Summary
Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.
Abstract
In den frühen Stadien des Krebses zeigen transformierte mutierte Zellen zytologische Anomalien, beginnen unkontrollierte Überwucherung und zerstören die Gewebeorganisation schrittweise. Drosophila melanogaster hat sich als ein populäres experimentelles Modellsystem in der Krebsbiologie entwickelt, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu untersuchen. Insbesondere genetische Werkzeuge für Drosophila- Imagialscheiben (Entwicklung von Epithelien in Larven) ermöglichen die Entstehung von transformierten Pro-Tumor-Zellen innerhalb eines normalen Epithelgewebes, eine Situation ähnlich der Anfangsphase des menschlichen Krebses. Eine neuere Studie der Tumorentstehung in Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben zeigte jedoch, dass die Tumorinitiierung von der gewebe-intrinsischen Cytoarchitektur und der lokalen Mikroumgebung abhängt, was darauf hindeutet, dass es wichtig ist, die regionsspezifische Anfälligkeit für tumorigene Reize bei der Bewertung von Tumor-Phänotypen im imaginären Bereich zu berücksichtigen Scheiben Zur Erleichterung der phänotypischen Analyse von Tumor progressiIn imaginären Scheiben beschreiben wir hier ein Protokoll für genetische Experimente mit dem GAL4-UAS-System, um neoplastische Tumore in Flügel-imaginären Scheiben zu induzieren. Wir stellen ferner eine Diagnosemethode vor, um die Phänotypen von in imaginären Epithelien induzierten klonalen Läsionen zu klassifizieren, da eine klare Klassifizierungsmethode zur Unterscheidung verschiedener Stadien der Tumorprogression (wie Hyperplasie, Dysplasie oder Neoplasie) bisher nicht beschrieben wurde. Diese Methoden können weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.
Introduction
Epithelgewebe sind hoch organisierte Systeme, die die bemerkenswerte homöostatische Fähigkeit haben, ihre Organisation durch Entwicklung und Zellumsatz zu erhalten. Dieses robuste Selbstorganisationssystem wird jedoch während der Tumorentwicklung zunehmend unterbrochen. Zu Beginn der Tumorentwicklung treten einzelne Mutantenzellen aus der Onkogenaktivierung oder der Tumor-Suppressor-Gen-Inaktivierung innerhalb einer Epithelschicht auf. Wenn diese transformierte "Pro-Tumor-Zelle" einer unterdrückenden Umgebung entzieht, die Epithelorganisation stört und unkontrollierte Proliferation beginnt, tritt die Tumorentstehung auf 1 . In den vergangenen Jahrzehnten haben herausragende technologische Fortschritte in der Genetik und Molekularbiologie bemerkenswerte Fortschritte bei der Krebsforschung gemacht. Insbesondere wurden neuere Studien unter Verwendung der genetischen Mosaikanalyse-Werkzeuge in Drosophila melanogaster , wie FLP-FRT (Flippase-Rekombinase / Flippase-Rekombinase-Target) mitotisches RekombinatAtion 2 und Flip-out-GAL4-UAS (Upstream-Aktivierungssequenz) -Systeme 3 haben wesentlich dazu beigetragen, die genetischen Mechanismen der Bildung und Metastasierung der Tumore 4 , 5 , 6 besser zu verstehen.
Untersuchungen einer Gruppe konservierter Drosophila- Tumor-Suppressor-Gene, tödlicher Riesen-Larven ( lgl ), Scheiben groß ( dlg ) und Scribble ( Scrib ), unterstrichen die kritische Beziehung zwischen dem Verlust der Epithelorganisation und der Tumorentwicklung, da diese Gene eine Schlüsselrolle spielen In Regulation der apikalen Basalzellpolarität und Zellproliferation in Epithelgeweben 7 . Während Drosophila- Imagialscheiben normalerweise monolayered Epithelien sind, verursachen homozygote Mutationen in einem dieser drei Gene Zellen zu verlieren Struktur und Polarität, nicht zu unterscheidenVermietung, überproliferieren und letztlich mehrschichtige amorphe Massen bilden, die mit angrenzenden Geweben verschmelzen 7 . Ebenso ist die Störung dieser Gene bei Säugetieren an der Entwicklung von bösartigen Tumoren beteiligt 8 , 9 . Die neoplastischen Phänotypen, die von den mutierten Geweben gezeigt wurden, führten zur Klassifizierung dieser drei Gene als konservierte, neoplastische Tumorsuppressorgene (nTSGs) 7 , 8 . Wenn jedoch homozygote nTSG-Mutantenzellen sporadisch bei der Entwicklung von Wildtyp-Imagialscheiben unter Verwendung von FLP-FRT-vermittelter mitotischer Rekombination erzeugt werden, werden mutierte Zellen aus dem Gewebe durch c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) -abhängige Apoptose 10 , 11 eliminiert , 12 , 13 , 14 , Extrusion 15 , 16 oder Engagierung und Phagozytose durch Nachbarn 17 . In diesen genetisch mosaischen Epithelien wird die Apoptose meist in nTSG-Mutantenzellen, die sich an der Klongrenze befinden, nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass benachbarte normale Zellen die Apoptose der nTSG-Mutantenzellen 10 , 11 , 12 , 18 auslösen. Jüngste Studien in Säugetierzellen haben bestätigt, dass diese zellwettbewerbsabhängige Eliminierung von Pro-Tumor-Zellen ein evolutionär konservierter epithelialer Selbstverteidigungsmechanismus gegen Krebs ist. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Eine neuere Studie in Drosophila- Imagialscheiben zeigte jedoch, dass Mosaik-NTSG-Knockdown-Klone neoplastische Tumore induzierenIc Bereiche von Flügel imaginären Scheiben 16 . Die anfängliche Tumorbildung fand sich immer in der peripheren "Scharnierregion" und wurde niemals im zentralen "Beutel" -Bereich des Flügelscheibenepithels beobachtet, was darauf hindeutet, dass das tumorigene Potential der nTSG-Knockdown-Zellen von der lokalen Umgebung abhängt. Der zentrale Beutelbereich fungiert als "Tumor-Kaltfleck", wo Pro-Tumor-Zellen keine dysplastische Überwucherung zeigen, während sich die periphere Scharnierregion wie ein "Tumor-Hotspot" 16 verhält. In "Kaltfleck" Beutelregionen delaminieren nTSG-Knockdown-Zellen von der Basalseite und unterziehen sich der Apoptose. Im Gegensatz dazu, als "Hotspot" Scharnierzellen besitzen ein Netzwerk von robusten zytoskeletalen Strukturen auf ihren basalen Seiten, nTSG-Knockdown-Zellen delaminieren von der apikalen Seite des Epithels und initiieren tumorigene Überwucherung 16 . Daher erfordert die Analyse von Tumor-Phänotypen in imaginären Scheiben sorgfältige consiVerringerung der regionsspezifischen Anfälligkeit für tumorigene Reize.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der neoplastischen Tumorbildung in den Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung des GAL4-UAS- RNAi- Systems, durch das nTSG-Knockdown-Zellen in normalen Flügelscheibenepithelien erzeugt werden. Obwohl diese experimentellen Systeme nützlich sind, um die frühen Stadien von Krebs zu untersuchen, wurde eine eindeutige Klassifizierungsmethode zur Bewertung der Stadien der Tumorprogression in imaginären Scheibenepithelien bisher nicht klar beschrieben. Daher schlagen wir auch eine Diagnosemethode vor, um pro-Tumor-Klon-Phänotypen, die in den Flügelscheibenepithelien induziert werden, in drei Kategorien zu klassifizieren: Hyperplasie (Akkumulation einer übermäßigen Anzahl von normal erscheinenden Zellen mit erhöhter Proliferation), Dysplasie (prämalignes Gewebe, das aus ungewöhnlich erscheinendem zusammengesetzt ist Zellen) und Neoplasien (gutartiger oder bösartiger Tumor aus Zellen mit abnormalem Aussehen und abnormalem Proliferationsmuster).
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Protocol
1. Fliegen Sie Kreuze und Klon Induktion
- Entfernen Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche 12 h, bevor Sie Jungfliegen sammeln.
- Anästhesieren Sie die Fliegen in der Durchstechflasche, indem Sie CO 2 -Gas injizieren und Fliegen auf ein CO 2 -Flugpad legen.
- Übertragen Sie 10 - 20 Jungfrauen und 10 Männer aus dem CO 2 Fliegenkissen in eine frische Ampulle und inkubieren für 1 Tag bei 25 ° C.
- Übertragen Sie diese Fliegen in eine frische Ampulle und inkubieren für 12 h bei 25 ° C.
HINWEIS: Verwerfe die erste Durchstechflasche als Jungfrau Weibchen legen nicht genug Eier am ersten Tag. - Für Enhancer-GAL4-Linien entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren die Durchstechflasche bei 25 ° C bis zur Dissektion.
- Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4, entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren Sie die Durchstechflasche für 2 - 4 Tage bei 25 ° C. Die Inkubationszeit vor Hitzeschock ist abhängig vom experimentellen Zweck. Ein Hitzeschock 2 Tage nach Eiablagerung (AED) erzeugt Mosaikklone in unreifer SekundeImagin imaginale epithelien Ein Hitzeschock nach 3 oder 4 Tagen AED erzeugt Mosaikklone im differenzierten frühen bis mittleren Drittel der imaginären Epithelien.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Wirkung eines veränderten Hitzeschock-Timings auf tumorigene Phänotypen zu untersuchen. - Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4 wird die Durchstechflasche durch Eintauchen in ein 37 ° C-Wasserbad für 10 - 45 min erhitzt, gefolgt von einer Inkubation für 2 - 3 Tage bei 25 ° C.
HINWEIS: Die Informationen über die Hitzeschockzeit, das Timing und die Inkubationszeit in jedem Experiment sind in den Figuren der Legenden dargestellt.
2. Dissektion von Larven
- Sammeln Sie wandernde dritte Larven mit einem Holzstab oder einer stumpfen Pinzette, indem Sie sie durch geeignete fluoreszierende Marker ( z. B. EGFP) unter einem fluoreszierenden stereoskopischen Mikroskop herotypisieren und in eine Dissektion mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) geben.
- Die Larven in PBS durch Pipettieren mit 2 ml Plastikübertragungspipetten waschen.
- Klemmen Sie die Mitte der Larve mit einer Pinzette und reißen den Körper in der Hälfte mit der anderen Pinzette.
