Summary
تحليل استنساخ الفسيفساء في ذبابة الفاكهة تخيلي القرص ظهارة هو نظام نموذج قوي لدراسة الآليات الوراثية والخلوية من تكون الأورام. نحن هنا وصف بروتوكول للحث على الأورام في أقراص ذبابة الجناح ذبابة الفاكهة باستخدام نظام GAL4-واس، وإدخال طريقة التشخيص لتصنيف المظاهر الورمية.
Abstract
في المراحل المبكرة من السرطان، والخلايا المتحولة تتحول تظهر تشوهات الخلوية، وتبدأ فرط غير المنضبط، وتعطيل تدريجيا تنظيم الأنسجة. وقد ظهرت ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر كنظام نموذج تجريبي شعبية في علم الأحياء السرطان لدراسة الآليات الوراثية والخلوية لتوليد الأورام. على وجه الخصوص، وأدوات وراثية للأقراص تمايل ذبابة الفاكهة (تطوير الظهارة في اليرقات) تمكن من إنشاء خلايا الموالية للورم تتحول داخل الأنسجة الظهارية العادية، وهو وضع مماثل للمراحل الأولية لسرطان الإنسان. وأظهرت دراسة حديثة عن تكوين الأورام في أقراص تخيل الجناح ذبابة الفاكهة ، أن بدء الورم يعتمد على الهندسة المعمارية الخلوية الأنسجة الداخلية والمكروية المحلية، مما يشير إلى أنه من المهم النظر في قابلية المنطقة محددة لمؤثرات الأورام في تقييم المظاهر الورمية في خيال أقراص. لتسهيل التحليل المظهري من التقدم الورمعلى أقراص تخيلي، هنا نحن تصف بروتوكول للتجارب الوراثية باستخدام نظام GAL4-واس للحث على الأورام الورم في أقراص تخيل الجناح. نحن أيضا إدخال طريقة التشخيص لتصنيف المظاهر من الآفات النسلي الناجم عن ظهارة ظهارية، كما لم يتم وصفها طريقة تصنيف واضحة للتمييز في مراحل مختلفة من تطور الورم (مثل تضخم، خلل التنسج، أو الورم) من قبل. قد تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على تحليل نسيلي من المظاهر الورمية في مختلف الأجهزة في ذبابة الفاكهة .
Introduction
الأنسجة الظهارية هي نظم منظمة للغاية التي لديها القدرة هوموستاتيك ملحوظ للحفاظ على تنظيمها من خلال التنمية ودوران الخلية. هذا النظام الذاتي التنظيم القوي، ومع ذلك، تتعطل تدريجيا خلال تطور الورم. في بداية تطور الورم، والخلايا الطافرة الفردية الناشئة عن تفعيل الجين الورم أو ورم-قمع تعطيل الجينات تظهر داخل طبقة الظهارية. عندما يتحول هذا "الخلية المؤيدة للورم" يتلاشى بيئة قمعية، ويعطل تنظيم الظهارية، ويبدأ انتشار غير المنضبط، يحدث الأورام 1 . خلال العقود القليلة الماضية، أحرز التقدم التكنولوجي المتميز في علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية تقدما ملحوظا في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، والدراسات الحديثة باستخدام أدوات تحليل الفسيفساء وراثيا في ميلانوغاستير ذبابة الفاكهة ، مثل فلب-فرت (فليباس ريكومبيناس / فليباس ريكومبيناس الهدف) ريكومبين الإنقساميةأتيون 2 والوجه خارج GAL4-واس (تسلسل تفعيل المنبع) 3 ، ساهمت إلى حد كبير في فهم أفضل للآليات الوراثية المشاركة في تشكيل ورم خبيث من الأورام 4 و 5 و 6 .
دراسات لمجموعة من الجينات السرطانية، القامع الحفظ ذبابة الفاكهة، اليرقات العملاقة القاتلة (LGL)، وأقراص كبيرة (أجهزة ...)، وخربشات (scrib)، سلط الضوء على العلاقة الحاسمة بين فقدان التنظيم الظهارية والتنمية الورم، حيث أن هذه الجينات تلعب أدوارا رئيسية في تنظيم قطبية الخلايا القاعدية وانتشار الخلايا في الأنسجة الظهارية 7 . في حين أن ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي هي عادة ظهارة أحادي الطبقة، والطفرات متماثلة في أي من هذه الجينات الثلاثة تسبب الخلايا لانقاص هيكل وقطعية، تفشل في ديفريفيات، أوفيربروليفيرات، وتشكل في نهاية المطاف الجماهير غير متبلور متعدد الطبقات التي فتيل مع الأنسجة المجاورة 7 . وبالمثل، انقطاع هذه الجينات في الثدييات وتشارك في تطوير الأورام الخبيثة 8 ، 9 . وقد أدت الأنماط الظاهرية للأورام التي عرضتها الأنسجة المتحولة إلى تصنيف هذه الجينات الثلاثة كجينات مضادة للورم الورمية (نتسغس) 7 ، 8 . ومع ذلك، عندما يتم إنشاء خلايا متحولة نتس متماثل متماثل في تطوير البرية نوع أقراص تخيل باستخدام فلب-فرت بوساطة إعادة التركيب الانقسامية، والقضاء على الخلايا الطافرة من الأنسجة من خلال C- جون كيناز محطة N- (جنك) موت الخلايا المبرمج 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، إكستروسيون 15 ، 16 ، أو غمر و البلعمة من قبل الجيران 17 . في هذه الظهارة الفسيفساء وراثيا، وكشف معظم موت الخلايا المبرمج في الخلايا متحولة نتس تقع على حدود استنساخ، مما يشير إلى أن الخلايا الطبيعية المجاورة تؤدي موت الخلايا المبرمج للخلايا متحولة نتس 10 ، 11 ، 12 ، 18 . وقد أكدت الدراسات الحديثة في خلايا الثدييات أن هذه الخلية تعتمد على المنافسة القضاء على الخلايا المؤيدة للورم هو آلية الحفاظ على الظهارية دفاعيا التطورية ضد السرطان 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 .
