Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

וירוסים שפעת A (IAVs) הם חשובים פתוגנים הנשימה האנושית. כדי להבין את פתוגניות של IAVs וכדי לבצע בדיקות פרה גישות חיסון הרומן, חייתיים מחקה פיזיולוגיה אנושית נדרשים. כאן, אנו מתארים שיטות להערכת iav ב פתוגנזה, התגובות ההורמונאלית, יעילות החיסון באמצעות מודל של העכבר של זיהום.

Abstract

וירוסים שפעת לגרום למותם over 500,000 ברחבי העולם1 והן משויכות תמורת עלות שנתית של 12-14 מיליארד דולר בארצות הברית לבד בהתחשב רפואי ישיר, הוצאות אשפוז, עבודה ההיעדרויות2. מודלים בעלי חיים חיוני בלימודי וירוס (iav ב) שפעת A כדי להעריך פתוגנזה ויראלי, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, תגובות מערכת החיסון, היעילות של החיסון הנוכחית ו/או רומן גישות כמו גם עלולות. עכברים הם מודל חיה קטנה יתרון כי המערכת החיסונית אבולוציונית דומה לזה נמצא אצל בני אדם, הם זמינים מספקי מסחרי כמו בנושאים זהים גנטית, ישנם זנים מרובים שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להעריך בסיס גנטי של זיהומים, הם זולים יחסית, קל לתמרן. רוצה להתרכז iav ב זיהום בבני אדם באמצעות דרכי הנשימה, עכברים הם מרדימים קודם לפני חיסון תוך-אפי עם מדבקת IAVs תחת אבטחה נאותה הבלימה. לאחר ההדבקה, בפתוגנזה של IAVs נקבע על-ידי ניטור מדי יום התחלואה (ירידה במשקל הגוף) ושיעור התמותה (הישרדות). בנוסף, ניתן להעריך פתוגנזה ויראלי גם על-ידי הערכת שכפול וירוס העליון (רירית האף) או התחתון בדרכי הנשימה (ריאות) של עכברים נגועים. התגובות ההורמונאלית על זיהום iav ב ניתן להעריך במהירות על ידי דימום לא פולשנית וזיהוי נוגדן משני מבחני שמטרתו גילוי הנוכחות של סה כ או נטרול נוגדנים. כאן, אנו מתארים את שיטות נפוצות כדי להדביק עכברים intranasally (i.n) עם iav ב ולהעריך פתוגנזה, תגובות חיסוניות ההורמונאלית והיעילות הגנה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAVs הם וירוסים מעטפת מסווג של משפחה Orthomyxoviridae 3. הם מכילים מולקולות RNA חד-גדילי שמונה עם קוטביות שלילית3. בבני אדם, IAVs לגרום מגיפות עונתיים ומגפות מזדמנים של תוצאה חשובה כאשר הרומן הנגיפים מוחדרים את האוכלוסייה האנושית4. יתר על כן, IAVs עונתית מאוד, במהירות מועברים בין בני אדם בהפקת הפסד כלכלי גבוה ברחבי העולם בכל שנה2,5. Iav ב התסמינים כוללים שיעול, גודש באף, חום, חולשה, כאב ראש, אנורקסיה, myalgia, אבל הנגיף גם להפיק מחלה חמורה יותר חולים immunocompromised6. למעשה, ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחשבת כי וירוסים שפעת עונתית לגרום 300,000-500,000 מקרי מוות ברחבי העולם בכל שנה1. ישנם רק שני סוגים של תרופות המאושרות כיום על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) עבור טיפול מונע שפעת וטיפול בבני אדם: מעכבי neuraminidase (NA) (למשל, אוסלטמיביר), חוסמי של הערוץ יון M2 (למשל, amantadine); הופעתה של וירוסים עמידים לתרופות גרסאות זאת, דאגה גוברת. החיסון, לכן, נותרת האפשרות הרפואית הטובה ביותר כדי להגן על בני אדם מפני זיהומים IAVs. עד כה, שלושה סוגים של שפעת חיסונים מורשה ע י ה-FDA לשימוש בני אדם הינם זמינים: חיסונים חלבון רקומביננטי נגיפי hemagglutinin (HA), לא פעיל שפעת חיסונים (IIV), ו- live-הקלוש שפעת חיסונים (LAIV)5, 7. שלושת החיסונים נועדו לגרום תגובה חיסונית אדפטיבית כנגד החלבון HA ויראלי, היעד העיקרי של נטרול נוגדנים נגד IAVs.

דגם העכבר המאומת לימודים iav ב זיהום ויוו

היו בשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד, בין היתר, iav ב פתוגנזה8,9,10,11, נגיפי גורמים שתורמים למחלות12 ו/או ויראלי שידור13 ,14, ולא כדי לבדוק את היעילות של חיסונים חדשים או נגיפים סמים9,10,15. עכברים (ס. מאסכאלאס). הם המודל בעלי חיים בשימוש נרחב ביותר לחקר iav ב מכמה סיבות: 1) המערכת החיסונית דומה אבולוציונית כדי להציג את זה בבני אדם; 2) בעלות נמוכה, כולל רכישה בעלי חיים, דיור, רבייה; 3) גודל קטן בקלות לתפעל ולאחסן; 4) השתנות מארח מינימלי כדי לקבל תגובות הומוגניות ותוצאות; 5) ידע רב בביולוגיה עכברים, כולל רצף הגנום; 6) רבים זמינים ביולוגיה מולקולרית ו/או אימונולוגיה ריאגנטים; 7) מדהימה זמין (KO) עכברים ללמוד את התרומה של חלבון נתון המארח על זיהום ויראלי; ו, 8) מספר זנים העכבר, שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להעריך את בסיס גנטי של זיהומים.

ישנם מספר זנים העכבר זמין כרגע לימודים iav ויוו. גיל, מצב המערכת החיסונית, סקס, זן רקע ועכבר גנטית, כמו גם מסלולים של זיהום, מינון וללחצים ויראלי להשפיע על התוצאה של זיהום iav בעכברים. זנים עכבר הנפוץ ביותר בשימוש במחקר iav ב הם C57BL/6, BALB/C ועכברים, לאחרונה, DBA.2, שכן הם רגישים יותר למחלות iav ב מאשר שני זנים לשעבר16,17,18, 19 , 20. חשוב, התגובה החיסונית גם יכולה להיות שונה בהתאם העכבר זן18,19,20. לכן, חשוב מאוד לשחזר את כל המידע זמין על העכבר על iav ב להתאמץ כדי לבחור את האפשרות הטובה ביותר עבור הניסוי אמור להתנהל.

אמנם מודל בעלי חיים של זיהום ללימודי אין ויוו עם iav ב העכבר, יש להם מספר מגבלות, אשר צריך להיחשב בעיצוב ניסיוני. למשל, מגבלה עיקרית של שימוש בעכברים ללימודי אין ויוו הוא כי IAVs לא מעבירות בין עכברים. לכן, לצורך שידור מחקרים, מקובל יותר מודלים בעלי חיים (למשל, חמוסים או שרקנים) נמצאים בשימוש16,17,21. בנוסף, ישנם מספר הבדלים בין ביטויים iav בעכברים ובבני אדם. בניגוד לבני אדם, עכברים אינם מפתחים חום על זיהום iav; לעומת זאת הם מציגים עם היפותרמיה16,17. בעכברים, שכפול iav ב מרוכז במערכת הנשימה התחתונה (הריאות) ולא דרכי הנשימה העליונות. לפיכך, התקפה אלימה של iav בעכברים הוא לא תמיד מתואם כי ראיתי אצל בני אדם. כליל, בגלל היתרונות עולים על החסרונות מוגבל, העכבר מייצג את המודל החייתי הראשון המשמשים להערכת פתוגנזה נגיפי שפעת, immunogenicity, מגן יעילות במחקרים חיסון, אנטי-ויראלי. יתר על כן, זה לא יהיה קביל מבחינה מוסרית לבצע מחקרים עם iav ב באמצעות מודלים בעלי חיים גדולים ללא ראיות קודמות במודל בעלי חיים קטנים של זיהום iav. כתב יד זה, אנו נתאר כיצד להדביק עכברים intranasally (i.n.) עם iav ב, כיצד לפקח את חומרת והתקדמות של זיהום ויראלי, כיצד לבצע את הניסויים הנדרשים כדי להעריך את תגובות מערכת החיסון ההורמונאלית והיעילות הגנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) את המוסדיים אבטחה הוועדה (IBC) באוניברסיטת רוצ'סטר לרפואה ורפואת שיניים, ועומדים עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של 22 מועצת המחקר הלאומית. המתקנים ואת התוכניות של ביבר חלוקה של מעבדה חיה לרפואה של בית הספר לרפואה, רפואת שיניים הן מוסמכות על ידי הבינלאומי AAALAC ו לציית לחוק המדינה, חוק פדרלי ומדיניות הלאומית המכונים לבריאות (NIH). דרישות דומות צריך להיות מיושם בכל מוסד לדבוק הפרוטוקולים בעלי חיים המתואר בכתב היד.

