarbeitung der Daten mit der "Insel-Assay-Analyse" Skript erhalten Die Parameter in dieser Tabelle beschriebenen erscheinen in der Datei "data_all_conditions.csv" bei der Verarbeitung der Daten mit dem Skript "Insel-Assay-Analyse".
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt das"Drosophila Insel Assay" Makro, das quantitativ Drosophila motor Verhalten während der Insel-Assay bewertet. Das Makro zählt genau die fliegen auf der Plattform im Laufe der Zeit machen die Insel-Assay, sehr empfindlich und für quantitative Hochdurchsatz-Bewertung des Bewegungsapparates Mängel. Die Methode ermöglicht für den Vergleich von jedem Zustand mit fliegen unter verschiedenen genetischen und/oder ökologischen Bedingungen, einschließlich der Arzneimittelexposition angebaut. Diese Anzeige eignet sich somit besonders als Discovery-Tool bei genetischen oder pharmazeutische Großbildschirmen, beim Studium der Drosophila -Modelle von Bewegungsstörungen und anderen neurologischen Erkrankungen oder bei der Fortbewegung oder Flug Prüfung Verhalten.
Die Insel-Assay-Protokoll präsentiert in dieser Handschrift bietet Vorteile gegenüber bestehenden/Alternative Methoden. Video-Tracking Fortbewegung ist beispielsweise viel mehr Zeit in Anspruch und weniger geeignet für große Stichproben zu testen. Die Insel-Assay ist ein Hochdurchsatz-Screening-Tool, und in diesem Sinne ist vergleichbar mit der schnellen interaktive negative Geotaxis (RING) Assay16. Der Unterschied zwischen den beiden ist, dass die Insel-Assays ermöglicht die Erkennung von ein breiteres Spektrum an motorischen Probleme; die Unfähigkeit von fliegen, die Plattform verlassen kann durch Defekte im Flug, springen, oder zu Fuß Verhalten verursacht durch Flügel (Muskel/neuronale) und/oder Bein (Muskel/neuronale) Mängel. Auf der anderen Seite beurteilt die RING-Assay Mängel im Klettern/Wandern Verhalten verursacht durch defekte Bein (Muskel/neuronale). Für den Fall, dass mehrere Verhaltens anzeigen Nutzer interessiert sind, kann die Insel-Assay auch leicht mit anderen Tests, wie der RING-Test kombiniert werden. Darüber hinaus Laser erforderlich für Optogenetik können problemlos in der Insel-Assay-Box installiert werden, und das Setup ist so einfach, dass es leicht zu einem Raum bewegt werden kann wo Licht und Temperatur gesteuert werden kann.
Um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit des hier beschriebenen Insel Assays zu gewährleisten, sollten mehrere Empfehlungen befolgt werden. Aliquoten und Transfer die fliegen auf die experimentelle Probe Fläschchen auf mindestens einen Tag vor dem Experiment, die Auswirkungen der CO2 oder Kälte Narkose zu vermeiden. Nicht überfüllen die experimentelle Fläschchen (10-15 fliegen pro Fläschchen verwenden; es empfiehlt sich, immer die gleiche Anzahl von fliegen legen Sie pro Fläschchen). Halten Sie die fliegen auf frische Lebensmittel zu allen Zeiten. Wenn nicht noch nicht vertraut mit der Durchführung des Tests, Praxis werfen fliegt auf die Plattform, um den Ertrag zu maximieren. Auch die Praxis schnell zurückziehen der Hand gleich hinterher, wie es die Datenanalyse (Bildanalyse und fliegen zählen beginnen stört erst mit die Hand aus dem Bild ist). Halten Sie die Umwelt- und experimentellen Bedingungen identisch in Experimenten, die verglichen werden müssen (z. B. Kontrollen gegen Mutanten oder ein Genotyp getestet in verschiedenen Altersstufen). Immer zur gleichen Zeit des Tages die Experimente durchführen und die Fläschchen unter kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Testen Sie für statistische Aussagekraft mindestens drei technische Wiederholungen pro biologische replizieren.
Sicherstellung der erfolgreichen Aufführung des Makros beschrieben hier, Webcam und Bild-Einstellungen müssen angepasst werden, um maximalen Kontrast zu erzielen: fliegt als schwarze Objekte auf einer weißen Plattform erscheinen. Wenn die Anzahl der fliegen durch das Makro nicht richtig gezählt wird, passen Sie die Kontrasteinstellungen, prüfen Sie, ob der ROI richtig ausgewählt ist und stellen Sie sicher, dass die Größe der fliegen auf der Plattform über dem angegebenen Minimum Größe einstellen (siehe Punkt 8.3 dieses Protokolls) zu fliegen. Die Einstellungen müssen nur einmal definiert werden. Sie gelten für alle Experimente, solange der Abstand zwischen der Plattform und die Webcam nicht geändert wird. Die Circularity_min und max Einstellungen definieren die Kreisförmigkeit der Partikel (Teilchen = gezählte fliegen), die für die Analyse berücksichtigt werden wird (fliegt = gezählte Objekte). 1 steht einen perfekten Kreis, und 0 für eine Zeile17. Da die fliegen immer ein gewisses Maß an Zirkularität vorhanden (eine Fliege kann nicht als eine gerade Linie angezeigt), die "Circularity_max"-Einstellung ist auf 1 gesetzt und die "Circularity_min" Einstellung bei 0,4. Es ist unwahrscheinlich, dass der Benutzer diese Einstellungen anpassen muss.