ومع ذلك، أظهرت دراسة حديثة في أقراص ترويض ذبابة الفاكهة أن فسيفساء نتس-نوكدون استنساخ يدفع الأورام الورم في سبيسيفالمناطق جيم من أقراص تخيل الجناح 16 . تم العثور على تشكيل الورم الأولي دائما في المنطقة "المفصلي" الطرفية ولم يلاحظ قط في المنطقة "الحقيبة" المركزية من ظهارة القرص الجناح، مما يشير إلى أن إمكانات المستضد للخلايا نتس ضربة قاضية يعتمد على البيئة المحلية. تعمل منطقة الحقيبة المركزية على أنها "نقطة باردة للورم" حيث الخلايا المؤيدة للورم لا تظهر فرط التنسج الخاطئ، في حين أن منطقة المفصلي الطرفية تتصرف باعتبارها "نقطة ساخنة للورم" 16 . في مناطق "البرد" الحقيبة، خلايا نتس-ضربة قاضية ديلامينات من الجانب القاعدي وتخضع موت الخلايا المبرمج. على النقيض من ذلك، كما خلايا "المفصلي" المفصلي تمتلك شبكة من الهياكل الهيكلية قوية على الجانبين القاعدية، وخلايا نتس-ضربة قاضية ديلامينات من الجانب القمي من ظهارة والشروع في فرط نمو الأورام 16 . لذلك، تحليل الظواهر الورم في أقراص تخيلي يتطلب كونسي حذرادييراتيون من حساسية المنطقة محددة لمؤثرات الأورام.
هنا، نحن تصف بروتوكول للحث على تشكيل الورم الأورام في الجناح ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي باستخدام نظام رني GAL4-UAS- التي يتم إنشاؤها خلايا ضربة قاضية nTSG في العادية القرص الجناح ظهائر. على الرغم من أن هذه النظم التجريبية مفيدة لدراسة المراحل المبكرة من السرطان، لم يتم وصف طريقة تصنيف واضحة لتقييم مراحل تطور الورم في ظهارة القرص ظاهري من قبل. لذلك، فإننا نقترح أيضا طريقة تشخيص لتصنيف الظواهر النسلية المؤيدة للورم التي يسببها ظهارة القرص الجناح إلى ثلاث فئات: تضخم (عدد كبير من الخلايا التي تظهر بشكل طبيعي مع زيادة الانتشار)، خلل التنسج (الأنسجة سابقة التأليف تتألف من ظهور غير طبيعي الخلايا)، والأورام (ورم حميدة أو خبيثة تتألف من خلايا لها مظهر غير طبيعي ونمط انتشار غير طبيعي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. يطير الصلبان والاستنساخ استنساخ
- إزالة جميع الذباب في قارورة 12 ساعة قبل جمع الذباب البكر.
- تخدير الذباب في قارورة عن طريق حقن ثاني أكسيد الكربون غاز 2 ومكان الذباب على وسادة الطيران CO 2.
- نقل 10-20 أنثى عذراء و 10 ذكور من كو 2 ذبابة في قارورة جديدة واحتضان لمدة 1 يوم عند 25 درجة مئوية.
- نقل هذه الذباب في قارورة جديدة واحتضان لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: تجاهل القارورة الأولى كما الإناث البكر لا تضع ما يكفي من البيض في اليوم الأول. - لخطوط محسن GAL4، إزالة الذباب الكبار واحتضان القارورة في 25 درجة مئوية حتى تشريح.
- لتحريض استنساخ الفسيفساء عن طريق الوجه خارج GAL4، وإزالة الذباب الكبار واحتضان قارورة لمدة 2-4 أيام عند 25 درجة مئوية. فترة الحضانة قبل صدمة الحرارة تعتمد على الغرض التجريبي. الصدمة الحرارية بعد يومين من ترسب البيض (درهم) يولد استنساخ الفسيفساء في الثانية غير ناضجةإنستار ظهاري تخيل. صدمة حرارية بعد 3 أو 4 أيام إيد يولد استنساخ الفسيفساء في متباينة في وقت مبكر إلى منتصف الثالث إنستار ظهارة تخيل.
ملاحظة: من المهم أن ندرس تأثير تغيير توقيت صدمة الحرارة على النمط الظاهري للأورام. - لتحريض استنساخ الفسيفساء عن طريق الوجه خارج GAL4، صدمة الحرارة القارورة عن طريق الغمر في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 - 45 دقيقة تليها الحضانة لمدة 2 - 3 أيام عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم عرض معلومات من الحرارة صدمة الوقت والتوقيت، وحضانة الوقت في كل تجربة في الشكل الأساطير.
2. تشريح اليرقات
- جمع يتجول اليرقات الطور الثالث مع عصا خشبية أو ملقط حادة، وراثي لهم من قبل علامات الفلورسنت المناسبة (على سبيل المثال ، إغف) تحت المجهر مضان مجسمة ووضعها في طبق تشريح مع برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة).
- غسل اليرقات في برنامج تلفزيوني عن طريق بيبتينغ مع 2 مل ماصات نقل البلاستيك.
- قرصة مركز اليرقة مع ملقط واحد والمسيل للدموع الجسم في نصف مع ملقط أخرى.
- قرصة هوك الفم من النصف الأمامي مع ملقط واحد ودفع الفم نحو الجسم مع ملقط أخرى لتحويل الجسم من الداخل.
- إزالة المواد غير الضرورية مثل الغدد اللعابية أو الأجسام الدهنية مع ملقط.