1-שימוש של חוליות חיות קטנות

הערה: נאות אישי הגנה ציוד ולהצביע נדרש לעבודה עם עכברים. דרישות המינימום כוללים הסרבל חד פעמיות, ערדליים, מצנפת הראש, המסכה וכפפות.

  1. לפי פרוטוקול IACUC, מקום מקסימלית של עכברים 5 בכל כלוב. הפרוטוקול IACUC, המתת חסד עכברים עם שתי שיטות של המתת חסד (השני חייב להיות שיטה פיזית) על מנת להבטיח כי החיה מתים.
    הערה: בניסויים ב אילו iav ב יוערכו התחלואה והתמותה, שאיבדו 20% ממשקל גופם הראשונית נחשבו הגיעו הקצה ניסיוני, ועכברים היו מורדמים עם CO 2, נקע בצוואר הרחם כמו שיטת משני הפיזי. אחוז זה של משקל הגוף עשוי להיות שונה במוסדות אחרים. בפרוצדורות בו נאספים עכברים בריאות, רירית האף לאחר ההדבקה iav ב, עכברים מורדמים עם מנה קטלנית של 2,2,2-tribromoethanol (TBE), על ידי חיתוך ולשננו את הווריד כשיטת משני הפיזי. עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה היו נרכש ומתוחזק במתקן טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר לרפואה ורפואת שיניים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.

2. אבטחה

הערה: בדו ח זה, IAVs נעשה שימוש כדי להדביק עכברים הם נפוצים הותאם עכבר מעבדה מזן שפעת H1N1 ריקו/8/34 A/Puerto (PR8 WT) 22 , 23, טמפרטורה רגיש LAIV variant, PR8 LAIV 8. ביצוע כל ההליכים המערבות iav ב זיהומים (במבחנה או vivo) תרביות תאים, דגימות ביולוגיות, בבטיחות הביולוגי הקבינט תחת רמת אבטחה (BSL)-2 תנאים. לנצל BSL חליפות או בלימה תנאים אחרים אם נעשה שימוש מאוד מידבק זנים iav ב.

  1. נקיים בארון עם חומר חיטוי כלור דיאוקסיד לפני ואחרי ביצוע כל ההליכים ניסיוני המתוארים בכתב היד אבטחה. לעקר כל החומר חיתוך (מספריים, אזמל, לנתח מלקחיים), את מהמגן דאונס לפני ואחרי השימוש שלהם בעקבות המלצות IBC נאותה. ביטול כל החומר מיוצר במהלך ההליכים תחת הנחיות IBC IACUC נאותה.

3. זיהום תוך-אפי

  1. מקום 6 ל- 8-בת נקבה C57BL/6 עכברים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. לארגן ויסמנו את העכבר כלובים עם וירוס ואת המינון בשימוש. לזהות העכברים בכלוב כל באמצעות קוד ניקוב האוזן או בשיטה שאושרו אחר כגון ציור של הזנבות. מקום מקסימלית של עכברים 5 לכל כלוב.
  2. להכין את הדילול של iav ב (פלורסנט ויוצרים יחידות (ffu ב) / עכבר) בתנאים aseptic ב הנפח הכולל של µL 30/עכבר עקר 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS). לשמור את inoculum וירוס על קרח. לחשב את כמות iav ב להוסיף דילול ויראלי עם הנוסחה: ((ffu ב X לכל עכבר/30 µL) x נפח סופי) / מלאי כייל ויראלי.
  3. שוקל העכברים עם מידה ולהקליט את המשקל של כל עכבר (יום 0). החזק את העכבר בעמדה הגבי להרים אותו יתלה בצוואר בין האגודל והאצבע. שתחזיק את הזנב נגד ביד עם אצבע הזרת.
  4. עזים ומתנגד העכבר intraperitoneally (i.p.) עם 240-250 מ"ג/ק"ג של TBE על ידי החדרת המחט סימטרית 2/3 של הצד הימני של הבטן. עצור בקצרה לפני פורש את המחט. להחזיר את העכבר על הכלוב ולהמתין 5 דק
  5. להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים למניעת יובש, בעוד העכבר הוא מורדם. בדוק אם העכבר הוא ומורדמת באמצעות חוסר רפלקס הנסיגה פדלים (קרי, קמצוץ הבוהן). אם עכברים לא מורדם לחלוטין הם תוציא את הוירוס.
  6. כאשר העכבר הוא מורדם לחלוטין, מקם את העכבר recumbency הגבי. הטיפ pipet המכיל 30 µL של inoculum וירוס הנחיר, לאט אך כל הזמן להוציא את הפתרון. להיות בטוח העכבר הוא שאיפת ההכנה על ידי התבוננות על inoculum טיפה נעלמים.
  7. בדוק כי העכבר הוא נושם כמו TBE יכול לדכא את הטמפרטורה וקצב הנשימה. להחזיר את החיה לכלוב למקם אותה ב- recumbency הגבי. לפקח על העכברים עבור סימנים של מצוקה נשימתית, אם ציין, לעזור בעכבר כדי לנשום על ידי החזקת בעלי חיים אנכית, זירוז השפעה מונעת נשימה 24. לפקח על העכבר עד זה להכרה (30-45 דקות אחרי זה היה מורדם).

4. אפיון נגיפי פתוגנזה ( איור 1)