- Klemmen Sie den Mundhaken der vorderen Hälfte mit einer Pinzette und schieben Sie den Mund in Richtung des Körpers mit der anderen Pinzette, um den Körper von innen nach außen zu drehen.
- Entfernen Sie unnötige Materialien wie Speicheldrüsen oder Fettkörper mit Pinzette.
3. Fixierung und Antikörperfärbung
- Übertragen Sie die seziertes vordere Hälfte des Larvenkörpers (einschließlich der imaginären Flügelscheiben) auf ein 1,5 ml Plastikrohr und fixieren Sie in 1 ml Fixlösung (4% Formaldehyd in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichter Rotation.
ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig und hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden.
ANMERKUNG: In diesem Teil finden alle Schritte auf einem Nutator bei Raumtemperatur im Dunkeln statt, wenn nicht anders angegeben. - Entfernen Sie die Fix-Lösung und entsorgen Sie sie. Waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT (0,3% TritAuf X-100 in PBS) dreimal für jeweils 15 min.
- Entfernen Sie die PBT und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2% Rinderserumalbumin und 5% normales Ziegenserum in PBT) zum Blockieren und Nähren von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C hinzu.
- Entfernen Sie PBTG und fügen Sie eine primäre Antikörperlösung hinzu, die in geeigneter Weise mit PBTG verdünnt ist (siehe Materialtabelle ) und über Nacht bei 4 ° C nähren.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT dreimal für jeweils 15 min.
- PBT entfernen und sekundäre Antikörperlösung entsprechend mit PBTG (1: 400) verdünnen lassen. Für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Sekundäre Antikörperlösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen.
- Um F-Aktin zu färben, PBT zu entfernen und Phalloidin-Lösung zuzugeben, die in PBS (1:40) in geeigneter Weise verdünnt ist. Dann für 20 min nähren. Entfernen Sie die Phalloidin-Lösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min.
- Um Nuklear-DNA zu bekämpfen, PBT zu entfernen und DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) -Lösung (0,5 μg / ml DAPI in PBS) zuzugeben. Dann 10 min nähren.
ACHTUNG: DAPI hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden. - DAPI-Lösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen.
- Spülen Sie einmal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μl 100% Glycerin als Vormontagemedium hinzu.
4. Montage auf Mikroskop-Objektträger
- Legen Sie die gefärbten Gewebe auf eine Objektträger mit einer 2 ml Plastik-Transferpipette.
- Übertragen Sie das Gewebe auf Tropfen des Montagemediums auf einem anderen Mikroskop-Objektträger mit Pinzette.
- Halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette und ziehen Sie Gehirn und Augen Antenne Scheiben mit der anderen Pinzette.
HINWEIS: Halten Sie die zerlegten Gehirne, um sie in der Nähe der Flügel imaginären Discs zu platzieren. Die Gehirne fungieren als Plattform, die verhindert, dass das Deckglas die Flügel-Imagialscheiben zermalmt. - Um die Flügel-imaginären Scheiben zu isolieren, halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette fest und kratzen sanft die Körperwand und reißen die Scheiben mit der anderen Pinzette ab.
HINWEIS: Wenn es schwierig ist, Flügel imaginäre Scheiben zu finden, schälen Sie die Trachea von der hinteren zur vorderen Seite. Flügel-imaginäre Scheiben bleiben an der Trachea. - Die imaginären Scheiben vorsichtig mit einem Deckglas und einer Dichtung mit Nagellack bedecken; Bei 4 ° C aufbewahren.
5. Konfokale Mikroskopie
- Um konfokale Bilder unter Verwendung eines konfokalen Mikroskopsatz-Bilderfassungsparameters einschließlich des Bereichs der Emissionswellenlänge, der Laserintensität, des Verstärkungsfaktors, des Versatzes, der Abtastgeschwindigkeit und der Bildgröße 24 zu erhalten,
HINWEIS: Detaillierte Vorgehensweise bei der Einstellung der Bildaufnahme finden Sie in der Bedienungsanleitung des jeweiligen Mikroskopherstellers. - Um einzelne co zu erfassenNfocal Abschnitte einer ganzen Flügel imaginären Scheibe, verwenden Sie ein 20X Objektiv Objektiv.
- Erfassen Sie dreidimensionale Bilder durch z-Stapel-Scannen bei Schrittgröße von 0,5 - 1,0 μm mit 40X- oder 60X-Linsen.
HINWEIS: Um zelluläre Phänotypen in hoher Auflösung zu analysieren, sollte eine Bildgröße größer als 512 x 512 Pixel sein.
6. Bildanalyse mit ImageJ
- Verwenden Sie Fidschi, eine Open-Source-ImageJ-Software, die sich auf die biologische Bildanalyse (https://fiji.sc/) 25 konzentriert , um konfokale z-Stack-Bilder zu erfassen und zu analysieren.
- Um vertikale Abschnitte zu erwerben, öffnen Sie die Z-Stack-Bilder in ImageJ und wählen den Menüpunkt "Image / Stacks / Reslice".
HINWEIS: Im Menü Reslice sind entweder die XZ-Achse oder die YZ-Achse wählbar. Der vertikale Abschnitt kann auch in einer beliebigen Richtung erhalten werden, indem eine gerade Linie oder ein Rechteck auf das z-Stapelbild gezeichnet wird.
