Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Grip A virüs (IAVs) önemli insan solunum patojenler vardır. İnsan fizyolojisi taklit hayvan modelleri IAVs patojenitesi anlamak ve preklinik roman aşı yaklaşımlar sınamasını gerçekleştirmek için gereklidir. Burada, biz IAV Patogenez, humoral yanıt ve enfeksiyon bir fare modeli kullanarak aşı etkinliğini değerlendirmek için teknikler açıklanmaktadır.

Abstract

Grip virüsleri 500.000 ölüm dünya çapında1 neden ve 12-14 milyar USD Amerika Birleşik Devletleri tek başına doğrudan tıbbi ve hastaneye yatış masrafları ve iş devamsızlık2göz önünde bulundurarak bir yıllık ücret ile ilişkilidir. Hayvan modelleri viral Patogenez, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri, bağışıklık yanıtı değerlendirmek için grip A virüs (IAV) çalışmalarda açısından büyük önem taşıyor ve antiviral yanı sıra geçerli ve/veya roman aşı etkinliği yaklaşıyor. Bağışıklık sistemi örümceklerle insanlarda bulunan benzer çünkü fareler bir avantajlı küçük hayvan modeli değildir, onlar are elde edilebilir--dan genetik olarak aynı konular olarak ticari satıcı, değerlendirmek için istismar birden fazla suşları vardır enfeksiyonlar, genetik temeli ve onlar are oranla ucuz ve kolay işlemek. Solunum yolları üzerinden insanlarda IAV enfeksiyon özetlemek için fareler ilk uygun Biyogüvenlik koruma altında bulaşıcı IAVs ile burunici aşılama öncesinde anestezi. Enfeksiyon sonra IAVs patogenezinde günlük (vücut kilo kaybı) morbidite ve mortalite (hayatta kalma) izleme tarafından belirlenir. Buna ek olarak, viral Patogenez Ayrıca virüs çoğaltma üst (nazal Mukoza) veya daha düşük (akciğerler) solunum yolu virüslü fareleri değerlendirmek tarafından değerlendirilebilir. Humoral yanıt üzerine IAV enfeksiyon hızla non-invaziv kanama veya değerlendirmeye ikincil antikor algılama tarafından deneyleri yönelik toplam varlığı tespit veya antikorları nötralize. Burada, fareler intranasally bulaştırmak için kullanılan ortak yöntemleri (ın) IAV ile açıklamak ve Patogenez, humoral bağışıklık yanıtı ve koruma etkinliği değerlendirin.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAVs Orthomyxoviridae aile3' te gizli saran virüsler vardır. Onlar sekiz tek iplikçikli RNA molekülleri ile negatif polarite3içerir. Roman virüslerden insan nüfusunun4' te tanıttığında insanlarda, mevsimlik salgın hastalıklar ve ara sıra salgınları önemli sonucu IAVs neden. Ayrıca, mevsimlik IAVs yükseltilmiş bir ekonomik kayıp dünya çapında her yıl2,5üreten insanlar arasında son derece ve hızla iletilir. Öksürük, burun tıkanıklığı, ateş, kırgınlık, baş ağrısı, iştahsızlık ve miyalji IAV belirtileri içerir, ancak virüs daha ağır bir hastalık immün hastalar6' da oluşturabilir. Aslında, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) mevsimsel grip virüsleri 300.000 500.000 ölüm dünya çapında her yıl1neden hesaplar. Şu anda gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından grip profilaksi ve insanlarda tedavisi için onaylanan ilaçların sadece iki sınıf vardır: neuraminidase (NA) inhibitörleri (örneğin, oseltamivir) ve blokerleri M2 iyon kanalının (örn., Amantadin); Ancak, ilaca dirençli virüs türevleri ortaya çıkması artan bir konusudur. Aşı, bu nedenle, insanlar IAVs enfeksiyonlarına karşı korumak için en iyi tıbbi seçenek kalır. Bugüne kadar grip üç tür insan kullanmak için FDA tarafından lisanslı aşı mevcuttur: inaktive rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein aşılar grip aşıları (IIV) ve canlı zayıflatılmış grip aşıları (LAIV)5, 7. üç aşılar viral HA protein IAVs karşı antikor nötralize uğrak karşı adaptif immün yanıt ikna etmek için tasarlanmıştır.

IAV enfeksiyon vivo içinde çalışmaya doğrulanmış fare modeli

Hayvan modelleri, diğerleri arasında IAV Patogenez8,9,10,11, hastalık12 ve/veya viral iletim13 katkıda viral etkenler çalışma için kullanılan ,14, ve9,10,15yeni aşılar veya antiviral etkinliğini test etmek için ilaç. Fareler (Mus musculus) en yaygın kullanılan hayvan modeli IAV araştırma için birkaç nedeni vardır: 1) bağışıklık sisteminin evrimsel benzer bu mevcut insanlarda; 2) düşük maliyetli, dahil olmak üzere hayvan satın, konut ve üreme; 3) kolayca işlemek ve saklamak için küçük boyutu; 4) en az ana bilgisayar değişkenlik homojen yanıt ve sonuçları elde etmek için; 5) fareler biyoloji, genom sırası da dahil olmak üzere büyük bir bilgi; 6) birçok kullanılabilir moleküler biyoloji ve/veya İmmünoloji reaktifler; 7) viral enfeksiyon bir konağın protein katkısını çalışmaya (KO) fareler dışarı mevcut knock; ve 8) enfeksiyonları genetik temeli değerlendirmek için istismar birden çok fare suşları.

Orada birkaç fare suşları IAV vivo içindeincelemek için şu anda kullanılabilecek. Yaş, bağışıklık durumu, cinsiyet, genetik arka plan ve fare zorlanma yanı sıra yolları enfeksiyonu, doz ve viral suşları farelerde IAV enfeksiyon sonucu etkiler. Onlar iki eski suşları16,17,18yaşından, IAV hastalıklara daha duyarlı olduğundan IAV araştırmalarında kullanılan en yaygın fare suşları C57BL/6, BALB/C ve daha yakın zamanlarda, DBA.2 fareler vardır 19 , 20. önemlisi bağışıklık yanıtı da bağlı olarak fare zorlanma18,19,20farklı olabilir. Böylece, fare ve yapılacak deney için en iyi seçenek seçmek için IAV zorlanma ilişkin tüm bilgiler kurtarmak çok önemlidir.

Fare için in vivo çalışmalar IAV ile enfeksiyon iyi bir hayvan model olsa da, onlar deneysel tasarımında dikkat edilmesi gereken bazı sınırlamaları var. Örneğin, in vivo çalışmalar için fare kullanarak büyük bir sınırlama IAVs fareler arasında iletmek değil olduğunu. Böylece, aktarım için çalışmalar, daha kabul hayvan modelleri (örneğin, yaban gelinciği veya eskiden şiling şimdi pigs) kullanılan16,17,21. Buna ek olarak, farelerde IAV tezahürleri ve insanlar arasında çeşitli farklar vardır. İnsanlar farklı olarak, fare ateş IAV enfeksiyon üzerine geliştirmek mi; diğer taraftan hipotermi16,17ile mevcut. Farelerde, alt solunum yolu (akciğerler) üst solunum yolları yerine IAV çoğaltma yoğunlaşmıştır. Böylece, IAV virülans farelerde her zaman için insanlarda görülen correlated değil. Özet olarak, sınırlı dezavantajları avantajları ağır bastığı için fare grip viral Patogenez, immünojenisite ve aşı ve antiviral çalışmalarda koruyucu etkinliği değerlendirmek için kullanılan ilk hayvan modeli temsil eder. Ayrıca, bu IAV enfeksiyon bir küçük hayvan modelinde önceki kanıt olmadan büyük hayvan modeller kullanarak IAV ile çalışmalar yapmak için etik açıdan kabul edilebilir değil. Bu makale, biz fareler intranasally bulaştırmak anlatan (i.n.) IAV, önem derecesi ve viral enfeksiyon ilerlemesini izlemek nasıl ve nasıl humoral bağışıklık yanıtı ve koruma etkinliğini değerlendirmek için gerekli deneyler yürütmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

burada anlatılan tüm hayvan iletişim kuralları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) ve Rochester Tıp Fakültesi ve diş hekimliği Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Kurulu (IBC) tarafından kabul edildi ve uygun Bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Araştırma Konseyi 22 ile öneriler Kılavuzu. İmkanları ve Vivarium ve bölünme laboratuvar hayvan Tıp Fakültesi Tıp Fakültesi ve diş hekimliği programları AAALAC International tarafından akredite edilmiştir ve hukuk devleti, federal yasa ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) İlkesi ile uyumlu. Benzer gereksinimleri bu el yazması açıklanan hayvan iletişim kurallarına uymaları her kurumda uygulanan.