Das Makro macht gelegentlich zählen Fehler, wenn eine Fliege in der Nähe der Grenze der Plattform befindet. Dies kann auftreten, wenn die fliegen nicht, aber zu Fuß in die und aus der benutzerdefinierten ROI fliegen können. In den meisten Fällen kann dazu den ROI (so weit wie möglich auf die Plattform Einbau) dieses Problem leicht lösen. Jedoch das "Insel-Assay-Analyse" Skript ist in der Lage, zu erkennen und richtig falsche Daten zählt hervorgerufen fliegen innerhalb und außerhalb der ROI relativ gut zu gehen. Obwohl die Auflösung der hier vorgestellten Webcam hoch genug, um fliegen in der Nähe ziemlich gut zu unterscheiden ist, haben wir umgesetzt zusätzliche Algorithmen in der Bild-Verarbeitungsprozess des Makros"Drosophila Insel Assay", wie die Wasserscheide und erodieren Funktion17. Diese erleichtern die richtige Abgrenzung von fliegen, die in unmittelbarer Nähe auf der Plattform befinden. Darüber hinaus das Makro ist nicht in der Lage zu fliegen unterscheiden, die von der Plattform sprang oder flog davon. Dennoch ist es in der Regel beobachtet, dass gesunde junge Stämme fliegen away Fly sofort, wenn auf der Plattform abgelegt, während ältere fliegen und fliegen mit motorischen Defiziten länger auf der Plattform bleiben und werden schließlich zu springen oder Weg von der Plattform fallen. Trotz dieser Einschränkungen bieten die Assay und Analysen eine sehr genaue Messung der motorischen Verhalten.
Um der erfolgreichen Aufführung des "Insel-Assay-Analyse" Skripts zu gewährleisten, muss der Benutzer sicherstellen, dass die richtigen Pfade für die Input- und Output-Dateien in den Skript-Zeilen im Protokoll angegeben eingeben und die Daten in die richtigen Ordner Format (wie angegeben in Abbildung 2). Wenn der Benutzer die Kriterien verwendet, um unzuverlässig zu streng experimentellen Daten herausfiltern findet (Zeile 68: der erste Wert in der Spalte "Zählen" ist kleiner als oder gleich 5, Zeile 71: der erste Wert in der Spalte "Anzahl" ist höher als die Gesamtzahl der fliegen auf der Platfo geworfen RM + 3), schalten Sie diese Filter-Einstellungen durch ein # vor dem Text in den Zeilen 68 und 71 in der "Insel-Assay-Analyse" Skript hinzufügen. In diesem Fall werden alle Datensätze in die Analyse einbezogen werden. Alternativ können Filtereinstellungen geändert werden, indem Sie die Werte in den Zeilen 68 und 71 je nach Benutzeranforderungen anpassen. Mögliche Artefakte in der Zählwerte in der "results.txt" durch das"Drosophila Insel Assay" Makro erzeugt auch manuell eingestellt werden, und das Skript kann auf die korrigierten Daten erneut ausgeführt werden. Wenn der Benutzer interessiert sich für Verarbeitung von mehr als 10 fps oder mehr als 10 s Daten, sollte die Anzahl der Frames, die von der "Insel-Assay-Analyse" Skript verarbeitetangepasst werden. Die statistische Auswertung kann auch durch benutzerdefinierte Alternativen ersetzt werden.
Ein Ordner namens "Beispiele Insel Assay", mit Beispielen mit Bild-Zeitreihen mit Hilfe der Insel-Test finden Sie auf der folgenden Website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Laden Sie den Ordner "Beispiele Insel Assay" und befolgen Sie die Schritte in diesem Protokoll, sich schnell mit der Struktur der Dateiablage, die Verarbeitung von Bildern mit das Makro "Drosophila Insel Assay" und die "Insel-Assay-Analyse" vertraut werden Skript.
Die Insel-Assay kann in Kombination mit dem entwickelten Makro und Analyse Skript verwendet werden, zu bewerten und zu quantifizieren das aberrante Bewegungsverhalten eines Drosophila -Modells der Ataxia Telangiectasia. Da der Test effizient auf verschiedenen Alters angewendet werden kann, ist es gut geeignet für die Analyse der potenziell Progressivität der Phänotypen.
Zusammenfassend ist die Insel-Assay, in Kombination mit das Makro"Drosophila Insel Assay" und das "Insel-Assay-Analyse"-Skript, eine kostengünstige, zuverlässige und hocheffiziente Assay objektiv analysieren und Bewegungsorgane Mängel der zu quantifizieren Drosophila Modelle von Bewegungsstörungen in gewissem Sinne Hochdurchsatz-.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir anerkennen das Vienna Drosophila Resource Center und Bloomington Drosophila Lager Zentrum (NIH P40OD018537) für die Bereitstellung von Drosophila -Stämme. Wir sind dankbar, Klämbt Labor für die Einführung von uns, die Insel-Assay und Martijn Eidhof für den Bau der Insel-Assay-Setup. Diese Studie wurde teilweise unterstützt durch E-RARE-3 gemeinsame länderübergreifende rufen gewähren "Therapien für autosomal rezessive Ataxien vorbereitet" PREPARE (NWO 9003037604), mit einem TOP Stipendium die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) und von (912-12-109) zwei DCN/Radboud University Medical Center PhD Stipendien. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
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