3. تثبيت وتلطيخ الأجسام المضادة
- نقل النصف الأمامي تشريح الجسم اليرقات (بما في ذلك أقراص الجناح تخيل) إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 مل وإصلاح في 1 مل من حل فيكس (4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع دوران لطيف.
تنبيه: الفورمالديهايد سامة ولها إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد.
ملاحظة: في هذا الجزء، جميع الخطوات تجري على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة في الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك. - إزالة الحل إصلاح وتجاهل. غسل الأنسجة مع 1 مل من بت (0.3٪ الحقدعلى X-100 في برنامج تلفزيوني) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إزالة بت وإضافة 1 مل من بتغ (0.2٪ ألبومين المصل البقري و 5٪ مصل الماعز الطبيعي في بت) لحجب و نوتات 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة بتغ وإضافة حل الأجسام المضادة الأولية المخفف بشكل مناسب مع بتغ (انظر المواد الجدول ) ونوتيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الحل الأجسام المضادة الأولية وغسل الأنسجة مع 1 مل بت ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إزالة بت وإضافة حل الأجسام المضادة الثانوية المخفف بشكل مناسب مع بتغ (1: 400). نوتيت لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الأنسجة مع 1 مل من بت مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- وصمة عار F- أكتين، وإزالة بت وإضافة الحل فالويدين المخفف بشكل مناسب في برنامج تلفزيوني (1:40). ثم نوتات لمدة 20 دقيقة. إزالة الحل فالويدين وغسل الأنسجة مع 1 مل من بت مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- ل كونترستين الحمض النووي النووي، وإزالة بت وإضافة دابي (4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) حل (0.5 ميكروغرام / مل من دابي في برنامج تلفزيوني). ثم نوتات 10 دقيقة.
تنبيه: دابي لديه إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد. - إزالة حل دابي وغسل الأنسجة مع 1 مل من بت مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- شطف مرة واحدة في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة بس وإضافة 500 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ كما المتوسطة قبل تصاعد.
4. تركيب على شرائح المجهر
- وضع الأنسجة الملون على شريحة المجهر باستخدام ماصة نقل البلاستيك 2 مل.
- نقل الأنسجة إلى قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة المجهر آخر مع ملقط.
- عقد باستمرار نهاية الأنسجة تشريح مع ملقط واحد وسحب الدماغ والعين أنتينال أقراص مع ملقط أخرى.
ملاحظة: الحفاظ على العقول تشريح لوضعها بالقرب من أقراص تخيل الجناح. العقول بمثابة منصة منع ساترة من سحق أقراص تخيل الجناح. - لعزل أقراص تخيل الجناح عقد أسفل نهاية الأنسجة تشريح مع ملقط واحد وخدش بلطف جدار الجسم والمسيل للدموع قبالة الأقراص مع ملقط أخرى.
ملاحظة: إذا كان من الصعب العثور على أقراص تخيل الجناح، قشر القصبة الهوائية من الخلفي إلى الجانب الأمامي. الجناح تخيل أقراص عصا القصبة الهوائية. - تغطية بلطف أقراص تخيلي مع ساترة وختم مع طلاء الأظافر. مخزن في 4 درجات مئوية.
5. متحد البؤر المجهري
- للحصول على الصور متحد البؤر باستخدام متحد البؤر المجهر مجموعة المعلمات الحصول على صورة بما في ذلك مجموعة من الطول الموجي الانبعاثات، كثافة الليزر، وكسب، تعويض، سرعة المسح الضوئي وحجم الصورة 24 .
ملاحظة: لإجراء مفصل من إعدادات الحصول على الصور، راجع دليل التعليمات التي تقدمها كل مصنع المجهر. - لالتقاط واحد كوأقسام نفوكال من الجناح بأكمله القرص تخيل، واستخدام عدسة الهدف 20X.
- الحصول على صور ثلاثية الأبعاد بواسطة المسح كومة Z في خطوة حجم 0.5 - 1.0 ميكرون باستخدام 40X أو 60X العدسات.
ملاحظة: لتحليل الأنماط الظاهرية الخلوية في دقة عالية، يجب أن يكون حجم الصورة أكبر من 512 × 512 بكسل.
6. تحليل الصورة باستخدام إيماجيج
- استخدام فيجي، وهو برنامج مفتوح المصدر إيماجيج تركز على تحليل الصورة البيولوجية (https://fiji.sc/) 25 ، لاكتساب وتحليل متحد البؤر ض الصور كومة.
- للحصول على المقاطع الرأسية، افتح صور z-ستاك في إيماجيج وحدد عنصر القائمة "إيماج / ستاكس / ريسليس".
ملاحظة: إما محور شز أو محور يز يمكن اختيارها في القائمة ريسليس. ويمكن الحصول على القسم الرأسي أيضا في اتجاه تعسفي عن طريق رسم خط مستقيم أو مستطيل على صورة z- المكدس.
7. تشخيص الأنماط الورمية
- افتح العموديةأقسام (شز أو محور يز) التي تم الحصول عليها من مجموعة واحدة من الصور Z المكدس وتحليل المظاهر المورفولوجية وتلطيخ الأجسام المضادة.
- لتشخيص المظاهر الورمية، تركز أساسا على النقاط الثلاث التالية: (1) إذا كتلة الخلية، بما في ذلك استنساخ ضربة قاضية، ينحرف عن الطبقة الظهارية الرئيسية، (2) إذا تم تغيير توطين تحت الخلية من البروتينات الوصفي في هذه الكتلة الخلية ، و (3) إذا كان قطر هذه الكتلة الخلية أكبر من 4 خلايا.