1. kullanım küçük omurgalı hayvanlar

Not: uygun kişisel koruma donanımları (PPE) fare ile çalışmak için gereklidir. Minimum gereksinimleri dahil tek kullanımlık tulum, galoş, baş Bone, maske ve eldiven.

  1. IACUC Protokolü uygun olarak en fazla 5 fareler kafesi yerleştirin. IACUC protokolüne ötenazi fareler ötenazi (ikinci fiziksel bir yöntem olmalıdır) iki yöntemi ile hayvan ölü olduğundan emin olmak için.
    Not: Hangi IAV morbidite ve mortalite değerlendirmeye alınır deneyler, onların ilk vücut ağırlığının % 20 kayıp fareler deneysel bitiş noktası ulaştınız kabul edildi ve CO 2 ve servikal çıkık olarak ötenazi fiziksel ikincil yöntem. Bu yüzde vücut ağırlığının diğer kurumlarda farklı olabilir. Fareler akciğerler ve nazal mukoza IAV enfeksiyon sonra nerede toplanan yordamlar, fareler 2,2,2-tribromoethanol (TBE) öldürücü bir doz ile are euthanized ve hepatik kesim tarafından fiziksel ikincil yöntem damar. Kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 fare satın ve Rochester Tıp Fakültesi ve diş hekimliği Üniversitesi'nde hayvan bakım tesisi patojen-Alerjik belirli koşullar altında saklanır.

2. Biyogüvenlik

Not: Bu rapor, fareler bulaştırmak için kullanılan IAVs grip A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 WT) 22 , 23 ortak fare adapte laboratuvar suşu vardır ve bir sıcaklık hassas LAIV varyant, PR8 LAIV 8. IAV enfeksiyonlar (vitro veya vivo), hücre kültürleri ve biyolojik örnekleri, biyolojik Emanet biyogüvenlik düzeyi (BSL) -2 altında dolap dahil tüm yordamları gerçekleştirmek koşulları. Son derece öldürücü IAV suşları kullandıysanız diğer BSL takım elbise veya koruma koşulları kullanmak.

  1. Temizlik klor dioksit dezenfektan önce ve sonra bu el yazması açıklanan tüm deneysel yordamları gerçekleştirirken ile kabine Biyogüvenlik. Tüm diseksiyon malzeme (makas, neşter ve anatomi forseps) ve Dounce homogenizer önce ve aşağıdaki uygun IBC önerileri kendi kullandıktan sonra sterilize. Tüm malzemeden imal uygun IBC ve IACUC kurallar altında yordamları sırasında atma.

3. Etkilerinin enfeksiyon

  1. yer kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 fareler patojen-Alerjik belirli koşullar altında. Düzenlemek ve fare ile virüs ve kullanılan doz kafesleri etiket. Bir kulak yumruk kodu kullanarak her kafes veya kuyruk boyama gibi başka bir onaylanmış yöntemi ile fareler tanımlayın. Kafes en fazla 5 fareler yer.
  2. Hazırlamak IAV seyreltme (floresan oluşturan birimler (FFU) / fare) steril 1 fosfat tampon serum (PBS) x 30 µL/fare toplam hacmi içinde aseptik koşullar altında. Buz üstünde virüs inoculum korumak. IAV formülü ile viral seyreltme eklemek için miktarı: ((X FFU fare başına/30 µL) son hacim x) / stok viral titresi.
  3. Bir ölçek ile fareler tartmak ve her fare (0 gün) ağırlığı kaydetmek. Fare başparmak ve işaret parmağı arasında boyun scruff tarafından alacak tarafından dorsal konumda tutun. Pinky parmak ile el karşı kuyruk tutun.
  4. Anestezi fare intraperitoneally (IP) 240-250 mg/kg, TBE Kaudal 2/3'te, karın sağ tarafında iğne ekleyerek. Kısaca iğne geri çekilme önce duraklatın. Fare kafes dönmek ve 5 dk. bekleyin
  5. Steril oftalmik merhem fare anestezi kuruluk önlemeye gözler için geçerlidir. Fare pedal çekilme refleks (Yani, ayak tutam) eksikliği nedeniyle anestezi kontrol edin. Fareler değil tam anestezi Eğer bu virüsü öksürük.
  6. Ne zaman fare tam anestezi,
  7. dorsal recumbency fare yerleştirin. Virüs inoculum burun ve yavaş yavaş 30 µL içeren damlalıklı ipucu koymak ama sürekli çözüm dışarı atmak. Fare kaybolan damla inoculum gözlemleyerek hazırlık teneffüs olduğunu emin olun.
  8. Kontrol edin TBE sıcaklık ve solunum hızı düşürmek gibi fare nefes alıyor. Hayvan dorsal recumbency yerleştirerek kafes dönün. Solunum güçlüğü belirtisi için fareler izlemek ve gözlenen, dikey olarak tutan hayvan tarafından nefes ve solunum 24 tahrik etkisi teşvik için fareyi yardımcı. Bilinç (30-45 dk anestezi sonra) tekrar yerine geleceğinden fare izlemek.