  1. הערכה של תחלואה ותמותה ( איור 1 ואיור 2)
    1. להדביק i.n. 3-4 קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (לפחות 5 עכברים לכל קבוצה, n = 5) עם מינונים 10-fold (10, 10 2, 10 3 ו- 10 4 ffu ב/עכבר) של WT PR8 כמתואר בסעיף 3.
    2. צג ולשקול העכברים עם מידה בימים 14 בערך באותו זמן כדי למזער את משקל וריאציות בשל בליעה מזון. המתת חסד עכברים להפסיד 20% ממשקל גופם הראשונית כמתואר בסעיף 1-
    3. אחרי 14 יום, המתת חסד העכברים לשרוד זיהום ויראלי כמתואר בסעיף 1-
    4. לחשב ויראלי 50% העכבר מנה קטלנית (MLD 50) בהתבסס על הנתונים הישרדות שהושג באמצעות השיטה של ריד, Muench 25. ראשית, לחשב את המרחק פרופורציה (PD):
      Equation 1
      1. הבא, לחשב MLD 50 לפי הנוסחה הבאה:
        Equation 2
  2. הערכה של titers ויראלי בתוך הריאות ורירית האף ( איור 1, באיור 2. )
    1. השחזור של הריאות ורירית האף
      1. להדביק עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה i.n. (n = 6) עם המינון ויראלית כדי לבדוק 10-10 4 ffu של PR8 WT כמתואר בסעיף 3.
      2. לאסוף את הריאות העכבר ואת רירית האף ימים 2 (n = 3) ו-4 (n = 3).
        1. המתת חסד העכברים עם מנה קטלנית (i.p.) של TBE (500 מ ג/ק ג). למקם את החיה recumbency הגבי ולחטא את הפרווה מעל בית החזה עם 70% אתנול. לחתוך את העור עם אזמל של עצם החזה לבסיס של הבטן. לבצע קיצוצים 1 ס מ מבסיס של החתך לאזורים לרוחב של העכברים עם המספריים.
        2. לחתוך את וריד הכבד עם מספריים לדמם את העכבר כשיטת משני המתת חסד. למקם את החיה במיקום הגחון והמתן 2 דקות כדי לאפשר את הדם לנקז. השלב זה חשוב להפחית דם בריאות.
        3. להסיר את העור החלק העליון כל של העכבר (כולל הראש) לבסיס של הבטן איפה החתך הראשון בוצע בעזרת לנתח מלקחיים ומספריים. לחתוך את הראש עם המספריים ולמקם אותו בצלוחית יבשה סטרילית.
        4. לחתוך את צמתי בין הלסת העליונה את הלסת התחתונה עם המספריים ולמחוק את הלסת התחתונה. עם המספריים, להפוך את שני חתכים בקצות הקשתות העול ולהסיר אותם. להסיר את העיניים בעזרת המלקחיים ויבתר.
        5. להחזיק את הגולגולת עם המלקחיים ויבתר וחותכים את הגולגולת לאורך התפר המשונן עם אזמל. הרם את שני החצאים של הגולגולת למוח כדי לראות את רירית האף. Mucosas האף מוקפים עצמות הקדמי של הגולגולת, כולל את אפי, הלסת העליונה, גבעת הפלטין, העול, ועצמות הכברה.
        6. משתמש את האזמל, לחתוך את החלק של הגולגולת למוח ולמחוק. המקום החלק השני של הגולגולת עם רירית האף בשפופרת סטרילי. לאחסן את הצינורית על קרח (4 ° C) אם הדגימות מעובדים באותו היום, או על קרח יבש להקפיא אותם במהירות אם הדגימות יעובדו מאוחר יותר.
        7. למניעת זיהום של דגימות, לנקות ולחטא את הכלים ויבתר בין כל רקמות התאושש ובין כל דיסקציה בעלי חיים עם כלור דיאוקסיד חיטוי.
        8. כדי לאסוף את הריאות, למקם את החיה recumbency הגבי וחותכים את קרום הריאות עם המספריים. פתח את כלוב הצלעות על ידי חיתוך הצלעות-1 ס מ משני צידי החזה. להפוך את הקיצוצים מבסיס של כלוב הצלעות לחלק עליון עם המספריים.
        9. לעשות חתך עם המספריים בין שני חתכים בחלק עליון של כלוב הצלעות, הסר את לוחית החזה. להחזיק את הריאות עם המלקחיים, לחתוך בסוף קנה הנשימה (רק לפני הריאות) עם המספריים ולשים את הריאות לתוך צינור סטרילי. לאחסן את הצינורית על קרח (4 ° C) אם הדגימות מעובדים באותו היום, או על קרח יבש להקפיא אותם במהירות אם הדגימות יעובדו מאוחר יותר.
          הערה: Homogenize את דגימות רקמה באותו היום שבו הם נאספו, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לנתח titers ויראלי מאוחר יותר. חשוב כי דגימות לא לעבור הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה מחזורים לפני titers וירוס נקבעות. לחלופין, לאחסן את דגימות רקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד שהם יעובדו.
    2. המגון הריאות ורירית האף
      1. למקם את הריאות או רירית האף מהמגן דאונס סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של זיהום קר מדיה. Homogenize המדגם על-ידי הזזת איחדו את מעלה ומטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד הריאות הן משובשות לחלוטין. שים המדגם homogenized צינור סטרילי, חנות 4 ° ג שימוש מהמגן דאונס חדש עבור כל דגימה.
      2. Centrifuge הדגימות ב g x 300 למשך 5-10 דקות ב RT. לאסוף תגובת שיקוע בשפופרת סטרילית חדשה. לאחסן את תגובת שיקוע ב 4 ° C אם טיטור ויראלי מתבצע באותו יום וזורקים בגדר. לחלופין, הקפאת דגימות (-80 מעלות צלזיוס) תגובת שיקוע של homogenized כדי להעריך את נגיפי titers מאוחר יותר.
    3. וירוס טיטור מאת עקיף immunofluorescence
      1. יום לפני טיטור, זרע 96-ובכן צלחות עם תאים אפיתל מדין טומי הכלבי הכליה (MDCK) (4 x 10 4 תאים/טוב) כדי להגיע למפגש ~ 80-90% בתקשורת תרביות רקמה. מקם את התאים 37 ° C חממה עם 5% CO 2. היום של נגיפי טיטור, לבדוק את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר חד שכבתי לפני שמתחילים זיהום נגיפי.
      2. להכין 1:10 דילולים של תגובת שיקוע של הדגימות homogenized (ריאות או רירית האף) בתקשורת זיהום בצלחת 96-ובכן. לבצע טיטרציה ויראלי על ידי triplicates כדי לקבוע במדויק titers ויראלי.
        1. µL להוסיף 90 של זיהום מדיה לכל אחד מן הבארות בצלחת 96-ובכן. להוסיף 10 µL של אחד תגובת שיקוע של הדגימות homogenized בארות A1, A2, A3 כדי להעריך את כייל ויראלי של כל מדגם דולר. להוסיף 10 µL של עוד תגובת שיקוע של הדגימות homogenized בארות A4, A5, A6. לבצע הדילול באותו ברציפות עם שאר הדגימות.
        2. לאחר הוספת הדגימה supernatant row A, השתמש pipet רב-ערוצי לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר 10 µL row A שורה בי שינוי את הטיפים בין דילולים ומערבבים היטב. חזור על פעולה זו עד השורה האחרונה (H).
      3. להסיר את המדיום תרביות רקמה (שלב 4.2.3.1) באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום מתאי MDCK צלחות 96-ובכן, לשטוף פעמיים עם µL 100/טוב של PBS 1 x.
      4. תאים
      5. להעביר 50 µL/טוב של תגובת שיקוע מדולל באופן סדרתי של הדגימות homogenized לצלחת 96-ובכן עם MDCK. להתחיל העברת את דילולים גבוה יותר (שורה H) דילולים נמוכים (row A). במקרה זה, אין צורך לשנות את הטיפים בין שורות שונות.
      6. לשים את הצלחות 96-ובכן על פלטפורמה נדנדה עבור h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי. לאחר ספיחה ויראלי, להסיר את inoculum באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של מדיה לאחר הפגיעה. דגירה תאים נגועים במשך 8 שעות בחממה 33 מעלות או 37 ° C עם 5% CO 2. המשך תיקון, מכתים, הדמיה של חישוב כייל ויראלי כמתואר בצעדים 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      7. להסיר המדיום תרביות רקמה של הלוחות 96-ובכן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לתקן, permeabilize את התאים עם µL 100/טוב של קיבעון/permeabilization פתרון עבור 20 דקות ב- RT.
        התראה: שימוש הפתרון פיקסציה/permeabilization בשכונה fume כדי למנוע חשיפה פורמלדהיד.
      8. הסר את הפתרון פיקסציה/permeabilization באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום, לשטוף עם 1 x PBS, דגירה התאים קבוע עם חסימת פתרון עבור h 1 בחנות RT. התאים חסימת פתרון ב 4 ° C או להמשיך לשלב הבא.
      9. להסיר הפתרון חסימה. להוסיף µL 50/טוב של µg/mL 1 נוגדנים חד שבטיים (mAb) אנטי-NP HB-65 מדולל בפתרון דילול נוגדן. תקופת דגירה של h 1 37 ° ג. שונה mAb או polyclonניתן להשתמש באל נוגדנים (pAb) אנטי-PR8.
      10. לדלל בינתיים, 1:200 isothiocyanate fluorescein (FITC)-מצומדת נוגדן אנטי-העכבר המשני בפתרון דילול נוגדן. Centrifuge הפתרון ב g x 1,700 למשך 5-10 דקות ב- RT. נוגדנים משניים אחרים מצומדת עם אחרים fluorophores ניתן להשתמש.
      11. להסיר את הנוגדן העיקרי ולשטוף 3 פעמים עם µL 100/טוב של PBS 1 x. הוסף µL 50/טוב של דילול נוגדנים משניים, תקופת דגירה של 30-45 דקות ב 37 ° C. הסר הנוגדן משני ושטוף 3 פעמים עם µL 100/טוב של PBS 1 x. להשאיר את השטיפה האחרונה בצלחת.
      12. לבחון את התאים במיקרוסקופ זריחה כדי לקבוע את מספר התאים (ירוק) המוכתם חיובי. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים על ידי ספירת ffu ב/mL. לחשב את כייל ויראלי לידי ffu ב/mL של הדילול עם 30-50 תאים מוכתם חיובית תוך שימוש בנוסחה: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/דילול.

5. הערכה של ההורמונאלית תגובות מערכת החיסון ( איור 3)