- تصنيف المظاهر الورمية وفقا لمخطط انسيابي وصفها في الشكل 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات تشكيل ورم الورم تجريبيا التي يسببها رني -NTSG ضربة قاضية ضربة قاضية في أقراص ذبابة الجناح ذبابة الفاكهة ، استخدمت ثلاثة برامج تشغيل GAL4 مختلفة للتعبير واس- رناي لجل أو سكريب : (1) سد- GAL4، الذي يدفع التعبير واس قوية في الجناح الحقيبة والتعبير المعتدل في المناطق المفصلي ( الشكل 2 والشكل 3A ). (2) أوبد-GAL4، الذي يدفع في النطاقات الفرعية للمفصل، بما في ذلك التعبير القوي في مجالين من أضعاف وسطي الظهرية، والتعبير معتدل في المجال الأمامي الأمامي الوحشي، وضعف التعبير في المجال البطني الخلفي ( الشكل 2 والشكل 3C )؛ و (3) الناجم عن الحرارة صدمة الوجه المغادرة GAL4، الذي يولد استنساخ الفسيفساء عشوائية التعبير UAS-الجينات (الشكل 4 وفايغور 5). في كل من التجارب، واس-إغف شارك في التعبير مع واس-رناي للاحتفال استنساخ ضربة قاضية.
أولا، تم استخدام سد- GAL4 مدفوعة لغل-رني للحث على ضربة قاضية من لغل في الحقيبة الجناح والمناطق المفصلي. في السيطرة الثالثة أجنحة الجناح إنستار بدون واس-لغل-رني ، لم يحدث أي تغيير المورفولوجية ( الشكل 3A ). في المقابل، في الثالثة الجناح أجنحة الجناح معربا عن لغل-رني ، لوحظت تشوهات الظهارية ونمو مفرط المنشأ في أجزاء معينة من المفصلي ( الشكل 3B ). في منطقة الحقيبة الجناح، ومع ذلك، لم يلاحظ فرط التنسج. وقد لوحظ قوي MMP1 (مصفوفة ميتالوبروتيس-1) التعبير في الآفات المفصلي ورم ولكن ليس في منطقة الحقيبة الجناح ( الشكل 3B ). منذ التعبير MMP1 تشارك في تدهور الغشاء القاعديإس، فمن الممكن أن هذه الأورام المفصلي لديها قدرة النقيلي ( الشكل 3B ). بعد ذلك، تم استخدام أوبد- GAL4 للحث على ضربة قاضية لغل في منطقة المفصلي. في السيطرة الثالثة أجنحة الجناح إنستار بدون واس-لغل-رني ، لم تحدث أي تغييرات المورفولوجية ( الشكل 3C ). ومع ذلك، بعد 5 أيام درهم، وأقراص الجناح الجناح الثالث مع أوبد- GAL4 و لغل-رناي عرض اضطراب ظهاري بارز، مع تراكم F- أكتين واستنساخ استنساخ من الطبقة الظهارية ( الشكل 3D ). في 6 أيام إيد، الأورام الأورام معربا عن MMP1 جائت في منطقة المفصلي ( الشكل 3G )، وإن كان مع الاختلاف في حجم الورم بين العينات ( الشكل 3E و F ). وأكد قسم عمودي من منطقة المفصلي أن الورم الورم خضعت انحراف ثمرة في الجانب القمي من طبقة الظهارية ( لمراقبة تطور نمو الورم الناجم عن ضربة قاضية لغل ، تم إنشاء الحيوانات المستنسخة متفرقة التعبير عن لغل-رني في أقراص الجناح باستخدام نظام الفسيفساء GAL4 الناجمة عن الصدمة الناجمة عن الحرارة. بعد يومين من صدمة الحرارة إلى يرقات الطور الثاني (2 أيام إيد )، أظهرت بعض المستنسخات لغل -knockdown تقع في منطقة المفصلي الانحراف بعيدا عن الجانب القمي من طبقة الظهارية ( الشكل 4A ). بعد أربعة أيام من الحرارة الصدمة الحث، آفات عسر التنسج في منطقة المفصلي أصبحت واضحة، مما يشير إلى أن استنساخ لغل -knockdown النازحين بعيدا عن الجانب القمي تتكاثر في التجويف ( الشكل 4B ). بعد سبعة أيام من الحرارة الصدمة الاستقراء، هيمنة فرط المنشأ هيمنت على المناطق المفصلي ( الشكل 4C ). للتدليل علىتصنيف النمط الظاهري النسيلي مع طريقة التشخيص لدينا، تم إنشاء الحيوانات المستنسخة متفرقة التعبير عن سكريب-رني في أقراص الجناح باستخدام نظام الفسيفساء GAL4 الناجم عن صدمة الحرارة التي يسببها. بعد خمسة أيام من صدمة الحرارة إلى الثاني يرقات إنستار (2 أيام إيد )، وبعض غفب معربا عن استنساخ -knockdown أظهرت المظاهر المستضدية ( الشكل 5A ). قمنا بتحليل أربعة الحيوانات المستنسخة (B، C، D و E في الشكل 5A ) في أقسام عمودية من Z- كومة الصور متحد البؤر باستخدام إيماجيج، لأنه من الصعب الحصول على المظاهر الخلوية والهيكلية مفصلة في الصور متحد البؤر 2D ( الشكل 4 والشكل 5A ). تم تصنيف الحيوانات المستنسخة B و C كما خلل التنسج كما البروتين سيبتات تقاطع أقراص كبيرة (دلغ) كان ميسلوكاليزد ( الشكل 5B و C ). في الاستنساخ B، كان حجم كتلة الخلية المشردين من ظهارة لا يزيد عن 4 خلايا في دياميتيص ( الشكل 5B )، في حين استنساخ C لم تحيد من ظهارة ( الشكل 5C ). ولذلك، لم تعتبر المستنسخة B و C الورم. ومع ذلك، استنساخ D و E، والتي أظهرت أيضا سوء تعريف دلغ، شكلت كتل الخلايا الورمية خارج الظهارة ( الشكل 5D و 5 هاء ). كما كان حجم هذه الحيوانات المستنسخة الورمية المشردة أكثر من 4 خلايا في القطر، تم تصنيف الحيوانات المستنسخة على أنها الأورام. للحث على الأورام المفرطة التنسج أو تشكيلات الكيس في أقراص تخيل الجناح، تم إنتاج الحيوانات المستنسخة المتفرقة التي تعبر عن رأس الورم غير المتجانس ( رأس V12 ) أو شكل نشط من الناحية الجوهرية من يوركي، وهو محفز نسخي لمسار فرس النهر، ( يكي 3SA ) باستخدام الحرارة الناجمة عن الصدمة الوجه GAL4 نظام الفسيفساء. بعد أربعة أيام من صدمة الحرارة إلى يرقات المرحلة الثانية (2 أيام درهم)، راالصورة V12 -expressing الحيوانات المستنسخة وصفت من قبل GFP أصبحت الجماهير الخلايا المستديرة في أقراص تخيلي (الشكل 6A). كشف القسم الرأسي من استنساخ رأس V12- إكسبريسينغ (استنساخ B في الشكل 6A ) أن كتلة الخلية فصلها عن طبقة الظهارية لديها توطين السليم من دلغ، مما يشير إلى أن كتلة الخلية يحافظ على الهياكل الظهارية الطبيعية خارج طبقة الظهارية ( الشكل 6B ) . لم يكن لوحظ التعبير MMP1 في هذه V12 -expressing استنساخ رأس (الشكل 6C). لذلك، تم تصنيف استنساخ B كما تشكيل الكيس. بعد أربعة أيام من الصدمة الحرارية إلى الثانية يرقات العمر (2 أيام درهم) YKI 3SA -expressing الحيوانات المستنسخة وصفت من قبل GFP شكلت الجماهير خلية كبيرة في أقراص تخيلي (الشكل 7A). ركزنا على اثنين من الحيوانات المستنسخة (B و C في الشكل 7A ). وأظهر الاستنساخ Bوالتكامل في طبقة الظهارية والتوطين السليم لل دلغ في الأغشية شبه القمية للخلايا الظهارية، مما يشير إلى أن استنساخ يكي 3SA -expressing B حافظت على هيكل الظهارية. لذلك، تم تصنيف استنساخ B كما تضخم ( الشكل 7B ). استنساخ C يقع في منطقة المفصلي أظهرت ميسلوكاليزاتيون من دلغ وشكلت بنية متعددة الطبقات في الجانب القاعدي من الطبقة الظهارية. لم يلاحظ التعبير MMP1 في استنساخ يكي 3SA -expressing . أخذت معا، تم تصنيف استنساخ C كما الأورام حميدة ( الشكل 7C و D ). 5 "كلاس =" زفيجيمغ "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
الشكل 1: مخطط انسيابي لتصنيف الأنماط الورمية. هذا المخطط يمثل طريقة التشخيص لتصنيف الآفات النسلية في ظهارة تخيلي. كلاسيفيك(1) الانحراف من الحيوانات المستنسخة من الطبقة الظهارية، (2) خلل تحت الخلية من البروتينات الوصلي، (3) الانتشار الخلوي، (4) حجم استنساخ و (5) التعبير MMP1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2: ( A ) الجناح من نوع البرية القرص تخيل ملطخة دلغ (الأخضر) ونوى (دابي، أرجواني). ( B ) تمثيل تخطيطي للجناح ذبابة الفاكهة أقراص تخيل تظهر الجناح الحقيبة (الأزرق)، المفصلي (البرتقالي) والمفكرة (الأخضر) المناطق. ( C ) الجناح العادي تخيل القرص الملون ل F- أكتين (الأحمر) والأنابيب الدقيقة (الأخضر). وصفت الأغشية الطابق السفلي مع الكولاجين إيف / فكغ-غفب (الأزرق). ( D ) القسم الرأسي للموقعملحوظ مع خط منقط أبيض في ( C ). ( E ) رسومات الخط تتبع قمي (الأحمر) والقاعدية (الأزرق) الجانبين من الطبقة الظهارية في ( D ). خطوط منقطة تتبع الغشاء المحيطية. القاصي (دف)، الإنسي (مف) والداني (يف) طيات المفصل الظهرية.
أنماط وراثية مفصلة: A، ث - سد، فكغ-غفب الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 3: أورام محددة الموقع المستحث من قبل محسن-GAL4s. ( A ، B ) تظهر الصور متحد البؤر الجناح أقراص تخيل تشريح من يرقات الطور الثالث من الأنماط الجينية المشار إليها ملون ل MMP1 (الأحمر). و سد- GAL4 -expreسميت المناطق سسينغ من قبل التعبير غفب (الأخضر). ( سغ ) تظهر الصور متحد البؤر الجناح أقراص تخيل تشريح من يرقات الطور الثالث من الأنماط الجينية المشار إليها في النقطة الزمنية المشار إليها إيد. تم ملطخة F- أكتين مع فالويدين (الأحمر) في ( سف ). ملطخة التعبير MMP1 مع الأجسام المضادة MMP1 المضادة (الأحمر) في ( G ). تم وضع علامة على المناطق -expressing أوبد-GAL4 بواسطة غفب التعبير (الأخضر). تظهر الألواح السفلى من ( سف ) وجهات نظر مكبرة من المناطق المشار إليها في لوحات العلوي. وتشير السهام البيضاء الآفات الناجمة عن خلل التنسج LGL استنساخ -knockdown. ( H ) القسم الرأسي للموقع ملحوظ بخط أبيض منقط في اللوحة السفلية من (E). خطوط منقط بيضاء ترسم الحدود بين الحقيبة الجناح والمناطق المفصلي في (A) و (B). وقد وصفت نوى مع دابي (الأزرق). الحانات مقياس = 100 ميكرون في (أغ) و 50 ميكرون في (H). الأنماط الجينية المفصلة: A، w - ، سد-GAL4، واس-إغف؛ UAS-dicer2. B، w - ، سد-GAL4، واس-إغف؛ UAS-dicer2. UAS-LGL-رني. C، w - ، أوبد-GAL4، واس-إغف؛ UAS-dicer2. د، w - ، أوبد-GAL4، واس-إغف؛ UAS-dicer2. واس-لغل-رني الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 4: الأنماط الورمية المستحثة من قبل الحيوانات المستنسخة الفسيفساء عشوائية. ( أس ) تظهر الصور متحد البؤر فسيفساء الجناح أقراص تخيل من اليرقات الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة شارك في التعبير عن لغل-رني و غفب (الأخضر) في نقطة زمنية المشار إليها بعد الحرارة الصدمة الاستقراء. وقد وصفت نوى من قبل دابي (الأزرق). وتظهر اللوحات الوسطى مناظر مكبرة لمناطق مربع أبيض ملحوظ في لوحات اليسار. اللوحة اليمنى تظهر رسومات خط التخطيطي من الجانب القمي من طبقات الظهارية (الأزرق) واستنساخ غفب معربا عن (الأخضر). يتم تصوير الحيوانات المستنسخة فسيفساء تقع داخل ظهارة في الضوء الأخضر في حين تظهر الأورام الورمية الانحراف من ظهارة في أرجواني. خطوط منقط بيضاء في لوحات اليسار علامة الحدود بين الحقيبة الجناح والمناطق المفصلي. السهام البيضاء في لوحات الوسطى وتشير الآفات الناجمة عن خلل التنسج LGL استنساخ -knockdown. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الأنماط الجينية التفصيلية: أس، هسفلب؛ UAS-dicer2. أكت> CD2> GAL4، واس-إغف / واس-لغل-رناي (صدمت الحرارة 30 دقيقة في 2 أيام درهم، واحتضان يومين في 25 درجة مئوية في A، احتضان 4 أيام عند 25 درجة مئوية في B، احتضان 7 أيام في 25 درجة مئوية في C بعد صدمة الحرارة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الفحص التشخيصي للنمط الكلوي النمطي. ( A ) اللوحة اليسرى يظهر القرص التخيلي الجناح الفسيفساء من يرقات الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة شارك في التعبير عن سكريب-رني و غفب (الأخضر) بعد 5 أيام من الحرارة الحث الصدمة، ملطخة ل دلغ (الأحمر). اللوحة اليمنى يظهر رسم خط التخطيطي من الجانب القمي من طبقات الظهارية (الأزرق) واستنساخ غفب معربا عن (الأخضر). تظهر استنساخ الفسيفساء في الطبقات الظهارية باللون الأخضر الفاتح بينما تظهر الأورام الورمية النازحة من الظهارة في أرجواني. ( بي ) تظهر الصور متحد البؤر أقسام العمودية من استنساخ سكريب -knockdown المشار إليها في اللوحة اليمنى من (A). تظهر اللوحات الثانية من اليسار أنماط توطين دلغ (أحمر). لوحات الثالث من اليسار تظهر رسومات الخط التخطيطي للقمي (الأحمر) والقاعدية (الأزرق) الجانبين من طبقات الظهارية و غفب-إكسرإسينغ سكريب -knockdown استنساخ (الأخضر). تظهر استنساخ خلل التنسج في الطبقات الظهارية باللون الأخضر الفاتح (B و C) بينما تظهر المستنسخات الورمية المشردة من الظهارة في أرجواني (D و E). السهام البيضاء تشير سكريب -knockdown الحيوانات المستنسخة تظهر النمط الظاهري توموريجينيك. وقد وصفت نوى مع دابي (الأزرق). شريط مقياس = 50 ميكرون. تم تصنيف النمط الظاهري الورم من كل استنساخ وفقا لمخطط انسيابي هو مبين في الشكل 1 . الأنماط الجينية المفصلة: إ، هسفلب؛ UAS-scrib رني. > CD2> GAL4، واس-إغف (صدمت الحرارة 30 دقيقة في 2 أيام درهم، واحتضان 4 أيام عند 25 درجة مئوية بعد صدمة الحرارة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 6: التشخيصعرة فحص رأس V12 -expressing الظواهر نسيلي. ( A ) اللوحة اليسرى يظهر القرص تخيل الجناح الفسيفساء من يرقات الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة تعبير المشارك أونكوجينيك رأس V12 و غفب (الأخضر) بعد 4 أيام الحرارة الحث الصدمة، ملطخة ل دلغ (الأحمر). اللوحة اليمنى يظهر رسم خط التخطيطي من الجانب القمي من طبقات الظهارية (الأزرق) واستنساخ غفب معربا عن (الأخضر). شريط مقياس يمثل 50 ميكرون. ( ب ) الأجزاء الرأسية من النسخ المستنسخة من راس V12 المشار إليها في اللوحة اليمنى من (A). تظهر اللوحات الثانية من اليسار أنماط توطين دلغ (أحمر). لوحات الثالث من اليسار تظهر رسومات خط التخطيطي من القمي (الأحمر) والقاعدية (الأزرق) الجانبين من طبقات الظهارية ورأس V12 و غفب التعبير عن الحيوانات المستنسخة (الأخضر). شريط مقياس = 25 ميكرون. ( C ) الجناح الفسيفساء القرص تخيل من اليرقة الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة شارك في التعبير عن <إم> رأس V12 و غفب (الأخضر) بعد 4 أيام من الحرارة الصدمة الحث، ملطخة ل MMP1 (الأحمر). شريط مقياس = 100 ميكرون. الأنماط الجينية التفصيلية: أس، هسفلب؛ واس-راس V12 ؛ > CD2> GAL4، واس-إغف (صدمت الحرارة 45 دقيقة في 2 أيام درهم، واحتضان 4 أيام عند 25 درجة مئوية بعد صدمة الحرارة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 7: الفحص التشخيصي من يكي 3SA -expressing الأنماط الكلوية. ( A ) اللوحة اليسرى يظهر القرص التخيلي الجناح الفسيفساء من اليرقة الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة شارك في التعبير عن نشاطا نشيطا يكي 3SA و غفب (الأخضر) بعد 4 أيام الحرارة الحث الصدمة، ملطخة ل دلغ (الأحمر). يظهر اللوحة اليمنى كما رسم خط كيميائي من الجانب القمي من طبقات الظهارية (الأزرق) واستنساخ غفب معربا عن (الأخضر). شريط مقياس = 50 ميكرون. ( بك ) أقسام عمودي من يكي 3SA تعبير عن الحيوانات المستنسخة المشار إليها في اللوحة اليمنى من (A). تظهر اللوحات الثانية من اليسار أنماط توطين دلغ (أحمر). لوحات الثالث من اليسار تظهر رسومات خط التخطيطي للقمي (الأحمر) والقاعدية (الأزرق) الجانبين من طبقات الظهارية و يكي و غفب التعبير عن الحيوانات المستنسخة (الأخضر). شريط مقياس = 25 ميكرون. ( D ) الجناح الفسيفساء القرص تخيل من اليرقة الطور الثالث مع الحيوانات المستنسخة شارك في التعبير عن يكي 3SA و غفب (الأخضر) بعد 4 أيام الحرارة الصدمة الحث، ملطخة ل MMP1 (الأحمر). شريط مقياس = 100 ميكرون. الأنماط الجينية المفصلة: أد، هسفلب ؛؛ واس-يكي 3SA / أكت> CD2> GAL4، واس-إغف (صدمت الحرارة 30 دقيقة في 2 أيام درهم، واحتضان 4 أيام عند 25 درجة مئوية).5901fig7large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام GAL4-واس هي واحدة من الأدوات الوراثية أقوى للتعبير الجيني المستهدفة في ذبابة الفاكهة 26 ويسهل إلى حد كبير تحريض الخلايا السرطانية والتحليل في الجسم الحي 4 . هذا النظام يتيح توليد الحيوانات المستنسخة التي تحمل ضربة قاضية من الجينات الكابتة للورم أو أوفيركسريسيون من الجينات الورمية داخل الأنسجة الظهارية من النوع البري، وهو وضع يشبه إلى حد كبير المراحل الأولية من سرطان الإنسان حيث يتم محو الخلايا المؤيدة للورم المحولة بالخلايا الظهارية العادية. خطوط التشغيل GAL4 التي تنظمها متواليات محسن مثل GAL4 خطوط المحسن-فخ أو خطوط جانيليا GAL4 27 لها فريدة من نوعها، مقاييس التعبير المقيدة زباتيا. لذلك، هذه خطوط محسن GAL4 مفيدة للحث على الأورام باستمرار في مناطق محدودة من أقراص تخيل. بالإضافة إلى سد-GAL4 و أوبد-GAL4 هو مبين في هذه الدراسة، أكدنا أن لغل -knockdown الناجم بذ خطوط أخرى GAL4 محسن شرك بما GAL4 معكوسة (أون-GAL4)، القنفذ، GAL4 (ح ح-GAL4)،-optomotor أعمى GAL4 (مكتب الإدارة والميزانية، GAL4)، مصححة-GAL4 (PTC-GAL4) وشبالت الميجر GAL4 ( سالم-GAL4 ) يمكن أن تولد الأورام الورمية في المناطق المفصلي من أقراص تخيل الجناح. إذا كان نمط التعبير محسن GAL4 يحتاج إلى التحكم مؤقتا، مجموعة من GAL4 والإصدار حساس لدرجة الحرارة من GAL80 (GAL80 تيسي ) هو خيار. تلغي تيسي GAL80 وظيفة GAL4 عند 18 درجة مئوية ولكن ليس عند 29 درجة مئوية، مما يسمح التعبير واس-ترانزجينس أن يتم تشغيل أو إيقاف تشغيله حسب الضرورة 28 .
نظام فسيفساء GAL4، الذي يجمع بين نظام فلب-فرت ونظام GAL4-واس 3 ، يولد استنساخ عشوائي في أقراص تخيلي. من خلال الجمع بين فليباس الحرارة المحفزة للصدمة (هسفلب) مع الوجه خارج GAL4، توقيت جينيرات استنساخأيون هو السيطرة عليها. ولأن الإمكانات المستخلصة للأورام من خلايا القرص التخيلي قد تعتمد على المرحلة التنموية، وأحداث التشوير الذاتية، و / أو التمايز الخلوي 29 ، 30 ، من المهم جدا دراسة تأثير تغير توقيت الصدمة الحرارية على النمط الظاهري للأورام.
وقد تبين سابقا أن استنساخ متحولة نتس تخضع الخلايا الخلوية التي تعتمد على المنافسة عندما تحيط بها الخلايا من نوع البرية 10 ، 11 ، 12 ، 18 ، مما يشير إلى أن الطفرات متعددة مطلوبة لتحويل الخلايا خلال تطور السرطان. في الواقع، أوفيركسريسيون من أونكوجينيك راس أو يكي في لغل أو سكريب متحولة استنساخ يحولها إلى أورام عدوانية 10 ، 18 ، 31 في حين خاطئةوالتعبير عن رأس V12 أو يكي 3SA لا تحفز الأورام الخبيثة في حد ذاتها دون طفرات نتس. كما هو مبين هنا وقبل 16 ، الموالية للورم نتس ضربة قاضية استنساخ ولدت في أقراص الجناح من نوع البرية أيضا الخضوع لموت الخلايا المبرمج ولا تظهر أورام في الجناح الجناح 16 . وفي الوقت نفسه، استنساخ نكتون ضربة قاضية تقع في المفصلي "النقاط الساخنة" تتطور إلى أورام الورم دون أي طفرات أونكوجينيك إضافية. في المناطق المفصلي، خلايا نتسغ ناقصة خطف الذاتية جانوس كيناز / إشارة محول ومنشط النسخ (جاك / ستات) مما يشير إلى دفع الأورام 16 . لذلك، GAL4s المفصلي محددة مثل أوبد- GAL4 هي أدوات مفيدة لتحفيز باستمرار تشكيل ورم الورم بواسطة رني - ضربة قاضية المتوسطة من الجينات الكابتة للورم. على الرغم من أن الوجه-خارج GAL4 التي يسببها نتس ضربة قاضية استنساخ فسيفساء أيضا تحفز الأورام الورم في المفصلي إعادةالجينات، حدوث الأورام يعتمد على حجم استنساخ الأولية: استنساخ كبيرة الناتجة عن صدمة حرارة أكثر من 20 دقيقة عادة ما تسبب الورم، في حين أن معظم الحيوانات المستنسخة الصغيرة الناتجة عن صدمة الحرارة أقصر من 10 دقيقة يتم القضاء تماما (كم و يت، بيانات غير منشورة).
وهناك عدد من الدراسات التي أجريت مؤخرا على تطور الورم وسرطان التقدم استخدام ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي كنموذج نظام 32 ، 33 . وتشمل هذه الدراسات عدة علامات من الأورام الورم: الجماهير الخلية المنحرفة، والأشكال القرص المشوهة، وتراكم F- أكتين، وتعزيز الدراجات الخلية (بردو / إيدو التأسيس أو التعبير PH3)، وتفعيل الإشارات جنك والهدف المصب MMP1، الغشاء القاعدي و / أو الفوضى الظهارية، بما في ذلك فقدان أو تحلل البروتينات تحت الخلية المشاركة في قطبية الخلايا القاعدية القاعدية (كرومبس، ستاردوست، باتج، أكك، بازوكا / بار-3 أو بار-6)، تقاطعات الحاجز(لغل، سكريب، دلغ أو كوراكل)، أو تلتصق تقاطعات (E-كادهرين أو أرماديلو). هذه الظواهر هي كشفها بسهولة من قبل تلطيخ الأجسام المضادة التقليدية. على الرغم من أنه من الصعب تحديد ما إذا كان النمط الظاهري نسلي هو تضخم، خلل التنسج، الأورام الحميدة أو الأورام الخبيثة في المرحلة المبكرة من الأورام، فإنه ينبغي أن يكون أكثر بساطة في ذبابة الفاكهة ظهارة القرص تماثيل تتألف من أحادي الطبقة الظهارية واحدة. في هذه الدراسة، قدمنا طريقة التشخيص لتصنيف الظواهر استنساخ الورم التي يسببها في أحادي الطبقة الظهارية ( الشكل 1 ). تتطلب هذه الطريقة ملاحظات دقيقة من خمسة معايير باستخدام Z- كومة الصور مبائر. كل معيار التشخيص يمكن فحصها من قبل تلطيخ الأجسام المضادة التقليدية والتصوير مبائر. واحدة من المعايير الجديدة التي أدخلناها في هذا الأسلوب هو "4-خلية قطرها المعايير" الذي يميز بين خلل التنسج والأورام في أقراص خيالية. الخلايا الموالية للورم مثل الحيوانات المستنسخة نتس متحولة متكررةلي مقذوف من طبقات الظهارية من خلال المنافسة الخلية أو المغزل ميسورينتاتيون 15 ، 16 ، 34 . في معظم الحالات، هذه الخلايا مقذوف أبوبتوس، وحتى أنها لا يمكن أن تتكاثر. على الرغم من أنه قد يكون من الممكن أن الخلايا المؤيدة للورم الخضوع انقسام الخلية مرة واحدة خلال قذف ومرة أو مرتين أكثر بعد البثق، وهذا يجعل كتلة الخلية من 2-3 إلى 3 خلايا الخلية. لذلك، إذا كانت كتلة الخلايا من الخلايا المؤيدة للورم انحرفت عن طبقة الظهارية أكبر من قطر 4 خلايا، يمكننا أن نحدد أنهم البقاء على قيد الحياة وتكاثر كما ورم خارج الطبقة الظهارية.
على الرغم من أن هذا الأسلوب التشخيص هو بسيط، فمن الأهمية بمكان أن تأخذ دورة الزمن من المظاهر، كما تطور الورم والخبيثة تقدم على مر الزمن. على سبيل المثال، خلل التنسج هو النسيج غير طبيعي خلوي وحالة انتقالية بين نمو حميدة تماما وتلك التي هي قبلخبيث. لذلك، حتى لو تم تعريف استنساخ لوحظ على أنه خلل التنسج وفقا لمخطط انسيابي ( الشكل 1 )، فمن الممكن أن تتطور بعد ذلك في الأورام الورم. على الرغم من أن مرحلة اليرقات محدودة في الوقت (5 - 6 أيام عند 25 درجة مئوية أو 4 - 5 أيام عند 29 درجة مئوية إيد)، نمو الورم في أقراص تخيلي يطيل مرحلة اليرقات من خلال التأخير الناجم عن الببتيد مثل الانسولين 35 ، 36- لذلك، تشكيل ورم الورم في أقراص تخيلي يجعل من الممكن لمراقبة الورم استنساخ المظهري التقدم لعدة أيام أخرى. لدينا طريقة تصنيف بسيطة قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحليل نسيلي من المظاهر الورمية في مختلف الأجهزة في ذبابة الفاكهة .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر J. فوغن للقراءة النقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح من جسبس كاكينهي أرقام المنحة 26891025، 15H01500 ومنحة البحوث مؤسسة تاكيدا العلوم إلى يت
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
