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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

流感病毒在小鼠感染模型中的研究

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

甲型流感病毒 (IAVs) 是人类重要的呼吸道病原体。为了了解 IAVs 的致病性和对新疫苗方法进行临床前测试, 需要模仿人体生理学的动物模型。在这里, 我们描述的技术, 以评估 IAV 病机, 体液反应和疫苗的效果使用小鼠感染模型。

Abstract

流感病毒在全球范围内造成超过50万人死亡1 , 并与每年的费用 12-140亿 USD 在美国单独考虑直接医疗和住院费用和工作缺勤的2。动物模型是关键的流感 A 病毒 (IAV) 研究评估病毒发病机制, 宿主-病原体相互作用, 免疫反应, 以及目前和/或新的疫苗方法的功效, 以及抗病毒药物。小鼠是一种有利的小动物模型, 因为它们的免疫系统在进化上与人类相似, 它们可从商业供应商那里获得, 作为基因上相同的学科, 有多种菌株可以利用来评估感染的遗传基础, 它们相对便宜, 易于操作。为了总结 IAV 感染的人通过呼吸道, 小鼠首先被麻醉之前, 鼻腔接种与传染性 IAVs 在适当的生物安全控制下。感染后, IAVs 的发病机制是通过每日监测发病率 (体重损失) 和死亡率 (存活率) 来确定的。此外, 病毒病机还可以评估病毒复制在上 (鼻黏膜) 或较低 (肺) 呼吸道感染小鼠。对 IAV 感染的体液反应可以通过无创性出血和二级抗体检测方法快速评估, 目的是检测总或中和抗体的存在。在这里, 我们描述了常用的方法感染小鼠鼻 (i. n) 与 IAV 和评估发病机制, 体液免疫反应和保护功效。

Introduction

IAVs 被封装在Orthomyxoviridae系列3中的病毒分类。他们包含八单 RNA 分子与阴性极性3。在人类中, IAVs 导致季节性流行病和偶然大流行的重要后果, 当新的病毒在人类人口中引入4。此外, 季节性 IAVs 是高度和迅速传播之间的人产生了高的经济损失世界各地每年2,5。IAV 症状包括咳嗽、鼻塞、发热、不适、头痛、厌食和肌痛, 但病毒也会在免疫缺陷患者中产生更严重的疾病6。事实上, 世界卫生组织 (WHO) 计算, 季节性流感病毒每年造成30万至50万人死亡, 在世界各地1。目前只有两类药物被食品和药物管理局 (FDA) 批准用于人类的流感预防和治疗: 神经氨酸酶 (NA) 抑制剂 (例如, 奥司他韦) 和阻断剂的 M2 离子通道 (例如,金刚烷胺);然而, 耐药性病毒变种的出现日益引起人们的关注。因此, 疫苗接种仍然是保护人类免受 IAVs 感染的最佳医疗选择。迄今为止, 有三种类型的流感疫苗是由 FDA 授权供人使用的: 重组病毒血 (HA) 蛋白疫苗、灭活流感疫苗 (IIV) 和活减流感疫苗 (LAIV)5,7. 三种疫苗的设计目的是诱导对病毒 HA 蛋白的适应性免疫反应, 这是中和抗体对抗 IAVs 的主要目标。

一种验证的小鼠模型, 用于研究 IAV 感染在体内

动物模型被用于研究, 除其他以外, IAV 发病机制8,9,10,11, 导致疾病的病毒因素12和/或病毒传输13 ,14, 并测试新疫苗或抗病毒药物的功效9,10,15。老鼠 (小家鼠) 是最广泛使用的动物模型为 IAV 研究有几个原因: 1) 免疫系统在进化上类似于人类的存在;2) 低成本, 包括动物购买、住房和繁殖;3) 体积小, 易于操作和贮存;4) 最小主机的变异性, 以获得均匀的反应和结果;5) 大鼠生物学知识, 包括基因组序列;6) 许多可用的分子生物学和/或免疫学试剂;7) 可用的敲出 (KO) 小鼠研究某一宿主蛋白对病毒感染的贡献;和, 8) 多小鼠菌株, 可以利用, 以评估遗传基础的感染。

目前有几个老鼠菌株可用于研究 IAV在体内。年龄、免疫状况、性别、遗传背景和小鼠品系以及感染途径、剂量和病毒株均影响小鼠 IAV 感染的结果。IAV 研究中使用的最常见的小鼠菌株是 C57BL/6、balb/c/C 和最近的 DBA. 2 只小鼠, 因为它们比两个前菌株更容易 IAV 疾病16,17,18,19,20. 重要的是, 免疫应答也可以根据鼠标的应变情况而有所不同18,19,20。因此, 恢复所有关于鼠标和 IAV 应变的可用信息是非常重要的, 以选择最佳的实验方法进行。

虽然鼠标是一个良好的动物模型感染的在体内研究与 IAV, 他们有几个限制, 需要考虑的实验设计。例如, 使用小鼠进行体内研究的一个主要限制是, IAVs 不在小鼠之间传播。因而, 为传输研究, 更加被接受的动物模型 (例如, 雪貂或试验品) 使用16,17,21。此外, IAV 在小鼠和人类中的表现也存在着一些差异。与人类不同, 老鼠在 IAV 感染时不会发热;相反, 他们目前与低温16,17。在小鼠中, IAV 的复制集中在下呼吸道 (肺部) 而不是上层气管。因此, IAV 在小鼠中的毒力并不总是与人类所看到的相关联。总之, 由于优势大于有限的劣势, 鼠标代表了第一个动物模型, 用于评估流感病毒的发病机制, 免疫原性和保护功效的疫苗和抗病毒研究。此外, 在 IAV 感染的小动物模型中, 使用大型动物模型进行 IAV 研究, 并没有以前的证据, 在道德上是不能接受的。在这篇手稿中, 我们描述了如何感染小鼠鼻 (.) 与 IAV, 如何监测病毒感染的严重性和进展, 以及如何进行的实验, 以评估体液免疫反应和保护功效。

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Protocol

这里描述的所有动物协议都是由机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 和罗切斯特大学医学院和牙医学院的机构生物安全委员会 (IBC) 批准的, 并遵守与建议在指南为实验室动物的关心和用途全国研究委员会22。医学和牙科学院的 Vivarium 和实验动物医学科的设施和方案由 AAALAC 国际认证, 并符合国家法律、联邦法规和国家卫生研究院的政策。在每个机构都应采用类似的要求, 以遵守本手稿中所描述的动物协议.

1. 使用小型脊椎动物

注意: 在与鼠标一起工作时需要适当的个人防护设备 (PPE)。最低要求包括一次性工作服, 鞋套, 头罩, 口罩和手套.

  1. 根据 IACUC 协议, 每个笼子最多放置5只老鼠。按照 IACUC 协议, 安乐的小鼠有两种安乐死方法 (第二个必须是物理方法), 以确保动物死亡.
    注意: 在对 IAV 发病率和死亡率进行评估的实验中, 失去20% 的初始体重的小鼠被认为已经达到了实验终点, 并以 CO 2 进行了安乐死, 并以颈椎脱位为物理辅助方法。这一比例的体重可能是不同的其他机构。在 IAV 感染后, 小鼠肺部和鼻腔粘膜被收集的过程中, 小鼠被安乐死, 致死剂量为22、2-tribromoethanol, 并以肝静脉为物理辅助方法。在罗彻斯特大学医学院和牙科学院的动物保育设施中, 在特定的无病原体条件下购买并维持了雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠.

2。生物安全

注意: 在本报告中, 用于感染小鼠的 IAVs 是常用的流感 A/波多黎各 Rico/8/34 (PR8) 22 、 23 和温度敏感的 LAIV 变体, PR8 LAIV 8 。执行所有涉及 IAV 感染 ( 体外 或 体内 )、细胞培养和生物样本的所有过程, 在生物安全水平 (BSL) 下, 2 条件。如果使用剧毒的 IAV 菌株, 可利用其他 BSL 的套装或密闭条件.

  1. 在执行本手稿中描述的所有实验程序之前和之后, 用二氧化氯消毒剂清洁生物安全柜。对所有解剖材料 (剪刀、手术刀和解剖钳) 和 Dounce 均质机进行消毒, 然后使用适当的 IBC 建议。在适当的中型散货箱和 IACUC 准则下, 丢弃在过程中产生的所有材料.

3。鼻腔感染

  1. 将雌性6至8周的 C57BL/6 小鼠置于特定的无病原体条件下。使用病毒和剂量组织和标记鼠标笼。使用耳打码或其他批准的方法 (如画尾) 来识别每个笼子中的老鼠。每个笼子最多放置5只老鼠.
  2. 在无菌条件下准备 IAV (FFU)/鼠标) 的稀释, 总容量为30和 #181; 无菌1x 磷酸缓冲液 (PBS) 中的 L/老鼠。在冰上保持病毒接种。计算 IAV 在病毒稀释中添加的量: ((x FFU 每只老鼠/30 和 #181; L) x 最终体积)/股票病毒滴度.
  3. 按比例称量小鼠并记录每只老鼠的重量 (0 天)。在食指和拇指之间的颈背上捡起, 将鼠标置于背部位置。用小指把尾巴握在手上.
  4. 麻醉 240-250 毫克/千克的小鼠腹腔 (ip), 插入针头在右侧腹部的尾端2/3。在撤回针头之前暂停片刻。将鼠标返回到笼子, 等待5分钟.
  5. 用无菌眼膏涂抹于眼部, 防止老鼠被麻醉时干燥。检查是否被麻醉的鼠标缺乏踏板撤退反射 ( 即 , 脚趾捏)。如果老鼠没有完全麻醉, 他们会咳出病毒.
  6. 当鼠标完全麻醉时, 将鼠标置于背卧床。把含有30和 #181 的吸管尖端; 病毒接种在鼻孔里, 缓慢而不断地弹出解决方案。确保鼠标通过观察接种滴消失来吸入制剂.
  7. 检查鼠标是否呼吸, 可以降低温度和呼吸速率。把动物放回笼子里, 把它放在背卧床。监测小鼠是否有呼吸窘迫的迹象, 如果观察到, 可以通过垂直保持动物来帮助小鼠呼吸, 并诱发撞击驱动的呼吸作用 24 。监测鼠标, 直到它恢复知觉 (30-45 分钟后, 它被麻醉).

4。病毒病机的特征 ( 图 1 )

  1. 发病率和死亡率的评估 ( 图 1 和 图 2 )
    1. 感染. 3-4 组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (每组至少5只小鼠, n = 5) 具有10倍的剂量 (10, 10 2 , 10 3 和 10 4 FFU/鼠标) 的 PR8 重量, 如在3节中所述。
    2. 在接下来的14天内监测和衡量小鼠的体重, 以尽量减少由于食物摄入而造成的重量变化。安乐小鼠, 失去20% 的初始体重如1节所述.
    3. 14 天后, 安乐在1节所述的病毒感染中存活的小鼠.
    4. 计算病毒50% 鼠标致死剂量 (MLD 50 ), 根据使用芦苇和明奇的方法获得的生存数据 25 。首先, 计算比例距离 (PD):
      Equation 1
      1. 下一步, 按以下公式计算 MLD 50 : Equation 2
  2. 评估肺部和鼻腔黏膜中的病毒滴 ( 图 1 和 图2)
    1. 肺部和鼻粘膜的恢复
      1. 感染. 的雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 6) 与病毒剂量测试 10-10 4 FFU PR8 的重量, 如第3节所述。
      2. 在2天 (n = 3) 和 4 (n = 3) 中收集鼠标的肺部和鼻腔粘膜。
        1. 安乐 (500 毫克/千克) 的致命剂量 (ip) 的小鼠。将动物置于背卧床上, 用70% 乙醇消毒胸部的皮毛。用手术刀从胸骨到腹部的底部切开皮肤。用剪刀将切口底部的1厘米切到小鼠的侧部.
        2. 用剪刀切开肝静脉以出血作为继发性安乐死的方法。将动物置于腹位, 等待2分钟, 让血液排出。这一步对于减少肺部的血液是很重要的.
        3. 将小鼠的整个上部 (包括头部) 的皮肤从腹部的底部移除, 并借助解剖钳和剪刀进行第一切口。用剪刀割头, 把它放在无菌的干培养皿中.
        4. 用剪刀剪下上颌与下颌骨的接合处, 并丢弃下颌骨。用剪刀, 在颧骨的两端做两个切口, 然后把它们去掉。在解剖钳的帮助下移除眼睛.
        5. 用解剖钳握住颅骨, 用手术刀将颅骨沿矢状缝合线切开。抬起头骨的两半, 用大脑去看鼻腔粘膜。鼻粘膜周围的头骨前骨, 包括鼻, 上颌, 腭, 颧骨, 和筛骨.
        6. 使用手术刀, 用大脑切开颅骨部分, 然后丢弃。将颅骨的另一部分与鼻腔粘膜放在无菌管中。把管子放在冰上 (4 和 #176; C) 如果样品在同一天处理, 或者在干冰上, 如果样品以后被处理, 将它们快速冷冻.
        7. 为了避免样品的污染, 在每个组织之间的解剖工具和二氧化氯消毒剂之间进行清洁和消毒.
        8. 收集肺部, 将动物置于背卧床, 用剪刀切开胸膜。在胸骨两侧1厘米处切开肋骨, 打开胸腔。用剪刀把肋骨底部的切口从肋架的底座上剪下来.
        9. 在肋骨保持架的上级部分的两个切口之间用剪刀制作一个横截面, 并取出胸腔板。用钳子把肺部夹住, 在气管的末端 (在肺部前) 切开, 用剪刀把肺部放进无菌管。把管子放在冰上 (4 和 #176; C) 如果样品在同一天处理, 或者在干冰上, 如果样品以后被处理, 将它们快速冷冻.
          注: 质在采集的同一天, 将组织样品保存在-80 和 #176; C) 后进行病毒滴分析。在确定病毒滴之前, 样品不经过反复的冻融循环是很重要的。或者, 将组织样本存储在-80 和 #176; C, 直到它们被处理.
    2. 肺部和鼻腔粘膜的均匀性
        将肺部或鼻腔粘膜放入无菌 Dounce 均质机中, 并添加1毫升的冷感染介质。质的样品通过移动杵上下约1分钟室温 (RT), 直到肺部完全中断。将匀浆样品放在无菌管中, 贮存于4和 #176; c. 为每个样品使用新的 Dounce 均质机.
      1. 在 RT 上离心样品 300 x g, 5-10 分钟. 在新的无菌管中收集上清液。将上清液储存在4和 #176; C 如果在同一天进行病毒滴定并丢弃颗粒。或者, 冷冻 (-80 和 #176; C) 滴后的匀浆样品的上清液来评价病毒的后期.
    3. 病毒滴定法间接免疫荧光
      1. 前一天滴定, 种子 96-Madin-达比犬肾脏 (MDCK) 上皮细胞 (4 x 10 4 细胞/井) 达到〜 80-90% 在组织培养媒体融合。将单元格放置在37和 #176; C 孵化器与 5% CO 2 。在病毒性滴定的当天, 检查显微镜下的细胞, 在病毒感染开始前确认单层.
      2. 在96井板上的感染介质中制备1:10 稀释的匀浆样品 (肺或鼻粘膜) 的上清液。通过 triplicates 进行病毒滴定来准确测定病毒滴。
        1. 在96孔板中的每个井中添加90和 #181; L 感染介质。添加10和 #181; A1、A2 和 A3 的匀浆样品中的一个上清液, 对每一个样品的病毒滴度进行三份评价。添加10和 #181; 在 A4、A5 和 A6 中, 将匀浆样品的另一上清液升为水井。与样品的其余部分进行相同的稀释.
        2. 在将样品上清液添加到 a 排后, 使用多通道吸管移上下混合。转移10和 #181; L 从 A 排到行 b. 改变稀释之间的技巧和混合好。重复此操作, 直到到达最后一行 (H).
      3. 将组织培养介质 (步骤 4.2.3.1) 从96个井板中的 MDCK 单元中取出器多通道适配器, 然后用100和 #181 清洗两次; 1x PBS 的 L/好.
      4. 传输50和 #181; 将匀浆样品的连续稀释上清液的 L/井转至 96-MDCK 细胞的板。开始将更高的稀释 (行 H) 转移到下稀释 (行 A)。在这种情况下, 不需要更改不同行之间的提示.
      5. 在 RT 上将96个井板放在一个摇摆平台上1小时, 以允许病毒吸附。在病毒吸附后, 接种使用真空器多通道适配器, 并添加100和 #181; 感染介质的 L/井。在33和 #176 中孵育感染细胞8小时; c 或37和 #176; c 孵化器 5% CO 2 。进行固定, 染色, 成像和病毒滴度计算, 如步骤4.2.3.6 和 #8211; 4.2.3.12.
      6. 使用真空器多声道适配器从96井板中取出组织培养基。固定和 permeabilize 100 和 #181 的细胞; L/性溶液在 RT 上20分钟.
        注意: 在通风柜中使用固定/性溶液防止甲醛暴露.
      7. 使用真空器多通道适配器去除固定/性溶液, 用 1x PBS 冲洗, 并在 RT 中用阻塞溶液孵育固定电池1小时. 将单元格存储在4和 #176 的阻塞解决方案中, 或继续执行下一步.
      8. 删除阻止解决方案。增加50和 #181; 1 和 #181; HB-65 抗体稀释液中稀释的抗 NP 抗体。在37和 #176 孵育1小时; c. 不同的单克隆或 polyclon可使用 al 抗体 (pAb) anti-PR8.
      9. 同时, 在抗体稀释液中稀释1:200 荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-共轭二 anti-mouse 抗体。离心解决方案在 1700 x g 为 5-10 分钟在 RT。其他与其他荧光共轭的二次抗体可以使用.
      10. 去除主抗体, 用100和 #181 冲洗3次; 1x PBS 的 L/井。添加50和 #181; 在37和 #176 中, 二次抗体稀释和孵育 30-45 分钟的 L/井; c. 除去二次抗体, 用3和 #181 冲洗100次; 1x PBS 的 l/井。把最后一把洗的放在盘子里.
      11. 观察荧光显微镜下的细胞, 确定阳性染色 (绿色) 细胞的数量。计算的病毒滴度计数 FFU/毫升。使用公式计算 30-50 阳性染色细胞在 FFU/毫升中表达的病毒滴度: (n1 + n2 + n3)/3) x 20 x 1/稀释.

5。体液免疫应答 ( 图 3 )

  1. 感染. 3 组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 5) 与不同剂量 (10 2 , 10 3 , 和 10 4 FFU/鼠) 的 PR8 LAIV, 并模拟感染一组 (n = 5) 与1x 无菌 PBS 作为一个负控制。执行3节所述的 i. n 鼠标感染.
    1. 小鼠通过下颌下腺穿刺出血
      1. 十四天后进行免疫接种, 用4毫米的柳叶刀对小鼠下颌下腺出血进行血液收集, 或使用另一种 IACUC 批准的方法。
        1. 通过将鼠标从食指和拇指之间的颈背上捡起来抓住它。用小指把尾巴靠在手上使鼠标固定住.
        2. 将鼠标置于横向位置以查看脸颊。在与颈静脉的后眶和下颌下腺静脉接合处进行穿刺。下沉柳叶刀 (4 毫米) 和恢复血液在一个无菌管 (大约 0.2-0.4 毫升/老鼠被恢复)。用无菌餐巾纸按压穿刺几秒钟。将鼠标放回笼子.
      2. 将 1-2 小时的管子放在37和 #176; C, 然后将它们离心到 700 x g, 在 RT 中将血清与血液分离。将含有吸管的血清的上层转移到新的无菌管上。丢弃红血球颗粒 (红细胞)。将血清储存在-20 和 #176; C.
  2. 对病毒蛋白的总抗体的分析
      感染 MDCK 细胞提取物的制备
      1. 传染前的前一天, 种子一个100毫米的菜与 4-5 x 10
      1. 6 MDCK 细胞 (达到〜 80-90第二天汇合) 在组织培养培养基中。将单元格放置在37和 #176; C 孵化器与 5% CO 2 。病毒感染的当天, 检查显微镜下的细胞, 确认一单层, 然后开始病毒感染.
      2. 在4毫升的最终容量中, 在感染介质中制备一种低 (0.001) PR8 重的病毒性稀释。计算 PR8 量与公式 ((x 莫伊 x n 和 #176; 细胞) x 最终体积)/股票病毒滴度.
      3. 从 MDCK 细胞板中吸取组织培养基, 用4毫升 1x PBS 冲洗两次。添加病毒接种 (4 毫升), 并把板上的一个摇摆平台为1小时的 RT, 以允许病毒的吸附。去除病毒接种与真空, 并添加8-10 毫升的感染介质含有1和 #181; TPCK 处理的胰蛋白酶的 g/毫升。在33和 #176 中孵育感染细胞 48-72 小时; c 或37和 #176; c 孵化器与 5% CO 2 .
      4. 在细胞刮刀的帮助下分离细胞和收集细胞和组织培养基与一个吸管在一个15毫升的管。离心管在 400 x g 为 5-10 分钟在 RT. 在1毫升的帕缓冲液中吸取上清和重细胞颗粒, 并将该混合物放入1.5 毫升的无菌管中。在冰上孵育20-30 分钟.
      5. 离心管在 1300 x g 为 20-30 分钟在4和 #176; 小心, 恢复上清。将细胞提取物存储在100和 #181; 等分-20 #176; C.
      6. 滴定酶联免疫吸附试验 (ELISA) 所描述的细胞提取物, 在评估它们是否存在抗体之前 9 , 10 , 11 , 27 . 包括模拟感染的 MDCK 细胞中的细胞提取物 (如上所示) 作为阴性对照.
    2. ELISA ( 图 4 )
      1. 涂层聚苯乙烯 96-井板在 1x PBS 中适当稀释受感染的 MDCK 细胞提取物 (通常在 1:200-1:1, 000)。用同样稀释的模拟感染的 MDCK 细胞提取物作为阴性对照来涂另一盘。在4和 #176 夜间孵育 (O/N); C.
      2. 使用真空器多通道适配器卸下上清液, 用100和 #181 冲洗一次; 1x PBS 的 L/井与多通道吸管。通过在 RT 中添加100和 #181、1 h 的阻塞解决方案的 L/井来阻止非特定的绑定.
      3. 同时, 在96口板的抗体稀释液中, 在步骤5.1 中感染的每只老鼠, 制作2倍的稀释 (开始稀释 1:50) 的血清.
      4. 使用真空器多声道适配器从聚苯乙烯 96-井板上取下阻挡液。添加50和 #181; 每只老鼠血清稀释在适当的井和孵育 1 h 在37和 #176; C.
      5. 用真空器多声道适配器移除小鼠血清。使用多通道吸管用蒸馏水冲洗3次水井。添加50和 #181; anti-mouse 二级抗体共轭辣根过氧化物酶 (HRP) 稀释 1:2, 000 抗体稀释液。在37和 #176 孵育1小时; C.
      6. 卸下带有真空器多声道适配器的二次抗体。使用多通道吸管用蒸馏水冲洗3次水井。tetramethylbenzidine (TMB) 基体溶液通过混合1:1 溶液 A 和 b. 增加100和 #181; L/良好的基质和孵化 5-10 分钟在 RT 在黑暗中.
      7. 停止反应, 添加100和 #181; 0.2 N H 2 所以 4 。阅读 450 nm 在一个 ELISA 平板阅读器的板块.
      8. 减去从 MDCK 感染的 96-井板中获得的 MDCK 模拟感染的 96-井板的每个稀释值。计算每个稀释的平均值与不同的血清和代表他们在一个图表显示标准偏差 (SD).
  3. 中和抗体分析
    1. 血凝抑制 (海) 试验 ( 图 5 )
      1. 在执行海化验前, 用受体治疗小鼠血清破坏酶 (RDE) 消除血清中存在的所有非特异性抑制剂。添加1体积的小鼠血清到4卷的 RDE 工作稀释 (血清稀释现在 1:5)。孵育 O/N (12-18 h) 在37和 #176; C 水浴.
      2. 将血清样品加热56和 #176; C 为30分钟, 使 RDE 失效.
      3. 用标准 HA 测定法测定 PR8 的血凝活性 (口) 28 。一旦病毒口被确定, 稀释病毒的股票到8口每50和 #181; L 在 1x PBS.
      4. 准备2倍系列稀释 (12 稀释) 的 RDE 处理的血清在一个96井 V 底板。对每个血清样本使用一行 ( 例如 , A1 到 A12)。
        1. 添加25和 #181; 1x PBS 从 A1 到 A12 井。在一排中测试每个血清样本。添加25和 #181; RDE 处理的血清 (1:5) 到25和 #181; l 1x PBS 在专栏的第一井 (A1)。第一次血清稀释是 1:10.
        2. 一旦将所有 RDE 处理的血清添加到第一列中, ( 如 、A1、B1、C1), 使用多通道吸管将血清和 1x PBS 混合在一起移。转移25和 #181; 从第一列到第二列 ( 例如 , 从 A1 到 A2) 的稀释血清 L。更改稀释和混合的提示.
        3. 重复步骤 5.3. 1.4. 2. 直到到达最后一列 ( 例如 、A12、B12、C12)。丢弃25和 #181; l 从最后一栏, 保持音量一致的所有水井 (25 和 #181; l)。包括一排仅含25和 #181 的井; 1x PBS 没有任何血清作为阴性对照.
      5. 添加25和 #181; IAV 稀释到 8 HAU/50 和 #181; l 对每一个井与血清在96井 V 底板; 每个井的最终体积为50和 #181; l, 含有4口病毒。通过重复的移来混合内容。在 RT 上孵育1小时.
      6. 添加50和 #181; 0.5% 土耳其红细胞每口井。通过重复的移来混合内容。在冰上孵育盘子 30-45 分钟。当控制井 (1x PBS) 中的红细胞在井底形成红色沉淀 ( 即 、颗粒状) 时, 请看海法.
        注意: 还可以使用其他种类的红细胞, 如鸡肉、豚鼠或马.
      7. 计算海滴通过确定最后井, 其中红细胞形成一个红色的颗粒和血凝不发生.
        注: 这种稀释的相互价值是海滴度。相互价值乘以20的因子, 以纠正1:20 稀释的血清在第一行.
    2. 病毒 microneutralization 检测 (网络) ( 图 6 )
      1. 在网络之前的前一天, 在96个井板中准备 MDCK 单元, 以便在第二天到达80-90% 汇合处, 如步骤5.2.1.1 中所述。准备在感染介质中稀释 PR8 200 FFU/25 和 #181; L.
      2. 在56和 #176 上禁用鼠标血清; C 为1小时, 用96个井板对每只老鼠血清进行2倍的连续稀释 (12 稀释)。
        1. 在第一行的第一个井中添加40和 #181; l 血清到160和 #181; l 感染媒体 ( 例如 , A1) (血清稀释 1:5)。混合移。添加100和 #181; L 感染介质到其他水井 (A2 至 H12).
        2. 传输100和 #181; L 从第一行到第二行, 使1:2 稀释 ( 例如 , 从 A1 到 A2)。改变稀释之间的技巧和混合的移。重复此操作, 直到最后一行 ( 例如 , A12)。丢弃100和 #181; 从最后一排, 保持在所有的水井 (100 和 #181; l) 的音量一致.
      3. 添加100和 #181; IAV 稀释到所有井。在 RT 处孵育1小时。同时, 用真空器多通道适配器从96井板的 MDCK 细胞中去除组织培养培养基, 用100和 #181 冲洗两次; 1x PBS 的 L/井.
      4. 在每96个 MDCK 单元格中, 为控件保留两行。一排是负控制 (没有病毒和血清的细胞), 另一排是阳性控制感染 (细胞与病毒在没有血清或血清从模拟感染小鼠).
      5. 传输50和 #181; 从病毒抗体板到 MDCK 细胞的96井板。将平板放在 RT 平台上1小时, 以允许病毒吸附.
      6. 使用真空器多通道适配器移除病毒抗体接种, 并添加100和 #181; 含有1和 #181 的感染介质的 L/井; TPCK 处理的胰蛋白酶的 g/毫升.
      7. 在33和 #176 中孵育细胞 3-4 天; c 或37和 #176; c 孵化器与 5% CO 2 直到病变效应 (CPE) 被观察到阳性对照 (感染细胞在缺乏血清或与对照血清).
      8. 使用真空器多通道适配器移除组织培养基, 并添加100和 #181; 0.1% 结晶紫的 L/井。在 RT 处孵育1小时. 使用真空器多通道适配器去除结晶紫溶液。用蒸馏水冲洗3次水井。在 RT 上擦干盘子.
      9. 通过确定保留 MDCK 细胞的汇合细胞单层的最高稀释度来计算网络滴.
        注: 此相应稀释的倒数值是中和抗体滴度。相互价值乘以10的因子, 以纠正1:10 的稀释的血清在第一井的行.

6。保护功效疫苗的评价 ( 图 3 )

  1. 接种. 一组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 11) 与 PR8 LAIV 剂量测试 (FFU/老鼠) 和模拟接种另一组小鼠 (n = 11)有1x 无菌 PBS。执行3节中所述的鼠标. 免疫.
  2. 十四天 post-vaccination, 出血的小鼠和收集的血清, 如3节所述。分析 PR8 的总和中和抗体的存在, 如5.1.1 节所述.
  3. 十五天 post-vaccination, 测量和记录鼠标的体重 (天 0)。挑战鼠. 与致命剂量的 PR8 重量 (同源挑战) 前面所描述的3节.
  4. 测量体重和存活率 (n = 5/组) 在挑战后的14天评估的发病率和死亡率的 PR8 免疫小鼠的挑战, 接种疫苗 (第4.1 节).
  5. 恢复鼠肺和鼻腔黏膜 (n = 3/天) 在2天 4 post-challenge 与 PR8 质和分析肺部和鼻腔黏膜, 如4.2 节所述, 评估免疫小鼠的病毒复制 PR8.

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Representative Results

小鼠病毒病机的特征

IAV 的发病机制与其感染引起的发病率和死亡率有关。这两个参数可以很容易地在小鼠中进行评估: IAV 发病率与受感染小鼠的体重下降有关, 存活率的百分比将表明死亡率 (图 1)。IAV 感染小鼠的体重和生存率通常在感染8、9、10、29后每天监测至少两周。获得的生存数据可以确定使用簧片和明奇25方法计算的 MLD50 。IAV 发病机制的另一个指标是与下 (肺) 和上 (鼻黏膜) 呼吸道的病毒复制有关 (图 1)。这些器官的病毒滴度所获得的信息对应于发病率和死亡率, 并一起提供了一个很好的迹象, 病毒病机。据了解, IAV 复制在老鼠肺部峰值之间的天2和4感染 (私家侦探), 所以我们建议恢复这些器官在天2和4私家侦探

Figure 1
图 1: 小鼠 IAV 病机的特征:小鼠的 IAV 病机与其发病率 (体重下降) 和死亡率 (% 存活率) 有关, 也与 IAV 在上 (鼻黏膜) 和下 (肺) 呼吸道中复制的能力有关。简要地, 在天0小鼠称重和麻醉腹腔与 22, 2-tribromoethanol (未), 在他们被传染的鼻与 IAV 之前。从每天1天到 14, 小鼠每日体重评估体重损失 (发病率) 和% 生存率 (死亡率) 计算鼠标致死剂量 50 (MLD50)。在天2和天4感染, 老鼠肺和鼻黏膜被恢复并且均匀性评估病毒复制。小鼠实验的特点 IAV 发病机制使用 PR8 体重在 BSL-2 条件下进行。请单击此处查看此图的较大版本.

在图 2中, PR8 体重机制评估中获得的数据表示。四组6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 11) 被感染. 与指示剂量 (10, 102, 103和 104 FFU/鼠标) 的 PR8 的重量。每组5只小鼠的体重和存活率由14天的私家侦探 (图 2A-B) 进行测量。所有的小鼠免疫 104 FFU PR8 体重迅速减轻 (图 2A), 他们都死在天5和6私家侦探 (图 2B)。用 103 FFU 免疫小鼠 PR8 体重在以后的时间里丢失了身体重量 (图 2A), 并且他们全部死了由天7和8私家侦探 (图 2B)。所有的小鼠接种了 102 FFU PR8 体重减轻 (图 2A), 但其中只有2人死于9私家侦探 (图 2B)。最后, 接种了 10 FFU PR8 的小鼠并没有减轻体重 (图 2A), 并且它们都存活了感染 (图 2B)。在本实验中, 用簧片和明奇方法计算出的 PR8 MLD50 25是 1.5 x 102 FFU (图 2C)。

评估感染. 的小鼠上、下呼吸道的 PR8 复制量 (10, 102、103和 104 FFU/鼠标), 肺部和鼻腔粘膜在天2和4私家侦探 (n = 3) 中恢复。在肺均质性后, 用免疫荧光法 (图 2D) 对该器官中的病毒数量进行分析。在不同小鼠的肺中检测到的病毒滴度与用于免疫的剂量有关: 在2和4私家侦探中, 104 FFU 免疫的小鼠肺部检测出较高的病毒滴, 而低病毒滴被检测到 用 10 FFU PR8 免疫小鼠的肺。

Figure 2
图 2: 在病毒病机评估中获得的数据的表示:分析 PR8 的发病率和死亡率, 6 至8周老的雌性 C57BL/6 小鼠 (n = 5) 被感染., 其荧光形成单位 (FFU) 的数量显示为 PR8, 然后每日监测2周 (A) 体重减轻 (发病率)和 (B) 生存 (死亡率)。数据代表单个小鼠所确定结果的平均值和标准偏差 (n = 5)。(C) 2 周以上的生存率计算值用于计算 MLD50 , 使用簧片和明奇方法25。(D) 评估病毒复制, 6 至8周老的雌性 C57BL/6 小鼠 (n = 6) 被感染., 其数量为 FFU。病毒复制在肺部或鼻腔粘膜感染的小鼠通常评估在2天和4私家侦探使用 immunofocus 化验。病毒滴被记录为 FFU/毫升。数据代表每只老鼠获得的结果的手段和 SDs。虚线被包括在内, 以表明检测的限制 (200 FFU/毫升) 的化验。在 BSL-2 条件下, 利用 PR8 进行小鼠和组织培养试验, 以评估 IAV 发病率、死亡率和病毒滴。请单击此处查看此图的较大版本.

免疫接种后体液反应的评价

IAV 感染引起的体液反应对控制病毒感染起着至关重要的作用。因此, 分析 IAV 感染或新的 IAV 疫苗引起的体液反应是非常重要的 (图 3)。在免疫接种后14天的小鼠模型中, 通过 ELISA (图 4) 分析了抗体对总病毒蛋白的存在, 以及以病毒 HA 蛋白为靶的中和抗体的存在, 这通常是分析了常见的血清学方法, 如海化验 (ng 类 = "xfig" > 图 5) 和/或网络 (图 6)。

Figure 3
图 3: LAIV 的安全性、免疫原性和保护功效的不同步骤的方案:在开发新的 LAIV 时, IAV 感染的小鼠模型通常用于测试安全性、免疫原性和保护功效。在该方案中, 对候选 LAIV 的安全性 (A)、免疫原性 (B) 和保护效能 (C) 进行了实验。(a) 为了评估 LAIV 的安全性, 必须对图 1中描述的相同参数 (发病率、死亡率和病毒复制在上下呼吸道中) 进行检测。为了评估免疫原性, 小鼠免疫接种后14天, 他们被下颌下腺穿刺出血。通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和用血凝抑制试验 (海) 和/或病毒评价中和抗体的存在来分析体液反应, 以评估 IAV 蛋白的总抗体microneutralization 测定 (网络)。(C) 为了评估保护效果, 在接种疫苗15天后, 小鼠受到 IAV 的挑战. 通过对小鼠的发病率、死亡率和病毒滴的测量来评估保护功效, 如图1所述.在 BSL-2 条件下, 对 LAIV 候选者的安全性、免疫原性和保护效果进行小鼠实验。其他 BSL 的西装或遏制条件可能需要根据 IAV 应变所使用的挑战接种小鼠。请单击此处查看此图的较大版本.

评估 PR8 LAIV 的免疫原性三组6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 5) 接种了不同剂量 (102, 103, 和 104 FFU/鼠标) 的 PR8 LAIV 或模拟疫苗接种 1x PBS 作为一个负控制。接种后十四天, 小鼠血清由下颌下腺出血26 (图 3) 采集。用1:200 稀释 PR8-infected MDCK 细胞提取物 (图 4) 对总病毒蛋白的抗体反应进行了 ELISA 评价。每个血清分别进行分析。结果表明, PR8 LAIV 高剂量 (104 FFU) 免疫小鼠血清对总 PR8 蛋白的抗体滴高于接种低剂量 (102 FFU) 的小鼠血清。血清控制 (模拟感染小鼠) 没有表现出对 PR8 抗原的反应。

Figure 4
图 4: 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 的示意图表示法评估体液抗体应答:受感染小鼠的 PR8-specific 抗体水平是由酶联免疫吸附法测定的 96-好聚苯乙烯板涂层的细胞提取物从模拟 (控制) 或 PR8-infected MDCK 细胞。简单地说, 在14天的私家侦探 (图 3) 中, 用 PR8 LAIV 免疫的小鼠通过下颌下腺穿刺和血清进行了出血。每个血清通过 ELISA 对总 PR8 蛋白的 IgG 抗体单独评估。图形数据表示从单个小鼠血清 (n = 6) 获得的结果的方法和标准偏差。光学密度。ELISA 测定是在 BSL-2 的柜子里进行的。请单击此处查看此图的较大版本.

为了分析在小鼠血清中中和抗体的存在, 使用海化验, 2 倍稀释血清 (以前灭活在56° c) 每组接种不同剂量 (102, 103, 104FFU) PR8 LAIV 在 RT (图 5) 中孵育了4口 PR8 重量为1小时。然后, 0.5% 的火鸡红细胞被添加到 PR8-sera 混合物中。图 5的上部是可能的海结果的示意性表示: 当血清中含有中和抗体时, 在井底观察到红细胞沉淀, 因为与病毒 HA 蛋白结合的抗体阻止红细胞的血凝另一方面, 在缺乏中和抗体的情况下, 观察了红细胞的血凝。然后, 在最后一井缺乏血凝的情况下, 将海滴度计算为血清稀释的倒数。海的结果显示, 在图 5的下部表明, PR8 LAIV (104 FFU) 接种的小鼠的血清中和抗体的效价较高, 而从小鼠的血清免疫低剂量 (102 FFU) 对 PR8 的中和抗体的效价最低,.在血清控制 (模拟感染小鼠) 中, 没有中和抗体存在。

Figure 5
图 5: 血凝抑制 (海) 试验:通过海化验可以很容易地评价感染小鼠 PR8 的中和抗体水平。简单地说, 2 倍序列稀释 (开始稀释 1:10) 的血清从免疫小鼠的 PR8 LAIV 的指示剂量是混合 (1:1) 与4口 PR8 重量为 1 h 在 RT 在一个96井 V 底板。1 h 潜伏期后, 0.5% 红细胞被添加到病毒-血清混合物 30-60 分钟冰。海滴是确定的最后井, 其中红细胞形成一个红色按钮和血凝不发生 (顶部)。在 BSL-2 柜中进行了 PR8 重量的海化验。请单击此处查看此图的较大版本.

在图 6中, 用网络表示了在评估小鼠血清中和抗体中所获得的数据。200 FFU PR8 混合2倍稀释血清 (以前 inactivated 在56° c) 从接种了不同剂量的小鼠 (102, 103, 和 104 FFU) 的 PR8 LAIV 在 RT 的1小时。每一个血清样本进行三份评估。病毒-血清混合物被用来感染 MDCK 细胞的单分子膜在一个96井板。图 6的上部是可能的网络结果的示意性表示: 血清中和抗体的缺乏使 CPE 的结果在大约 3-4 天的私家侦探相反, 当中和抗体存在 (完整的细胞单层), 他们绑定到病毒 HA 和防止病毒感染, 并没有 CPE。CPE 的存在通常是通过染色被感染的细胞与结晶紫, 和病毒中和滴被计算为最后的稀释的倒数, 在其中完全阻断感染。网络的结果在图 6的下部表示。高剂量 PR8 LAIV (104 FFU) 免疫小鼠的血清中和抗体的效价最大, 而免疫小鼠或 PR8 LAIV (102 FFU) 的血清中和抗体的效价最低,与海化验所得的结果相似。模拟感染小鼠血清中不存在中和抗体。

Figure 6
图 6: 病毒 Microneutralization 检测 (网络):另一种方法, 网络测定可以评估 PR8 中和抗体的存在。简单地说, 接种了 PR8 LAIV 的小鼠的血清是连续2倍稀释 (开始稀释 1:5) 在 96-井板和混合1:1 与 200 FFU PR8 重量为 1 h 在 RT。1小时后, 病毒-血清混合物被用来感染96个 MDCK 细胞板。感染细胞孵育 3-4 天, 直到完全病变的效果。96井板然后被染色与0.1% 水晶紫罗兰色。网络滴是确定的最高稀释保留一个汇合的细胞单层。网络 PR8 在 BSL-2 条件下进行。请单击此处查看此图的较大版本.

小鼠 IAV 疫苗保护效果评价

当一个新的 LAIV 的开发, 它的安全性, 免疫原性和保护功效必须在体内测试, 而鼠标模型通常是第一个动物模型, 选择分析这些参数。图 3是一种在小鼠中描述新 LAIV 所需的不同步骤的方案。为了评估 LAIV 的安全性 (图 3A), 小鼠被感染. 使用类似的协议的实验过程中描述的发病机制部分 (4 节), 和体重和生存监测将提供有关信息LAIV 的发病率和死亡率 (图 2A-2B), 包括 MLD50。另外, 在接种用不同的疫苗药量时, LAIV 的复制在下 (肺) 和在上部 (鼻黏膜) 呼吸道应该被评估8,9,10, 11,29 (图 2D)。为了测试免疫原性, 接种 LAIV 疫苗的小鼠的血清在挑战前收集 PR8 (同源挑战), 使用与免疫原性部分所描述的类似的协议 (5 节) (图 3B)。血清中的总和中和抗体的存在可以通过 ELISA 和海和/或网络分别检测。

最后, 为了测试保护功效, LAIV 免疫小鼠受到 PR8 的挑战, 其保护功效的特点是监测发病率、死亡率和在肺部存在的挑战 PR8, 如上文4节所述 (图 3C)8,9,10,11。如果 LAIV 诱导保护抗 PR8 的挑战, 小鼠不会失去体重, 他们将生存的致命挑战与 IAV 重量。此外, IAV 病毒滴在肺部将不会被检测到, 或将大大减少与模拟 (PBS) 疫苗接种小鼠8,9,10,11。

组织培养介质及解决方案 组成 存储 使用 评论
组织培养介质:Dulbecco 氏改良的鹰培养基 (DMEM), 10% 胎牛血清 (FBS), 1% 青霉素-链霉素-l-谷氨酰胺 (DMEM 10% FBS 1%) 445毫升 DMEM、50毫升 FBS 和5毫升 100x 1% 青霉素 (100 单位/毫升)-链霉素 (100 µg/毫升)-l-谷氨酰胺 (2 mM) 贮存在4° c 该培养基用于维持 Madin-达比犬肾脏 (MDCK) 上皮细胞
后感染介质: DMEM 0.3% 牛白蛋白 (ba)、1% 例 (DMEM 0.3% ba 1%) 491毫升 DMEM, 4.2 毫升 35% BA 和5毫升的100x。 贮存在4° c 此介质用于在感染甲型流感病毒后维持 MDCK 细胞 (IAV)
10x 磷酸盐缓冲盐水 (10x PBS) 80克氯化钠, 2 克氯化钾, 11.5 克 Na2HPO4. 7H2O, 2 g 的下一2PO4。添加 ddH2O 最多 1 l 调整 pH 值到7。3 室温贮存 (RT) 灭菌釜
1x PBS 用 ddH2O 稀释 10x PBS 1:10 存储在 RT 灭菌釜
感染媒体: 1x pbs, 0.3% BA, 1% 青霉素-链霉素 (ps) (pbs/BA/ps) 487毫升 1x PBS 无菌, 4.2 毫升 35% BA 和5毫升 100x 1% 青霉素 (100 单位/毫升)-链霉素 (100 µg/毫升) (PS) 贮存在4° c 此介质用于 IAV 感染
固定/性溶液: 4% 甲醛, 0.5% 海卫 X-100 稀释在 1x PBS 400毫升中性缓冲福尔马林 10%, 5 毫升的海卫 X-100 和595毫升的 1x PBS
d > 存储在 RT 本解用于病毒滴定实验中的 MDCK 细胞的固定和 permeabilize 在通风柜中准备解决方案, 防止接触甲醛 阻止解决方案: 1x PBS 中的2.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 2.5 克 BSA 97.5 毫升 1x PBS 贮存在4° c 本解决方案被用作免疫荧光检测和 ELISAs 的阻断溶液。 用0.2 µm 过滤器进行过滤消毒。 抗体稀释液 (1% BSA 在 1x PBS) 1克 BSA 99 毫升 1x PBS 贮存在4° c 本解决方案用于免疫荧光分析和 ELISAs 中的主次抗体稀释 0.2 µm 过滤器过滤消毒 0.1% 水晶紫罗兰色溶液 1克结晶紫在400毫升甲醇。添加600毫升的 ddH2O 存储在 RT 本解决方案用于修复和染色 MDCK 细胞在病毒中和化验 Tosylsulfonyl phenylalanyl 氯甲基酮 (TPCK)-治疗胰蛋白酶 在 ddH2O 中准备1毫克/毫升的1,000x 库存解决方案 贮存在-20 ° c TPCK-胰蛋白酶在 IAV 感染中增加 制作100µl 等分 帕缓冲区 10毫米三氯 (pH 8.0), 1 毫米 EDTA, 1% 海卫 X-100, 0.1% 钠胆酸, 0.1% SDS, 140 毫米氯化钠 贮存在4° c 此解决方案用于制作细胞提取物

表 1: 组织培养介质和解决方案。

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Discussion

IAV 的小鼠模型广泛应用于体内的 IAV 病机、免疫原性和保护功效的研究。与其他动物模型 (如雪貂或豚鼠) 相比, 小老鼠可以使它们易于操作和储存。此外, 在动物成本、住房和生殖方面的便利使它们能够用于需要大量动物的前体免疫试验。值得注意的是, 由于小鼠已被用于多个研究学科, 一些分子和免疫学鼠试剂可以方便用于 IAV 研究。此外, 最小的寄主变异性和存在的免疫系统, 在进化上类似于目前在人类, 使他们一个强大的小动物模型的 IAV 研究。最后, 研究宿主病毒蛋白相互作用及其对病毒病机的贡献目前是可行的, 以获得高鼠。然而, 除了使用小鼠进行 IAV 研究的几个优点之外, 它们对于 IAV 传输研究是无用的。因此, 雪貂或豚鼠是更适合研究 IAV 传播的动物模型。感染 IAV 的小鼠的临床症状通常出现在 2-3 天感染, 虽然这可能会因老鼠的年龄、免疫状况、性别、遗传背景和应变而有所不同;以及使用的病毒株和剂量。症状包括厌食、嗜睡、蜷缩、毛绒、体重损失和死亡16,17。

在这篇手稿中, 我们描述了如何评估感染. 的小鼠病毒病机, 通过监测体重损失 (发病率), 生存率 (死亡率) 和评估病毒复制在上 (鼻黏膜) 和下 (肺) 的 IAV。呼吸道 (图 1和 图 2)。IAV 的发病机制是一个非常重要的参数, 不仅在新的 IAV 菌株的情况下, 而且在安全实施 LAIV 疫苗候选 (图 3)。季节性 IAVs 和 IAVs 感染其他哺乳动物 (如马、狗或猪) 通常不会在小鼠体内产生疾病症状11,27。在这种情况下, 对感染小鼠的肺部或鼻腔黏膜中病毒滴的分析是评价 IAV 菌株病毒病机的主要参数。一旦肺部和鼻腔粘膜被收集, 它们均质化, 并通过斑块法、免疫荧光法、组织培养感染剂量 50 (TCID50) 或其他经验证的方法来分析这些器官中存在的病毒的数量,8 ,29。我们建议使用间接免疫荧光法评估病毒滴, 因为斑块检测需要较高数量的 MDCK 细胞 (6-井板格式), 并且, 像 TCID50, 需要更多的时间 (3-4 天) 来计算病毒滴。然而, 要进行间接免疫荧光分析, 有必要有: 1) 抗 IAV 蛋白的初级特异抗体 (建议使用抗体对 IAV 核, NP, 因为它是最丰富的病毒蛋白产生病毒感染期间);2) 二次抗体共轭荧光;和 3) 荧光显微镜对荧光阳性感染细胞计数。

由于小鼠的免疫系统在进化上类似于人类的免疫系统16 , 而且由于小鼠可以诱发对 IAV 感染的强大和保护性体液反应, IAVs (或候选疫苗) 的免疫原性可以很容易通过测定总 (ELISA;图 4)和中和 (海,图 5) 或网络 (数字 6) 抗体应答。为了分析免疫后的体液反应, 可以采用不同的方法, 如逆行眶穿刺, 尾夹, 大隐静脉穿刺或下颌下腺穿刺。我们选择了下颌下腺穿刺技术26 , 因为该手术不需要使用麻醉, 并允许我们获得可接受的血液免疫研究量;与逆行眶穿刺相反, 在那里小鼠应麻醉, 并与尾夹或隐静脉穿刺, 在那里的血容量恢复通常是低的。

在这篇手稿中, 我们描述了如何通过 ELISA 使用病毒感染细胞提取物来评估抗体对总病毒蛋白的存在。由于 IAV 感染诱导一种保护性免疫, 主要是通过对病毒 ha (主要抗原病毒靶) 的抗体进行介导, 因此强烈建议用重组纯化 ha 对 ha 的特异抗体进行评估。蛋白质10。为了分析中和抗体的存在, 海和网络方法都接受, 但都有利弊。海是快速 (2-3 h) 并且由疾病和控制中心 (CDC) 批准评估存在 IAV 中和抗体30。网络是更费时 (3-4 天), 但更具体, 因为它只评估抗体, 可以中和病毒感染。值得注意的是, 网络已被证明可以检测到茎-反应性 HA 中和抗体31, 以及 NA 中和抗体32。网络的另一个优点是检测灵敏度, 因为相对于需要大约 104-105 FFU 的口检测, 需要较少的 IAV (200 FFU)。此外, 由于难以解释结果33、34、35, 因此, 海试检测可能会引起对禽 IAVs 的中和抗体的检出问题。此外, 网络不需要使用红细胞来鉴别流感中和抗体。

最后, 我们描述了评估在开发新的 IAV 疫苗 (图 3): 1) 安全方面必须考虑的三主要方面的实验程序: 疫苗必须是安全的, 而不是产生疾病;2) 免疫原性: 该疫苗必须免疫, 同时诱发体液和细胞保护反应;3) 保护功效: 该疫苗必须通过相应的和/或异源病毒来诱导保护免受挑战。小鼠模型是一个很好的选择, 第一次筛选新的 IAV 疫苗在体内, 因为它可以评估不同的疫苗接种计划和条件, 包括使用各种佐剂, 抗原/疫苗剂量, 管理和广泛的保护应对与同源或异源 IAVs 菌株的挑战16,17。然而, 在进行人体临床试验之前, 疫苗候选者至少应在第二个体内模型中进行测试。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

流感病毒在 LM 实验室的研究部分由纽约流感卓越中心 (NYICE) 提供, 这是 NIAID 流感研究和监测卓越中心 (CEIRS) 的成员。我们感谢温迪. 贝茨对手稿的修正表示支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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