4. Karakterizasyonu Viral Patogenez ( şekil 1)

  1. morbidite ve mortalite ( Resim 1 ve Şekil 2)
    1. İ.n. 3-4 kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 farelerin grupları bulaştırmak (n, grup başına en az 5 fare = 5) 10 kat dozlarda (10, 10 2, 10 3 ve 10 4 FFU/fare) PR8 madde 3 te açıklandığı gibi WT,.
    2. Monitör ve ağırlık varyasyonları yemek yenmesi nedeniyle en aza indirmek için yaklaşık aynı zamanda sonraki 14 gün boyunca bir ölçek ile fareler tartın. Onların ilk vücut ağırlığının % 20 1 bölümünde açıklandığı gibi kaybetmek fareler ötenazi.
    3. 14 gün sonra 1 bölümünde açıklandığı gibi viral enfeksiyon hayatta fareler ötenazi.
    4. Reed ve Muench 25 yöntemi kullanarak elde edilen hayatta kalma verilere dayanarak viral % 50 fare öldürücü doz (MLD 50) hesaplar. İlk olarak, orantılı uzaklığı (PD) hesaplamak:
      Equation 1
      1. sonra aşağıdaki formülle MLD 50 hesaplamak:
        Equation 2
  2. akciğerler ve nazal mukoza viral titreleri değerlendirilmesi ( Resim 1 ve Şekil 2. )
    1. Kurtarma akciğerler ve nazal mukoza
      1. i.n. kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 fareler bulaştırmak (n = 6) madde 3 te açıklandığı gibi 10-10 4 PR8 WT FFU test etmek için viral dozla.
      2. Toplamak fare akciğerler ve nazal mukoza gün 2 (n = 3) ve 4 (n = 3).
        1. Ötenazi TBE (500 mg/kg) ölümcül bir doz (IP) ile fareler. Hayvan dorsal recumbency yerleştirin ve % 70 etanol ile göğüs üzerinde kürk dezenfekte. Karın tabanına göğüs kemiği üzerinden bir neşter ile deriyi kesme. Belgili tanımlık kesme tabanından 1 cm kesim fareler, lateral bölümlerine makasla yapmak.
        2. Hepatik ven ikincil ötenazi yöntemi olarak fare bleed makasla kesme. Hayvan ventral konumda yer ve kan tahliye izin vermek için 2 dakika bekleyin. Akciğerlerde kan azaltmak önemli bir adımdır.
        3. Bankası ilk kesi forseps ve makas dissekan yardımı ile yapıldığı karın için fareyi (baş dahil olmak üzere) tüm üst bölümünden cilt kaldırın. Makas ile kafa keser ve bir steril kuru kabında yerleştirir.
        4. Üst çene ve çene arasında kavşak makas ile kesme ve çene atın. Makas ile kesme, elmacık kemerler ucunda iki kesim yapmak ve bunları kaldırın. Diseksiyon forseps yardımıyla gözlerle kaldırmak.
        5. Kafatası parçalanmış Forseps ile tutun ve kafatası sagittal dikiş bir neşter ile birlikte kesti. Kafatası nazal mukoza görmek için beyin ile iki yarısı kaldır. Burun mucosas Burun kemiği, üst çene kemiği, palatine, elmacık, dahil olmak üzere Kafatasının ön kemikleri ve etmoid kemik tarafından çevrilidir.
        6. Neşteri kullanarak, beyin ile kafatası parçası kesme ve atmak. Kafatası nazal mukoza ile diğer kısmı steril bir tüp içinde yerleştirin. Tüp buz (4 ° C) saklamak örnekleri aynı gün işlenir veya bunları hızlı bir şekilde Eğer dondurmak için Kuru buza örnekleri daha sonra işlenir.
        7. Örneklerin kirlenmesini önlemek için temiz ve kurtarılan her doku arasında her hayvan diseksiyon klor dioksit dezenfektan ile arasında parçalanmış araçları dezenfekte.
        8. Akciğerleri toplamak, hayvan dorsal recumbency yerleştirin ve plevra makasla kesmek için
        9. . Göğüs kafesi 1 cm her iki göğüs kemiği, kaburga keserek açın. Göğüs kafesi tabanından kesim üstün bölümü makasla yapmak.
        10. Göğüs kafesi üstün kısmında iki insizyon arasındaki makas ile bir kesit olun ve göğüs plakası çıkartın. Forseps ile akciğerlere tutun, Trakea (hemen önce akciğer) sonunda makasla ve akciğerler steril tüp içine koydu. Tüp buz (4 ° C) saklamak örnekleri aynı gün işlenir veya bunları hızlı bir şekilde Eğer dondurmak için Kuru buza örnekleri daha sonra işlenir.
          Not: doku örnekleri toplanan aynı günde homojenize ve viral titreleri daha sonra analiz etmek için-80 ° C'de depolayın. Bu örnekleri tekrarlanan donma-çözülme virüs titreleri karar vermeden önce döngüleri geçmesi değil ki önemlidir. Onlar işlenir kadar alternatif olarak, doku örnekleri-80 ° C'de depolayın.
    2. Homojenizasyon akciğerler ve nazal mukoza
      1. akciğer veya nazal mukoza steril Dounce homogenizer yerleştirin ve 1 mL soğuk enfeksiyon medya ekleyin. Örnek akciğerler tamamen bozulduğu kadar havaneli ile yukarı ve aşağı yaklaşık 1 dakika oda sıcaklığında (RT) hareket ettirerek lunaparkçı. Homojenize örnek 4'te bir steril tüp ve mağaza koymak ° C. kullanım her örnek için yeni bir Dounce homogenizer.
      2. 300 x g 5-10dk RT. toplamak süpernatant yeni steril tüp içinde için de örnekler santrifüj kapasitesi. Viral titrasyon aynı gün gerçekleştirilirse süpernatant 4 ° C'de depolayın ve Pelet atmak. Alternatif olarak, daha sonra viral titreleri değerlendirmek için (-80 ° C), homojenize süpernatant örnekleri dondurma.
    3. Virüs titrasyon tarafından dolaylı ayirt
      1. titrasyon, önceki gün tohum 96-şey pilakalar ve doku kültürü medya ~ 80-%90 izdiham ulaşmak için Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) epitel hücreleri (4 x 10 4 hücreleri/de). 37 ° C kuluçka %5 CO 2 hücreleri yerleştirin. Viral enfeksiyon başlamadan önce bir monolayer onaylamak için mikroskop altında hücreleri kontrol viral titrasyon, gün.
      2. 1:10 hazırlamak süpernatant homojenize örnekleri (akciğer veya nazal Mukoza) enfeksiyon medya bir 96-şey plaka, dilutions. Viral titrasyon doğru viral titreleri belirlemek için triplicates tarafından gerçekleştirin.
        1. Ekleyin 90 µL enfeksiyon medya her 96-şey plaka Wells. Birinin süpernatant homojenize örnekleri 10 µL wells A1, A2 ve A3 nüsha her örnekte viral titresi değerlendirmek için ekleyin. 10 µL başka bir süpernatant homojenize örnekleri, A4, A5 ve A6 wells için ekleyin. Arka arkaya örnekleri geri kalanı ile aynı seyreltme gerçekleştirmek.
        2. Süpernatant örnek satır A ekledikten sonra bir çok kanallı damlalıklı yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırmak için kullanın. 10 µL A satırdan satıra B. değişim ipuçları dilutions arasında aktarmak ve iyice karıştırın. Son satır (H) erişene dek bu işlemi yineleyin.
      3. (Adım 4.2.3.1) doku kültürü orta kaldırmak 96-şey plakaları ve yıkama 100 µL/kuyu 1 x PBS ile iki kez MDCK hücrelerden bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcı ile.
      4. Transfer 50 µL/iyi bir seri olarak seyreltilmiş süpernatant 96-şey plaka ile MDCK homojenize örneklerinin hücreleri. Daha yüksek dilutions (satır H) alt dilutions (a satır) aktarma başlatın. Bu durumda, bu ipuçları farklı satırları arasında değiştirmek gerekli değildir.
      5. RT viral adsorpsiyon izin vermek için 1 h için sallanan bir platform 96-şey tabak koyun. Viral adsorpsiyon sonra bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcısı kullanan inoculum kaldırın ve 100 µL/iyi sonrası enfeksiyon medya ekleyin. 33 ° C veya 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ile 8 h için enfekte hücreleri kuluçkaya. Sabitleme, Boyama, görüntü ve viral titresi hesaplama için 4.2.3.6 adımlarda açıklandığı gibi devam – 4.2.3.12.
      6. Doku kültürü orta bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcı ile 96-şey plakalar kaldırın. Düzeltmek ve 100 µL/iyi fiksasyon/permeabilization çözüm RT., 20 dk için hücrelerle permeabilize
        Dikkat: fiksasyon/permeabilization çözüm formaldehit etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak için bir duman mahallede kullanın.
      7. Bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcı ile fiksasyon/permeabilization çözümü kaldırmak, yıkama 1 x PBS ile ve RT. mağazasında 1 h için çözüm çözüm 4 ° C'de kapatmaktır hücreleri engelleme ile sabit hücreleri kuluçkaya veya sonraki adıma geçin.
      8. Engelleme çözüm kaldırın. 50 µL/iyi 1 µg/mL Monoklonal antikor (mAb) anti-NP HB eklemek-antikor seyreltme çözümde seyreltilmiş 65. 1 h 37 ° C. farklı mAb veya polyclon için kuluçkayaAl antikorlar (pAb) anti-PR8-ebilmek var olmak kullanılmış.
      9. Bu arada, 1: 200 floresein isothiocyanate (FITC) seyreltik-konjüge ikincil Anti-fare antikor antikor seyreltme çözümde. Belgili tanımlık eriyik için 5-10 dk RT. az 1.700 x g vasıl santrifüj kapasitesi Diğer fluorophores ile Birleşik diğer ikincil antikorlar kullanılabilir.
      10. Birincil antikor kaldırmak ve 3 kez 100 µL/kuyu ile 1 x PBS yıkayın. İkincil antikor seyreltme 50 µL/kuyu ekleyin ve 30-45 dk 37 ° C. Kaldır ikincil antikor ve yıkama 3 kez ile 100 µL/kuyu 1 x PBS için kuluçkaya. Son yıkama plaka bırakın.
      11. Pozitif lekeli (yeşil) hücrelerinin sayısını belirlemek için bir floresan mikroskop altında hücreler gözlemlemek. Viral titresi FFU/mL sayarak hesaplayın. FFU/mL seyreltme formülü kullanarak 30-50 olumlu lekeli hücreleri ile ifade viral titresi hesaplamak: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/seyreltme.

5. Değerlendirme Humoral bağışıklık yanıtı ( şekil 3)

  1. i.n. 3 kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 farelerin grupları bulaştırmak (n = 5) farklı dozlarda (10 2, 10 3 ve 10 4 FFU / fare) ve PR8 LAIV ve sahte bir grup bulaştırmak (n = 5) 1 x bir negatif kontrol olarak steril PBS ile. Madde 3 te açıklandığı gibi ın fare enfeksiyonlar gerçekleştirmek.
    1. Fare submandibular delik
      1. on dört gün sonra aşılama, kanama submandibular kanayan bir 4 mm mazgal 26 kullanarak fare kan toplamak veya başka bir IACUC kullanarak yöntemi onayladı.
        1. Tutun başparmak ve işaret parmağı arasında boyun scruff tarafından alacak tarafından fare. Pinky parmak fare hareketsiz eliyle karşı kuyruk tutun.
        2. Yatay bir konumda yanak görmek için fare koymak. Retro-orbital ve çene damarlar juguler ven ile noktada bir delik olun. Lancet (4-mm) batırın ve steril bir tüp kan kurtarmak (yaklaşık 0.2 - 0.4 mL/fare kurtarılan). Steril bir peçete ile ponksiyon için birkaç ikinci basınç uygulayın. Kafesin içine fareyi getirin.
      2. 1-2 h için tüpler 37 ° C'de koymak ve sonra onları vasıl 700 x g RT gelen kan serumu ayırmak için 30 dk santrifüj kapasitesi. Damlalıklı yeni bir steril tüp için serumla oluşur üst katmana aktarmak. Pelet kırmızı kan hücrelerinin (RBCs) atmak. -20, serum depolamak ° C.
  2. Toplam antikorlar viral proteinler karşı analizi
    1. enfekte MDCK hücre özleri hazırlanması
      1. enfeksiyon, önceki gün bir 100-mm çanak ile 4-5 x 10 6 MDCK hücreleri (~ 80-90 ulaşmak için tohum % izdiham ertesi gün) doku kültürü medya. 37 ° C kuluçka %5 CO 2 hücreleri yerleştirin. Viral enfeksiyon başlamadan önce bir monolayer onaylamak için mikroskop altında hücreleri kontrol viral enfeksiyon, gün.
      2. Enfeksiyonu (MOI) viral bir seyreltme düşük (0.001) çeşitlilik ile 4 mL toplam son hacim enfeksiyon medyada PR8 WT hazır olun. PR8 WT, miktarı Formula ((n ° hücreleri x X MOI) son hacim x) / stok viral titresi.
      3. MDCK hücre plaka doku kültürü ortamından Aspire edin ve iki kez 4 mL 1 x PBS yıkayın. RT viral adsorpsiyon izin vermek için 1 h için sallanan bir platformda plaka koymak ve viral inoculum (4 mL) ekleyin. Vakum ile viral inoculum kaldırın ve 8-10 mL 1 µg/mL TPCK tedavi tripsin içeren sonrası enfeksiyon medya ekleyin. 48-72 h 33 ° C veya 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ile enfekte hücreleri kuluçkaya.
      4. Hücreleri hücre kazıyıcı yardımı ile bağlantısını kesin ve bu hücre ve doku kültürü orta damlalıklı 15 mL tüp ile toplamak. 400 x g 5-10 dk RT. aspiratı süpernatant az için de tüp santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet 1 mL RIPA arabellek resuspend ve karışımı bir 1.5 mL steril tüpe koy. 20-30 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
      5. Santrifüj tüpü 1.300 x g de 20-30 dk 4 ° C. dikkatle, süpernatant kurtarmak. Hücre ayıklamak 100 µL aliquots -20, içinde mağaza ° C.
      6. Hücre özleri gibi bunları değerlendirerek antikorlar 9 , 10 , 11 varlığı için önce enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından açıklanan titre , 27. Ekle hücre bir negatif kontrol sahte enfekte MDCK hücreleri (yukarıda belirtildiği şekilde hazırlanmış) ayıklar.
    2. ELISA ( şekil 4)
      1. kat 96-şey plakaları ile enfekte MDCK hücre uygun seyreltme ayıklamak 1 x PBS (genellikle arasında 1: 200 - 1:1, 000), polistiren. Başka bir plaka ile sahte enfekte MDCK hücre özü aynı seyreltme bir negatif kontrol olarak kat. Kuluçkaya gecelik (O/N) 4 ° C.
      2. Bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcısı kullanan süpernatant çıkarın ve bir kez 100 µL/kuyu 1 x PBS bir çok kanallı damlalıklı ile yıkayın. Kütük parçası non-spesifik bağlama 100 µL/iyi RT. 1 h için çözüm engelleme ekleyerek
      3. Bu arada, adım 5.1 antikor seyreltme çözüm bir 96-şey plaka'de enfekte her fareden sera logosuna 2 kat seri dilutions (seyreltme 1: 50'den başlayarak) yapmak.
      4. Kaldır polistiren 96-şey engelleme çözümden plakalı bir vakum aspiratör-çok kanallı adaptörü kullanarak. Her fare serum seyreltme 50 µL uygun kuyuda ekleyin ve 1 h 37 kuluçkaya ° C.
      5. Vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcımda fareler sera kaldırın. Kuyuları 3 kez bir çok kanallı damlalıklı kullanarak distile su ile yıkayın. 50 µL/iyi bir anti-fare ikincil antikor antikor seyreltme çözümde Horseradish peroksidaz (HRP) seyreltilmiş 1:2,000 ile Birleşik olarak ekleyin. 1 h 37 ° C'de kuluçkaya
      6. Vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcımda ikincil antikor kaldırın. Kuyuları 3 kez bir çok kanallı damlalıklı kullanarak distile su ile yıkayın. 1:1 çözüm A ve B. eklemek 100 µL/kuyu substrat karıştırarak tetramethylbenzidine (TMB) substrat çözeltisi hazırlamak ve 5-10dk RT, karanlıkta için kuluçkaya.
      7. 100 µL/iyi 0.2 N H 2 kadar ekleyerek reaksiyonu durdurmak 4. Plakayı 450 de okumak bir ELISA plaka okuyucu üzerinde nm.
      8. Her seyreltme MDCK sahte enfekte 96-şey plaka MDCK enfekte 96-şey plaka elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkarma. Farklı sera ile her seyreltme için ortalama değerleri hesaplamak ve standart sapma (SD) gösteren bir grafik temsil ettiğim.
  3. Antikorları nötralize analizi
    1. hemaglütinasyon inhibisyon (HAI) tahlil ( şekil 5)
      1. HAI tahlil yapmadan önce fare sera reseptör ile tedavi enzim (RDE tüm non-spesifik inhibitörleri serum içinde mevcut ortadan kaldırmak için) yok. RDE çalışma seyreltme 4 cilt için fare serum 1 birim ekleme (serum seyreltme şu anda 1:5). O/N (12 - kuluçkaya 18 s) 37 ° C su banyosunda.
      2. Serum numuneleri RDE devre dışı bırakabilirsiniz 30 dk 56 ° C'de ısı.
      3. Hemaglütinasyon etkinliğini (HAU) standart HA tahlil 28 tarafından önceden PR8 WT belirlemek. Viral HAU belirlendikten sonra 1 x PBS 50 µL başına 8 HAU viral stok sulandırmak.
      4. Logosuna 2 kat seri dilutions (12 dilutions) RDE tedavi sera bir 96-şey V-alt plaka
      5. hazırlayın. Bir satır için her serum örneği (örneğin, A1 A12 için) kullanın. A12 kuyu
        1. 1 x 25 eklemek µL PBS'ye a1. Her bir serum numuneleri, bir satır test. RDE tedavi sera (1:5) 25 µL 1 x PBS (A1) sütunun ilk iyi 25 µL ekleyin. İlk serum seyreltme 1: 10'dur.
        2. Bir kez tüm sera RDE tedavi ilk sütuna eklenen
        3. (örneğin, A1, B1, C1), yukarı ve aşağı pipetting tarafından sera ve 1 x PBS karıştırmak için bir çok kanallı damlalıklı kullanın. Seyreltilmiş sera 25 µL ilk sütun ikinci sütun (örneğin, a1 A2 için) aktarın. İpuçları dilutions arasında değiştirmek ve mix.
        4. Yinele adımları 5.3.1.4.2. son sütun (örneğin, A12, B12, C12) ulaşan kadar. Birimin tüm wells (25 µL) içinde tutarlı tutmak son sütundan 25 µL atmak. Wells, bir negatif kontrol olarak herhangi bir sera olmadan 1 x PBS sadece 25 µL içeren bir satır eklemek.
      6. Ekle 25 µL IAV, seyreltilmiş 8 HAU/50 µL her sera içinde 96-şey V-alt plaka ile Wells için; her son hacim 50 µL, 4 HAU virüs içeren bir şey. İçeriği tekrarlanan pipetting tarafından karıştırın. Dik, 1 h için kuluçkaya
      7. Ekle 50 µL % 0.5 Türkiye RBCs her Wells. İçeriği tekrarlanan pipetting tarafından karıştırın. 30-45 dk buz üzerinde plaka kuluçkaya. Denetim Wells (1 x PBS) RBCs kuyu dibinde kırmızı çökelti (Yani, pellet) oluşturduğunuzda HAI tahlil görsel olarak okuyun.
        Not: RBCs gibi diğer türlerden tavuk, eskiden şiling şimdi domuz ya da atı da kullanılabilir.
      8. De hangi RBCs kırmızı Pelet formu ve hemaglütinasyon oluşmaz son tanımlayarak HAI titreleri hesaplamak.
        Not: Karşılıklı bu seyreltme HAI titresi değeridir. Karşılıklı değer 20 1:20 için doğru bir faktörüyle çarpılır ilk satırda serum seyreltme.
    2. Virüs microneutralization tahlil (VNA) ( şekil 6)
      1. VNA, önceki gün MDCK hücrelerin % 80-90 izdiham 5.2.1.1. adımda açıklandığı gibi ertesi gün ulaşmak için bir 96-şey plaka hazırlamak. PR8 WT seyreltme 200 FFU/25 µL için enfeksiyon medya hazırlayın.
      2. Yinele 1 h. için 56 ° C'de fare sera onaylatılacak 96-şey plaka kullanarak fare sera başına logosuna 2 kat seri dilutions (12 seyreltme) olun.
        1. Ekleyin 40 µL serum 160 için µL enfeksiyon medya (örneğin, A1) ilk satırının ilk iyi (serum seyreltme 1:5). Pipetting tarafından mix. Diğer wells 100 µL enfeksiyon medya ekleyin (H12 için A2).
        2. İlk satırındaki transfer 100 µL için 1:2 dilutions (örneğin, A1 A2 için üzerinden) yapmak için ikinci satır. İpuçları dilutions ve karışımı arasında pipetting tarafından değiştirin. (Örneğin, A12) son satır kadar bu işlemi yineleyin. Birimin tüm wells (100 µL) içinde tutarlı tutmak son satırdan 100 µL atın.
      3. Ekle 100 µL IAV seyreltme için bütün wells. 1 h RT. kuluçkaya Bu arada, bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcı ile 96-şey plaka MDCK hücrelerde doku kültürü orta kaldırmak ve yıkama iki kez 100 µL/kuyu ile 1 x PBS.
      4. Her 96-şey saçtan MDCK hücreleri, denetimleri için iki satır bırakın. Bir satır negatif kontrol (virüs ve sera olmayan hücreler) ve diğer satır enfeksiyon (hücre ile virüs yokluğunda, sera veya sera sahte enfekte fareler üzerinden) pozitif kontrolü.
      5. Transfer 50 µL/iyi virüs-antikor plaka 96-şey plakaları MDCK hücre. RT viral adsorpsiyon izin vermek için 1 h için sallanan bir platformda plakaları koymak.
      6. Bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcısı kullanan virüs-antikor inoculum kaldırın ve 100 µL/iyi TPCK tedavi tripsin 1 µg/mL içeren sonrası enfeksiyon medya ekleyin.
      7. Cytopathic etkisi (CPE) pozitif kontrolü (yokluğunda sera veya kontrol serumu ile enfekte hücreleri) gözlenen kadar hücreleri 33 ° C veya 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ~ 3-4 gün kuluçkaya.
      8. Bir vakum aspiratör-çok kanallı adaptörü kullanarak doku kültürü orta kaldırın ve % 0.1 kristal violet 100 µL/kuyu ekleyin. RT Kaldır, 1 h için bir vakum aspiratör-çok kanallı bağdaştırıcısı kullanarak kristal violet solüsyonu kuluçkaya. Wells 3 kez distile su ile yıkayın. Plakayı RT., Kuru
      9. Hesaplamak VNA titreleri Konfluent hücre monolayer MDCK hücreleri korur yüksek seyreltme tanımlayarak.
        Not: Karşılıklı karşılık gelen bu seyreltme nötralize antikor titresi değeridir. Karşılıklı değer 10 1:10 düzeltmek için faktörüyle çarpılır seyreltme sera satırın ilk iyi.

6. Koruma etkinliği aşılar ( şekil 3) değerlendirilmesi

  1. aşılanmalıdır i.n. bir grup kadın 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 farelerin (n = 11) (FFU/fare) test etmek ve başka bir grup farelerin sahte aşılamak PR8 LAIV doz ile (n = 11) steril PBS x 1 ile. Daha önce madde 3 te açıklandığı gibi fare i.n. Immunizations gerçekleştirmek.
  2. On dört gün sonrası aşılama, farelerin kan ve 3 bölümde açıklandığı gibi sera toplamak. Toplam ve PR8 WT karşı antikor 5.1.1 bölümünde açıklandığı gibi nötralize varlığı analiz.
  3. On beş gün sonrası aşılama, ölçmek ve fare vücut ağırlığı (0 gün) kaydedin. Fareler i.n. PR8 WT (homolog challenge) daha önce madde 3 te açıklandığı gibi öldürücü bir doz ile meydan.
  4. Vücut ağırlığı ve hayatta kalma ölçmek (n = 5 / grup) 14 gün sonra morbidite ve mortalite aşı fareler (Bölüm 4.1) PR8 WT mücadelesine tarafından üretilen değerlendirmek için meydan okuma sırasında.
  5. Yeniden elde etmek fare akciğerler ve nazal mukoza (n = 3/gün) 2 gün ve gün 4 sonrası meydan PR8 WT ile homojenize ve akciğerleri analiz ve nazal mukoza bölümünde 4.2 için açıklandığı gibi değerlendiriyor PR8 WT viral çoğaltma aşı farelerde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fareler viral patogenezinde karakterizasyonu

IAV patogenezinde morbidite ve mortalite onun enfeksiyonu neden ilgilidir. Bu iki parametre farelerde kolayca değerlendirilebilir: IAV morbidite virüslü farelerde vücut kilo kaybı ile ilişkili ve ölüm oranı (Resim 1) hayatta kalma yüzdesini gösterir. Vücut ağırlığı ve hayatta kalma IAV enfekte farelerde genellikle her gün en az iki hafta sonra enfeksiyon8,9,10,29için izlenir. Hayatta kalma veri elde Reed ve Muench25yöntemi kullanarak hesaplanır MLD50 belirleyebilirsiniz. Başka bir göstergesi IAV Patogenez viral çoğaltma (akciğerler) alt ve üst (nazal Mukoza) solunum yolu (şekil 1) ilişkilidir. Bu organların viral titresi ile elde edilen bilgileri morbidite ve mortalite değerleri, karşılık gelen ve birlikte ele alındığında viral Patogenez iyi bir gösterge sağlar. Bu bilinen IAV çoğaltma fare akciğerlerde zirve arasında 2 ve 4 gün sonrası enfeksiyon (özel dedektif) ve bu yüzden biz bu organların gün 2 ve 4 özel dedektif, kurtarma önerilir

Figure 1
Şekil 1: fareler patogenezinde IAV karakterizasyonu: Fareler patogenezinde IAV morbidite (vücut kilo kaybı) ve mortalite (% hayatta kalma) ve ayrıca IAV üst (nazal Mukoza) ve alt (akciğerler) solunum yolu çoğaltmak yeteneği ilgilidir. Fareler tartılır ve intranasally IAV ile bulaşmış olup önce intraperitoneally 2,2,2-tribromoethanol ile (TBE) anestezi kısaca, gün 0. Gün 1 gün 14, fareler vücut kilo kaybı (hastalık) ve % hayatta kalma fare öldürücü doz 50 (MLD50) hesaplamak için (mortalite) değerlendirmek için günlük tartılır vardır. Gün 2 ve 4 gün sonrası enfeksiyon, fareler akciğerler ve nazal mukoza kurtarıldı ve viral çoğaltma değerlendirmek için homojenize. Fareler deneyler PR8 WT kullanarak IAV Patogenez karakterize BSL-2 koşullar altında yapılmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2' de, PR8 WT Patogenez değerlendirilmesinde elde edilen veriler gösterilir. 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 farelerin dört gruba (n = 11) belirtilen dozlarda enfekte i.n. idi (10, 102, 103 ve 104 FFU/fare) PR8 WT. Vücut ağırlığı ve hayatta kalma grubu başına 5 farelerin 14 gün p.ı. (şekil 2A-B) tarafından ölçüldü. Bütün fareler (şekil 2A) 104 FFU PR8 kayıp WT ağırlık ile hızlı bir şekilde aşı ve bunların tümünün gün 5 ve 6 özel dedektif (şekil 2B) öldü. 103 FFU PR8 kayıp WT vücut ağırlığı daha sonra özel dedektif (şekil 2A) kere ve onlar bütün gün 7 ve 8 p.ı. (şekil 2B) tarafından öldü ile aşı fareler. Bütün fareler 102 FFU PR8 kayıp WT vücut ağırlığı ile (şekil 2A) sadece 2 gün 9 p.ı. (şekil 2B) öldü ama aşı. Son olarak, 10 ile aşı fareler PR8 WT FFU ağırlığı (şekil 2A) kaybetmek değil ve hepsi enfeksiyon (şekil 2B) hayatta. MLD50 / PR8 WT Reed Muench yöntemi ve25 ile hesaplanan bu deneyde 1.5 x 10 yapıldı2 FFU (şekil 2C).

Değerlendirmek PR8 çoğaltma üst ve alt solunum yolu farelerin enfekte i.n. belirtilen dozlarda (10, 102, 103ve 104 FFU/fare), akciğer ve nazal mukoza gün 2 ve 4 p.ı. ele geçirilmiştir (n = 3). Akciğer homojenizasyon sonra virüs bu organ mevcut miktarı ayirt tahlil (şekil 2B) tarafından analiz edildi. Farklı fareler grupları akciğerlerde tespit viral titresi onlara bağışıklık için kullanılan doz ile ilgili olarak: Yüksek viral titreleri 10 ile aşı farelerin akciğerlerde algılandı4 PR8 WT FFU gün 2 ve 4 p.ı., daha düşük viral titreleri tespit iken, Fareler PR8 WT 10 FFU ile aşı akciğerler.

Figure 2
Şekil 2: verilerin sunumunu elde Viral Patogenez değerlendirme içinde: Morbidite ve mortalite PR8 WT, 6-8-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fareler, analiz etmek için (n = 5) floresan oluşturmayan sayısını ile enfekte i.n. edildi PR8 WT birimlerinin (FFU) ve(a)vücut-kilo kaybı (morbidite) için 2 hafta boyunca her gün izleniyor ve (B) hayatta kalma (mortalite). Verileri göstermek anlamına gelir ve standart sapmalar bireysel fareler için belirlenen sonuçlarının (n = 5). (C) değerler % hayatta kalma 2 hafta içinde değerlendirilen Reed ve Muench yöntemi25kullanarak MLD50 hesaplamak için kullanılır. Viral çoğaltma, 6-8-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fareler değerlendirmek için (D) (n = 6) FFU sayısını ile enfekte i.n. vardı. Akciğer veya virüslü fareleri nazal mukoza viral çoğaltma genelde bir immunofocus yöntemi kullanarak gün 2 ve 4 p.ı. değerlendirilir. Viral titreleri FFU/mL kaydedilir. Veri anlamına gelir ve her fare elde edilen sonuçlar SDs temsil eder. Kesik çizgiler tahlil tespiti (200 FFU/mL) sınırını belirtmek için dahil edilir. Fareler ve IAV morbidite, mortalite ve viral titreleri PR8 kullanarak değerlendirmek için doku kültürü deneyleri BSL-2 koşullar altında yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonra aşı indüklenen humoral yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Humoral yanıt IAV enfeksiyona karşı indüklenen viral enfeksiyon kontrol önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, IAV WT enfeksiyonlar veya yeni IAV aşılar (şekil 3) elde edildi humoral yanıt-e doğru çözümlemek çok önemlidir. Fare modelinde, 14 gün sonra aşılama, fareler toplam viral proteinler tarafından ELISA (şekil 4) karşı antikor varlığı ve genellikle viral HA protein hedefleme antikorları nötralize varlığını çözümlemek için kanadı bir HAI tahlil (gibi yaygın gonore yaklaşımlarla analizNG sınıf "xfig" = > Şekil 5) ve/veya VNA (şekil 6).

Figure 3
Resim 3: bir LAIV koruma etkinliği ve güvenliği, immünojenisite karakterizasyonu farklı adımları düzeni: Ne zaman yeni bir LAIV geliştirilen, fare modeli IAV enfeksiyon genellikle güvenlik, immünojenisite ve koruma etkinliğini test etmek için kullanılır. Bu düzende, Emanet(a)değerlendirmek için deneyler immünojenisite (B) ve koruma etkinliği (C) bir aday LAIV belirtilir. (Agüvenliğini değerlendirmek için) bir LAIV aynı parametreleri tahlil gereklidir (morbidite, mortalite ve viral çoğaltma üst ve alt solunum yolu) şekil 1' de açıklanan. Fareler immünojenisite değerlendirmek için aşı ve 14 gün sonra aşılama onlar tarafından submandibular ponksiyon kanadı. Humoral yanıt IAV proteinler karşı toplam antikor varlığı enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve hemaglütinasyon inhibisyon tahlil (HAI) ve/veya virüs tarafından antikorları nötralize varlığını değerlendirmek tarafından değerlendirilmesi tarafından incelenir microneutralization tahlil (VNA). (Koruma etkinliği, 15 gün sonra aşılama, fareler meydan değerlendirmek için,C) IAV WT koruma ile etkinlik fareler morbidite, mortalite ve meydan farelerin akciğerlerde viral titreleri ölçümü tarafından Resim 1 açıklandığı gibi değerlendirilir . LAIV aday Emanet, immünojenisite ve koruma etkinliği karakterize etmek için fareler deneyler BSL-2 koşullar altında yapılmaktadır. Diğer BSL takım elbise veya koruma koşullarına bağlı olarak aşı fareler mücadele için kullanılan IAV zorlanma gerekli olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

PR8 LAIV, 6-8-hafta-yaşlı C57BL/6 fare üç grup immünojenisite değerlendirmek için (n = 5) ile farklı doz aşı (102, 103ve 104 FFU/fare) PR8 LAIV veya sahte bir negatif kontrol olarak 1 x PBS ile aşı. On dört gün sonra aşılama, fareler sera submandibular kanama26 tarafından (şekil 3) toplanmıştır. Toplam viral proteinler karşı antikor yanıt-e doğru MDCK PR8 enfekte hücre (şekil 4) hücre ekstresinin bir 1: 200 dilüsyonu kullanılarak ELISA tarafından değerlendirildi. Her serum ayrı ayrı analiz edildi. Fareler üzerinden sera ile daha yüksek doz aşı sonuçlar gösterir (104 FFU) PR8 LAIV sera ile daha düşük dozda aşı farelerin daha toplam PR8 proteinler karşı daha yüksek antikor titreleri vardı (102 FFU). Sera kontrolü (sahte enfekte fareler) reaktivite PR8 antijenlere karşı belli etmedi.

Figure 4
Şekil 4: enzim bağlı Immunosorbent Assay (ELISA) Humoral antikor yanıtları değerlendirmek için şematik gösterimi: Virüslü farelerde mevcut PR8 özgü antikorların düzeyleri tarafından ELISA 96-şey polistren levhalar sahte (kontrol) veya MDCK PR8 enfekte hücreleri hücre özleri ile kaplı olarak belirlenir. Kısaca, 14 gün p.ı. (şekil 3), fare ile PR8 LAIV belirtilen doz aşı submandibular ponksiyon tarafından kanadı ve sera toplanmıştır. Her serum IgG antikorlar karşı toplam PR8 proteinler için ELISA tarafından ayrı ayrı değerlendirilmiştir. Grafik verilerini temsil anlamına gelir ve standart sapmalar sonuçları elde bireysel fareler sera (n = 6). O.D, optik yoğunluk. ELISA deneyleri BSL-2 kabinde yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Fare antikorları nötralize varlığını çözümlenecek HAI kullanarak serum tahlil, seri logosuna 2 kat dilutions (daha önce 56 ° C'de inaktive) sera ile farklı doz aşı fareler her grubunun (102, 103ve 104 FFU) PR8 LAIV PR8 WT RT (şekil 5), 1 h için 4 HAU ile inkübe. Sonra Türkiye'nin RBCs % 0.5 PR8-sera karışımları için eklenmiştir. Şekil 5 üst kısmındaki HAI sonucu, şematik bir gösterimidir: serum nötralize antikorlar içerdiğinde, viral HA protein ilişkili antikorlar engellediğinden RBCs yağış kuyunun içinde görülmektedir RBCs hemaglütinasyon. Öte yandan, antikorları nötralize yokluğunda, RBCs hemaglütinasyon görülmektedir. O zaman, HAI titresi son de eksik hemaglütinasyon serum seyreltme karşılıklı olarak hesaplanır. Fareden serum PR8 LAIV en büyük miktar ile aşı şekil 5 alt kısmında gösterdi HAI sonuçlar gösterir (104 FFU) ile bir fareden serum aşı iken antikorları nötralize, daha yüksek titresi var. daha düşük dozda (102 FFU) PR8 karşı antikor nötralize en düşük titresi var. Hiçbir nötralize antikorlar serum denetiminde (sahte enfekte fareler) mevcuttu.

Figure 5
Şekil 5: hemaglütinasyon inhibisyon (HAI) tahlil: Virüslü farelerde PR8 WT karşı antikorları nötralize seviyeleri kolayca HAI tahlil tarafından değerlendirilebilir. Kısaca, (seyreltme 1: 10'den başlayarak) logosuna 2 kat seri dilutions sera PR8 LAIV belirtilen doz ile aşı fareler gelen PR8 WT RT 1 h bir 96-şey V-alt plaka için 4 HAU (1:1) karışık. 1 h kuluçka sonra % 0.5 RBCs 30-60 dakika buz üzerinde virüs-serum karışımları için eklenmiştir. HAI titreleri de hangi RBCs kırmızı bir düğme oluşturmak ve hemaglütinasyon (üst) oluşmaz son tanımlayarak belirlenir. HAI deneyleri PR8 WT ile BSL-2 kabinde yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6' da, fare sera antikorları nötralize değerlendirme VNA tarafından elde edilen veriler gösterilir. PR8 WT 200 FFU sera (daha önce inactivat seri logosuna 2 kat dilutions ile karışıkEd 56 ° c) üzerinden fare ile farklı doz aşı (102, 103ve 104 FFU) PR8 LAIV RT. 1 h için Her serum örneği nüsha değerlendirildi. Virüs-sera karışımları bir 96-şey plaka MDCK hücrelerinin monolayers bulaştırmak için kullanılmıştır. Şekil 6 üst kısmındaki VNA sonucu, şematik bir gösterimidir: yaklaşık 3-4 gün p.ı., CPE serum sonuçlarında antikorları nötralize yokluğu Buna ek olarak, ne zaman nötralize antikor mevcut (sağlam hücre monolayer), onlar bağlamak için viral HA ve viral enfeksiyon önleme, ve orada hiçbir CPE. CPE varlığı genellikle kristal violet ile boyama enfekte hücreleri tarafından görüntülenir ve viral nötralizasyon titreleri hangi enfeksiyon tamamen kapanmış son seyreltme karşılıklı hesaplanır. VNA sonuçları şekil 6alt kısmında gösterilir. Serum PR8 LAIV yüksek miktarda ile aşı fareler dan (104 FFU) sera daha düşük doz veya PR8 LAIV aşı fareler gelen sırasında nötralize antikorların en büyük titresi var (102 FFU) nötralize antikorlar, en düşük fiyat titresi var. HAI tahlil ile elde edilen sonuçlar benzer. Hiçbir nötralize antikorlar serum içinde sahte enfekte fareler mevcuttu.

Figure 6
Şekil 6: virüs Microneutralization tahlil (VNA): Alternatif HAI tahlil, VNA tahlil PR8 antikorları nötralize WT varlığını değerlendirebilir. Kısaca, sera PR8 LAIV belirtilen doz ile aşı fareler üzerinden seri olarak logosuna 2 kat (başlangıç seyreltme 1:5) 96-şey levha seyreltilmiş ve PR8 WT RT. 1 h için 200 FFU 1:1 karışık 1 saat sonra virüs-serum karışımları 96-şey plakaları MDCK hücre bulaştırmak için kullanılmıştır. Enfekte hücreleri için tam cytopathic etkisi kadar 3-4 gün inkübe. 96-şey plakaları sonra % 0,1 kristal violet ile lekeli. VNA titreleri en yüksek seyreltme tanımlayarak Konfluent hücre monolayer korumak için belirlenir. VNA PR8 WT ile BSL-2 koşullar altında gerçekleştirilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

IAV aşılar farelerde koruma etkinliğinin değerlendirilmesi

Ne zaman yeni bir LAIV geliştirilen, onun güvenliği, immünojenisite ve koruma etkinliğini test vivo içindeolması gerekir, ve fare modeli genellikle bu parametreler analiz etmek için seçilen ilk hayvan modeli. Şekil 3 yeni LAIV farelerde karakterize farklı adımları düzenidir. Bir LAIV (şekil 3A) güvenliğini değerlendirmek için virüslü i.n. (Bölüm 4) patogenezinde bölümünde açıklanan deneysel yordamlarına benzer bir iletişim kuralı kullanılarak farelerin karışıyor ve vücut ağırlığı ve hayatta kalma izleme ile ilgili bilgi verecek morbidite ve mortalite MLD50de dahil olmak üzere, (şekil 2A-2B), LAIV. Buna ek olarak, farklı aşı dozlarda aşı (akciğerler) alt ve üst (nazal Mukoza) solunum yolu LAIV çoğaltılması biçilen8,9,10, -meli var olmak 11,29 (şekil 2B). İmmünojenisite sınamak için sera LAIV ile aşı fareler dan önce meydan benzer için açıklananlar immünojenisite bölümünde (Bölüm 5) (şekil 3B) protokolleriyle PR8 WT (homolog challenge), ile toplanır. Toplam ve sera antikorları nötralize varlığı ELISA ve HAI ve/veya VNA, anılan sıraya göre tespit edilebilir.

Son olarak, koruma etkinliğini test etmek için LAIV aşı fareler PR8 WT ile meydan vardır ve koruma etkinliği morbidite, mortalite ve Bölüm 4 ( daha önce açıklandığı gibi akciğerlere PR8 WT mücadelesine varlığı izleyerek karakterize Şekil 3 c)8,9,10,11. LAIV PR8 WT meydan karşı koruma neden olmaktadır, fareler vücut ağırlığı kaybetmek değil ve öldürücü meydan okuma IAV WT ile hayatta kalacak. Ayrıca, akciğerlerde IAV WT viral titreleri değil algılanır veya göre için önemli ölçüde azalacaktır sahte (PBS) aşı fareler8,9,10,11.

Doku kültürü medya ve çözümleri Kompozisyon Depolama Kullanım Yorumlar
Doku kültürü medya: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), % 10 Fetal sığır Serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin-L-glutamin (PSG) (DMEM % 10 FBS % 1 PSG) 445 ml DMEM, 50 ml FBS ve 100 x 1 5 ml % penisilin (100 adet/ml)-streptomisin (100 µg/ml) - L - glutamin (2 mM) (PSG) Mağaza 4° c Bu medya Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) epitel hücrelerinin bakım için kullanılır
Sonrası enfeksiyon medya: DMEM %0,3 sığır Albumin (BA), % 1 PSG (DMEM %0,3 BA % 1 PSG) 491 ml DMEM, %35 4,2 ml BA ve 5 ml / 100 x PSG Mağaza 4° c Bu medya Influenza A virüs (IAV) ile enfeksiyon sonra MDCK hücre bakım için kullanılır
Fosfat tamponlu tuz (10 x PBS) x 10 80 gr NaCl, KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2o, KH2PO42 g, 2 g. GKD2O kadar 1 L. ayarlama faz 7,3 için Ekle Mağaza oda sıcaklığında (RT) Otoklav tarafından sterilize
1 x PBS 1:10 GKD2O ile 10 x PBS sulandırmak RT mağazasında Otoklav tarafından sterilize
Enfeksiyon medya: 1 x PBS, %0,3 BA % 1 penisilin-streptomisin (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS steril, %35 4,2 ml BA ve 100 x 1 5 ml % penisilin (100 adet/ml)-streptomisin (100 µg/ml) (PS) Mağaza 4 ° c Bu medya IAV enfeksiyonları için kullanılır
Fiksasyon/permeabilization çözüm: % 4 formaldehit, % 0.5 triton X-100 1 x PBS içinde seyreltilmiş 400 mL tarafsız arabelleğe alınmış Formalin %10, Triton X-100 ve 1 x PBS 595 ml 5 ml
d > RT mağazasında Bu çözüm düzeltmek ve MDCK hücreler viral titrasyon deneylerde permeabilize için kullanılır Bir duman hood formaldehit etkilenmemek için çözümde hazırlamak Çözüm engelleme: %2.5 sığır Serum Albumin (BSA) 1 x PBS içinde BSA 2.5 g 1 x PBS 97,5 ml Mağaza 4 ° c Bu çözümü engelleyen bir çözüm olarak ayirt deneyleri ve ELISAs için kullanılır. Filtrasyon tarafından 0.2 µm filtre ile sterilize. Antikor seyreltme çözüm (1 x PBS % 1 BSA) BSA 1 g 99 ml 1 x PBS Mağaza 4 ° c Bu çözüm ayirt deneyleri ve ELISAs birincil ve ikincil antikorların seyreltme için kullanılır Filtrasyon tarafından 0.2 µm filtre ile sterilize %0.1 kristal violet çözüm Kristal violet 400 ml metanol 1 gr. GKD2O 600 ml ekleyin RT mağazasında Bu çözüm düzeltmek ve viral nötralizasyon deneyleri hücrelerde MDCK leke için kullanılır Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-tripsin tedavi GKD2O 1 mg/ml, 1000 x hisse senedi çözüm hazırlamak Mağaza-20 ° c TPCK-tripsin IAV enfeksiyonları eklenir 100 µl aliquots olun RIPA arabellek 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, %1 Triton X-100, % 0,1 sodyum deoxycholate, % 0,1 SDS, 140 mM NaCl Mağaza 4 ° c Bu çözüm hücre özleri yapmak için kullanılır.

Tablo 1: doku kültürü medya ve çözümleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAV fare modeli IAV Patogenez, immünojenisite ve koruma etkinliğinin in vivo çalışmalar için yaygın olarak kullanılır. Fareler küçük boyutunu değiştirmek ve yaban gelinciği veya eskiden şiling şimdi pigs gibi hayvan diğer modeller ile karşılaştırıldığında depolamak kolaylaştırır. Ayrıca, kolaylığı açısından maliyet hayvan konut ve üreme hayvanlar çok sayıda gerekli önceden klinik aşı testlerinde kullanımlarını sağlar. Özellikle, beri fareler içinde kullanılan birden çok araştırma disiplin, birkaç moleküler ve İmmünoloji fare reaktifler kullanımları IAV çalışmaları için kolaylaştırmak kullanılabilir. Ayrıca, en az ana bilgisayar değişkenliği ve evrimsel aynıdır bir bağışıklık sistemi mevcut insanlar onları güçlü bir küçük hayvan modeli IAV araştırmalar yapmak. Son olarak, ana bilgisayar viral protein etkileşimlerinin incelenmesi ve viral Patogenez yaptıkları katkı KO fareler için access tarafından şu anda uygulanabilir. Ancak, fareler IAV çalışmaları için kullanmanın birçok yararları, onlar IAV iletim çalışmaları için yararlı değildir. Bu nedenle, yaban gelinciği veya eskiden şiling şimdi pigs IAV iletim çalışmaya daha uygun hayvan modellerdir. Bu fare yaş, bağışıklık durumu, cinsiyet, genetik arka plan ve zorlanma bağlı olarak değişebilir, ancak 2-3 gün sonrası enfeksiyon, klinik Belirtiler genellikle IAV ile enfekte farelerde görünür; viral yük ve kullanılan doz yanı sıra. Semptomlar anoreksi, yer ısıtmaz, uyuşukluk, kürk, vücut ağırlığı ve ölüm16,17kaybı karıştırdı.

Bu makale, biz nasıl vücut kilo kaybı (hastalık), yüzde hayatta kalma (mortalite) ve viral üst (nazal Mukoza) çoğaltmasında değerlendirmek tarafından izleyerek viral IAV ile enfekte fareler i.n. patogenezinde değerlendirmek ve (akciğerler) alt tarif solunum yolu (şekil 1 ve Şekil 2). IAV patogenezinde bağlamında yeni IAV suşları, hem de LAIV aşı aday (şekil 3) güvenli uygulanması çok önemli bir parametredir. Genellikle mevsimlik IAVs ve diğer memeliler (gibi atlar, köpekler veya domuz) enfekte IAVs fareler11,27' deki hastalığın belirtileri üretmek değildir. Bu durumda, akciğerlerde viral titreleri analizi veya virüslü fareleri nazal mukoza IAV suşlarının viral Patogenez değerlendirmek için ana parametredir. Bir kez akciğer ve nazal mukoza toplanır, onlar homojenize ve virüs bu organlarda mevcut miktarı tarafından plaket tahlil, ayirt tahlil, analiz edilebilir doku kültürü bulaşıcı doz 50 (TCID50) veya başka bir doğrulanmış yöntemi8 ,29. Viral titreleri beri plak tahlil MDCK hücreleri (6-şey plaka biçimi) daha yüksek bir miktar gerektirir ve gibi TCID50, viral titreleri hesaplamak için daha fazla zaman (3-4 gün) gereklidir, dolaylı ayirt kullanarak değerlendirmek tavsiye ediyoruz. Ancak, dolaylı ayirt tahlil gerçekleştirmek için gerekli öyle: 1) (tavsiye edilir üretilen en bol viral protein olduğundan bir antikor IAV nükleoprotein, NP, karşı kullanmak için bir IAV protein karşı birincil belirli antikor viral enfeksiyon sırasında); 2) ikincil antikorlar bir fluorophore Birleşik; ve 3) floresan olumlu enfekte hücreleri saymak için floresan mikroskop.

Fareler bağışıklık sisteminin evrimsel insanlar16 bağışıklık sistemine benzer olduğu ve fareler IAV bulaşmasına karşı güçlü ve koruyucu humoral yanıt temin çünkü immünojenisite IAVs (veya aşı aday) kolayca olabilir Toplam (ELISA; belirlenerek değerlendirilmesi Şekil 4) ve nötralize (HAI, şekil 5) veya VNA (şekil 6) antikor yanıt. Bağışıklama sonra humoral yanıt-e doğru çözümlemek için fareler retro-orbital ponksiyon, kuyruk klibi, Safen ven ponksiyon veya çene delik gibi farklı onaylanmış yöntemler tarafından kanamış. Submandibular ponksiyon tekniği26 seçtik çünkü yordamı anestezi kullanımını gerektirmez ve kan immünolojik araştırmalar için kabul edilebilir bir cilt elde etmek için bize izin verir; retro-orbital ponksiyon aksine fareler anestezi ve kuyruk klibi veya Safen ven ponksiyon, ile nerede genellikle kan hacmi yeniden elde etmek düşüktür.

Bu makale, biz nasıl toplam viral proteinler tarafından virüs bulaşmış hücre özleri kullanarak ELISA karşı antikor varlığı değerlendirmek için açıklanan. IAV enfeksiyon, esas olarak, tarafından viral HA (ana antijenik viral hedef), karşı antikor aracılı bir koruyucu bağışıklık indükler beri özel antikorlar karşı HA saflaştırılmış rekombinant HA kullanarak ELISA tarafından indüklenen miktarını değerlendirmek için önerilir proteinler10. Antikorları nötralize varlığını analiz için HAI ve VNA yöntemleri kabul edilir ancak her ikisi de avantaj ve dezavantajları vardır. HAI hızlı (2-3 h) ve Merkezi hastalık kontrolü (CDC) antikorlar30nötralize IAV varlığı değerlendirmek onaylanmıştır. VNA daha zaman alıcı (3-4 gün) ama sadece viral enfeksiyon etkisiz hale getirebiliriz antikorlar değerlendirir bu yana daha belirlidir. Özellikle, VNA SAP-reaktif HA antikorlar31yanı sıra antikorlar32nötralize NA nötralize algılamak için gösterilmiştir. VNA bir diğer avantajı tahlil hassasiyeti daha az IAV beri nedir (200 FFU) yaklaşık 10 ~4-105 FFU gerektirir HAU tahlil ile karşılaştırıldığında gereklidir. Ayrıca, HAI tahlil sonuçları33,34,35yorumlama ile zorluk nedeniyle kuş IAVs karşı nötralize antikor algılamak için sorunlu olabilir. Ayrıca, VNA antikorları nötralize grip tanımlanması için RBCs kullanımını gerektirmez.

Son olarak, biz yeni IAV aşılar (şekil 3) geliştirme konusunda dikkate alınması gereken üç ana yönleri değerlendirmek için deneysel yordamlar açıklar: 1) Emanet: aşı hastalığı; güvenli ve değil üretmek olmalı 2) immünojenisite: aşı immunojenik ve neden hem humoral hem de hücresel koruyucu yanıt; 3) koruma etkinliği: aşı karşı meydan okuma ile WT homolog ve/veya kapaklı virüs koruma ikna etmek gerekir. Fare modeli ilk bir yeni IAV aşı vivo içinde çeşitli aşı düzenleri değerlendirebilir ve koşullar da dahil olmak üzere, farklı adjuvan, antijen/aşı dozu, yönetim ve geniş koruma kullanın çünkü süzmek için iyi bir seçimdir homolog veya kapaklı IAVs suşları16,17ile meydan karşı. Ancak, insan klinik deneyler için devam etmeden önce aşı adaylar en azından ikinci vivo içinde model olarak test edilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Grip virüsü LM-S laboratuvarında araştırma kısmen New York grip Center of Excellence (NYICE), NIAID merkezleri grip araştırma ve gözetleme (CEIRS) için mükemmel bir üyesi tarafından finanse edilmektedir. Biz Wendy Bates el yazması düzeltmeler onun desteği için teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23, (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430, (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18, (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9, (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356, (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500, (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252, (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83, (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199, (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3, (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85, (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22, (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4, (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9, (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76, (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37, (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70, (3), 391-398 (2003).
Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter