Summary
섬 분석 결과 초파리 melanogaster의 기본적인 운동 동작을 평가 하는 데 사용할 수 있는 비교적 새로운, 비용 분석 결과가 이다. 이 원고는 자동 데이터 처리 및 유전 약리학 큰 스크린에 대 한 중요 한, 높은 처리량 판독 시험이 섬 분석 결과 데이터의 객관적인 정량화에 대 한 알고리즘을 설명 합니다.
Abstract
차세대 시퀀싱 기술의 발전 (후보) 운동 장애 및 증가 속도 다른 신경 질환에 대 한 질병 유전자의 식별에 기여 한다. 그러나, 약간이 장애 기초 분자 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 초파리 melanogaster 의 유전, 분자, 그리고 행동 도구 상자는이 모델 유기 체는 높은 처리량 방법에 새로운 질병 유전자와 메커니즘을 특성화 하 특히 유용 하다. 그럼에도 불구 하 고, 높은 처리량 화면 효율적이 고 신뢰할 수 있는 분석을, 이상적으로, 비용 효율적인 이러한 장애에 관련 된 특성의 automatized 정량화에 대 한 허용 해야 합니다. 섬 분석 결과 비용 효율적인 초파리 운전 행동 평가를 쉽게 설정 방법. 이 분석 결과에서 파리는 플랫폼에 고정된 높이에서 throw 됩니다. 이 타고 난 모터 응답 초 이내 플랫폼에서 탈출 파리 수 있도록 유도 합니다. 현재, 촬영된 섬 분석 실험의 정량 분석 할 수 있습니다 수동으로, 대형 스크린을 수행 하는 경우에 특히 힘 드는 사업입니다.
이 원고는 높은 처리량, 자동화 된 데이터 처리 및 섬 분석 결과 데이터의 정량화"초파리 섬 분석 결과"와 "섬 분석 결과 분석" 알고리즘을 설명합니다. 분석 결과 수행 하는 동안 설치 프로그램에서 노트북에 연결 된 간단한 웹캠 플랫폼의 이미지 시리즈를 수집 합니다. "초파리 섬 분석 결과" 알고리즘 피지 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 개발이 이미지 시리즈를 처리 하 고 수량화, 각 실험 조건에 대 한 시간이 지남에 플랫폼에 파리의 수 있습니다. 자동으로 얻은 데이터를 처리 하 고 치료/genotypes 통계적으로 다른 인지 계산 하는 "섬 분석 결과 분석" 스크립트, R, 자유 소프트웨어와 호환 개발 되었다. 이 크게 섬 분석 결과의 효율성을 향상 하 고 기본적인 운동 및 비행 행동에 대 한 강력한 판독 하 게. 따라서 대형 스크린 조사 비행 운동 능력, 운동 장애, 약물 효능의 초파리 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 다음-세대 시퀀싱 기술의 발전 크게 기여한 뇌의 (예를 들어, 소 뇌 운동 실 조 증 및 파 킨 슨 병), 말 초 신경의 퇴행 성 운동 장애를 기본 유전자의 식별 기원 (예를 들어, 루 경화 증 그리고 유전 경련 적인 하반신 불 수), 그리고 근육 근원 (예를 들어, 듀 켄 씨 근이 영양 증 및 myotonic 영양 장애)1,2,3,4 . 그럼에도 불구 하 고, 약간이 무질서의 대부분을 기초 분자 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 이러한 메커니즘의 이해 요법 개발에 필수적 이다.
인간, 모형 유기 체, 비행 등 초파리에 운동에서에서 운동 중앙 두뇌, 말 초 신 경계와 근육에 의해 제어 됩니다. 또한, 빠른 생성 시간 및 초파리 의 유전 도구 상자 적합 하 게이 모델 유기 체 특히 유전자의 높은 처리량 검열 관련 된 운동 장애 그리고 약물 테스트5,6 . 때문에 같은 화면, 신뢰성, 비용 효율적인, 그리고 상대 간단한 분석 실험, 뿐만 아니라 자동화 된 방식으로 출력 결과 계량 도구에서 테스트 하는 데 필요한 조건 중 상당수는 매우 바람직한.
슈미트 외. (2012 년) 7 저가 테스트 "섬 분석 결과" 라고 설명 초파리 운동 동작을 평가 하. 섬 분석 결과 사용 되었습니다 성공적으로 대규모 검사 명과 관련 기능7,8, 지적 장애 초파리 모델의 일반 평가 대 한 평가에서 유전자를 식별 하 모터 동작9비행. 높은 플랫폼에 여러 파리 던진 섬 분석 결과의 원리 디자인에 의하여 이루어져 있다. 이 타고 난 모터 동작 초 이내 플랫폼에서 탈출 하기 위해 건강 한 파리 수 있도록 유도 합니다. 분석 결과 파리 시간7,,89플랫폼에 남아의 수를 측정 합니다. 이러한 모든 기능 섬 분석 결과 운동 장애에 관련 된 유전자에 대 한 강력한 검사 도구 있을 수 있습니다 나타냅니다.
현재, 촬영된 섬 분석 결과 데이터의 정량 분석 수동으로7,,89를 이루어집니다. 분석 결과의 효율 향상, 저가 방법 반자동 계량 플랫폼에서의 탈출을 개발 되었습니다. 설치는 이미지 시간 프레임 플랫폼의 시리즈 인수 s. 프레임"초파리 섬 분석 결과" 매크로 처리는 모든 0.1 이상의 플랫폼에서 파리의 수를 수량화 하는 수집 하는 노트북에 연결 된 간단한 웹캠 사용 시간입니다. "초파리 섬 분석 결과" 매크로 3 개의 독립적인 하위 매크로으로 나누어져 있습니다: (I) "만들기 스택 및 프로젝션," 하위 매크로 다른 하위 폴더에 저장 하는 다른 섬 실험을 식별 하 고 스택 및 각각의 투영을 만듭니다 시간 시리즈입니다. (II) "정의 플랫폼" 하위 매크로 연속적으로 어느 시점에서 사용자 수동으로 관심 (ROI)의 영역으로 섬 플랫폼을 정의 하도록 요청 개별 실험 하위 폴더에 있는 모든 "Projection_image_name.tif" 파일을 열 것 이다. (III) "분석"는 자동으로 시간 시리즈 동안 플랫폼에 남아의 수를 단정. 연속적으로 (한 실행)에 하위 매크로 실행할 수 있습니다 또는 독립적으로. 통계 데이터 분석을 위해 자동으로 얻은 데이터를 처리 하 고 치료/genotypes 크게 (그림 1) 서로 다른 동작 여부를 확인 하려면 통계 테스트를 적용 하는 스크립트 개발 되었다. 마지막으로, 그것은 평가 하 고 증-telangiectasia (에서)에 대 한 초파리 모델의 탈 선 운동 능력 척도이 설치 프로그램을 사용할 수 있는 시연입니다.
Protocol
1. 섬 분석 결과 상자의 건설
- 준비 물 (즉 목욕)의 레이어를 포함 하는 강력한 소재, 폴 리 메 틸 메타 크리 레이트 (PMMA) 등의 만든 트레이. 재료 흰색 인지 확인.
참고: 40 x 35 x 2.5 c m 3의 크기는 것이 좋습니다 ( 그림 1A). - 파리 실험실 공간으로 탈출 하지 않도록 목욕 주위에 배치 되 게 강력 하 고 투명 한 소재, PMMA, 등의 상자 (42 x 38 x 25 cm 3) 준비 합니다. 구멍 (20 x 30 cm 2) 쉽게 파리와 튜브를 처리 하 고 ( 그림 1A) 섬에 그들을 드롭 실험에 대 한 충분히 큰 측면에 배치.
- 준비는 불 침투성 물자 (아크릴 또는 플라스틱) 방수의 차원에서 높은 플랫폼 10 x 15 x 2.5 cm 3.
참고:이 플랫폼은 필요 균일 한 백색 표면 이미지 분석에 대 한 대비가 되도록 합니다. 크기는 반드시 고정 되지 않습니다, 하지만 충분히 큰 모든 파리 처음 플랫폼에 착륙 하 고 ( 그림 1A) 그것에 걸을 수 있는 기회를 얻을 다는 것을 확인 하는 것. - 플랫폼 또는 목욕을에 그것을 붙이는 실험/촬영 세션 동안 플랫폼의 위치 변화를 방지 하기 위해 플랫폼 상자 안에 무게 또는 다른 무거운 물건을 배치 하 여 수정.
2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치
- 이미지 레코딩 소프트웨어의 설치.
- 섬 이미지 시리즈 (자료 표 참조)을 기록 하 고 컴퓨터에 소프트웨어를 설치 하려면 다운로드 이미지 레코딩 소프트웨어.
참고:이 프로토콜에서 설명 하는 영상 기록 소프트웨어는 windows 에서만 지원 됩니다. 다른 사용자에 대 한 대안 자료 테이블에 추가 되었습니다.
- 섬 이미지 시리즈 (자료 표 참조)을 기록 하 고 컴퓨터에 소프트웨어를 설치 하려면 다운로드 이미지 레코딩 소프트웨어.
- " 초파리 섬 분석 결과 " 매크로 설치.
- 다운로드는 " 초파리 섬 분석 결과 " 매크로 호환 피지 10 버전 1.4 (이상) 다음 웹 사이트에서: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- 에 커서는 " 섬 분석 결과 " 디렉터리 및 클릭 " 보기. "
- 클릭 " 다운로드 모든. " 폴더 콘텐츠를.zip 파일로 다운로드 될 것 이다, 다운로드 한 파일의 압축을 풉니다.
- 복사는 " 초파리 섬 Assay.ijm "로 파일 " Fiji.app/plugins/directory. "
참고: 시작할 때, 피지는 " 초파리 섬 분석 결과 " 매크로 플러그인 드롭다운 메뉴의 맨 아래에 나타납니다.
- " 섬 분석 결과 분석 " 다운로드 및 설치를 스크립트.
- 다운로드 R 11은 다음
- 웹 사이트: https://cran.rstudio.com. 컴퓨터에 설치.
- 다운로드 R 스튜디오는 다음 웹 사이트에서: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. 컴퓨터에 설치.
참고:는 " 섬 테스트 분석 " 스크립트를 R만 실행할 수 있습니다. R 스튜디오, 그것의 더 쉬운 사용자 인터페이스와 R.와 경험이 없는 사용자에 대 한 대체 단계로 제시 - 다운로드는 " 섬 분석 결과 분석 "에서 스크립트는 " 초파리 섬 분석 결과 " 다음 웹 사이트에서 디렉토리: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
참고: 2.2, 단계를 수행한 후에 " 섬 분석 결과 분석 " 라는 압축이 풀린된 폴더에서 스크립트를 찾을 수 있습니다 " 섬 분석 결과. "
3. 섬 분석 결과에서 테스트를 파리의 준비
- 수집 앞에서 설명한 13 (기간 동안 감기 또는 이산화탄소 (CO 2) 마 취, 각 실험 조건에 대 한 파리 개최 1-2 일).
실험 조건 당
- 준비 3의 최소 샘플 튜브, 각각 약 15 상연을 포함 하는 파리. 사용 그대로 날개와 유사한 나이 및 성별은 파리.
참고: 여기에 설명 된 실험에 대 한 5 샘플 리 바이 알 포함 15 남성 파리 genotypes w -; 말라-Gal4 / + (제어) 및 w -; 말라-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) 일수로, 4 일 세의 날에 모였다 고 섬 분석 결과 수행 하는 데 사용 했다. RNAi, 제어, 긴장과 말라 gal4 드라이버는 상업에서 가져온 소스 (자료 표 참조).
- 준비 3의 최소 샘플 튜브, 각각 약 15 상연을 포함 하는 파리. 사용 그대로 날개와 유사한 나이 및 성별은 파리.
- 파리는 마 취약에서 효과 방지 하려면 복구를 하자 (최소 1 일 CO 2를 사용 하는 경우)의 나이에 섬 분석 결과에서 수집 된 파리를 테스트 하기 전에.
4. 실험 설정
참고: 그림 1B 참조.
- 작은 양의 비누 냉 수 목욕 트레이 추가 하 고 중간에는 플랫폼을 위치.
참고: 비누 물;의 표면 장력을 감소 물을 만져 파리 빠뜨릴 것 이다. 그러면 실험 세션의 진행 하는 동안 상자에 도착 하는 파리의 증가 금액. - 트레이 위에 투명 한 상자를 배치 하 고 조명 램프를 사용 하 여 위에서 플랫폼.
참고: 플랫폼의 조명은 주로 적절 한 비디오 대비를 보장 하기 위해 필요 합니다. 일반 12 V LED 빛이 적합 하다. - 플랫폼 위에 직접 웹캠 (상자) 밖에 서 놓고 컴퓨터에 그것을 연결.
- 실험 전에 다른 실험 데이터를 저장 하는 컴퓨터에 새 폴더를 만듭니다.
- 따라 예의 구조 그림 2A에 폴더를 만드는 나와 있습니다. 예를 들어 실험 설계에서 5 복제 함께 두 genotypes을 테스트 하는 경우 먼저 실험의 날짜를 포함 하는 주요 폴더를 만듭니다. 주요 폴더 안에 (유전자 형 당 하나) 두 개의 하위 폴더를 만듭니다. 유전자 형 폴더 안에 복제 당 하나 5 개의 새 하위 폴더를 만듭니다.
참고: 추가 분석을 위해 필수적입니다 해당 개별 실험 하 이미지 시리즈 고유 이름 가진 폴더에 저장 됩니다.
- 따라 예의 구조 그림 2A에 폴더를 만드는 나와 있습니다. 예를 들어 실험 설계에서 5 복제 함께 두 genotypes을 테스트 하는 경우 먼저 실험의 날짜를 포함 하는 주요 폴더를 만듭니다. 주요 폴더 안에 (유전자 형 당 하나) 두 개의 하위 폴더를 만듭니다. 유전자 형 폴더 안에 복제 당 하나 5 개의 새 하위 폴더를 만듭니다.
5. 비디오 설정을 설치에는 " 캡처 장치 " 인터페이스의 섹션
- 오픈 이미지 레코딩 소프트웨어 고, 아래는 " 캡처 " 탭, 클릭 " 계시 노출 인 이미지 … " 선택으로 적절 한 웹캠은 " 캡처 장치. "
- 섬에 죽은 비행 장소;를 클릭 하 여 비디오 설정을 조정에서 " 비디오 설정을 " 상자. 밝기, 대비, 조정 도구 모음을 통해 스크롤한 방식으로 죽은 즉시 나타납니다 ( 그림 2B)는 흰색 바탕에 검은 색. 조정이 완료 되 면 클릭 " 확인. "
6. 녹화 및 비디오 저장 설정을 설치에는 " 시간 경과 " 인터페이스의 섹션
< ol>참고: 비디오 파일 데이터의 부 량에 대 한 사용 되지 않습니다; 그리고, 전반적인 아이디어를 얻을에 유용할 수 있습니다 실험에 대 한.
- 압축 상자에서 선택 " 인텔 IYUV 코드 " 비디오 압축에 대 한 선택 "가지고 한 프레임 마다 0.1 초 "와 " 놀이 다시 속도 (초당 이미지): " 10.
- 실험 시간 시리즈를 클릭 하 여.bmp 프레임으로 저장 " 고급 … " 선택 " 각 캡처 프레임. 대 한.bmp 이미지를 만들 " 클릭 " 찾아보기. "에 동일한 디렉터리 선택는 " 동안 AVI 영화 캡처 " (창 단계 6.1에서에서 선택) 클릭 ", "를 누르고 " 확인. "
참고: 통지, 실험 중 프레임 (데이터 분석에 필요한).bmp 파일로 저장 됩니다. 프로그램 이름으로 프레임 " A " 뒤에 숫자 해당 하는 프레임 캡처 시퀀스 (예: " A_number.bmp ") ( 그림 2C). 항상 이전에 기록 된 이미지 시리즈를 덮어쓸 수 됩니다 보장 하기 위해 새 폴더에 다른 실험에 속하는 이미지를 저장 합니다. 그 이미지는 자동으로 저장 되지 비디오 파일과 같은 폴더에이 폴더에서 선택 되지 않은 경우 주의 " 찾아보기 … " 클릭 시는 " 고급 " 상자.
7. 분석 결과 및 데이터 수집 섬
- 녹음 시작 이미지 레코딩 소프트웨어의 시간 경과 이미지 인터페이스에서 시작 단추를 누릅니다.
- 누릅니다 파리 (3 단계)를 포함 하는 실험적인 유리병 2-3 시간 되도록 파리 유리병의 바닥에. 신속 하 게 유리병의 플러그를 제거 하 고, 모든 파리 ( 그림 1C) 동시에 플랫폼에 대비한 누릅니다 플랫폼에 유리병을 활발 한 운동.
- 약 30 후 s, 보도 " 중지 " 녹음을 중지 하려면 단추.
참고: 모든 파리 플랫폼에서 사라지고, 녹음 수 중지 됩니다 이전. - 30 남아 있는 파리 제거 이미지 녹음을 중지 한 후 손으로 플랫폼에 s.
- 기록 다음 실험을 진행 하기 전에.bmp 파일 및 영화 (참조 섹션 6)에 대 한 대상 디렉토리 변경.
8. 데이터 처리: 실행은 " 초파리 섬 분석 결과 " 매크로
참고: 그림 1D 참조.
- 실행는 " 스택 및 프로젝션 만들 " 하위 매크로 스택 및 수집된 이미지 시리즈의 계획 나.
- 시작 피지, 클릭에 " 플러그인 " 선택 하 고 도구 모음에서 " 초파리 섬 분석 결과 "; 드롭다운 메뉴에서 새 창이 나타납니다.
- Enter는 " 먼저 시계열 식별자 이미지 " 매크로 그래픽 인터페이스 설정.
참고: 기록된 이미지 프레임으로 저장 됩니다 " A-number.bmp " 이미지 가져온 순서 대로. 에 " 먼저 프레임 식별자 " 매크로 인터페이스, 입력 설정 프로그램에서 첫 번째 프레임 번호와 파일 확장명이. 채우기 " 먼저 프레임 식별자 "와 "-0001.bmp, " 이후 첫 번째 프레임 이라고 " A 0001.bmp " ( 그림 2C). 에 첫 번째 이미지의 올바른 파일 확장명을 지정 하는 경우에 다른 이미지 형식 (예:.tiff,.jpeg) 웹캠 소프트웨어에 의해 생성 됩니다, " 먼저 이미지 시계열 식별자. " - 만 선택는 " 스택 및 프로젝션 만들기 " 하위 매크로 클릭 ", " 개별 섬 분석 결과 실험과 함께 모든 하위 폴더를 포함 하는 기본 디렉터리를 선택 하 고.
참고: 각 개별에서.bmp 파일 실험을 포함 하는 폴더는 " 먼저 프레임 식별자 " 이후에 처리 됩니다. 2 새로운 기본적으로 명명 된 파일은 각 개별 실험 하위 폴더에 표시 됩니다 " Stack_image_name.tif " 및 " Projection_image_name.tif " ( 그림 1D). 일단이 단계를 수행 하는.bmp 파일을 삭제할 수 있습니다. 스택 및 프로젝션.tif 파일 모든 데이터를 포함 하 고 추가 분석을 위해 충분 하다.
- 실행은 " 정의 플랫폼 " 플랫폼의 정확한 위치를 선택 하려면 하위 매크로 II.
- 의 그래픽 인터페이스를 열고는 " 초파리 섬 분석 결과, "만 선택는 " 정의 플랫폼 " 확인란, 누르고 " 확인. "
- 에 " 디렉터리 선택 " 창 주요 디렉터리 선택 어디 실험적인 하위 저장 누르고 " 선택. "
참고:는 " 정의 플랫폼 " 하위 매크로 자동으로 검색 " Projection_image_name.tif " 메인 디렉토리에 저장 된 모든 하위 폴더에 파일. " Projection_image_name.tif " 두 개의 창이 함께 첫 번째 폴더에 저장 된 이미지 — " 플랫폼 정의 " 및 " ROI 관리자 " — 열립니다. - 선택은 " 다각형 선택 "을 그리는 섬 플랫폼 일치 하는 선택 도구 모음에서 도구.
참고: 그것은 매우 선택에서 플랫폼의 경계선을 제외 하는 것이 중요입니다. 그림 2D를 참조 하십시오. - 클릭 첫 번째 이미지에는 플랫폼을 선택한 후 " 추가 "에 " ROI 매니저 " 창; 선택된 영역 됩니다 값 ( 그림 2D)의 집합으로 ROI 관리자 창에 나타납니다. 보도 " 확인 "에 " 플랫폼 정의 " 창. 매크로 다음 투영에 진행 합니다.
- 숫자 ( 그림 2D)에 저장 된 클릭은 " ROI 매니저 " 창, 이전 선택 합니다 자동으로 현재 이미지 투영에 표시.
참고: 섬부터 플랫폼 (으로 웹캠 섬 위치 변함) 실험 행에 수행 될 때 크기와 위치를가지고 있을 가능성이 있다, 그것은 투자 수익에 플랫폼을 정의 저장 하는 데 유용는 " ROI 관리자. "에 의해 이렇게, 사용자 시간;을 저장 하는 것 이다 곧 예측, 그것은 단지 투자 수익 관리자에 일시적으로 저장된 선택을 클릭할 필요가. - 섬의 위치는 이전 실험에 비해 약간 이동 했다, 선택의 중심에 필요한 위치로 선택된 영역을 드래그 하 여 선택의 위치를 조정.
- 선택 플랫폼으로, 일치 하지 않는 경우는 선택 영역 밖에 서 마우스 왼쪽 단추로 클릭 하 고 플랫폼을 사용 하 여 새로운 선택 윤곽을 그리 다는 " 다각형 선택 " 도구. 클릭 하 여 투자 수익 관리자에서 새로운 선택 저장 " 추가; " 새로운 선택에 나타납니다는 " ROI 관리자 " 지속적으로 사용할 수 있는 창.
- 선택 조정 클릭 " 확인 "에 " 플랫폼 정의 " 창 고 반복까지 모든 플랫폼 정의 절차.
참고: 검은 배경에 흰색 delineated 투자 수익 영역에 해당 하는 플랫폼의 바이너리 이미지 라는 사실을 " Platform_image_name.tif, " 각 처리 이미지 스택과 투영으로 동일한 실험적인 하위 폴더에 대 한 등장 생성 된 이미지 단계 8.1.3 ( 그림 1D).
- 최소 비행 크기 정의.
참고:이 설정은 픽셀 단위로 최소 비행 크기를 정의 하 고. 지정된 된 최소 크기 보다 작은 입자는 소음으로 인해 가양성을 피하기 위해 분석에서 제외 됩니다.- 만든 이미지 스택 열는 " 스택 및 프로젝션 만들 " 하위 매크로 I.
- 변환 이미지 스택을 8 비트 이미지를 클릭 하 여 > > 유형 > > 8 비트.
- 메뉴로 이동 하 여, 이미지를 눌러 > > 조정 > > 임계값, 있는지 확인은 " 어두운 배경 " 상자를 선택 하 고를 누릅니다 " 적용; " 두 번째 창 이라고 " 임계값 " 나타납니다. 클릭 " 어두운 background "를 누르고 " 확인. "
참고: 파리 검정과 흰색에서 플랫폼에 정의 되어 있는 바이너리 이미지 스택을 생성 됩니다. 아닌 경우는 " 반전 " 기능 편집을 클릭 하 여 > > 반전 > > 실행. - 설정 분석을 클릭 하 여 픽셀 수를 검출 하기 위하여 규모 > > 비율 설정. 다음 설정을 적용: 픽셀에서 거리 = 1, 알려진 거리 = 1, 픽셀 가로 세로 비율 = 1, 및 길이 단위 = 픽셀. 보도 " 확인. "
- 선택은 " 지팡이 " (추적) 도구를 도구 모음에 비행 (검은 점) 현재 플랫폼에 클릭. Ctrl + m (윈도우 사용자) 또는 cmd + m (맥 사용자); 새로운 " 결과 " 창 선택한 픽셀에서의 영역을 나타냅니다. 여러 가지 파리에 연속적으로 이렇게 고 최소 비행 크기 결정.
참고: 매크로 실행할 때 설정 된 " 최소 비행 크기 " 10%의 마진을 뺀 작은 관찰 비행 크기 설정. ( 그림 2E).
- 실행에 " 분석 " 척도를 하위 매크로 III 파리 플랫폼에서 탈출.
- 도구 모음, 선택에 서 " 플러그인, " 선택은 " 초파리 섬 분석 결과. "
- 조정은 " 최소 비행 크기 " 단계 8.3에에서 정의 된 값에 따라 설정.
참고: 사용 값에에서 정의 된 경우에만 단계 8.3 표준 설정 " 최소 비행 크기 " 현재 플랫폼에서 또는 매크로로 파리 배경 신호 감지 했다 파리의 발생. - 에는 " 수 유리병 당 파리의 " 완전 한 실험 기간 동안 파리 튜브에의 최대 수를 입력 설정. 예를 들어 한 실험은 튜브 15 파리, 20 파리, 포함 된 다른 사람 및 23 파리, 포함 된 다른 사람을 포함 하는 " 유리병 당 파리의 수 " 23으로 표시 해야 합니다.
- 선택은 " 분석 " 확인란 누르고 " 확인; "는 새로운 " 디렉터리를 선택 " 창이 나타납니다. 주요 디렉터리 (모든 하위 폴더와 안의 파일)를 선택 하 고를 누릅니다 " 선택. "
참고: 매크로 분석으로 포함 된 하위 폴더에 저장 된 모든 이미지는 " stack_image_name, " " Projection_image_name, " 및 " Platform_image_name " 파일. 매크로는 이미지 후 이미지를 처리 합니다. 매크로 출력 라는 이진 결과 이미지 스택 구성 “ result_stack_subfolder_name.tif ” 라는 결과 텍스트 파일 및 " result_subfolder_name.txt, " 포함 나타나는 각 데이터 폴더. 결과 텍스트 파일 (.txt) 정량적 측정에 해당 하는 이미지 스택과 9 열로 구성 됩니다. 이러한 열의 콘텐츠는 표 1에 요약 됩니다. " Result_stack_subfolder_name.tif " 해당 하 이미지 시간 시리즈의 한 실험, 실험 기간 동안 발견 하는 파리 ( 그림 1E)는 흰색 바탕에 검은 점 들으로 표현 됩니다. - 신중 하 게 아무 유물 발생 했 고 매크로 정확 하 게 일 한 결과 스택 검사 ( 그림 2F).
참고: 아티팩트의 예는 이미지 요소를 이동 하지 하지만 그는 같은 이미지 세그먼트화 알고리즘 (틀린 확실성)가 검색 될 수 있습니다. 이 예를 들어 투자 수익의 부정확 한 선택 때문에 배경 신호 감지를 때문일 수 있습니다,.
9. 사용 하 여 데이터 분석 " 섬 분석 결과 분석 "
- 구조 분석에 대 한 수 있도록 그림 2A에 표시 된 대로 데이터는 " 섬 분석 결과 분석 " 스크립트. 각 하위 분석 한 실험 조건에 해당 하는 하위 폴더가 기본 디렉토리 생성.
- 는 하위 폴더 생성 독립적인 실험 복제 ( 그림 2A) 및 제작한 results.txt 파일이 포함 된 폴더는 " 초파리 섬 분석 결과 " 매크로.
참고:는 " 섬 분석 결과 분석 " 매크로 한 번에 기본 디렉터리에 있는 모든 실험 조건 처리 합니다. - 시작 R 또는 R 스튜디오. 파일을 클릭 > > 파일 열기 … 선택 하 고 도구 모음에는 " 섬 분석 결과 분석 " 재구현
- Ggplot2와 matrixStats 패키지를 실행할 때 설치는 " 섬 분석 결과 분석 " 처음으로 스크립트. 콘솔 창에 다음을 입력:
> install.packages("ggplot2"), 입력
> install.packages("matrixStats"), 입력.
- Ggplot2와 matrixStats 패키지를 실행할 때 설치는 " 섬 분석 결과 분석 " 처음으로 스크립트. 콘솔 창에 다음을 입력:
- 지정 데이터 및 분석 출력의 위치는 스크립트에 파일. 다음 스크립트 행에서 삽입:
- 행 16: 분석 하 고 비교 하는 실험을 포함 하는 기본 디렉터리를 경로 삽입 ( 그림 2A, 이것은에 지시 하는 경로 " 섬 분석 결과 " 폴더).
- 행 19: 분석 출력 파일에 저장 된 폴더의 경로를 삽입.
참고: 행 16에에서 표시 된 디렉토리만 분석할 폴더를 포함할 수 있습니다. 스크립트 또한 제대로 작동 하지 것입니다 행 16 및 19 행에 삽입 경로 같은 경우.
- 코드를 클릭 하 여 스크립트 실행 > > 실행 지역 > > 도구 모음에서 모든 실행.
결과.csv 파일 세 개 및 한 결과.txt 파일 ( 그림 1E) 행 19에에서 정의 된 디렉터리에 표시 되는 참고: 통지. 이들은: (I)는 " data_all_conditions.csv " 각 실험 조건 및 실험적인 복제, 표 2에 설명 된 대로 조직에 해당 하는 처리 된 데이터 파일에 포함 되어 있습니다. (II)는 " 통계 summary.csv " 파일 요약 평균, 표준 편차 (SD), 및 각 실험 조건에 대 한 플랫폼에 파리의 %의 평균 (SEM)의 표준 오차. (III)는 " AUC.csv " 각 실험 복제에 대 한 곡선 아래의 영역을 포함 하는 파일. (4) 주요 폴더에 조건 수에 따라 스크립트는 어느 내보내기는 " Welch_t-test_results.txt " 파일 (조건 2) 또는 " AUC_anova_results.txt " 파일 (2 개 이상의 조건), 어디 t-검정의 결과 또는 ANOVA 비교 실험 조건 사이의 곡선 아래의 영역 표시 됩니다. .Tiff 파일의 이미지 ( 그림 1E) 4 종류 행 19에에서 정의 된 경로에 표시 되는 공지. 이들은 불린다: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (여기서 Name_Of_Data_Folder 사용자가 제공한 폴더 이름 나타냅니다), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " 및 " AUC_anova.tiff. " 자세한 정보 이 그래프의 내용에 대해 찾을 수 있습니다이 원고의 대표 결과에 그림 3에서.
Representative Results
설명된 프로토콜에서 초파리 섬 분석 결과 데이터는 인수 하 고 3 단계에서 처리. 첫째, 초파리 섬 플랫폼에 던진의 비행 탈출 응답 웹캠이 기록 이며 개별.bmp 이미지 (프로토콜 섹션 1-7)으로 저장 됩니다. 둘째,"초파리 섬 분석 결과" 매크로 (8 단계) 생성 "result.txt" 텍스트 파일 (표 1), 있는 각 프레임에 검색 된 개체의 수를 요약, 프레임 및 이미지 스택 "Result_stack.tiff," 표시 처리 개체의 각 프레임에 플랫폼의 영역 내에서 검색 합니다. 셋째, "섬 분석 결과 분석" 스크립트 (프로토콜 섹션 9)의 개별 실험 "results.txt" 파일에 저장 된 매크로 데이터를 처리 합니다. 몇 가지 단계는 필터링 하 고 통계 분석을 위해 데이터를 결합 스크립트에 포함 됩니다. 파리는 플랫폼에서 throw 됩니다 첫 번째 프레임 감지 하 고 1 시간으로 간주 됩니다. 이전 프레임 데이터 집합에서 제거 됩니다. 시간에 따라 100 프레임 포인트 1 (10에 s) 분석을 위해 선택 됩니다. 실험 있는 플랫폼에서 감지 하는 파리의 초기 수 5 보다 작으면 underpowered 실험에서 신뢰할 수 없는 결과 제거 하는 분석에서 자동으로 제외 됩니다. 플랫폼에서 감지 하는 파리의 초기 수 초과 "유리병 당 파리의 수" 설정을 플러스 3의 허용 오차는 실험도 제외 됩니다. 이 소음에 입자 잘못 파리로 검색 된 데이터 집합을 제거 합니다. 스크립트는 다음 시리즈에서 발견 하는 파리의 가장 높은 숫자에 비해 각 시간 지점에 대 한 검색의 비율을 계산 합니다. 파리 (파리의 비율 증가 플랫폼에 시간이 지남에 뒤 감소 감지) 투자 수익 및 산책에 의해 발생 하는 데이터 집합에서 오류는 자동으로 수정 하 여 그들에 관한 이전 단계에서 플랫폼에 일관 되 게 현재로 . 기본 디렉토리에 존재 했던 특정 실험 상태에 대 한 모든 복제 데이터 집합은 결합 하 고 "data_all_conditions.csv" 파일에 수출. 그것의 열 표 2에 설명 된 변수를 나타냅니다. 스크립트 또한 데이터가 포함 된 폴더에 따라 이름이 지정 하는 각 실험 조건에 대 한 선 그래프를 내보낼 것 이다. 이 그래프로 실험에 대 한 시간 (비행 탈출 응답) 플랫폼에 남아 있는 파리의 % (그림 3A각각 폴더에 복제-B). 평균, SD, 그리고 각 실험 조건에 대 한 SEM 계산 되며 "통계 summary.csv" 파일에 요약 한. "Escape_response_all_conditions.tiff" 라는 선 그래프가 보여줍니다 최대 12 평균 비행 탈출 반응 실험 기본 폴더 (그림 3C)에 존재 하는 조건을. 마지막으로, 기본 폴더에 있는 모든 실험 조건에 대 한 곡선 아래 면적 계산 이며 "AUC.csv" 파일에 요약. 주요 폴더에 조건 수에 따라 스크립트 중 수행 양측 홀된 웰 치 t-검정 (2 조건) 또는 Tukey 정정 ANOVA 여러 테스트를 확인 (2 이상 조건)에 대 한 여부는 실험 조건에서 서로 크게 다릅니다. 이러한 결과 "Welch_t test_results.txt" 또는 "AUC_anova_results.txt"에서 요약 된다 ANOVA를 수행할 때 스크립트 또한 평균 AUC에에서 차이 비교 실험 조건의 95% 신뢰 간격을 표시 하는 "AUC_anova.tiff" 파일을 내보낼 것 이다. 모든 실험 조건에 대 한 실험적인 복제의 곡선에서 절대 영역의 값은 "AUC.tiff" (그림 3D)에 중앙값으로 개별 데이터 요소로 표시 됩니다.
증 Telangiectasia (AT)는 상 염색체 열성 운동 장애 증 Telangiectasia 돌연변이 (ATM) 유전자14돌연변이 때문에 소 뇌 증의 발병 초기에 의해 특징입니다. ATM, tefu의 초파리 orthologue의 돌연변이 성과 장 수15에 결함을 표시합니다. "초파리 섬 분석 결과" 매크로 평가 하려면의 초파리 모델 섬 분석 결과에서 시험 되었다 그리고 매크로의 데이터 출력 수동 데이터 수에 비해. 결과 유비 쿼터 스 tefu 최저 (w-; Actin-Gal4/GD11950) 그들의 유전 배경 컨트롤 (-; w에 비해 플랫폼을 떠나이 파리의 능력을 크게 감소 Actin-Gal4/+) (그림 4). 1 후 s, 제어 파리의 50% 탈출 플랫폼, 달리는 < tefu의 1%-RNAi 파리. 매크로와 충실 하 게 얻은 데이터 수동 계산, 매크로 섬 분석 결과 데이터의 정량화 및 운동 결함 ( 의 평가에 사용할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구 임을 나타내는 얻은 데이터를 복제 하는 중요 한 것은, 그림 4 A-B).
그림 1: 요구 사항, 실험 절차, 및 섬 분석 결과의 분석 개요 순서도. (A) 섬 시험 장비. (B) 섬 분석 결과 대 한 실험 설정. (C) 섬 분석 결과. (D)"초파리 섬 분석 결과" 매크로와 섬 분석 결과 데이터의 처리. "초파리 섬 분석 결과" 매크로 3 하위 매크로의 구성: 1) 스택 및 투영, 2) 정의 플랫폼, 및 3) 분석. (E) 처리 고 "섬 분석 결과 분석" 스크립트를 사용 하 여 데이터의 통계 평가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로토콜 중 필요한 다른 조정의 예. (A)는 필수 디렉터리 구조는 섬 분석 결과 실험 데이터 처리 및 분석을 위한 저장 해야 합니다. (B) 파리 나타나야 비디오 설정을 조정할 때 흰색 바탕에 검정. (C) 이미지 프레임 출력 파일로 저장이 원고에 설명 된 이미지 레코딩 소프트웨어. (D) 노란색 윤곽선 플랫폼 선택을 표시합니다. "ROI 관리자"에서 저장된 플랫폼 선택 파란색으로 강조 표시 됩니다. (E) 파리는 "최소 비행 크기 설정."의 조정 동안 흰색 점으로 표시 됩니다. 결과 창에서 픽셀 파리의 영역을 표시합니다. (왼쪽)에 기록 된 하나의 이미지 프레임 (오른쪽)에"초파리 섬 분석 결과" 매크로로 얻은 결과 이미지 스택에서 해당 프레임의 (F) 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: "섬 분석 결과 분석" 하시기로 데이터 처리 후 얻은 결과 이미지 (A) 선 각 비행 탈출 응답을 보여주는 그래프 제어 실험 복제. (B) 선 각 tefu RNAi 실험적인 복제에 대 한 비행 탈출 응답을 보여주는 그래프. (C) 평균 비행 탈출 응답 표시 된 실험 조건; 오차 막대의 곡선 분포 제어 및 돌연변이 조건 아래 영역을 나타내는 SEM. (D) 도트 플롯을 나타냅니다. 두 tefu RNAi 및 제어 조건에 대 한 실험적인 복제는 개별 데이터 포인트 (블랙)에 중앙값 (레드 라인)으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 유비 쿼터 스 tefu 최저의 파리 플랫폼을 두고 크게 감소 능력을 보여줍니다. 데이터 제어 (w-;에 대 한 시간 (s)에 플랫폼에 파리의 %를 나타내는 Actin-Gal4/+)와 tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) 파리. (복제의 수 = 5; 오차 막대를 나타내는 SEM). (A)"초파리 섬 분석 결과" 매크로와 얻은 원시 데이터 (B) 점 제어 및 tefu RNAi 조건"초파리 섬 분석 결과" 매크로와 얻은 곡선 분포에서 영역을 나타내는 플롯 (웰 치 홀 t-검정, * * p < 0.01). (C) 원시 데이터의 수를 수동으로 계산 하 여 얻은 파리 초당 섬에 존재. (D) 도트의 곡선 분포 제어 및 손으로 계산 하 여 얻은 Tefu RNAi 조건 아래 영역을 나타내는 플롯 (웰 치 홀 t-검정, * * p < 0.01). 오차 막대는 SEM. 대표 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 열 이름 | 설명 | ||
| 슬라이스 | 프레임 이름입니다. | ||
| 개수 | 플랫폼 (ROI)의 범위 내에서 프레임에서 검색 된 개체의 수입니다. | ||
| 총 면적 | 픽셀에서 (ROI) 플랫폼의 한계 내에서 프레임에서 검색 된 개체의 총 면적. | ||
| 평균 크기 | 플랫폼 (ROI)의 범위 내에서 개체의 수로 나눈 프레임에서 검색 된 개체의 총 면적. | ||
| % 영역 | 지역 플랫폼 (ROI)의 전체 면적에 대해 개체의 백분율입니다. | ||
| Perim입니다. | 픽셀에서 (ROI) 플랫폼의 한계 내에서 프레임에서 검색 된 개체의 총 둘레. | ||
| 분 비행 크기 | 최소 크기 설정 (픽셀)에서"초파리 섬 분석 결과" 매크로의 그래픽 인터페이스에 사용자에 의해 정의 된 비행. | ||
| 지역 투자 수익 | 하위 매크로 실행 하는 동안 사용자에 의해 정의 된 플랫폼 (ROI)의 영역 (픽셀)에서 플랫폼을 정의 합니다. | ||
| 파리의 수 | "초파리 섬 분석 결과" 매크로의 그래픽 인터페이스에 사용자가 정의한 실험 당 사용 하는 파리의 수입니다. | ||
표 1: 매개 변수"초파리 섬 분석 결과" 매크로 의해 측정. 이 표에 설명 된 매개 변수"초파리 섬 분석 결과" 매크로 실행 시 "results.txt" 파일에 표시 됩니다.
| 열 이름 | 설명 | ||
| 슬라이스 | 프레임 수입니다. | ||
| 개수 | (ROI) 플랫폼의 한계 내에서 프레임에서 발견 하는 파리의 수입니다. | ||
| X.Area | 픽셀 단위로 플랫폼 (ROI)의 범위 내에서 프레임에서 발견 하는 파리의 총 면적. | ||
| 분 비행 크기 | 최소 크기 항목 설정 (픽셀)에서"초파리 섬 분석 결과" 매크로의 그래픽 인터페이스에 사용자에 의해 정의 된 비행. | ||
| 지역 투자 수익 | 플랫폼 (ROI, 픽셀 단위로) 하위 매크로 실행 "정의 플랫폼" 사용자에 의해 정의 된 영역. | ||
| 파리의 수 | "초파리 섬 분석 결과" 매크로의 그래픽 인터페이스에 사용자가 정의한 실험 당 사용 하는 파리의 수입니다. | ||
| X.Count | % 실험 중에 플랫폼에서 감지 하는 파리의 가장 높은 번호를 기준으로 각각 슬라이스/프레임에서 플랫폼에 있는 파리. | ||
| Timepoint | 시간 포인트 1 첫 번째 프레임 분석을 나타내고 파리 처음 나타나는 플랫폼에 프레임에 해당. 분석 하는 복제 당 100 프레임의 총 (10에 s, 설명된 설정을 사용할 때. | ||
| 실험 | 조건 당 복제의 수입니다. | ||
| 조건 | 실험 조건 (에 따라 데이터를 포함 하는 폴더의 사용자 정의 이름)의 이름을 나타냅니다. | ||
표 2: 설명 변수의 "섬 분석 결과 분석" 하시기를 사용 하 여 데이터를 처리 한 후 얻은 이 표에 설명 된 매개 변수 "섬 분석 결과 분석" 스크립트를 사용 하 여 데이터 처리 시 "data_all_conditions.csv" 파일에 나타납니다.
Discussion
이 프로토콜 양적 초파리 모터 동작을 평가 하는 섬 분석 결과 중"초파리 섬 분석 결과" 매크로를 설명 합니다. 매크로 정확 하 게 계산 플랫폼에 파리, 시간이 지남에 만들고 섬 분석 결과 매우 민감한 운동 결함의 양적 높은 처리량 평가 적합 합니다. 방법론 약물 노출을 포함 하 여 다른 유전자 또는 환경 조건 하에서 성장 하는 파리와 어떤 조건 든 지의 비교에 대 한 수 있습니다. 운동 장애의 초파리 모델 및 다른 신경 질환을 공부 하면 큰 유전 또는 제약 스크린을 수행할 때 또는 운동 또는 비행 검사 때이 판독은 이렇게 검색 도구로 서 유용 동작입니다.
이 원고에 섬 분석 결과 프로토콜 기존/대체 방법에 비해 이점이 있습니다. 예를 들어 비디오 추적 운동은 훨씬 더 어렵고 큰 샘플 크기를 테스트를 위해 보다 적게 적당 하다. 섬 분석 결과 높은 처리량 검열 도구 이며, 이러한 의미에서은 급속 한 대화형 부정적인 geotaxis (반지) 분석 결과16. 둘 사이의 차이점은 섬 분석 광범위 한 운전 문제;의 검출에 대 한 허용 플랫폼을 떠나 파리의 무 능력 비행, 점프, 결함에 의해 발생할 수 있습니다 또는 걷는 동작에 기인한 날개 (근육/신경) 또는 다리 (근육/신경) 결함. 다른 한편으로, 반지 분석 결과 다리 (근육/신경) 결함으로 인 한 등산/산책 행동에 결함을 평가 합니다. 경우에 사용자가 여러 행동 정보에 관심이 있는, 섬 분석 결과 또한 쉽게 반지 분석 결과 같은 다른 분석 실험과 결합 수 있습니다. 더하여, optogenetics에 필요한 레이저 섬 분석 결과 상자에 쉽게 설치할 수 및 설치는 너무 간단 그것 쉽게 방에 온도 빛을 제어할 수 있습니다 이동할 수 있습니다.
성공 및 여기에 설명 된 섬 분석 결과의 재현성을 보장 하기 위해, 몇 가지 권장 사항은 따라야 한다. 약 수와 전송 실험 테스트를 파리 리 바이 알에 CO2 또는 감기 마 취의 효과 피하기 위해 실험 전에 적어도 1 일. 실험적인 병 들이다 하지 마십시오 (병 당 10-15 파리를 사용 하 여, 항상 유리병 당 파리의 동일한 수를 배치 하는 것이 좋습니다). 항상 신선한 음식에 파리를 유지. 그렇지 않으면 아직 익숙한 실시 분석 결과, 수율을 최대화 하기 위해 플랫폼에 파리 연습 던지기. 또한 신속 하 게 손을 제거 연습으로 데이터 분석 (이미지 분석 및 비행 손 그림에서 후에 시작을 계산)으로 나중에, 오른쪽. 환경 및 실험 조건을 비교 하는 실험에서 동일한 유지 (예를 들어, 컨트롤 돌연변이 나는 유전자 형 다른 연령대에서 테스트). 항상 하루 중 같은 시간에 실험을 수행 하 고 제어 된 온도 습도 조건에서 튜브를 유지 합니다. 통계적 인 힘에 대 한 생물 학적 복제 당 적어도 3 개의 기술 복제를 테스트 합니다.
설명 하는 매크로의 성공적인 성능을 보장 하기 위해 여기, 웹캠 및 이미지 설정을 조정 해야 합니다 최대한 대비를 달성 하기 위해: 흰색에 검정 개체로 나타나는 파리. 매크로 의해 파리의 수 제대로 계산 되지 않습니다 때 대비 설정을 조정, ROI 제대로 선택 되었는지 여부를 확인 하 고 플랫폼에 파리의 크기 지정된 최소 위에 확인 날 크기 설정 (8.3이이 프로토콜의 단계 참조). 설정을 한 번 정의 될 필요가 있다. 웹캠과 플랫폼 사이의 거리는 변경 되지 않습니다으로 그들은 모든 실험에 적용 됩니다. Circularity_min 및 최대 설정 정의 입자의 순환 (입자 계산된 파리 =) 분석에 대 한 계정으로 옮겨질 것입니다 (파리 = 계산된 개체). 1 완벽 한 원을 나타내고 0 선17를 나타냅니다. 파리는 항상 어느 정도의 순환 (비행 거리는 직선으로 나타날 수 없습니다)을 제시, 이후 1에서 "Circularity_max" 설정 하 고 "Circularity_min" 설정 0.4에서 설정 됩니다. 사용자가이 설정을 조정할 필요가 가능성이 크다.
매크로 때때로 계산 실수를 파리는 플랫폼의 테두리에 가깝게 만듭니다. 이 파리는 사용자 정의 투자 수익에 밖으로 걸어 하지만 날지 못하는 경우 발생할 수 있습니다. 대부분의 경우에 (그것은 가능한 플랫폼 피팅) 투자 수익을 다시 선택이 문제가 쉽게 해결할 수 있다. 그러나, "섬 분석 결과 분석" 스크립트 감지할 수 이며 올바른 부적절 한 데이터 카운트 ROI와 비교적 잘 걷는 파리에 의해 발생 합니다. 여기에 제시 된 웹캠의 해상도 충분히 가까이 꽤 잘 파리 차별 높은, 우리는 추가 알고리즘"초파리 섬 분석 결과" 매크로의 이미지 처리 절차에 같은 구현에 분수령 기능17를 침식 하 고. 이러한 플랫폼에 가까운 근접에 있는 파리의 적절 한 묘사를 용이 하 게. 또한, 매크로 플랫폼에서 뛰어 또는 멀리에서 날아 파리 구분할 수. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 일반적으로 건강 한 젊은 비행 긴장 이전 파리와 파리 운동 적자와 플랫폼에 더 이상 남아 및 됩니다 결국 점프 또는 플랫폼에서가, 플랫폼에 떨어질 때에 즉시 날아 관찰 됩니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 분석 결과 및 분석 운동 행동의 매우 정확한 측정을 제공합니다.
"섬 분석 결과 분석" 스크립트의 성공적인 성능을 보장 하기 위해 사용자가 프로토콜에 표시 된 스크립트 행에서 입력 및 출력 파일에 대 한 올바른 경로 입력 하 고 (올바른 폴더 형식으로 데이터를 제공 하기 다는 것을 확인합니다 그림 2)에서. 사용자 발견 너무 엄격한 신뢰할 수 없는 실험 데이터를 필터링 하는 데 사용 하는 기준 (68 행: "계산" 열에 첫 번째 값이 5 보다 작거나; 71 행: "수" 열에 첫 번째 값은 파리에는 platfo의 총 수 보다 높은 rm + 3), 68-71 "섬 분석 결과 분석" 스크립트에서 행에 텍스트 앞에 #을 추가 하 여 이러한 필터 설정 꺼 주십시오. 이 경우에, 모든 데이터는 분석에 포함 됩니다. 또한, 필터 설정 68 및 71 사용자 필요에 따라 행의 값을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. "초파리 섬 분석 결과" 매크로 의해 생성 된 "results.txt"에서 카운트 값에 가능한 아티팩트 수동으로 조정할 수도 있습니다, 하 고 스크립트를 다시 조정된 데이터에서 실행할 수 있습니다. 때 사용자는에 관심이 10 프레임 이상 또는 10 개 이상의 처리 데이터의 s, "섬 분석 결과 분석" 스크립트에서 처리 하는 프레임 수 한다조정할 수 있습니다. 통계 분석 사용자 정의 대안 또한 대체 수 있습니다.
폴더 라는 "예 섬 분석 결과," 섬 분석 결과 사용 하 여 얻은 이미지 시계열와 예제를 포함 하는 다음 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. "예 섬 분석 결과" 폴더를 다운로드 하 고 신속 하 게 파일 저장, "초파리 섬 분석 결과" 매크로와 "섬 분석 결과 분석" 이미지의 처리의 구조에 익숙하게 될 하이 프로토콜에서 설명 하는 단계에 따라 스크립트입니다.
섬 분석 결과, 개발 된 매크로 및 분석 스크립트와 함께 사용할 수 있습니다 평가 하 고 증 Telangiectasia의 초파리 모델의 탈 선 운동 동작을 계량. 때문에 분석 결과 다양 한 연령대에 효율적으로 적용할 수 있는, 고기의 잠재적으로 진보적인 성격을 분석 하는 데 적합 하다.
요약 하자면,"초파리 섬 분석 결과" 매크로 "섬 분석 결과 분석" 스크립트와 함께 섬 분석 결과 객관적으로 분석 하 고 의 운동 결함을 계량 분석, 신뢰성, 비용 효율적이 고 고효율 결과 초파리 는 높은 처리량 방법으로 운동 장애의 모델.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 비엔나 초파리 리소스 센터와 초파리 긴장을 제공 하기 위한 블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018537) 인정 합니다. 우리는 우리에 게 섬 분석 결과 설치를 구축 하기 위한 섬 분석 결과 Martijn Eidhof 소개 Klämbt 실험실에 감사. 이 연구는는 E-희귀-3 공동 국제 전화에서 지 원하는 부분에 부여 "요법을 준비 하 고 상 염색체 열성 ataxias에 대 한"에 대 한 과학적 연구 (NWO), 그리고 네덜란드 조직에서 최고 그랜트 (912-12-109)에 의해 준비 (NWO 9003037604), 두 DCN/Radboud 대학교 의료 센터 박사 장학금. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