  1. להדביק i.n. 3 קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (n = 5) במינונים שונים (10 2, 10 3 ו- 10 4 ffu ב / עכבר) של PR8 LAIV, ובהן מוק-קבוצה אחת (n = 5) עם 1 x PBS סטרילי כפקד שלילי. לבצע דלקות העכבר i.n כמתואר בסעיף 3.
    1. עכבר דימום על ידי ניקוב נקראות
      1. 14 ימים לאחר חיסון, לאסוף את הדם עכברים באמצעות submandibular דימום נולד 4 מ מ 26, או שימוש אחר IACUC אושרה בשיטה.
        1. להחזיק העכבר על-ידי הרמת אותו יתלה בצוואר בין האגודל והאצבע. שתחזיק את הזנב נגד ביד עם אצבע זרת בחולייה העכבר.
        2. לשים את העכבר במצב לרוחב כדי לראות את הלחי. להפוך הניקוב ואחריותה של הורידים רטרו-מסלולית, submandibular עם ומוחלף. כיור lancet (4 מ מ) ולשחזר את הדם בצינור סטרילי (כ 0.2 - 0.4 מ ל/עכבר התאוששו). הפעילו לחץ על הניקוב עם מפית סטרילי לכמה שניות. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.
      2. לשים את הצינורות עבור 1-2 h ב 37 מעלות צלזיוס, ואז centrifuge אותם ב 700 g x במשך 30 דקות ב- RT להפריד את הנסיוב הדם. להעביר את השכבה העליונה המורכבת הסרום עם pipet על צינור סטרילי. להתעלם בגדר של כדוריות דם אדומות (RBCs). לאחסן את הנסיוב ב-20 מעלות צלזיוס
  2. ניתוח הכולל נוגדנים נגד חלבונים ויראלי
    1. הכנת תמציות נגוע של תא MDCK
      1. יום לפני זיהום, זרע צלחת אחת 100-מ מ עם 4-5 x 10 6 תאים MDCK (כדי להגיע ~ 80-90 הנהרות % למחרת) בתקשורת תרביות רקמה. מקם את התאים 37 ° C חממה עם 5% CO 2. היום של זיהום ויראלי, לבדוק את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר חד שכבתי לפני שמתחילים זיהום נגיפי.
      2. להכין לדילול ויראלי עם ריבוי (0.001) נמוך של זיהום (MOI) של PR8 WT בתקשורת זיהום בהנפח הסופי הכולל 4 מ"ל. לחשב את כמות PR8 WT עם הנוסחה ((X MOI x n ° תאים) x נפח סופי) / מלאי כייל ויראלי.
      3. תשאף המדיום תרביות רקמה מהצלחת תא MDCK, לשטוף פעמיים עם 4 מ ל 1 x PBS. להוסיף את inoculum ויראלי (4 מ ל), לשים את הצלחת על פלטפורמה נדנדה עבור h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי. להסיר את inoculum ויראלי עם ואקום ולהוסיף 8-10 מ"ל של המדיה לאחר הפגיעה המכילה 1 µg/mL של טריפסין שטופלו TPCK. דגירה תאים נגועים במשך 48-72 h בחממה 33 מעלות או 37 ° C עם 5% CO 2.
      4. לנתק את התאים בעזרת מגרד תא ולאסוף את התאים ואת תרביות רקמה בינוני עם pipet בשפופרת 15-mL. Centrifuge את הצינור ב 400 g x 5-10 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר ריפה, מכניסים את התערובת צינור 1.5-mL סטרילי. דגירה על קרח במשך 20-30 דק...
      5. צנטריפוגה הצינור ב g 1,300 x למשך 20-30 דקות ב-4 ° C. בזהירות, לשחזר את תגובת שיקוע. חנות התא לחלץ מתוך 100 aliquots µL ב-20 מעלות צלזיוס
      6. Titrate תא תמציות כמתואר המקושר-אנזים immunosorbent assay (אליסה) לפני הערכת אותם נוכחות של נוגדנים 9 , 10 , 11 , 27. כלול תא מחלצת MDCK תאים הנגועים מעושה (להכין כמצוין לעיל) כפקד שלילי.
    2. אליסה ( איור 4)
      1. מעיל פוליסטירן 96-ובכן צלחות עם דילול המתאים של תאים נגועים-MDCK לחלץ ב- PBS 1 x (בדרך כלל בין 1:200 - 1:1, 000). המעיל עוד צלחת עם הדילול באותו נגוע ואימץ MDCK תא תמצית כפקד שלילי. דגירה לילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס
      2. להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום, לשטוף פעם עם µL 100/טוב של PBS 1 x עם pipet רב-ערוצי. לחסום מחייב שאינם ספציפיים על-ידי הוספת µL 100/טוב של חסימת פתרון עבור 1 h RT.
      3. בינתיים, להפוך 2-fold דילולים טורי (החל דילול 1:50) של sera כל עכבר נגוע בשלב 5.1 בפתרון דילול נוגדן בצלחת 96-ובכן.
      4. להסיר הפתרון החוסמים הצלחות 96-ובכן פוליסטירן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. מוסיפים 50 µL של כל עכבר בסרום הבאר המתאים, דגירה h 1-37 מעלות צלזיוס.
      5. להסיר את סרה עכברים עם מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים באמצעות של pipet רב-ערוצי. הוסף µL 50/טוב של נוגדן אנטי עכבר משני מצומדת עם חזרת Peroxidase (HRP) מדולל 1:2,000 בתמיסה דילול נוגדן. דגירה h 1 ב 37 º C
      6. להסיר את הנוגדן משני עם מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים באמצעות של pipet רב-ערוצי. להכין את הפתרון המצע tetramethylbenzidine (שוייץ) על ידי ערבוב פתרון 1:1 A ו- B. להוסיף 100 µL/טוב של סובסטרט, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב RT בחושך.
      7. לעצור את התגובה על-ידי הוספת µL 100/טוב של N H 0.2 2 אז 4. לקרוא את הצלחות ב- 450 ננומטר על צלחת חלבונים-
      8. להחסיר את הערך שהתקבל בכל דילול של MDCK נגועה ואימץ 96-ובכן צלחת מהערך שהושג בצלחת 96-ובכן נגועה MDCK. חישוב ממוצע הערכים עבור כל דילול עם sera שונים ולייצג אותם ב גרף המציג סטיות תקן (SD).
  3. ניתוח של נטרול נוגדנים
    1. Hemagglutination עיכוב (חי) assay ( איור 5)
      1. לפני ביצוע וזמינותו HAI, מתייחסים סרה את העכבר עם קולטן השמדת האנזים (RDE) כדי לחסל את כל המעכבים שאינם ספציפיים נוכח הנסיוב. להוסיף נפח 1 של העכבר סרום 4 כרכים של דילול עבודה RDE (בסרום הוא עכשיו 1:5). דגירה O/N (12- 18 h) בתוך אמבט מים 37 ° C.
      2. לחמם את הדוגמאות סרום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להשבית את RDE.
      3. לקבוע מראש את הפעילות hemagglutination (טין) של PR8 WT על ידי HA סטנדרטי assay 28. ברגע חואה ויראלי נקבעת, לדלל המניה ויראלי חואה 8 לכל µL 50 ב- PBS 1 x.
      4. להכין דילולים טורי 2-fold (12 דילולים) של sera שטופלו RDE בצלחת התחתונה V 96-ובכן. השתמש שורה אחת עבור כל דגימה סרום (למשל, A1 כדי A12).
        1. µL להוסיף 25 של 1 x PBS מ- A1 ל A12 בארות. לבדוק כל אחד הדוגמאות סרום בשורה אחת. להוסיף 25 µL של סרה שטופלו RDE (1:5) 25 µL של 1 x PBS בהבאר הראשונה של העמודה (A1). הדילול סרום הראשון הוא 1:10-
        2. לאחר כל שטופלו RDE סרה מתווספים העמודה הראשונה, (למשל, A1, B1, C1), להשתמש pipet רב-ערוצי כדי לערבב את סרה, 1 x PBS על ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר 25 µL של סרה מדולל העמודה הראשונה העמודה השניה (למשל, מ- A1 ל- A2). לשנות את הטיפים בין דילולים ומערבבים.
        3. חזור על צעדים 5.3.1.4.2. עד שהגיע העמודה האחרונה (למשל, A12, B12, C12). למחוק את µL 25 של העמודה האחרונה, שמירה על אמצעי האחסון עקבי כל הבארות (25 µL). לכלול שורה אחת של בארות המכיל רק 25 µL של PBS 1 x בלי שום סרה כפקד שלילי.
      5. µL להוסיף 25 של iav ב מדולל כדי 8 µL חואה/50 לכל אחד מן הבארות עם סרה בצלחת התחתונה V 96-ובכן; האחסון הסופי בכל טוב הוא 50 µL, המכיל 4 חואה של וירוס. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting חוזרות ונשנות. תקופת דגירה של 1 h RT.
      6. להוסיף 50 µL של 0.5% טורקיה RBCs לכל אחד מן הבארות. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting חוזרות ונשנות. דגירה את הצלחת למשך 30-45 דקות על קרח. לקרוא וזמינותו חי מבחינה ויזואלית, כאשר RBCs בבארות שליטה (1 x PBS) יוצרים המשקע האדום (קרי, גלולה) בתחתית הבארות.
        הערה: RBCs ממינים אחרים כגון עוף, חזיר או סוס יכול לשמש גם.
      7. לחשב את titers חי על ידי זיהוי האחרון טוב בו RBCs בצורת גלולה אדום, hemagglutination לא יתרחש.
        הערה: ערך הופכי של דילול זו היא כייל האי. ערך הופכי מוכפל במקדם של 20 לתיקון 1:20 דילול של הסרום בשורה הראשונה.
    2. וירוס microneutralization assay (VNA) ( איור 6)
      1. יום לפני VNA, להכין MDCK תאים בצלחת 96-ובכן להגיע למפגש 80-90% ביום המחרת כפי שמתואר בשלב 5.2.1.1. להכין לדילול PR8 WT בתקשורת זיהום יש 200 ffu ב/25 µL.
      2. Inactivate העכבר sera ב 56 ° C עבור ה 1 להפוך דילולים 2-fold טורי (דילול 12) לכל העכבר סרה triplicate באמצעות צלחת 96-ובכן. µL
        1. µL להוסיף 40 של נסיוב 160 של התקשורת הבאר הראשונה של השורה הראשונה, (למשל, A1) זיהום (סרום דילול 1:5). מערבבים על-ידי pipetting. להוסיף 100 µL של התקשורת זיהום בארות אחרים (A2 כדי H12).
        2. µL העברת 100 מהשורה הראשונה לשורה השנייה כדי להפוך דילולים 1:2 (למשל, מ- A1 ל- A2). לשנות טיפים בין דילולים מיקס על ידי pipetting. חזור על זה עד השורה האחרונה (למשל, A12). התעלם µL 100 מן השורה האחרונה, שמירה על אמצעי האחסון עקבי כל הבארות (100 µL).
      3. µL להוסיף 100 של דילול iav את כל בארות. דגירה h 1-RT. בינתיים, להסיר המדיום תרביות רקמה של תאי MDCK בצלחת 96-ובכן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולשטוף פעמיים עם µL 100/טוב של PBS 1 x.
      4. ב 96-ובכן כל צלחת של תאים MDCK, להשאיר שתי שורות עבור הפקדים. שורה אחת הוא הפקד שלילי (תאים ללא וירוס ולא סרה), השורה אחרים היא שליטה חיובית של זיהום (תאים עם וירוס בהיעדרו של sera או סרה של עכברים נגועים מעושה).
      5. להעביר 50 µL/טוב מהצלחת וירוס-נוגדן אל צלחות 96-ובכן MDCK תאים. ! תחזירו את הצלחות בפלטפורמה נדנדה h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי.
      6. להסיר את inoculum וירוס-נוגדן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של המדיה לאחר הפגיעה המכילה 1 µg/mL של טריפסין שטופלו TPCK.
      7. תקופת דגירה התאים של ~ 3-4 ימים חממה 33 ° C או 37 ° C עם 5% CO 2 עד ציטופתי (CPE) הוא ציין בפקד חיובי (תאים נגועים בהיעדרו של sera או עם פקד סרום).
      8. להסיר את המדיום תרביות רקמה באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של 0.1% קריסטל ויולט. תקופת דגירה של h 1 הסר RT. הפתרון קריסטל ויולט באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את בארות 3 פעמים עם מים מזוקקים. יבש את הצלחות ב- RT.
      9. לחשב את titers VNA על ידי זיהוי דילול הגבוהה ביותר השומרת על טפט תא confluent של תאים MDCK.
        הערה: ערך הופכי זה דילול המתאים הוא כייל נוגדנים נטרול. ערך הופכי מוכפל במקדם של 10 כדי לתקן את ה-1:10 דילול של sera הבאר הראשונה של השורה.

6. הערכה של הגנה יעילות החיסונים ( איור 3)

  1. Vaccinate i.n. קבוצה של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (n = 11) עם המינון PR8 LAIV לבדוק (ffu ב/עכבר), מוק-לחסן קבוצה נוספת של עכברים (n = 11) עם 1 x PBS סטרילי. לבצע את החיסונים i.n. העכבר תיאר כאמור בסעיף 3.
  2. 14 ימים לאחר החיסון, לדמם העכברים ולאסוף את סרה כמתואר בסעיף 3. לנתח את הנוכחות של סך ונטרול נוגדנים נגד PR8 WT כמתואר בסעיף 5.1.1.
  3. חמישה עשר ימים לאחר החיסון, למדוד ולהקליט את משקל הגוף של העכבר (יום 0). אתגר i.n. עכברים עם מנה קטלנית של WT PR8 (אתגר הומולוגיים) תיאר כאמור בסעיף 3.
  4. מודדים את משקל הגוף ואת הישרדות (n = 5 / קבוצה) במהלך 14 ימים לאחר אתגר כדי להעריך את התחלואה והתמותה המיוצר על ידי האתגר PR8 WT בעכברים שחוסנו (סעיף 4.1).
  5. לשחזר את הריאות העכבר ורירית האף (n = 3/day) ב יום שני ויום 4 פוסט-אתגר עם PR8 WT. Homogenize ולנתח את הריאות, רירית האף כמתואר בסעיף 4.2 כדי ומעריכה את שכפול ויראלי של PR8 WT בעכברים שחוסנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אפיון נגיפי פתוגנזה בעכברים

בפתוגנזה של iav ב קשורה את התחלואה ואת התמותה הנגרמת על ידי הזיהום שלה. שני פרמטרים אלה ניתן להעריך בעכברים בקלות: iav ב תחלואה קשורה עם ירידה במשקל הגוף אצל עכברים נגועים, האחוז של הישרדות יציין שעור התמותה (איור 1). משקל הגוף של הישרדות ב עכברים נגועים iav ב בדרך כלל מנוטרים מדי יום במשך לפחות שבועיים לאחר זיהום8,9,10,29. נתוני הישרדות שהושג ניתן לקבוע MLD50 זה מחושב באמצעות השיטה של ריד, Muench25. אינדיקטור נוסף של פתוגנזה iav ב קשורה שכפול ויראלי התחתון (הריאות), במערכת הנשימה העליונה (רירית האף) (איור 1). המידע הנקלט עם כייל ויראלי באיברים אלה מקביל התחלואה ואת התמותה הערכים, ונלקח ביחד מספקים אינדיקציה טובה של פתוגנזה ויראלי. זה ידוע כי שכפול iav ב העכבר בריאות שיא בין 2 ו- 4 ימים לאחר הפגיעה (פרטי), אז מומלץ מחלים את האיברים האלה-חוקר פרטי ימים 2 ו- 4

Figure 1
איור 1: אפיון iav ב פתוגנזה בעכברים: הפתוגנזה iav בעכברים קשורה שלה (ירידה במשקל הגוף) גם התמותה (% הישרדות), גם היכולת של iav ב שכפל העליונה (רירית האף), מערכת הנשימה התחתונה (הריאות). בקצרה, ביום 0 שקל, מרדימים intraperitoneally עם 2,2,2-tribromoethanol (TBE) לפני שהם נגועים intranasally עם iav ב עכברים. מיום 1 ליום 14, עכברים ששקלת יומי כדי להעריך את אובדן משקל הגוף (תחלואה) ו- % הישרדות (תמותה) כדי לחשב מנה קטלנית העכבר 50 (MLD50). ימים 2, יום 4 לאחר הפגיעה, עכברים הריאות ורירית האף התאושש, הומוגני להעריך שכפול ויראלי. עכברים ניסויים כדי לאפיין פתוגנזה iav ב באמצעות PR8 WT מבוצעות בתנאים BSL-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2, הנתונים שהתקבלו בהערכה של PR8 WT פתוגנזה מיוצג. ארבע קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת (n = 11) היו נגועים i.n. עם המנות המצוין (10, 102, 103 ו- 104 ffu ב/עכבר) של PR8 WT. משקל הגוף והישרדות של עכברים 5 לכל קבוצה נמדדו על ידי חוקר פרטי 14 ימים (איור 2AB). עכברים כל חיסון עם 104 ffu של PR8 WT איבד משקל במהירות (איור 2 א) וכל אחד מהם נפטר חוקר פרטי בימים 5 ו- 6 (איור 2B). עכברים חיסון עם משקל הגוף ffu של PR8 WT הפסיד3 10-מאוחר יותר פעמים חוקר פרטי (איור 2 א) והם כולם מת על ידי חוקר פרטי ימים 7 ו-8 (איור 2B). עכברים כל חיסון עם 102 ffu של PR8 WT איבד משקל הגוף (איור 2 א) אבל רק 2 מהם מתו-יום 9 חוקר פרטי (איור 2B). לבסוף עכברים חיסון עם 10 ffu של PR8 WT לא איבדת משקל (איור 2 א), כולן שרדו זיהום (איור 2B). MLD50 PR8 WT בניסוי זה מחושב עם ריד, Muench השיטה25 היה 1.5 x 102 ffu ב (איור 2C).

כדי להעריך את שכפול PR8 העליונה ולהוריד נשימתית בדרכי של עכברים נגועים i.n. עם המנות המצוין (10, 102, 103ו- 104 ffu ב/עכבר), בריאות, רירית האף ששוחזרו על חוקר פרטי ימים 2 ו- 4 (n = 3). לאחר המגון ריאות, כמות הנגיפים המצויה באיבר זה נותחה על ידי immunofluorescence assay (איור דו-ממדי). כייל ויראלי זוהה הריאות של קבוצות עכברים שונים היה קשור עם המינון המשמש כדי לחסן את אותם: titers נגיפי גבוה יותר אותרו בריאות של עכברים חיסון עם 104 ffu של PR8 WT ב ימים 2 ו- 4 עבודות שירות, בעוד titers נגיפי נמוך יותר אותרו הריאות של עכברים חיסון עם ffu ב 10 של PR8 WT.

Figure 2
איור 2: ייצוג של הנתונים שהתקבלו בהערכה של נגיפי פתוגנזה: כדי לנתח את התחלואה והתמותה של PR8 WT, עכברים C57BL/6 נקבות 6 ל- 8-בת (n = 5) היו נגועים i.n. עם המספר המצוין של יוצרי פלורסנט יחידות (ffu ב) של PR8 WT ולאחר מכן תחת פיקוח יומיומי עבור 2 שבועות עבור אובדן משקל הגוף (A) (תחלואה) (B) הישרדות (תמותה). נתונים מייצגים את האמצעים ואת סטיות תקן של תוצאות שנקבע עכברים בודדים (n = 5). (ג) ערכי ההישרדות % העריכו מעל שבועיים משמשים לחישוב MLD50 באמצעות ה ריד, Muench השיטה25. (ד) כדי להעריך את שכפול ויראלי, עכברים C57BL/6 נקבות 6 ל- 8-בת (n = 6) היו נגועים i.n. עם המספר המצוין של ffu ב. שכפול ויראלי ריאות או רירית האף של עכברים נגועים בדרך כלל מוערך ב ימים 2 ו- 4 בלש פרטי שימוש assay immunofocus. Titers ויראלי נרשמים כמו ffu ב/mL. נתונים מייצגים את האמצעים ואת מרחביות של התוצאות המתקבלות בכל עכבר. קווים מקווקווים כלולים כדי לציין את הגבול של זיהוי (ffu ב 200/mL) וזמינותו. עכברים וניסויים תרביות רקמה כדי להעריך iav ב תחלואה, תמותה, נגיפי titers באמצעות PR8 בוצעו בתנאים BSL-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הערכת התגובות ההורמונאלית המושרה לאחר החיסון

התגובות ההורמונאלית המושרה נגד זיהום iav ב תפקיד חיוני בשליטה על זיהום ויראלי. מסיבה זו, חשוב מאוד לנתח את התגובות ההורמונאלית elicited iav ב WT זיהומים או על ידי חיסונים iav ב חדשים (איור 3). במודל עכבר, 14 ימים לאחר חיסון, עכברים הם בלד לנתח הנוכחות של נוגדנים נגד חלבונים ויראלי הכולל מאת אליסה (איור 4), ואת נוכחותם של נוגדנים מיקוד החלבון HA ויראלי, אשר בדרך כלל לנטרל נותחו על ידי גישות serologic נפוצים, כגון (assay חיng class = "xfig" > איור 5) ו/או של VNA (איור 6).

Figure 3
איור 3: ערכה של השלבים השונים של האפיון של בטיחות, Immunogenicity, הגנה על יעילותם של LAIV: כאשר LAIV החדש פיתוח, המודל העכבר לזיהום iav ב משמש בדרך כלל כדי לבדוק את יעילות ובטיחות, immunogenicity הגנה. בערכה זו, הניסויים כדי להעריך את הבטיחות (A), immunogenicity (B), הגנה על יעילותם (C) של מועמד LAIV מצוינים. (א) כדי להעריך את הבטיחות של LAIV יש צורך assay באותם הפרמטרים (תחלואה, תמותה, שכפול ויראלי העליונה ודרכי הנשימה התחתונה) המתואר באיור1. כדי להעריך את immunogenicity, עכברים לחסן, 14 ימים לאחר החיסון שדיממו על ידי ניקוב נקראות. התגובות ההורמונאלית מנותחים על-ידי הערכת סה כ נוגדנים כנגד חלבוני iav ב מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) ועל ידי הערכת הנוכחות של נטרול נוגדנים hemagglutination עיכוב assay (חי) ו/או וירוס microneutralization assay (VNA). (ג) כדי להעריך את יעילות הגנה, 15 ימים לאחר החיסון, עכברים מאותגרים iav ב WT. הגנה יעילות מחושבת על ידי המדידה של עכברים תחלואה, תמותה, titers ויראלי של הריאות של עכברים מאותגר כמתואר באיור 1 . עכברים ניסויים כדי לאפיין את היעילות בטיחות, immunogenicity והגנה של מועמד LAIV מבוצעות בתנאים BSL-2. חליפות BSL או בלימה תנאים אחרים עשוי להידרש בהתאם המתח iav ב המשמש את האתגר של עכברים שחוסנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי להעריך את immunogenicity של PR8 LAIV, שלוש קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת (n = 5) היו לחסן במינונים שונים (102, 103ו- 104 ffu ב/עכבר) של PR8 LAIV או מעושה שחוסנו 1 x PBS כפקד שלילי. ארבעה עשר ימים לאחר החיסון, עכברים סרה נאספו על ידי דימום submandibular26 (איור 3). תגובות נוגדנים נגד חלבונים ויראלי הכולל הוערכו על ידי אליסה באמצעות לדילול 1:200 תא תמצית של תאים נגועים PR8 MDCK (איור 4). סרום כל היה ניתח באופן אינדיבידואלי. התוצאות מצביעות על sera של עכברים חיסון עם המינון גבוה יותר (104 ffu ב) PR8 LAIV הייתה גבוהה יותר titers נוגדנים נגד חלבונים PR8 הכולל יותר sera של עכברים חיסון עם מינון נמוך יותר (102 ffu ב). סרה שליטה (עכברים נגועים מעושה) לא הראה תגובתיות נגד אנטיגנים PR8.

Figure 4
איור 4: ייצוג סכמטי של וזמינותו Immunosorbent מקושרים-אנזים (אליסה) כדי להעריך את הנוגדן ההורמונאלית תגובות: רמות נוגדנים ספציפיים PR8 נוכח עכברים נגועים נקבעים על-ידי אליסה ב 96-ובכן פוליסטירן צלחות מצופה תא תמציות מעושה (בקרה) או תאים נגועים PR8 MDCK. בקצרה, 14 ימי עבודות שירות (איור 3), עכברים חיסון עם המנות המצוין של PR8 LAIV היו דימם על ידי ניקוב submandibular, סרה שנאספו. סרום כל הוערך בנפרד על ידי אליסה עבור נוגדנים IgG נגד חלבונים PR8 הכולל. נתוני תרשים מייצג את האמצעים ואת סטיות תקן של התוצאות המתקבל עכברים בודדים סרה (n = 6). . וייפר, צפיפות אופטית. אליסה מבחני בוצעו בארון BSL-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי לנתח את הנוכחות של נטרול נוגדנים העכבר בנסיוב באמצעות חי את assay, טורי דילולים 2-fold של סרה (בעבר לא פעיל ב 56 ° C) של כל קבוצה של עכברים לחסן במינונים שונים (102, 103ו- 104 Ffu ב) של PR8 LAIV היו מודגרות עם 4 חואה של WT PR8 עבור h 1 RT (איור 5). לאחר מכן, 0.5% של טורקיה RBCs נוספו את תערובות PR8-סרה. החלק העליון של איור 5 היא ייצוג סכמטי של התוצאות חי: הסרום מכיל נוגדנים נטרול, נצפית RBCs משקעים בתחתית הבאר, בגלל הנוגדנים חייבים החלבון HA ויראלי למנוע hemagglutination של RBCs. מצד שני, בהיעדר נטרול נוגדנים, hemagglutination של RBCs הוא ציין. לאחר מכן, כייל האי מחושבת על הדדיים של הדילול של סרום ב hemagglutination טוב חסר אתמול. התוצאות חי הראו את החלק התחתון של איור 5 מצביעות על הסרום של העכבר חיסון עם הכמות הגדולה ביותר של PR8 LAIV (104 ffu ב) יש את כייל נוגדנים גבוה יותר של נטרול נוגדנים בזמן לחסן הסרום של עכבר עם מינון נמוך (102 ffu ב) יש את כייל הנמוך של נטרול נוגדנים נגד PR8. אין נוגדנים נטרול נכחו בשליטה סרום (עכברים נגועים מעושה).

Figure 5
איור 5: Assay עיכוב (חי) Hemagglutination: רמות של נטרול נוגדנים נגד PR8 WT עכברים נגועים ניתן להעריך בקלות על ידי חי וזמינותו. בקצרה, 2-fold טורי דילולים (החל דילול 1:10) של sera של עכברים חיסון עם המנות המצוין של PR8 LAIV היו מעורבים (1:1) עם 4 חואה של WT PR8 עבור h 1 ב RT בצלחת התחתונה V 96-ובכן. לאחר דגירה 1 h, 0.5% RBCs נוספו את תערובות וירוס-סרום 30-60 דקות על קרח. Titers חי נקבעים על-ידי זיהוי האחרון טוב בו RBCs בצורת כפתור אדום, hemagglutination אינו מתרחש (למעלה). מבחני חי עם PR8 WT בוצעו בארון BSL-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6, הנתונים שבידי בהערכה של נטרול נוגדנים ב העכבר סרה VNA מיוצג. Ffu ב 200 של PR8 WT מעורבבים עם טורי דילולים 2-fold של סרה (בעבר inactivatאד ב 56 ° C) מעכברים לחסן במינונים שונים (102, 103ו- 104 ffu ב) של PR8 LAIV עבור h 1-RT. כל מדגם סרום הוערכה דולר. תערובות וירוס-סרה שימשו כדי להדביק את monolayers של תאים MDCK בצלחת 96-ובכן. החלק העליון של איור 6 היא ייצוג סכמטי של התוצאות VNA: היעדר נטרול נוגדנים בתוצאות סרום ב- CPE-כ 3-4 ימים חוקר פרטי לעומת זאת, כאשר נוגדנים נטרול נוכחים (חד שכבתי תא שלם), הם לאגד HA ויראלי ולמנוע זיהום נגיפי, ויש אין CPE. נוכחות של CPE הוא מדמיין בדרך כלל על ידי צביעת תאים נגועים עם קריסטל ויולט, ניטרול נגיפי titers מחושבים על הדדיים של דילול האחרון שבו זיהום חסומה לגמרי. תוצאות VNA מיוצגים בחלק התחתון של איור 6. הסרום של עכברים חיסון עם כמות גבוהה של PR8 LAIV (104 ffu ב) יש את כייל הגדול ביותר של נטרול נוגדנים תוך סרה של עכברים חיסון עם מינון נמוך יותר או PR8 LAIV (102 ffu ב) יש את כייל הנמוך של נטרול נוגדנים, דומה התוצאות המתקבלות עם חי וזמינותו. אין נוגדנים נטרול היו קיימות בהסרום של עכברים נגועים מעושה.

Figure 6
איור 6: וירוס Microneutralization Assay (VNA): אלטרנטיבה וזמינותו HAI, וזמינותו VNA ניתן להעריך את הנוכחות של WT PR8 בנטרול נוגדנים. בקצרה, סרה של עכברים שחוסנו המנות המצוין של PR8 LAIV היו 2-fold באופן סדרתי מדולל (דילול התחלה 1:5) ב 96-ובכן צלחות, מעורב 1:1 עם ffu ב 200 של WT PR8 עבור h 1-RT. לאחר 1 h, שימשו את תערובות וירוס-סרום להדביק לוחות 96-ובכן של תאים MDCK. תאים נגועים היו הדגירה במשך 3-4 ימים עד ציטופתי מלאה. הלוחות 96-ובכן, היו אז מוכתמים 0.1% קריסטל ויולט. VNA titers נקבעים על-ידי זיהוי דילול הגבוהה ביותר לשמירה על טפט תא confluent. VNA עם PR8 WT בוצעו בתנאים BSL-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הערכת יעילות הגנה של חיסונים iav בעכברים

כאשר LAIV החדש פיתוח, יעילותה בטיחות, immunogenicity והגנה בטח שנבדקו אין ויוו, המודל העכבר הוא בדרך כלל המודל החייתי הראשון נבחר כדי לנתח את הפרמטרים האלה. איור 3 היא ערכה של השלבים השונים הדרושים לאפיון של LAIV חדש בעכברים. כדי להעריך את הבטיחות של LAIV (איור 3 א), עכברים נגועים i.n. באמצעות פרוטוקול דומה להליכים ניסיוני המתוארות בסעיף פתוגנזה (סעיף 4), משקל הגוף וניטור הישרדות יספק מידע הקשור התחלואה והתמותה של LAIV (דמויות 2A2B), לרבות MLD50. בנוסף, על חיסון עם מנות חיסון שונים, השכפול של LAIV התחתונה (הריאות), במערכת הנשימה העליונה (רירית האף) צריך להיות המוערך8,9,10, 11,29 (איור דו-ממדי). כדי לבדוק immunogenicity, נאספים סרה של עכברים שחוסנו את LAIV לפני אתגר עם PR8 WT (אתגר הומולוגיים), שימוש דומה פרוטוקולים מהמתואר בסעיף immunogenicity (סעיף 5) (איור 3B). הנוכחות של נוגדנים ב סרה סך ונטרול יכול יזוהו על-ידי אליסה חי ו/או VNA, בהתאמה.

לבסוף, כדי לבדוק את יעילות הגנה, מאותגרים LAIV חוסנו עכברים עם PR8 WT, יעילות הגנה מאופיין על ידי ניטור תחלואה, תמותה, הנוכחות של אתגר PR8 WT בריאות, כפי שתואר בסעיף 4 ( איור 3C)8,9,10,11. אם LAIV מעניקה הגנה מפני PR8 WT אתגר, עכברים לא תאבד משקל הגוף, שהם ישרדו את האתגר קטלני עם iav ב WT. יתר על כן, לא יזוהו titers ויראלי iav ב WT של הריאות או יקטן באופן משמעותי בהשוואה מעושה (PBS) חוסנו עכברים8,9,10,11.

תרביות רקמה מדיה ופתרונות קומפוזיציה אחסון שימוש הערות
מדיה תרביות רקמה: Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (DMEM), 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-L-גלוטמין (פריז סן ז'רמן) (DMEM 10% FBS 1% פריז סן ז'רמן) 445 מ ל DMEM, 50 מ של FBS, 5 מ של 100 x 1% פניצילין (100 יחידות/ml)-סטרפטומיצין (100 µg/ml) - L - גלוטמין (2 מ מ) (פריז סן ז'רמן) חנות ב 4° C מדיה זו משמשת לצורך תחזוקה של תאי אפיתל כנגד מדין טומי הכלבי הכליה (MDCK)
לאחר הפגיעה מדיה: DMEM 0.3% שור אלבומין (BA), 1% פריז סן ז'רמן (DMEM 0.3% 1% BA פריז סן ז'רמן) 491 ml DMEM, 4.2 מ של 35% BA ו- 5 מ של 100 x PSG חנות ב 4° C מדיה זו משמשת לצורך תחזוקה של תאים MDCK לאחר ההדבקה בנגיף שפעת A (iav)
10 x buffered פוספט תמיסת מלח (10 x PBS) 80 גרם NaCl, דור 2 של אשלגן כלורי, 11.5 גר' נה2HPO4.7H2O, דור 2 ח'2PO4. להוסיף ddH2O עד 1 ל' התאם pH 7.3 לשמור בטמפרטורת החדר (RT) לחטא על ידי תא לחץ
1 x PBS לדלל 1:10 עם ddH2O 10 x PBS החנות RT לחטא על ידי תא לחץ
זיהום מדיה: 1 x PBS, 0.3% BA, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS) (PBS/BA/PS) 487 מ ל 1 x PBS סטרילי, 4.2 מ של 35% BA ו- 5 מ של 100 x 1% פניצילין (100 יחידות/ml)-סטרפטומיצין (100 µg/ml) (PS) חנות ב 4 ° C מדיה זו משמשת עבור זיהומים iav
פתרון פיקסציה/permeabilization: 4% פורמלדהיד, 0.5% טריטון X-100 מדולל ב- PBS 1 x 400 מ ל נייטרלי Buffered פורמלין 10%, 5 מ של טריטון X-100, 595 מ ל 1 x PBS
d > בחנות RT פתרון זה משמש כדי לתקן את permeabilize MDCK תאים בניסויים טיטור ויראלי להכין את הפתרון בשכונה fume כדי למנוע חשיפה פורמלדהיד חסימת פתרון: 2.5% שור אלבומין (BSA) ב- PBS 1 x 2.5 g של BSA ב- mL 97.5 ל- PBS 1 x חנות ב 4 ° C פתרון זה משמש כפתרון חסימה עבור מבחני immunofluorescence ו- ELISAs. לחטא על-ידי סינון במסנן 0.2 µm. נוגדן דילול פתרון (BSA 1% ב- PBS 1 x) 1g של BSA ב 99 מ ל 1 x PBS חנות ב 4 ° C פתרון זה משמש הדילול של נוגדנים והמשניים מבחני immunofluorescence ו ELISAs לחטא על-ידי סינון במסנן 0.2 µm 0.1 הפתרון קריסטל ויולט % 1 גרם קריסטל ויולט ב- 400 מ של מתנול. להוסיף 600 מ של ddH2O החנות RT פתרון זה משמש כדי לתקן, כתם MDCK בתאים מבחני ניטרול ויראלי Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl קטון (TPCK)-מטופלים טריפסין להכין פתרון מניות 1,000 x-1 מ"ג/מ"ל ב- ddH2O חנות ב-20 ° C TPCK-טריפסין מתווסף iav ב זיהומים להפוך 100 µl aliquots מאגר ריפה 10 מ מ (pH 8.0), Cl-טריס 1 מ"מ EDTA, 1% X-100 טריטון, 0.1% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות, 140 מ מ NaCl חנות ב 4 ° C פתרון זה משמש כדי להפוך את התא תמציות

טבלה 1: מדיה תרביות רקמה ופתרונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העכבר בדגם iav ב נעשה שימוש נרחב ללימודי אין ויוו של יעילות iav ב פתוגנזה, immunogenicity והגנה. גודל קטן של עכברים גורם להם קל לתמרן ולאחסן לעומת דגמים בעלי חיים אחרים כגון חמוסים או שרקנים. יתר על כן, הקלות במונחים של בעל החיים עולה, דיור ורביה לאפשר את השימוש בהם בבדיקות החיסון קליניים בהם נדרשים מספר רב של בעלי חיים. ראוי לציין, מאז עכברים שימשו מחקר מרובים ממשמעת, מספר מולקולרית, אימונולוגיה ריאגנטים מאתר הינם זמינים להקל על השימוש שלהם ללימודי iav. יתר על כן, ההשתנות מינימלי מארח ואת נוכחותם של מערכת חיסונית אבולוציונית דומה לזה נוכח בני אנוש עושים אותם חזקים מודל בעלי חיים קטנים ללימודי iav ב. לבסוף, חקר אינטראקציות חלבון מארח-נגיפים ותרומתם פתוגנזה ויראלי ניתנים לביצוע כעת על-ידי הגישה אל KO עכברים. עם זאת, לצד מספר יתרונות שימוש בעכברים ללימודי iav ב, הם אינם שימושיים ללימודי iav ב שידור. לכן, חמוסים או שרקנים הם מודלים בעלי חיים מתאים יותר ללמוד iav ב שידור. סימפטומים קליניים אצל עכברים נגועים iav ב בדרך כלל מופיעים 2-3 ימים לאחר הפגיעה, למרות זו עשויה להשתנות בהתאם העכבר גיל, מצב המערכת החיסונית, סקס, הרקע הגנטי זן; כמו גם עומס נגיפי והמנה בשימוש. התסמינים כוללים אנורקסיה, עייפות, המלטה, רפלד פרווה, אובדן של הגוף משקל ומוות16,17.

כתב יד זה, אנו נתאר כיצד להעריך מחלה נגיפית עכברים נגועים i.n. עם iav על-ידי ניטור ירידה במשקל הגוף (תחלואה), אחוז ההישרדות (תמותה) ועל -ידי הערכת שכפול ויראלי העליונה (רירית האף) ולהוריד (הריאות) מערכת הנשימה (איור 1 , איור 2). בפתוגנזה של iav ב הוא פרמטר חשוב מאוד לא רק בהקשר של זנים חדשים iav ב, אלא גם במימוש בטוחה LAIV חיסון מועמדים (איור 3). עונתי IAVs ו IAVs להדביק יונקים אחרים (כמו סוסים, כלבים או חזירים) בדרך כלל אינם מייצרים סימנים של מחלת עכברים11,27. במקרה זה, הניתוח של titers ויראלי בתוך הריאות או רירית האף של עכברים נגועים הוא הפרמטר העיקרי כדי להעריך את נגיפי בפתוגנזה של זנים iav. ברגע בריאות, רירית האף נאספים, הם נמצאים הומוגני, ניתן לנתח את כמות הנגיפים המצויה באיברים אלה על-ידי פלאק assay, immunofluorescence assay, תרביות רקמה זיהומיות במינון 50 (TCID50) או בשיטה אחרת המאומת8 ,29. אנו ממליצים על הערכת titers ויראלי באמצעות עקיפה immunofluorescence כיוון וזמינותו פלאק דורש כמות גבוהה של תאים MDCK (6-ובכן צלחת תבנית), כמו TCID50, נדרש זמן רב יותר (3-4 ימים) לחישוב titers ויראלי. עם זאת, כדי לבצע את הבדיקה immunofluorescence עקיף, זה חייב להיות: 1) ראשי נוגדנים ספציפיים נגד חלבון iav ב (מומלץ להשתמש נוגדן נגד נוקלאופרוטאין iav ב, NP, שכן הוא חלבון נגיפי הנפוץ ביותר המיוצר במהלך זיהום ויראלי); 2) נוגדנים משני מצומדת fluorophore; ו 3) מיקרוסקופ פלורסצנטיות לספור פלואורסצנט תאים נגועים חיובי.

מאז המערכת החיסונית של עכברים אבולוציונית הדומה למערכת החיסון של בני16 , כי עכברים יכולים להפיק תגובה הומוראלית חזק ומגן מפני זיהום iav ב, immunogenicity של IAVs (או חיסון מועמדים) יכול להיות בקלות הערכה על ידי קביעת סה כ (אליסה; איור 4) נטרול (HAI, איור 5) או תגובות נוגדנים VNA (6 ספרות). כדי לנתח את התגובות ההורמונאלית לאחר חיסון, עכברים יכול לדמם על ידי שיטות שאושרו שונות כגון ניקוב רטרו-מסלולית, קליפ הזנב, וריד saphenous לנקב או ניקוב submandibular בחרנו טכניקה לנקב submandibular26 כי ההליך אינו דורש השימוש בהרדמה, ומאפשר לנו להשיג אמצעי מקובל של דם ללימודי אימונולוגי; בניגוד הניקוב רטרו-מסלולית, שם צריך להיות מורדם עכברים, עם הזנב הסרטון או וריד saphenous לנקב, איפה האחסון דם משוחזרים בדרך כלל הוא נמוך.

כתב יד זה, אנחנו תיאר כיצד להעריך הנוכחות של נוגדנים נגד חלבונים ויראלי הכולל מאת אליסה באמצעות תמציות תא וירוס נגוע. מאז iav ב זיהום מעוררת חיסון המגן מתווך, בעיקר, על ידי נוגדנים נגד HA ויראלי (antigenic ויראלי המטרה העיקרית), מומלץ להעריך את כמות נוגדנים ספציפיים נגד HA שנגזרות אליסה באמצעות recombinant HA מטוהרים חלבונים10. כדי לנתח את הנוכחות של נטרול נוגדנים, יתקבלו גם חי וגם VNA שיטות אבל לשניהם יש יתרונות וחסרונות. האי הינו מהיר (2-3 h) ואושרו על-ידי מרכז הבקרה (CDC) ומחלת להעריך המצאות iav ב נטרול נוגדנים30. VNA יותר זמן רב (3-4 ימים) אבל הוא ספציפי יותר שכן הוא מוערך רק נוגדנים אשר ניתן לנטרל זיהום ויראלי. ראוי לציין, VNA הוכח כדי לזהות HA גבעול-תגובתי נטרול נוגדנים31, וכן NA נטרול נוגדנים32. יתרון נוסף של VNA הוא רגישות assay, מאז פחות iav ב (200 ffu ב) יש צורך לעומת וזמינותו חואה הדורשת כ ~ 104-105 ffu ב. יתר על כן, וזמינותו חי יכול להיות בעייתי עבור גילוי נטרול נוגדנים נגד IAVs העופות בשל קושי עם פענוח תוצאות33,34,35. בנוסף, VNA אינו דורש שימוש RBCs לצורך זיהוי שפעת נטרול נוגדנים.

לבסוף, אנו מתארים את ההליכים ניסיוני כדי להעריך את שלושת האספקטים העיקריים שיש לקחת בחשבון בעת פיתוח חיסונים iav ב חדשים (איור 3): 1) בטיחות: החיסון חייבת להיות מחלת כספת, לא לייצר; 2) immunogenicity: החיסון חייב להיות immunogenic, זירוז תגובות הגנה ההורמונאלית והן הסלולר; 3) הגנה יעילות: החיסון חייב לגרום הגנה מפני אתגר עם וירוסים WT הומולוגית ו/או heterologous. המודל העכבר הוא בחירה טובה עבור הראשון הקרנת הסרט iav ב החיסון החדש ויוו כי הוא יכול להעריך ערכות חיסון מגוונים, תנאים, לרבות שימוש adjuvants שונים, אנטיגן/חיסון מנה, ניהול והגנה רחבה נגד אתגר עם הומולוגיים או heterologous IAVs זנים16,17. עם זאת, לפני שתמשיך כדי ניסויים קליניים בבני, חיסון מועמדים לכל הפחות לבדוק מודל ויוו נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר על וירוס שפעת במעבדה LM-S יסובסד בחלקו על ידי ה ניו יורק שפעת מרכז התמחות (NYICE), חבר של NIAID מרכזי מצוינות עבור שפעת מחקר, מעקב (CEIRS). אנו מודים וונדי בייטס על שאתמוך בה התיקונים של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23, (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430, (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18, (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9, (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356, (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500, (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252, (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83, (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199, (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3, (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85, (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22, (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4, (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9, (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76, (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37, (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70, (3), 391-398 (2003).
מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter