Immunology and Infection

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898

Laura Rodriguez¹, Aitor Nogales¹, Luis Martínez-Sobrido¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Abstract

Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo¹ y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo². Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.

Introduction

Gripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae ³. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa³. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana⁴. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año²^,⁵. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebre, malestar general, cefalea, anorexia y mialgias, pero el virus también puede producir una enfermedad más severa en pacientes inmunocomprometidos⁶. De hecho, la Organización Mundial de la salud (OMS) calcula que el virus de la gripe estacional causan 300.000-500.000 muertes en todo el mundo cada año¹. Hay sólo dos clases de medicamentos actualmente aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para la profilaxis de la gripe y tratamiento en seres humanos: inhibidores de la neuraminidasa (NA) (p. ej., oseltamivir) y bloqueadores del canal iónico M2 (p. ej., amantadina); sin embargo, la aparición de variantes del virus resistentes a los medicamentos es una preocupación cada vez mayor. Vacunación, por lo tanto, sigue siendo la mejor opción médica para proteger a los seres humanos contra las infecciones de gripe. Hasta la fecha, tres tipos de influenza hay vacunas aprobadas por la FDA para el uso humano: las vacunas de proteínas recombinantes virales hemagglutinin (HA), inactivadas vacunas contra la influenza (IIV) y viva atenuada de influenza vacunas (LAIV)⁵^, ⁷. las tres vacunas están diseñadas para inducir la respuesta inmune adaptativa contra la proteína viral de la HA, el objetivo principal de neutralizar anticuerpos contra la gripe.

Un modelo de ratón validado para el estudio de infección de IAV en vivo

Se han utilizado modelos animales para estudiar, entre otros, IAV patogenesia⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, factores virales que contribuyen a la enfermedad¹² o transmisión viral¹³ ^,¹⁴, y probar la eficacia de nuevas vacunas o antivirales fármacos⁹^,¹⁰^,¹⁵. Ratones (Mus musculus) son el modelo animal más ampliamente utilizado para la investigación IAV por varias razones: 1) el sistema inmune es evolutivamente similar al que presentan en los seres humanos; compra animal de bajo costo, incluyendo 2), la vivienda y la reproducción; 3) pequeño tamaño fácilmente manipular y almacenar; 4) variabilidad de host mínimo para obtener respuestas homogéneas y resultados; 5) un gran conocimiento de la biología de ratones, incluyendo la secuencia del genoma; 6) muchos disponible biología molecular y/o reactivos de Inmunología; 7) disponible knock out (KO) de ratones para estudiar la contribución de una proteína huésped dado en infección viral; y, 8) múltiples cepas de ratón que pueden ser aprovechadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones.

Hay varias cepas de ratón disponibles actualmente para el estudio de IAV en vivo. Edad, estado inmunitario, sexo, cepa genética de fondo y el ratón, así como rutas de infección, dosis y cepas del virus de influyen en el resultado de la infección del IAV en ratones. Las cepas de ratón más comunes utilizadas en la investigación IAV son C57BL/6, BALB/C y, más recientemente, DBA.2 ratones ya que son más susceptibles a la enfermedad IAV que dos cepas anteriores¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^, ¹⁹ ^, ²⁰. lo que es importante, la respuesta inmune también puede ser diferente dependiendo de la cepa de ratón¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Por lo tanto, es muy importante recuperar toda la información disponible sobre el ratón y la cepa IAV a elegir la mejor opción para el experimento a realizarse.

Aunque el ratón es un buen modelo animal de infección para los estudios en vivo IAV, tienen varias limitaciones, que deben considerarse en el diseño experimental. Por ejemplo, una limitación importante de la utilización de ratones en vivo estudios es que la gripe no transmite entre ratones. Así, para la transmisión de los estudios, más aceptado modelos animales (e.g., hurones o cobayas) son usados¹⁶^,¹⁷^,²¹. Además, hay varias diferencias entre las manifestaciones del IAV en ratones y seres humanos. A diferencia de los seres humanos, ratones no desarrollan fiebre con infección de IAV; por el contrario presentan hipotermia¹⁶^,¹⁷. En ratones, replicación de IAV se concentra en el tracto respiratorio inferior (pulmones) en lugar de las vías aéreas superiores. Por lo tanto, virulencia del IAV en ratones no se correlaciona siempre al que se observa en los seres humanos. En conjunto, ya que las ventajas compensan las desventajas limitadas, ratón representa el primer modelo animal para evaluar patogenesia viral gripe, inmunogenicidad y eficacia protectora en los estudios de vacunas y antivirales. Por otra parte, no sería éticamente aceptable para llevar a cabo estudios con IAV usando modelos animales grandes sin pruebas previas en un pequeño modelo animal de infección IAV. En este manuscrito, describimos cómo infectar ratones intranasal (i.n.) con IAV, cómo controlar la severidad y progreso de la infección viral y cómo llevar a cabo los experimentos necesarios para evaluar la respuesta inmune humoral y la eficacia de protección.

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Protocol

todos los protocolos animal descritos aquí fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y el Comité institucional de bioseguridad (IBC) en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología y cumplir con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la 22 de Consejo de investigación nacional. Las instalaciones y programas del vivero y la división de medicina del laboratorio Animal de la Facultad de medicina y odontología están acreditados por AAALAC International y cumplan con la política de institutos nacionales de salud (NIH), ley federal y ley estatal. Requisitos similares se apliquen en cada institución se adhieran a los protocolos animal descritos en este manuscrito.

1. uso de animales vertebrados pequeños

Nota: el equipo de Protección Personal apropiado (PPE) se requiere para trabajar con los ratones. Requisitos mínimos incluyen batas desechables, cubre zapato, capucha cabeza, mascarilla y guantes.

Acuerdo con el protocolo IACUC, coloque un máximo de 5 ratones por jaula. Siguiendo el protocolo IACUC, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia (la segunda debe ser un método físico) para asegurarse de que el animal está muerto.
Nota: En los experimentos en que IAV se evalúan morbimortalidad, ratones que perdieron 20% de su peso corporal inicial se considera haber alcanzado el extremo experimental y fueron sacrificados con CO ₂ y la dislocación cervical como la método secundario físico. Este porcentaje de peso corporal puede ser diferente en otras instituciones. En los procedimientos donde se recogen los pulmones de ratones y la mucosa nasal después de la infección de IAV, ratones son sacrificados con una dosis letal de 2,2,2-tribromoethanol (TBE) y cortando el hepático vena como método secundario físico. Mujer ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad fueron comprados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de los animales en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología en condiciones libres de patógenos específicas.

2. Bioseguridad

Nota: en este informe, la gripe utilizada para infectar ratones es la cepa de laboratorio adaptados al ratón común de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8 WT) ²² ^, ²³ y una temperatura sensible LAIV variante, PR8 LAIV ⁸. Realizar todos los procedimientos que implican las infecciones IAV (en la vitro o en vivo), cultivos celulares y muestras biológicas, en un gabinete bajo nivel biosafety (BSL) -2 de seguridad biológica condiciones. Utilizar los otros trajes BSL o condiciones de contención si se utilizan cepas altamente virulentas de IAV.

Limpie el gabinete con desinfectante del dióxido de cloro antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito de bioseguridad. Esterilizar todo el material de disección (tijeras, bisturí y disección pinzas) y los homogeneizadores Dounce antes y después de su uso siguiendo las recomendaciones adecuadas de IBC. Descarte todo el material producido durante los procedimientos bajo pautas adecuadas de IBC y IACUC.

3. Infección intranasal

lugar del 6 a 8 semanas de edad hembra C57BL/6 ratones en condiciones libres de patógenos específicas. Organizar y etiquetar el ratón jaulas con el virus y la dosis utilizada. Identificar los ratones en cada jaula mediante un código de punzón de oreja o con otro método aprobado, como la pintura de las colas. Colocar un máximo de 5 ratones por jaula.
Preparar la dilución de IAV (fluorescente formando unidades (FFU) ratón) bajo condiciones asépticas en un volumen total de 30 μL/ratón estéril 1 x solución salina buffer fosfato (PBS). Mantener el inóculo de virus en el hielo. Calcular la cantidad de IAV a añadir en la dilución viral con la fórmula: ((X FFU por ratón/30 μL) x volumen final) / stock título viral.
Los ratones con una escala de pesar y registrar el peso de cada ratón (día 0). Mantenga el ratón en una posición dorsal al recoger por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique.
Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (i.p.) con 240-250 mg/kg de TBE insertando la aguja en el 2/3 caudal del lado derecho del abdomen. PAUSE brevemente antes de retirar la aguja. El ratón a la jaula y esperar 5 minutos
Aplique ungüento oftálmico estéril a los ojos para evitar la sequedad mientras el ratón está anestesiado. Compruebe si el ratón está anestesiado por falta del reflejo de retirada del pedal (es decir, presión del dedo del pie). Si los ratones no están completamente anestesiados tosen por el virus de la.
Cuando el ratón está totalmente anestesiado, coloque el ratón en recumbency dorsal. Poner la punta de la pipeta que contiene 30 μL del inóculo de virus en la nariz y lentamente pero constantemente expulsar la solución. Asegúrese de que el ratón es inhalar la preparación observando el inóculo gota desapareciendo.
Compruebe que el ratón está respirando como TBE puede deprimir la tasa de respiración y temperatura. Devolver el animal a la jaula en recumbency dorsal. Controlar los ratones para detectar cualquier signo de dificultad respiratoria y si observan, el ratón para respirar por animal sosteniendo verticalmente e inducen impacto impulsado por la respiración ²⁴. Controlar el ratón hasta que recupere conciencia (30-45 minutos después de fue anestesiada).

4. Caracterización de la patogenesia Viral ( figura 1)

evaluación de la morbilidad y mortalidad ( figura 1 y figura 2)
1. Infectar i.n. 3-4 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (por lo menos 5 ratones por grupo, n = 5) con dosis 10 veces (10, 10 ² 10 ³ y 10 ⁴ FFU y ratón) de PR8 WT como se describe en la sección 3.
2. Monitor y pesan los ratones con una escala en los próximos 14 días en aproximadamente el mismo tiempo para minimizar las variaciones del peso debido a la ingestión de alimentos. Eutanasia a ratones que pierden 20% de su peso corporal inicial como se describe en la sección 1.
3. Después de 14 días, eutanasia a los ratones que sobreviven a la infección viral como se describe en la sección 1.
4. Calcular el viral ratón 50% la dosis letal (MLD ₅₀) basada en los datos de supervivencia obtenidos mediante el método de Reed y Muench ²⁵. En primer lugar, calcular la distancia de la proporción (PD):
  1. a continuación, calcular el MLD ₅₀ mediante la siguiente fórmula:
evaluación de los títulos virales en los pulmones y la mucosa nasal ( figura 1 y figura 2. )
recuperación de pulmones y mucosa nasal
1. infectar ratones de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad hembra i.n. (n = 6) con la dosis viral a la prueba 10-10 ⁴ FFU de PR8 WT como se describe en la sección 3.
2. Recoger los pulmones de ratón y la mucosa nasal en los días 2 (n = 3) y 4 (n = 3).
  1. Eutanasia a los ratones con una dosis letal (i.p.) de TBE (500 mg/kg). Coloque el animal en dorsal recumbency y desinfectar la piel sobre el tórax con etanol al 70%. Cortar la piel con un escalpelo desde el esternón hasta la base del abdomen. Hacer cortes de 1 cm de la base de la incisión a las partes laterales de los ratones con las tijeras.
  2. Cortar la vena hepática con tijeras a sangrar el ratón como el método de eutanasia secundaria. Coloque el animal en posición ventral y esperar 2 minutos para permitir que la sangre drene hacia fuera. Este paso es importante para reducir la sangre en los pulmones.
  3. Quitar la piel de toda la parte superior del ratón (incluido el jefe) a la base del abdomen donde se hizo la primera incisión con la ayuda de pinzas y tijeras de disección. Cortar la cabeza con las tijeras y colocarlos en un plato de Petri seca estéril.
  4. Cortar a las uniones entre el maxilar y la mandíbula con las tijeras y deseche la mandíbula. Con las tijeras, hacer dos cortes en los extremos de los arcos cigomáticos y eliminarlos. Quitar los ojos con la ayuda de las pinzas de disección.
  5. Sostener el cráneo con el fórceps de disección y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí. Levante las dos mitades del cráneo con el cerebro para ver la mucosa nasal. Las mucosas nasales están rodeadas por los huesos etmoides y huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar, Palatino, malar,.
  6. Con el bisturí, cortar la parte del cráneo con el cerebro y deseche. Colocar la otra parte del cráneo con la mucosa nasal en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.
  7. Para evitar la contaminación de las muestras, limpiar y desinfectar las herramientas de disección entre cada tejido recuperado y entre cada disección animal con desinfectante del dióxido de cloro.
  8. Para recoger los pulmones, coloque el animal en recumbency dorsal y corte la pleura con las tijeras. Abrir la caja torácica cortando las costillas a 1 cm a ambos lados del esternón. Hacer los recortes de la base de la caja torácica en la parte superior con las tijeras.
  9. Hacer un corte transversal con las tijeras entre las dos incisiones en la parte superior de la caja torácica y retire la placa del pecho. Mantenga los pulmones con las pinzas, cortar al final de la tráquea (justo antes de los pulmones) con las tijeras y poner los pulmones en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.
    Nota: Homogeneizar las muestras de tejido en el mismo día que se recogen y almacenan a-80 ° C para analizar títulos virales más adelante. Es importante que las muestras no se someten a congelación y descongelación repetida ciclos antes de que se determinan los títulos de virus. Como alternativa, guardar las muestras de tejido a-80 ° C hasta que se procesarán.
Homogeneización de pulmones y mucosa nasal
1. Coloque los pulmones o la mucosa nasal en un homogeneizador de Dounce estéril y añadir 1 mL de medio de infección fría. Homogeneizar la muestra moviendo la mano hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente (RT) hasta que los pulmones están completamente interrumpidos. Poner la muestra homogeneizada en un tubo estéril y tienda a 4 ° C. utilizar un homogeneizador de Dounce nueva para cada muestra.
2. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5-10 min a RT. recoger el sobrenadante en un tubo estéril nuevo. Guarde el sobrenadante a 4 ° C si la titulación viral se realiza en el mismo día y descartar el precipitado. O bien, congelar (-80 ° C) del sobrenadante de homogeneizado de la muestras para evaluar los títulos virales más tarde.
Titulación de virus por inmunofluorescencia indirecta
1. el día antes de la titulación, placas de 96 pocillos con células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (4 x 10 ⁴ células/pocillo) para llegar a la confluencia de ~ 80-90% en medios de cultivo de tejidos de la semilla. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO ₂. El día de la titulación viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.
2. 1:10 de preparar las diluciones del sobrenadante de las muestras homogeneizadas (pulmón o mucosa nasal) en medios de infección en una placa de 96 pocillos. Realizar la titulación viral por triplicado para determinar con precisión los títulos virales.
  1. Agregar 90 μl de medio de infección para cada uno de los pozos de la placa de 96 pocillos. Añadir 10 μl de uno del sobrenadante de las muestras homogeneizadas a pozos A1, A2 y A3 para evaluar el título viral de cada muestra por triplicado. Añadir 10 μl de sobrenadante de otra de las muestras homogeneizadas a pozos A4, A5 y A6. Realizar la misma dilución consecutivamente con el resto de las muestras.
  2. Después de la adición la muestra sobrenadante a la columna A, usa una pipeta multicanal para mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir 10 μl de la columna A fila B. cambio las puntas entre diluciones y mezclar bien. Repetir este proceso hasta llegar a la última fila (H).
3. Retire el medio de cultivo de tejidos (paso 4.2.3.1) usando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal de las células MDCK en placas de 96 pocillos y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.
4. transferir 50 μL/pocillo del sobrenadante diluido en serie de las muestras homogeneizadas a la placa de 96 pocillos con MDCK. Empezar a transferir las diluciones más altas (columna H) a las diluciones más bajas (columna A). En este caso, no es necesario cambiar las puntas entre hileras diferentes.
5. Poner las placas de 96 pozos en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de los medios de comunicación después de la infección. Incube las células infectadas para 8 h en un incubador de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂. Proceder a la fijación, tinción, proyección de imagen y cálculo del título viral como se describe en pasos 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
6. Retire el medio de cultivo de tejidos de las placas de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Fijar y permeabilizar las células con 100 μL/pocillo de solución de fijación/permeabilización por 20 min a TA.
  PRECAUCIÓN: Use la solución de fijación/permeabilización en una campana de humos para evitar la exposición al formaldehído.
7. Quitar la solución de fijación/permeabilización utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal, lavado con PBS 1 x, incubar las células fijas con el bloqueo de solución por 1 h a RT. tienda las células al bloquear la solución a 4 ° C o proceder al siguiente paso.
8. Quitar la solución de bloqueo. Añadir 50 μL/pocillo de 1 μg/mL anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NP HB-65 diluido en solución de dilución del anticuerpo. Incubar durante 1 h a 37 ° C. diversos mAb o polyclonpuede ser utilizado al (pAb) los anticuerpos anti-PR8.
9. Mientras tanto, diluir 1: 200 el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticuerpo secundario conjugado del anti-ratón en solución de dilución del anticuerpo. Centrifugue la solución a 1.700 x g durante 5-10 min a TA. Pueden utilizarse otros anticuerpos secundarios conjugados con otros fluoróforos.
10. Quitar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Añadir 50 μL/pocillo de la dilución del anticuerpo secundario e incube durante 30-45 min a 37 ° C. quitar el anticuerpo secundario y lavado 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Deje el último lavado de la placa.
11. Observar las células bajo un microscopio de fluorescencia para determinar el número de células positivas (verde). Calcular el título viral contando FFU/mL. Calcular el título viral expresado en FFU/mL de la dilución con 30-50 las células manchadas positivas mediante la fórmula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/dilución.

5. Evaluación de la respuesta inmune Humoral ( figura 3)

infectar i.n. 3 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) con diferentes dosis (10 ² 10 ³ y 10 ⁴ FFU / ratón) de LAIV PR8 y mock-infectar a un grupo (n = 5) con 1 x PBS estéril como control negativo. Realizar las infecciones de ratón i.n como se describe en la sección 3.
1. Ratón sangrado por punción submaxilar
  1. catorce días después de la inmunización, recoger la sangre de ratones submaxilar sangrado utilizando una lanceta ²⁶ de 4 mm, o con IACUC otro método aprobado.
    1. Mantenga el ratón recogiendo por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique para inmovilizar el ratón.
    2. Poner el ratón en una posición lateral a la mejilla. Realizar la punción en la Unión de las venas retro orbital y submaxilares con la vena yugular. Fregadero de la lanceta (4 mm) y recuperar la sangre en un tubo estéril (aproximadamente 0.2 - 0.4 mL/ratón se recuperan). Aplique presión sobre la punción con una toalla estéril durante unos segundos. Coloque el ratón en la jaula.
  2. Poner los tubos por 1-2 h a 37 ° C y luego los Centrifugue a 700 x g durante 30 min a temperatura ambiente para separar el suero de la sangre. Transferir la capa superior que consiste en el suero con una pipeta en un tubo estéril nuevo. Deseche los pellets de células de sangre rojas (RBCs). Almacenar el suero a -20 ° C.
Análisis de anticuerpos totales contra proteínas virales
1. preparación de extractos de células MDCK infectados
  1. el día antes de la infección, la semilla un plato de 100 mm con 4-5 x 10 ⁶ células MDCK (a ~ 80-90 confluencia de % al día siguiente) en medios de cultivo de tejidos. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO ₂. El día de la infección viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.
  2. Preparar una dilución viral con una multiplicidad de (0.001) bajo de infección (MOI) de PR8 WT en los medios de infección en 4 mL de volumen final total. Calcular la cantidad de PR8 WT con la fórmula ((MOI X x células n °) x volumen final) / stock título viral.
  3. Aspirar el medio de cultivo de tejido de la placa de células MDCK y lavar dos veces con 4 mL de PBS 1 x. Añadir el inóculo viral (4 mL) y poner la placa en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Retirar el inóculo viral con vacío y añadir 8-10 mL de medio de infección posterior al que contiene 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK. Incube las células infectadas durante 48-72 h en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂.
  4. Separar las células con la ayuda de un raspador celular y recoger las células y el medio de cultivo de tejidos con una pipeta en un tubo de 15 mL. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5-10 min a RT. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón RIPA y poner la mezcla en un tubo de 1,5 mL estéril. Incubar en hielo durante 20-30 minutos
  5. Centrifugar el tubo a 1.300 x g por 20-30 min a 4 ° C. con cuidado, se recupera el sobrenadante. Tienda la célula extrae en alícuotas de μl 100-20 ° C.
  6. Valorar los extractos de células como se describe por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) antes de evaluar la presencia de anticuerpos ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ²⁷. celular incluyen extractos de células MDCK infectados de mock (preparadas como se indicó anteriormente) como control negativo.
2. ELISA ( figura 4)
  1. capa de poliestireno, placas de 96 pocillos con la dilución de células MDCK infectados extracción en PBS 1 x (generalmente entre 1: 200 - 1:1, 000). Cubra la otra placa con la misma dilución del extracto de células MDCK infectados mock como control negativo. Incubar durante la noche (O/N) a 4 ° C.
  2. Quitar el sobrenadante utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar una vez con 100 μL/pocillo de PBS 1 x con una pipeta multicanal. Bloque de fijación no específica mediante la adición de 100 μL/pocillo de bloquear la solución por 1 h a RT.
  3. Mientras tanto, hacer diluciones seriadas 2 veces (a partir de dilución 1:50) de los sueros de cada ratón infectado en el paso 5.1 en la solución de dilución del anticuerpo en una placa de 96 pozos.
  4. Quitar la solución de bloqueo de las placas poliestireno de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Añadir 50 μl de cada dilución de suero de ratón en el pozo apropiado e incubar 1 h a 37 ° C.
  5. Retirar los sueros de ratones con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Añadir 50 μL/pocillo de un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1:2,000 en la solución de dilución del anticuerpo. Incubar 1 h a 37 ° C.
  6. Quitar el anticuerpo secundario con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Preparar la solución de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) mezclando la solución de 1:1 A y B. Añadir 100 μL/pocillo de sustrato e incube durante 5-10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  7. Detener la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de 0,2 N H ₂ hasta ₄. Leer las placas a 450 nm en un lector de placas ELISA.
  8. Reste el valor obtenido en cada dilución de la placa de 96 pocillos de infectados mock MDCK desde el valor obtenido en la placa de 96 pocillos MDCK infectados. Calcular los valores medios para cada dilución con los diferentes sueros y representarlos en un gráfico que muestra las desviaciones estándar (SD).
Análisis de anticuerpos neutralizantes
1. ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) ( figura 5)
  1. antes de realizar el ensayo HAI, tratar el suero de ratón con receptor destruir la enzima (RDE) para eliminar todos inhibidores no específicos presentes en el suero. Agregar 1 volumen de suero de ratón a 4 volúmenes de la dilución de trabajo RDE (dilución de suero es ahora de 1:5). Incubar O/N (12- 18 h) en un baño de agua de 37 ° C.
  2. Calor de las muestras de suero a 56 ° C durante 30 min para inactivar el RDE.
  3. Previamente para determinar la actividad de hemaglutinación (HAU) de PR8 peso estándar HA ensayo ²⁸. Una vez determinada la HAU viral, diluir la acción viral que HAU 8 por 50 μl de PBS 1 x.
  4. Preparar diluciones seriadas 2 veces (12 diluciones) de los sueros tratados con RDE en una placa de 96 pocillos fondo V. Utilice una fila para cada muestra de suero (por ejemplo, A1 a A12).
    1. Añadir 25 μl de 1 x PBS desde A1 a A12 pozos. Prueba cada una de las muestras de suero en una fila. Añadir 25 μl del suero tratado con RDE (1:5) a 25 μl de PBS 1 x en el primer pocillo de la columna (A1). La primera dilución del suero es de 1:10.
    2. Una vez que todos los sueros tratados con RDE se agregan a la primera columna, (por ejemplo, A1, B1, C1), utilice una pipeta multicanal para mezclar el suero y 1 x PBS mediante pipeteo arriba y abajo. Transferencia 25 μl de los sueros diluidos de la primera columna a la segunda columna (por ejemplo, de A1 a A2). Cambiar las puntas entre las diluciones y mezcla de.
    3. Repetir pasos 5.3.1.4.2. hasta llegar a la última columna (p. ej., A12, B12, C12). Deseche los 25 μl de la última columna, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (25 μl). Incluyen una fila de pocillos que contengan sólo 25 μl de PBS 1 x sin ninguna sera como control negativo.
  5. Añadir 25 μl de la IAV diluido a 8 HAU/50 μl a cada uno de los pozos con los sueros en la placa de 96 pocillos fondo V, el volumen final en cada uno es bien 50 μL, que contiene 4 HAU de virus. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incubar durante 1 h a RT.
  6. Añadir 50 μl de Turquía 0.5% glóbulos rojos a cada uno de los pozos. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incube la placa durante 30-45 min en hielo. Lea el ensayo HAI visualmente cuando los hematíes en los pocillos de control (1 x PBS) forman un precipitado rojo (es decir, pellets) en la parte inferior de los pozos de.
    Nota: los glóbulos rojos de otras especies como pollo, cuy o caballo también se puede utilizar.
  7. Calcular los títulos HAI identificando la última en que los hematíes forman una pelotilla roja y no se produce hemaglutinación.
    Nota: El valor recíproco de esta dilución es el título HAI. El valor recíproco se multiplica por un factor de 20 para corregir para la 1:20 dilución del suero en la primera fila.
2. Ensayo de microneutralización virus (VNA) ( figura 6)
  1. el día antes de VNA, preparar las células MDCK en una placa de 96 pozos para llegar a 80-90% de confluencia al día siguiente como se describe en el paso 5.2.1.1. Preparar una dilución de PR8 WT en los medios de infección que 200 FFU/25 μl.
  2. Inactivate el suero de ratón a 56 ° C por 1 h. hace diluciones seriadas 2 veces (12 dilución) por suero de ratón en triplicado utilizando una placa de 96 pocillos.
    1. Agregar 40 μl del suero a 160 μl de medio de infección en el primer pozo de la primera fila, (por ejemplo, A1) (dilución de suero 1:5). Mezclar por pipeteo. Añadir 100 μl de medio de infección para los otros pozos (A2 a H12).
    2. Transferir 100 μl de la primera fila a la segunda fila para hacer diluciones de 1:2 (p. ej., de A1 a A2). Cambiar consejos entre diluciones y mezclar mediante pipeteo. Repetir este proceso hasta la última fila (p. ej., A12). Descartar 100 μl de la última fila, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (100 μL).
  3. Agregar 100 μl de dilución de IAV en todos los pocillos. Incubar 1 h a TA. Mientras tanto, retire el medio de cultivo de tejidos las células MDCK la placa de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.
  4. En cada placa de 96 pocillos de células MDCK, dejar dos filas de los controles. Una fila es el control negativo (células sin sueros y virus), y la otra fila es el control positivo de la infección (células con virus en ausencia de sueros o sueros de ratones infectados mock).
  5. Transferir 50 μL/pocillo de la placa del anticuerpo del virus a las placas de 96 pocillos de células MDCK. Poner las placas en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral.
  6. Retirar el inóculo de anticuerpo del virus utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de post-infección medios que contenga 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK.
  7. Incubar las células ~ 3-4 días en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂ hasta que se observa efecto citopático (CPE) en el control positivo (células infectadas en ausencia de suero o de suero control).
  8. Retire el medio de cultivo de tejidos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de la violeta cristalina de 0.1%. Incubar durante 1 h a RT. Retire la solución de cristal violeta con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada. Secar las láminas en RT.
  9. Calcular los títulos VNA identificando la dilución más alta que conserva una monocapa celular confluente de células MDCK.
    Nota: El valor recíproco de esta dilución correspondiente es el título del anticuerpo neutralizante. El valor recíproco se multiplica por un factor de 10 para corregir el 1:10 dilución de los sueros en el primer pocillo de la fila.

6. Evaluación de las vacunas de eficacia de protección ( figura 3)

vacuno i.n. un grupo de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 11) con la dosis de la LAIV PR8 para probar (FFU/ratón) y mock-vacunar a otro grupo de ratones (n = 11) con 1 x PBS estéril. Realizar las inmunizaciones de i.n. de ratón como descritas en la sección 3.
Vacunación después de catorce días, sangran los ratones y recoger el suero como se describe en la sección 3. Analizar la presencia de total y de neutralizar anticuerpos contra PR8 WT como se describe en la sección 5.1.1.
Vacunación después de quince días, mida y registre el peso del ratón (día 0). Desafío i.n. de ratones con una dosis letal de la WT de PR8 (desafío homólogo) como se describió anteriormente en la sección 3.
Medir el peso corporal y la supervivencia (n = 5 / Grupo) durante 14 días después del desafío para evaluar la morbilidad y la mortalidad producidas por el desafío de peso PR8 en ratones vacunados (sección 4.1).
Recuperar los pulmones de ratón y mucosa nasal (n = 3 al día) en el día 2 y día 4 posterior desafío con PR8 pesos homogeneizar y analizar los pulmones y mucosa nasal tal como se describe en la sección 4.2 a evalúa la replicación viral del PR8 WT en ratones vacunados.

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Representative Results

Caracterización de la patogenesia viral en ratones

La patogenesia de IAV se relaciona con la morbilidad y la mortalidad causada por la infección. Estos dos parámetros pueden evaluarse fácilmente en ratones: morbilidad IAV se asocia con pérdida de peso corporal en ratones infectados y el porcentaje de supervivencia indicará la tasa de mortalidad (figura 1). El peso corporal y la supervivencia en ratones infectados IAV generalmente son monitoreados diariamente durante al menos dos semanas después de la infección⁸^,⁹^,¹⁰^,²⁹. Los datos de supervivencia obtenidos pueden determinar la MLD₅₀ que se calculó utilizando el método de Reed y Muench²⁵. Otro indicador de la patogenesia IAV se relaciona con la replicación viral en la parte inferior (pulmones) y en el tracto respiratorio superior (mucosa nasal) (figura 1). La información obtenida con el título viral en estos órganos corresponde a la morbilidad y mortalidad valores y en conjunto proporcionan una buena indicación de la patogenesia viral. Se sabe que replicación de IAV en los pulmones de ratón de pico entre los días 2 y 4 post-infección (p.i.), y por lo tanto se recomienda recuperar estos órganos en los días 2 y 4 p.i.

Figura 1: caracterización de la patogenesia IAV en ratones: Patogenesia IAV en los ratones está relacionado con su morbosidad (pérdida de peso corporal) y mortalidad (% de supervivencia) y también la capacidad de IAV para replicar en la parte superior (mucosa nasal) y vías respiratorias (pulmones) más bajas. Brevemente, en el día 0 ratones son pesados y anestesiados por vía intraperitoneal con 2,2,2-tribromoethanol (TBE) antes de que están infectados vía intranasal con IAV. Desde el día 1 al día 14, ratones se pesaron diariamente para evaluar la pérdida de peso corporal (morbilidad) y % de supervivencia (mortalidad) para calcular la dosis letal ratón 50 (MLD₅₀). En los días 2 y la post-infección día 4, mucosa nasal y los pulmones de ratones son recuperados y homogeneizadas para evaluar la replicación viral. Experimentos de ratones para caracterizar la patogenesia IAV usando PR8 WT se realizan bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la figura 2, se representan los datos obtenidos en la evaluación de la patogenesia de PR8 WT. Cuatro grupos de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 11) fueron infectados i.n. con las dosis indicadas (10, 10²10³ y 10⁴ FFU y ratón) de PR8 WT. Se midieron el peso corporal y la supervivencia de 5 ratones por grupo por 14 días p.i. (figura 2A–B). Todos los ratones inmunizados con 10⁴ FFU de PR8 WT perdió peso rápidamente (figura 2A) y todos ellos murieron en los días 5 y 6 p.i. (figura 2B). Ratones inmunizados con 10³ FFU de PR8 WT perdió peso en el más adelante épocas p.i. (figura 2A) y todos murieron por p.i. días 7 y 8 (figura 2B). Todos los ratones inmunizaron con 10²FFU de PR8 peso perdida de peso corporal (figura 2A) pero solo 2 de ellos murieron en el día 9 p.i. (figura 2B). Finalmente, los ratones inmunizados con 10 FFU de PR8 WT no perdió peso (figura 2A) y todos ellos sobrevivieron a la infección (figura 2B). El MLD₅₀ WT PR8 en este experimento calculado con el método de Reed y Muench²⁵ fue de 1.5 x 10² FFU (figura 2).

Para evaluar la replicación PR8 en la parte superior e inferior respiratorio tracto de ratones infectados i.n. con las dosis indicadas (10, 10²10³y 10⁴ FFU y ratón), los pulmones y la mucosa nasal se recuperaron en los días 2 y 4 p.i. (n = 3). Después de la homogeneización del pulmón, la cantidad de virus presente en este órgano se analizó mediante análisis de la inmunofluorescencia (Figura 2D). El título viral detectado en los pulmones de los grupos de ratones diferentes estuvo relacionado con la dosis utilizada para inmunizarlos: títulos virales más altos se detectaron en los pulmones de los ratones inmunizados con 10⁴FFU de PR8 WT en p.i. de días 2 y 4, mientras que los títulos virales menores fueron detectados en los pulmones de los ratones inmunizados con 10 FFU de PR8 WT.

Figura 2: representación de los datos obtenidos en la evaluación de la patogenia Viral: Analizar la morbilidad y la mortalidad de PR8 WT, ratones C57BL/6 femeninos de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) fueron infectados i.n. con el número indicado de forma fluorescente unidades (FFU) de PR8 WT y luego supervisados diariamente por 2 semanas (A) pérdida de peso corporal (morbilidad) y (B) supervivencia (mortalidad). Los datos representan las medias y desviaciones estándar de resultados determinados para los ratones (n = 5). (C) valores de supervivencia % evaluadas durante 2 semanas se utilizan para calcular el MLD₅₀ utilizando el método de Reed y Muench²⁵. (D) para evaluar la replicación viral, ratones C57BL/6 femeninos de 6 a 8 semanas de edad (n = 6) fueron infectados i.n. con el número indicado de FFU. Replicación viral en los pulmones o la mucosa nasal de los ratones infectados se evalúa generalmente en días 2 y 4 p.i. usando un análisis immunofocus. Títulos virales se registran como FFU/mL. Los datos representan los medios y SDs de resultados obtenidos en cada ratón. Las líneas punteadas se incluyen para indicar el límite de detección (FFU 200/mL) del ensayo. Ratones y experimentos de cultivo de tejidos para evaluar morbilidad, mortalidad y los títulos virales usando PR8 IAV se realizaron bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la respuesta humoral inducida después de la vacunación

Respuesta humoral inducida frente a la infección de IAV juega un papel esencial en el control de la infección viral. Por esta razón, es muy importante analizar las respuestas humorales sacadas por infecciones IAV WT o nuevas vacunas IAV (figura 3). En el modelo murino, 14 días después de la inmunización, ratones se sangraron para analizar la presencia de anticuerpos contra las proteínas virales totales por ELISA (figura 4) y la presencia de anticuerpos contra la proteína viral de la HA, que suele ser neutralizantes analizadas por métodos serológicos comunes, como un HAI ensayo (clase de NG = "xfig" > Figura 5) o un VNA (figura 6).

Figura 3: esquema de los diferentes pasos en la caracterización de la seguridad, inmunogenicidad y eficacia de la protección de una vacuna viva atenuada contra: Cuando se desarrolla una nueva vacuna viva atenuada contra, el modelo murino de infección IAV se utiliza generalmente para probar la eficacia de la seguridad, inmunogenicidad y protección. En este esquema, los experimentos para evaluar la seguridad (A), (B) de inmunogenicidad y eficacia de protección (C) de un candidato de vacuna viva atenuada contra se indican. (A) para evaluar la seguridad de una vacuna viva atenuada contra es necesario analizar los mismos parámetros (morbilidad, mortalidad y replicación viral en la parte superior y el tracto respiratorio inferior) se describe en la figura 1. Para evaluar la inmunogenicidad, se vacunan ratones y 14 días después de la vacunación son sangrados por punción submaxilar. Las respuestas humorales son analizadas mediante la evaluación de la presencia de anticuerpos totales contra las proteínas IAV por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y evaluando la presencia de anticuerpos por ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) o virus neutralizantes ensayo de microneutralización (VNA). (C) para evaluar la eficacia de la protección, 15 días después de la vacunación, se reta a ratones con IAV WT. Protection eficacia es evaluada por la medición de ratones morbilidad, mortalidad y los títulos virales en los pulmones de los ratones desafiados como se describe en figura 1 . Se realizaron experimentos de ratones para caracterizar la eficacia de la seguridad, inmunogenicidad y protección de un candidato de vacuna viva atenuada contra condiciones BSL-2. Otros trajes BSL o condiciones de contención pueden ser requeridas dependiendo de la cepa IAV utilizada para el reto de los ratones vacunados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para evaluar la inmunogenicidad de PR8 LAIV, tres grupos de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) fueron inmunizados con diferentes dosis (10²10³y 10⁴ FFU/ratón) PR8 LAIV o mock vacunados con PBS 1 x como control negativo. Catorce días después de la vacunación, se recogieron sueros de ratones por sangrado submaxilar²⁶ (figura 3). Respuestas de anticuerpos contra proteínas virales totales se evaluaron por ELISA utilizando una dilución de 1: 200 del extracto celular de células MDCK infectados PR8 (figura 4). Cada suero se analizó individualmente. Los resultados indican que el suero de ratones inmunizados con la dosis más alta (10⁴ FFU) de LAIV PR8 tenía más altos títulos de anticuerpos contra proteínas totales PR8 que el suero de ratones inmunizados con la dosis más baja (10² FFU). Control de sueros (ratones infectados de mofa) no presentaron reactividad contra los antígenos de PR8.

Figura 4: representación esquemática de la análisis del inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) para evaluar las respuestas del anticuerpo Humoral: Niveles de anticuerpos de PR8-específica presentes en ratones infectados están determinados por ELISA en placas de poliestireno de 96 pozos recubiertas con extractos celulares de mock (control) o células MDCK infectados PR8. Brevemente, en 14 días p.i. (figura 3), ratones vacunados con las dosis indicadas de LAIV PR8 fueron sangrados por punción submaxilar y se recolectaron sueros. Cada suero fue evaluado individualmente por ELISA para anticuerpos IgG contra las proteínas totales de PR8. Datos del gráfico representan los medios y las desviaciones estándar de los resultados obtenidos de ratones individuales sueros (n = 6). OD, densidad óptica. Se realizaron ensayos de ELISA en un gabinete BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para analizar la presencia de anticuerpos en el ratón neutralizantes suero usando el HAI ensayo, diluciones seriadas 2 veces de sueros (previamente inactivados a 56 ° C) de cada grupo de ratones inmunizados con diferentes dosis (10²10³y 10⁴ FFU) de LAIV PR8 se incubaron con 4 HAU de PR8 WT por 1 h a temperatura ambiente (figura 5). Entonces, 0.5% de glóbulos rojos de Turquía fueron agregado a las mezclas de PR8-sera. La parte superior de la figura 5 es una representación esquemática de los resultados posibles de HAI: cuando el suero contiene anticuerpos de neutralización, precipitación de glóbulos rojos se observa en el fondo del pozo porque los anticuerpos a la proteína viral HA prevenir la hemaglutinación de los hematíes. Por otra parte, en la ausencia de anticuerpos neutralizantes, se observa hemaglutinación de los hematíes. Luego, el título HAI se calcula como el recíproco de la dilución del suero en la hemaglutinación bien pasado. Los resultados HAI demostrados en la parte inferior de la figura 5 indican que el suero de ratón vacunado con la mayor cantidad de LAIV PR8 (10⁴ FFU) tienen el más alto título de anticuerpos neutralizantes, mientras que el suero de un ratón inmunizado con la dosis más baja (10² FFU) tienen el título bajo de anticuerpos contra PR8 neutralizantes. No hay anticuerpos neutralizantes estaban presentes en el suero control (ratones infectados de mock).

Figura 5: ensayo de hemaglutinación inhibición (HAI): Niveles de anticuerpos contra la WT PR8 en ratones infectados neutralizantes pueden evaluarse fácilmente por análisis de HAI. Brevemente, diluciones seriadas 2 veces (a partir de dilución 1:10) de los sueros de ratones inmunizados con las dosis indicadas de LAIV PR8 se mezclaron (1:1) con 4 HAU de PR8 WT por 1 h a RT en una placa de 96 pocillos fondo V. Después de 1 h de incubación, 0.5% glóbulos rojos fueron agregados a las mezclas de virus suero durante 30-60 min en hielo. Títulos HAI se determinan mediante la identificación de la última en que los hematíes forman un botón rojo y hemoaglutinación no ocurre (arriba). Análisis HAI con PR8 WT fueron realizados en un gabinete BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la figura 6, se representan los datos obtenidos en la evaluación de anticuerpos en suero de ratón neutralizantes por VNA. FFU 200 de PR8 WT se mezclaron con diluciones seriadas 2 veces de sueros (previamente inactivatEd a 56 ° C) de los ratones inmunizados con diferentes dosis (10²10³y 10⁴ FFU) de PR8 LAIV durante 1 h a TA. Cada muestra de suero se evaluó por triplicado. Las mezclas de sueros de virus fueron utilizadas para infectar monocapas de células MDCK en una placa de 96 pocillos. La parte superior de la figura 6 es una representación esquemática de los resultados posibles de VNA: ausencia de anticuerpos en el suero como resultado CPE en aproximadamente 3-4 días p.i. neutralizantes En cambio, cuando están presentes anticuerpos neutralizantes (monocapa de células intactas), se unen a la HA vírica y prevenir la infección viral, y no hay CPE. Presencia de CPE es generalmente visualizado por tinción de las células infectadas con cristal violeta, y los títulos de neutralización viral se calcularon como el recíproco de la última dilución en que la infección se bloquea totalmente. En la parte inferior de la figura 6se representan los resultados de la VNA. El suero de ratones inmunizados con la gran cantidad de LAIV PR8 (10⁴ FFU) tienen el mayor título de anticuerpos neutralizantes mientras que los sueros de ratones inmunizados con la menor dosis o LAIV PR8 (10² FFU) tienen la concentración más baja de neutralizar anticuerpos, similar a los resultados obtenidos con el ensayo HAI. No hay anticuerpos neutralizantes fueron presentes en el suero de ratones infectados con mofa.

Figura 6: ensayo de microneutralización Virus (VNA): Una alternativa para el ensayo HAI, el ensayo VNA puede evaluar la presencia de PR8 WT anticuerpos neutralizantes. Brevemente, los sueros de ratones vacunados con las dosis indicadas de LAIV PR8 eran en serie 2 veces diluido (dilución 1:5 al inicio) en placas de 96 pocillos y mezclado 1:1 con 200 FFU de PR8 WT por 1 h a TA. Después de 1 h, las mezclas de virus suero fueron utilizadas para infectar a placas de 96 pocillos de células MDCK. Las células infectadas fueron incubadas durante 3-4 días hasta el completo efecto citopático. Las placas de 96 pocillos entonces fueron manchadas con 0.1% de cristal violeta. Títulos VNA son determinados mediante la identificación de la dilución más alta para retener una monocapa celular confluente. VNA con PR8 WT se realizaron bajo condiciones BSL-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la eficacia de la protección de las vacunas IAV en ratones

Cuando se desarrolla una nueva vacuna viva atenuada contra, su eficacia, seguridad, inmunogenicidad y protección debe ser probado en vivo, y el modelo de ratón suele ser el primer modelo animal elegido para analizar estos parámetros. Figura 3 es un esquema de los diferentes pasos necesarios para caracterizar una nuevo LAIV en ratones. Para evaluar la seguridad de una vacuna viva atenuada contra (Figura 3A), los ratones son infectados i.n. utilizando un protocolo similar a los procedimientos experimentales descritos en la sección de patogénesis (sección 4), y el peso corporal y el seguimiento de supervivencia proporcionará información relacionada con la morbilidad y la mortalidad de la LAIV (figuras 2A–2B), incluyendo el MLD₅₀. Además, a la inoculación con dosis de diferentes vacunas, la replicación de LAIV en las inferiores (los pulmones) y en el tracto respiratorio superior (mucosa nasal) debe ser evaluados⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹¹^,²⁹ (Figura 2D). Para prueba de inmunogenicidad, se recogen los sueros de ratones vacunados con la vacuna viva atenuada contra ante reto con PR8 WT (desafío homólogo), utilizando protocolos similares a los descritos en la sección de inmunogenicidad (sección 5) (figura 3B). Puede detectó la presencia de total y de neutralizar los anticuerpos en el suero por ELISA y HAI o VNA, respectivamente.

Por último, para probar la eficacia de protección, ratones de la vacuna LAIV se enfrentan con WT de PR8 y la eficacia de protección se caracteriza por la vigilancia de morbilidad, mortalidad y la presencia de desafío PR8 WT en los pulmones, según se describió anteriormente en la sección 4 ( Figura 3)⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Si la LAIV induce la protección contra el desafío de peso PR8, ratones no perderá peso y sobreviven el desafío mortal con WT de IAV. Por otra parte, los títulos virales WT IAV en los pulmones no serán detectados, o se reducirá significativamente en comparación con mock (PBS) vacunados ratones⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹.

Soluciones y medios de cultivo de tejido	Composición	Almacenamiento de información	Uso	Comentarios
Medios de cultivo de tejido: Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM), 10% suero bovino Fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG)	445 ml DMEM, 50 ml de SBF y 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 μg/ml) - L - glutamina (2 mM) (PSG)	Conservar a 4° C	Este medio se utiliza para el mantenimiento de las células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK)
Los medios de comunicación después de la infección: DMEM 0.3% albúmina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0.3% BA 1 PSG)	491 ml DMEM, 4,2 ml de 35% BA y 5 ml de 100 x PSG	Conservar a 4° C	Este medio se utiliza para el mantenimiento de células MDCK después de infección con el virus de la gripe (IAV)
10 x tamponada fosfato salino (PBS de x 10)	80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na₂HPO₄.7H₂O, 2 g de KH₂PO₄. Añadir ddH₂O hasta 1 L. ajustar pH a 7.3	Almacenar a temperatura ambiente (RT)		Esterilizar en autoclave
1 x PBS	Diluir 10 x PBS 1:10 con ddH₂O	Tienda en RT		Esterilizar en autoclave
Medios de infección: 1 x PBS, 0.3% BA, 1% penicilina-estreptomicina (PS) (PBS/BA/PS)	487 ml 1 x PBS estéril, 4,2 ml de 35% BA y 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 μg/ml) (PS)	Conservar a 4 ° C	Este medio es utilizado para infecciones de IAV
Solución de fijación/permeabilización: formaldehído al 4%, 0.5% Tritón X-100 diluido en PBS 1 x	400 mL neutro tamponado con formol al 10%, 5 ml de Triton X-100 y 595 ml de PBS 1 x

d > Tienda en RT Esta solución se utiliza para fijar y permeabilizar las células MDCK en experimentos de titulación viral La solución en una campana de humos para evitar la exposición al formaldehído Solución de bloqueo: 2,5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1 x 2,5 g de BSA en 97,5 mL de PBS 1 x Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza como una solución de bloqueo por ensayos de inmunofluorescencia y ELISA. Esterilizar por filtración con filtro de 0.2 μm. Solución de dilución del anticuerpo (1% de BSA en PBS 1 x) 1 g de BSA en 99 mL de PBS 1 x Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza para la dilución de los anticuerpos primarios y secundarios en ensayos de inmunofluorescencia y Elisa Esterilizar por filtración con filtro de 0.2 μm 0.1 violeta cristal en solución % 1 g de cristal violeta en 400 ml de metanol. Agregar 600 ml de ddH₂O Tienda en RT Esta solución se utiliza para fijar y teñir las células MDCK en ensayos de neutralización viral Tosylsulfonyl Fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tratado de tripsina Preparar una solución madre de 1.000 x 1 mg/ml en ddH₂O Conservar a-20 ° C La tripsina TPCK se agrega en las infecciones de IAV Hacer 100 μl alícuotas Almacenador intermediario RIPA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, desoxicolato de sodio 0.1%, 0.1% SDS, 140 mM NaCl Conservar a 4 ° C Esta solución se utiliza para hacer la célula extractos

Tabla 1: medios de cultivo de tejidos y soluciones.

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Discussion

El modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han utilizado en investigaciones múltiples disciplinas, varios molecular y murino reactivos de Inmunología están disponibles para facilitar su uso para estudios IAV. Además, la variabilidad de host mínimo y la presencia de un sistema inmune que es evolutivamente similar al presente en los seres humanos les hacen un modelo robusto de animal pequeño para estudios IAV. Finalmente, el estudio de las interacciones de la proteína viral de host y su contribución a la patogenia viral están actualmente factibles el acceso a los ratones KO. Sin embargo, al lado de las varias ventajas de utilizar ratones para estudios IAV, no son útiles para estudios de transmisión de IAV. Por lo tanto, hurones o cobayas son más adecuados modelos animales para estudiar la transmisión de IAV. Los síntomas clínicos en ratones infectados con IAV generalmente aparecen 2-3 días post-infección, aunque esto puede variar dependiendo de la edad de ratón, estado inmune, sexo, antecedentes genéticos y tensión; así como de la cepa y dosis utilizada. Los síntomas incluyen anorexia, letargo, acurrucados, con volantes de piel, pérdida del cuerpo¹⁶^,de peso y muerte¹⁷.

En este manuscrito, describimos cómo evaluar patogenesia viral en i.n. de ratones infectados con IAV mediante el control de pérdida de peso corporal (morbilidad), porcentaje de supervivencia (mortalidad) y mediante la evaluación de la replicación viral en la parte superior (mucosa nasal) e inferior (pulmones) tracto respiratorio (figura 1 y figura 2). La patogenesia de IAV es un parámetro muy importante en el contexto de nuevas cepas IAV, sino también en la ejecución segura de los candidatos LAIV vacuna (figura 3). Temporada de gripe y gripe que infecta a otros mamíferos (como caballos, perros o cerdos) no suelen producir signos de enfermedad en ratones¹¹^,²⁷. En este caso, el análisis de títulos virales en los pulmones o la mucosa nasal de los ratones infectados es el parámetro principal para evaluar la patogenia viral de cepas IAV. Una vez que los pulmones y la mucosa nasal se recogen, homogeneizó y la cantidad de virus presente en estos órganos puede ser analizada por el ensayo de placa, análisis de la inmunofluorescencia, cultivo de tejidos infeccioso dosis 50 (TCID₅₀) u otro método validado⁸ ^,²⁹. Recomendamos evaluar títulos virales mediante inmunofluorescencia indirecta ya que el ensayo de placa requiere una mayor cantidad de células MDCK (formato de placa de 6 pozos) y, como el TCID₅₀, más tiempo (3-4 días) es necesaria para calcular los títulos virales. Sin embargo, para realizar el ensayo de inmunofluorescencia indirecta, es necesario disponer de: 1) principal anticuerpos contra una proteína IAV (se recomienda utilizar un anticuerpo contra la nucleoproteína IAV, NP, ya que es la más abundante proteína viral producida durante la infección viral); 2) secundarios anticuerpos conjugados a un fluoróforo; y 3) un microscopio de fluorescencia para contar las células infectadas positivo fluorescentes.

Ya que el sistema inmune de ratones es evolutivamente similar al sistema inmune de los seres humanos¹⁶ y ratones pueden provocar una respuesta humoral fuerte y protectora contra la infección de IAV, la inmunogenicidad de la gripe (o candidatos vacunales) puede ser fácilmente evaluado mediante la determinación de total (ELISA; Figura 4) y neutralizar (HAI, figura 5) o las respuestas del anticuerpo VNA (figuras 6). Para analizar la respuesta humoral después de la inmunización, ratones pueden purgarse por diferentes métodos aprobados tales como punción retro-orbitales, clip de cola, punción de la vena safena o punción submaxilar. Elegimos la técnica de punción submaxilar²⁶ porque el procedimiento no requiere el uso de la anestesia y nos permite obtener un volumen aceptable de sangre para estudios inmunológicos; en lugar de la punción de retro-orbital, donde ratones deben ser anestesiados y con la cola clip o punción de la vena safena, donde el volumen de sangre recuperado generalmente es bajo.

En este manuscrito, nos describe cómo evaluar la presencia de anticuerpos contra proteínas virales totales por ELISA utilizando extractos de células infectadas por virus. Puesto que la infección IAV induce una inmunidad protectora mediada, principalmente, por anticuerpos específicos contra la HA vírica (la antigénica viral objetivo), se recomienda evaluar la cantidad de anticuerpos inducidos contra HA por ELISA usando recombinante purificada HA proteínas¹⁰. Para analizar la presencia de anticuerpos neutralizantes, se aceptan métodos HAI y VNA pero ambos tienen ventajas y desventajas. La HAI es rápida (2-3 h) y aprobado por el centro para la enfermedad y Control de enfermedades (CDC) evaluar la presencia de IAV neutralizar anticuerpos³⁰. La VNA es más desperdiciador de tiempo (3-4 días) pero es más específica ya que se evalúa sólo los anticuerpos que pueden neutralizar la infección viral. En particular, la VNA ha demostrado detectar tallo reactiva HA neutralizar anticuerpos³¹, así como NA neutralizar anticuerpos³². Otra ventaja de la VNA es la sensibilidad del ensayo, desde el menos IAV (FFU 200) es necesario en comparación con el ensayo HAU que requiere aproximadamente 10 ~⁴-10⁵ FFU. Por otra parte, el ensayo HAI puede ser problemático para la detección de anticuerpos neutralizantes contra la gripe aviar debido a dificultad con la interpretación de resultados³³^,³⁴^,³⁵. Además, VNA no requiere el uso de glóbulos rojos para la identificación de anticuerpos neutralizantes de la gripe.

Finalmente, describimos los procedimientos experimentales para evaluar los tres aspectos principales que deben considerarse en el desarrollo de nuevas vacunas IAV (figura 3): 1) seguridad: la vacuna debe ser seguro y no produce la enfermedad; 2) inmunogenicidad: la vacuna debe ser inmunogénica e inducir respuestas protectoras humorales y celulares; 3) eficacia de protección: la vacuna debe inducir protección contra el desafío con virus homólogos o heterólogos WT. El modelo de ratón es una buena opción para la primera proyección de un nuevo IAV vacuna en vivo ya pueden evaluar esquemas de vacunación diversas condiciones, incluyendo el uso de diferentes adyuvantes, dosis de vacuna de antígeno, administración y amplia protección contra el desafío con homólogas o heterólogas gripe cepas¹⁶^,¹⁷. Sin embargo, antes de proceder a ensayos clínicos en humanos, candidatos de vacuna al menos analizarse en un segundo modelo en vivo .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Investigación sobre el virus de la gripe en laboratorio LM-S es financiada parcialmente por la Nueva York Influenza centro de excelencia (NYICE), miembro de la NIAID centros de excelencia para la investigación de la Influenza y vigilancia (CEIRS). Agradecemos a Wendy Bates por su apoyo en las correcciones del manuscrito.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells	ATCC	CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice	National Cancer Institute (NCI)	01XBE
Turckey red blod cells	Biolink Inc		Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Corning Cellgro	15-013-CV	Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x	Corning	30-009-CI	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	Corning	30-00-CI	Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)	Sigma-Aldrich	A7409	Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647	Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin	Sigma-Aldrich	T8802	Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%	EMD	65346-85	Store at RT
Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65	ATTC	H16-L10-4R5	Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC	Dako	F0261	Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody	GE Healthcare	LNA931V/AG	Store at 4 °C
TMB substrate set	BioLegend	421101	Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader	Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders	Thomas Scientific	7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)	Denka Seiken Co.	370013	Store at -20 °C
Crystal Violet	Fisher Scienctific	C581-100	Store at RT
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-one	655-180
Cell Culture dishes 100 mm	Greiner Bio-one	664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Fisher Scienctific	269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates	Thermo Fisher Scienctific	249570
Puralub Vet Ointment	Dechra	9N-76855
Fluorescent microscope	Olympus	Olympus IX81

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References

Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Immunology and Infection

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

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Representative Results

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