7. Diagnose von neoplastischen Phänotypen
- Öffnen Sie die Vertikale(XZ- oder YZ-Achse), die aus einem Satz von Z-Stack-Bildern erhalten wurden und morphologische Phänotypen und Antikörper-Färbung analysieren.
- Für die Diagnose von Tumor-Phänotypen konzentrieren sich vor allem auf die folgenden drei Punkte: (1) Wenn eine Zellmasse, einschließlich Knockdown-Klone, von der Hauptepithelschicht abweicht, (2) wenn die subzelluläre Lokalisation von junctionalen Proteinen in dieser Zellmasse verändert wird , Und (3) wenn der Durchmesser dieser Zellmasse größer als 4 Zellen ist.
- Kategorisieren Sie Tumor-Phänotypen gemäß dem in Abbildung 1 beschriebenen Flussdiagramm.
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Representative Results
Um die neoplastische Tumorbildung, die experimentell durch RNAi- vermittelte NTSG-Knockdown in Drosophila- Flügel-Imagialscheiben induziert wurde, zu demonstrieren, wurden drei verschiedene GAL4-Treiber verwendet, um UAS-RNAi für lgl oder scrib auszudrücken : (1) sd-GAL4, das eine starke UAS-Expression in der Flügelbeutel und milde Expression in den Scharnierbereichen ( Fig. 2 und Fig. 3A ); (2) upd-GAL4, die in Subdomänen des Scharniers fährt, einschließlich starker Expression in zwei Domänen der dorsalen medialen Falte, milde Expression in einem anterior-lateralen Bereich und schwache Expression im ventral-posterioren Bereich ( Abbildung 2 und Abbildung 3C ); Und (3) Hitzeschock-induzierter Flip-out GAL4, der zufällige Mosaikklone erzeugt, die UAS-Gene exprimieren ( Abbildung 4 und Fi5). In allen Experimenten wurde UAS-EGFP mit UAS-RNAi co-exprimiert, um die Knockdown-Klone zu markieren.
Zuerst wurde sd-GAL4- angetriebenes lgl-RNAi verwendet, um ein Knockdown von lgl in den Flügelbeutel und den Scharnierbereichen zu induzieren. Bei der Kontrolle der dritten Instanzflügelscheiben ohne UAS-lgl-RNAi trat keine morphologische Veränderung auf ( Abbildung 3A ). Im Gegensatz dazu wurden in dritten Flügelscheiben, die lgl-RNAi exprimierten, epitheliale Deformationen und tumorigene Überwuchungen in bestimmten Teilen des Scharniers deutlich beobachtet ( Abbildung 3B ). Im Flügelbeutelbereich wurde jedoch keine dysplastische Überwucherung beobachtet. Starke MMP1 (Matrix-Metalloprotease-1) -Expression wurde in den Tumor-Scharnier-Läsionen beobachtet, aber nicht im Flügel-Beutelbereich ( Fig. 3B ). Da MMP1-Expression an der Verschlechterung der Basalmembran beteiligt istEs ist möglich, dass diese Scharniertumore eine metastatische Fähigkeit haben ( Abbildung 3B ). Als nächstes wurde upd-GAL4 verwendet, um den Lgl- Knockdown im Scharnierbereich zu induzieren. Bei der Kontrolle von dritten Instalflügelscheiben ohne UAS-lgl-RNAi traten keine morphologischen Veränderungen auf ( Abbildung 3C ). Nach 5 Tagen AED zeigten jedoch die dritten Instalflügelscheiben mit upd-GAL4 und lgl-RNAi eine prominenten epithelialen Desorganisation mit F-Aktin-Akkumulation und Klonverschiebung aus der Epithelschicht ( Abbildung 3D ). Bei 6 Tagen AED wurden neoplastische Tumore, die das MMP1 exprimieren, im Scharnierbereich ( Abb. 3G ), wenn auch mit einer Veränderung der Tumorgröße zwischen den Proben ( Abbildung 3E und F ). Ein vertikaler Querschnitt des Scharnierbereichs bestätigte, dass der neoplastische Tumor abweichendes Auswachsen an der apikalen Seite der Epithelschicht ( Um die Progression des Tumorwachstums zu überwachen, die durch den lgl- Knockdown induziert wurde, wurden sporadische Klone, die lgl-RNAi exprimierten , in Flügelscheiben unter Verwendung des Hitzeschock-induzierten Flip-out-GAL4-Mosaiksystems erzeugt. Zwei Tage nach dem Hitzeschock zu den zweiten Larven (2 Tage AED) zeigten einige lgl- Knockdown-Klone, die sich im Scharnierbereich befanden, Abweichung von der apikalen Seite der Epithelschicht ( Abbildung 4A ). Vier Tage nach der Hitzeschock-Induktion wurden dysplastische Läsionen im Scharnierbereich deutlich, was darauf hindeutet, dass die von der apikalen Seite weg verschobenen lgl- Knockdown-Klone im Lumen vermehren ( Abbildung 4B ). Sieben Tage nach der Hitzeschock-Induktion dominierten tumorigene Überwuchungen die Scharnierregionen ( Abbildung 4C ). Um das zu demonstrierenKlassifikation von klonalen Phänotypen mit unserer Diagnosemethode wurden sporadische Klone, die Scrib-RNAi exprimieren , in Flügelscheiben unter Verwendung des Hitzeschock-induzierten Flip-out-GAL4-Mosaiksystems erzeugt. Fünf Tage nach dem Hitzeschock zu den zweiten Larven (2 Tage AED) zeigten bestimmte GFP-exprimierende Scrib- Knockdown-Klone tumorigene Phänotypen ( Abbildung 5A ). Wir analysierten vier Klone (B, C, D und E in Abbildung 5A ) in vertikalen Abschnitten von z-Stack-konfokalen Bildern unter Verwendung von ImageJ, da es schwierig ist, die detaillierten zytologischen und strukturellen Phänotypen in den 2D konfokalen Bildern zu erfassen ( Abbildung 4 und Abbildung) 5A ). Die Klone B und C wurden als Dysplasie als Septat-Junction-Protein identifiziert. Die Scheiben (Dlg) wurden mislocalisiert ( Abbildung 5B und C ). Im Klon B war die Größe der aus dem Epithel verdrängten Zellmasse nicht größer als 4-Zellen in DiameteR ( Fig. 5B ), während der Klon C nicht vom Epithel abweicht ( Fig. 5C ); Daher wurden die Klone B und C nicht als neoplastisch betrachtet. Jedoch bildeten die Klone D und E, die auch eine Fehllokalisierung von Dlg zeigten, Tumorzellmassen außerhalb des Epithels ( Fig. 5D Und 5E ). Da die Größe dieser versetzten tumorösen Klone mehr als 4 Zellen im Durchmesser betrug, wurden die Klone als neoplastisch klassifiziert. Um hyperplastische Tumore oder Zyste-Formationen in den Flügel-Imagialscheiben zu induzieren, wurden sporadische Klone, die onkogene Ras ( Ras V12 ) exprimieren, oder eine konstitutiv aktive Form von Yorkie, ein Transkriptions-Coaktivator des Hippo-Weges ( Yki 3SA ), unter Verwendung des Hitzeschock-induzierten erzeugt Flip-out GAL4 Mosaik System. Vier Tage nach Hitzeschock zu den zweiten Larven (2 Tage AED), RaS V12- exprimierende Klone, die von GFP markiert wurden, wurden zu runden Zellmassen in den imaginären Scheiben ( Abbildung 6A ). Ein vertikaler Schnitt des Ras V12- exprimierenden Klons (Klon B in Abbildung 6A ) ergab, dass die von der Epithelschicht dissoziierte Zellmasse eine korrekte Lokalisation von Dlg aufweist, was darauf hindeutet, dass die Zellmasse normale Epithelstrukturen außerhalb der Epithelschicht aufrechterhält ( Abbildung 6B ) . MMP1-Expression wurde in diesen Ras- V12- exprimierenden Klonen nicht beobachtet ( Abbildung 6C ). Daher wurde der Klon B als Zyste-Bildung klassifiziert. Vier Tage nach Hitzeschock zu den zweiten Larven (2 Tage AED) bildeten Yki 3SA- exprimierende Klone, die von GFP markiert wurden, große Zellmassen in den imaginären Scheiben ( Abbildung 7A ). Wir konzentrierten uns auf zwei Klone (B und C in Abbildung 7A ). Klon B zeigteDie Integration in die Epithelschicht und die korrekte Lokalisation von Dlg in den subapikalen Membranen der Epithelzellen, was darauf hindeutet, dass der Yki 3SA- exprimierende Klon B eine Epithelstruktur aufrechterhielt. Daher wurde Klon B als Hyperplasie klassifiziert ( Abbildung 7B ). Klon C, der sich im Scharnierbereich befand, zeigte eine Fehllokalisierung von Dlg und bildete eine mehrschichtige Struktur an der Basalseite der Epithelschicht. MMP1-Expression wurde in den Yki 3SA- exprimierenden Klonen nicht beobachtet. Zusammengenommen wurde Klon C als gutartige Neubildung eingestuft ( Abbildung 7C und D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Abbildung 1: Flussdiagramm zur Klassifizierung von Tumorphänotypen. Dieses Flußdiagramm stellt eine Diagnosemethode dar, um klonale Läsionen in imaginären Epithelien zu klassifizieren. Der KlassikerAtion basiert auf fünf Kriterien: (1) Abweichung von Klonen aus der Epithelschicht, (2) subzelluläre Mislocalisierung von junctionalen Proteinen, (3) zelluläre Proliferation, (4) Klongröße und (5) MMP1-Expression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2: ( A ) Wildtyp-Flügel-imaginäre Scheibe gefärbt für Dlg (grün) und Kerne (DAPI, Magenta). ( B ) Schematische Darstellung von Drosophila-Flügel-imaginären Scheiben, die Flügelbeutel (blau), Scharnier (orange) und Notum (grüne) Regionen zeigen. ( C ) Normalflügel-imaginäre Scheibe gefärbt für F-Aktin (rot) und Mikrotubuli (grün). Basalmembranen sind mit Collagen IV / Vkg-GFP (blau) markiert. ( D ) Vertikaler Abschnitt der SeiteMarkiert mit weißer punktierter Linie in ( C ). ( E ) Linienzeichnungen verfolgen die apikalen (roten) und basalen (blauen) Seiten der Epithelschicht in ( D ). Die gestrichelten Linien verfolgen die peripodiale Membran. Distale (Df), mediale (Mf) und proximale (Pf) Falten des dorsalen Scharniers sind angegeben.
Detaillierte Genotypen: A, W - CD, VKG-GFP Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3: Site-spezifische Tumorigenese induziert durch Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Konfokale Bilder zeigen Flügel-imaginäre Scheiben, die aus den dritten Larven der Larven der angegebenen Genotypen, die für MMP1 (rot) gefärbt sind, zerlegt werden. Das sd-GAL4 -expreSinterregionen wurden durch GFP-Expression (grün) markiert. ( CG ) Konfokale Bilder zeigen Flügel-imaginäre Scheiben, die von den dritten Larven der Larven der angegebenen Genotypen zum angegebenen Zeitpunkt AED seziert wurden. F-Aktin wurde mit Phalloidin (rot) in ( CF ) gefärbt. Die MMP1-Expression wird mit Anti-MMP1-Antikörpern (rot) in ( G ) gefärbt. Die Aktual-GAL4- exprimierenden Regionen wurden durch GFP-Expression (grün) markiert. Die unteren Platten von ( CF ) zeigen vergrößerte Ansichten der Regionen, die in den oberen Tafeln angegeben sind. Weiße Pfeile zeigen dysplastische Läsionen, die durch lgl- Knockdown-Klone induziert werden. ( H ) Vertikaler Abschnitt der Stelle, der mit einer weißen gestrichelten Linie in der Bodenplatte von (E) markiert ist. Weiße punktierte Linien markieren die Grenzen zwischen Flügelbeutel und Scharnierbereichen in (A) und (B). Nuklei wurden mit DAPI (blau) markiert. Maßstäbe = 100 μm in (AG) und 50 μm in (H). Detaillierte Genotypen: A, W - , Sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 4: Tumor-Phänotypen induziert durch zufällige Mosaik-Klone. ( AC ) Konfokale Bilder zeigen Mosaikflügel-imaginäre Scheiben von dritten Instar-Larven mit Klonen, die lgl-RNAi und GFP (grün) zum angegebenen Zeitpunkt nach der Hitzeschockinduktion ausdrücken. Nuklei wurden durch DAPI (blau) markiert. Die mittleren Platten zeigen eine vergrößerte Ansicht der weißen quadratischen Regionen, die in den linken Tafeln markiert sind. Das rechte Panel S zeigen schematische Linienzeichnungen der apikalen Seite der Epithelschichten (blau) und der GFP-exprimierenden Klone (grün). Mosaikklone, die sich innerhalb des Epithels befinden, sind in hellgrün dargestellt, während neoplastische Tumore, die vom Epithel abweichen, in Magenta gezeigt werden. Weiße punktierte Linien in den linken Tafeln markieren die Grenzen zwischen Flügelbeutel und Scharnierregionen. Weiße Pfeile in den mittleren Tafeln zeigen dysplastische Läsionen, die durch lgl- Knockdown-Klone induziert werden. Maßstäbe = 100 μm. Detaillierte Genotypen: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Aktie> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi ( hitzeschüttelt 30 min bei 2 Tagen AED, 2 Tage bei 25 ° C in A inkubieren, 4 Tage bei 25 ° C in B inkubieren, 7 Tage bei inkubieren 25 ° C in C nach Hitzeschock). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Diagnostische Untersuchung von dysplastischen klonalen Phänotypen. ( A ) Die linke Tafel zeigt eine Mosaikflügel-imaginäre Scheibe der dritten Instar-Larve mit Klonen, die scrib-RNAi und GFP (grün) 5 Tage nach der Hitzeschock-Induktion co-exprimieren, gefärbt für Dlg (rot). Die rechte Tafel zeigt eine schematische Linienzeichnung der apikalen Seite der Epithelschichten (blau) und der GFP-exprimierenden Klone (grün). Mosaikklone in den Epithelschichten sind hellgrün dargestellt, während neoplastische Tumore, die aus dem Epithel verdrängt sind, in Magenta gezeigt werden. ( BE ) Die konfokalen Bilder zeigen vertikale Abschnitte der im rechten Bereich von (A) angegebenen Scrib- Knockdown-Klone. Die zweiten Panels von links zeigen die Dlg-Lokalisierungsmuster (rot). Die dritten Tafeln von links zeigen schematische Linienzeichnungen der apikalen (roten) und basalen (blauen) Seiten der Epithelschichten und der GFP-exprEssing scrib -knockdown clones (grün). Dysplastische Klone in den Epithelschichten sind in hellgrün (B und C) dargestellt, während neoplastische Klone, die aus dem Epithel verdrängt sind, in Magenta (D und E) gezeigt sind. Weiße Pfeile zeigen Scrib- Knockdown-Klone mit tumorigenem Phänotyp. Nuklei wurden mit DAPI (blau) markiert. Maßstab = 50 μm. Der Tumor-Phänotyp jedes Klons wurde gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Flußdiagramm klassifiziert. Detaillierte Genotypen: AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (hitzeschockiert 30 min bei 2 Tagen AED, 4 Tage bei 25 ° C nach Hitzeschock inkubieren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 6: DiagnosenTic Untersuchung von Ras V12- exprimierenden klonalen Phänotypen. ( A ) Die linke Tafel zeigt eine Mosaikflügel-imaginäre Scheibe der dritten Instar-Larve mit Klonen, die onkogene Ras V12 und GFP (grün) 4 Tage nach der Hitzeschock-Induktion ausdrücken, für Dlg (rot) gefärbt. Die rechte Tafel zeigt eine schematische Linienzeichnung der apikalen Seite der Epithelschichten (blau) und der GFP-exprimierenden Klone (grün). Der Skalenbalken repräsentiert 50 μm. ( B ) Vertikale Abschnitte der Ras V12 , die Klone ausdrücken, die im rechten Bereich von (A) angegeben sind. Die zweiten Panels von links zeigen die Dlg-Lokalisierungsmuster (rot). Die dritten Tafeln von links zeigen schematische Linienzeichnungen der apikalen (roten) und basalen (blauen) Seiten der Epithelschichten und der Ras V12 und GFP, die Klone ausdrücken (grün). Maßstab = 25 μm. ( C ) Mosaik Flügel imaginäre Scheibe der dritten Instar Larve mit Klonen co-expressing <Em> Ras V12 und GFP (grün) 4 Tage nach Hitzeschock-Induktion, gefärbt für MMP1 (rot). Maßstab = 100 μm. Detaillierte Genotypen: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (hitzeschockiert 45 min bei 2 Tagen AED, 4 Tage bei 25 ° C nach Hitzeschock inkubieren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 7: Diagnostische Untersuchung von Yki 3SA- exprimierenden klonalen Phänotypen. ( A ) Die linke Tafel zeigt eine Mosaikflügel-imaginäre Scheibe der dritten Instar-Larve mit Klonen, die konstitutiv aktiv Yki 3SA und GFP (grün) 4 Tage nach der Hitzeschock-Induktion, gefärbt für Dlg (rot), ausdrücken. Das rechte Panel zeigt als Chemische Linienzeichnung der apikalen Seite der Epithelschichten (blau) und der GFP-exprimierenden Klone (grün). Maßstab = 50 μm. ( BC ) Vertikale Abschnitte der Yki 3SA , die Klone ausdrücken, die im rechten Feld von (A) angegeben sind. Die zweiten Panels von links zeigen die Dlg-Lokalisierungsmuster (rot). Die dritten Tafeln von links zeigen schematische Linienzeichnungen der apikalen (roten) und basalen (blauen) Seiten der Epithelschichten und der Yki- und GFP-exprimierenden Klone (grün). Maßstab = 25 μm. ( D ) Mosaikflügel Phantasie Scheibe der dritten Instar Larve mit Klonen co-Expression Yki 3SA und GFP (grün) 4 Tage nach Hitzeschock Induktion, gefärbt für MMP1 (rot). Maßstab = 100 μm. Detaillierte Genotypen: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( hitzeschockiert 30 min bei 2 Tagen AED, 4 Tage bei 25 ° C inkubieren).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das GAL4-UAS-System ist eines der leistungsstärksten genetischen Werkzeuge für die gezielte Genexpression in Drosophila 26 und erleichtert die Injektion und Analyse von Tumorzellen in vivo 4 . Dieses System ermöglicht die Erzeugung von Klonen, die den Knockdown von Tumorsuppressorgenen oder die Überexpression von Onkogenen im Wildtyp-Epithelgewebe tragen, eine Situation, die den Anfangsstadien des menschlichen Krebses sehr ähnlich ist, wo transformierte Protumorzellen von normalen Epithelzellen umgeben sind. GAL4-Treiberlinien, die durch Enhancer-Sequenzen wie GAL4 Enhancer-Trap-Linien oder Janelia GAL4-Linien 27 reguliert werden, haben einzigartige, räumlich zeitlich beschränkte Expressionsmuster. Daher sind diese Enhancer-GAL4-Linien nützlich, um Tumore konsequent in eingeschränkten Bereichen von imaginären Scheiben zu induzieren. Zusätzlich zu sd-GAL4 und upd-GAL4 in dieser Studie gezeigt, bestätigten wir, dass lgl- knockdown induziert by andere Enhancer-Trap - GAL4 Linien , einschließlich engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotorischen Blind-GAL4 (OMB-GAL4), patched-GAL4 (ptc-GAL4) und spalt-Major- GAL4 ( Salm-GAL4 ) kann in den Scharnierbereichen der Flügel-Imagialscheiben neoplastische Tumore erzeugen. Wenn das Enhancer-GAL4-Expressionsmuster zeitlich gesteuert werden muss, ist eine Kombination aus GAL4 und einer temperaturempfindlichen Version von GAL80 (GAL80 ts ) möglich. GAL80 ts reprimiert GAL4 - Funktion bei 18 ° C , aber nicht bei 29 ° C, der UAS-Transgene Expression ermöglicht ein- oder ausgeschaltet , wie erforderlich , 28 geschaltet werden.
Das Flip-out-GAL4-Mosaiksystem, das das FLP-FRT-System und das GAL4-UAS-System 3 kombiniert, erzeugt zufällige Klone in imaginären Scheiben. Durch die Kombination von Hitzeschock-induzierbaren Flippase (hsFLP) mit Flip-out GAL4, dem Timing des KlongeneratorsIon ist kontrollierbar. Da das tumorigene Potential von imaginären Scheibenzellen von der Entwicklungsstufe, den endogenen Signalisierungsereignissen und / oder der zellulären Differenzierung 29 , 30 abhängig sein kann, ist es sehr wichtig, die Wirkung eines veränderten Hitzeschock-Timings auf tumorigene Phänotypen zu untersuchen.
Es wurde bereits gezeigt, dass nTSG-Mutanten-Klone einer zellwettbewerbsabhängigen Apoptose unterliegen, wenn sie von Wildtyp-Zellen 10 , 11 , 12 , 18 umgeben sind , was darauf hindeutet, dass mehrere Mutationen für die Zelltransformation während der Krebsentwicklung erforderlich sind. In der Tat, Überexpression von onkogenen Ras oder Yki in lgl oder scrib Mutante Klone verwandelt sie in aggressive Tumoren 10 , 18 , 31 während misDie Expression von Ras V12 oder Yki 3SA induziert keine maligne Neubildung selbst ohne nTSG-Mutationen. Wie hier und vorher 16, Pro-Tumor gezeigt erzeugte nTSG-Knock - Down - Klone in Flügel Wildtyp - Scheiben durchläuft auch die Apoptose und zeigt nicht tumorigenesis im Flügel Beutel 16. Gleichzeitig entwickeln sich nTSG-Knockdown-Klone, die sich in Scharnier-Hotspots befinden, zu neoplastischen Tumoren ohne zusätzliche onkogene Mutationen. In Scharnierbereichen entstellen nTSG-defiziente Zellen endogene Janus-Kinase / Signalwandler und Aktivator der Transkription (JAK / STAT) Signalisierung zur Tumorientese 16 . Daher sind Scharnierspezifische GAL4s wie upd-GAL4 nützliche Werkzeuge zur konsequenten Induktion der neoplastischen Tumorbildung durch RNAi- vermittelten Knockdown von Tumorsuppressergenen. Obwohl Flip-out-GAL4-induzierte nTSG-Knockdown-Mosaikklone auch neoplastische Tumore im Scharnier re induzierenGionen ist das Tumorigenese-Vorkommen von der anfänglichen Klongröße abhängig: Große Klone, die durch einen Hitzeschock über 20 min erzeugt werden, induzieren gewöhnlich eine Tumorentstehung, während die meisten kleinen Klone, die durch Hitzeschock kürzer als 10 min erzeugt werden, vollständig eliminiert werden (KM und YT, unveröffentlichte Daten).
Eine Reihe von neueren Studien über Tumorentwicklung und Krebs Progression verwenden Drosophila imaginäre Scheiben als Modell-System 32 , 33 . Zu diesen Studien gehören mehrere Marker von neoplastischen Tumoren: abweichende Zellmassen, deformierte Scheibenformen, Akkumulation von F-Aktin, verstärkte Zellzyklen (BrdU / EdU-Inkorporation oder PH3-Expression), Aktivierung der JNK-Signalisierung und ihrer nachgeschalteten Target-MMP1-Basalmembran Störung und / oder epitheliale Desorganisation, einschließlich Verlust oder subzelluläre Delokalisierung von Proteinen, die an der apikalen Basalzellpolarität beteiligt sind (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 oder PAR-6), Septat-Übergänge(Lgl, Scrib, Dlg oder Coracle) oder Adhäsionsverbindungen (E-Cadherin oder Gürteltier). Diese Phänotypen sind durch herkömmliche Antikörperfärbung leicht nachweisbar. Obwohl es schwierig ist, festzustellen, ob ein klonaler Phänotyp Hyperplasie, Dysplasie, gutartige Neubildung oder bösartige Neubildung im frühen Stadium der Tumorentstehung ist, sollte es in den Drosophila- Phantasie-Scheibenepithelien, die aus einer einzigen epithelialen Monoschicht zusammengesetzt sind, einfacher sein. In dieser Studie haben wir eine Diagnosemethode eingeführt, um die in der Epithelmonoschicht induzierten Tumor-Klon-Phänotypen zu klassifizieren ( Abbildung 1 ). Diese Methode erfordert sorgfältige Beobachtungen von fünf Kriterien mit z-Stack konfokalen Bildern; Jedes diagnostische Kriterium kann durch konventionelle Antikörperfärbung und konfokale Bildgebung untersucht werden. Eines der neuen Kriterien, die wir in dieser Methode eingeführt haben, sind "4-Zellen-Durchmesser-Kriterien", die zwischen Dysplasie und Neoplasie in imaginären Scheiben unterscheiden. Pro-Tumor-Zellen wie nTSG-Mutanten-Klone sind häufigAus den Epithelschichten durch Zellwettbewerb oder Spindel-Fehlorientierung 15 , 16 , 34 extrudiert. In den meisten Situationen, diese extrudierten Zellen apoptose, und so können sie nicht proliferieren. Obwohl es möglich wäre, dass die Pro-Tumor-Zellen einmal während der Extrusion eine Zellteilung erfahren und ein- oder zweimal mehr nach der Extrusion vorliegen, ergibt sich eine Zellmasse von 2- bis 3-Zellen-Durchmesser. Wenn also eine Zellmasse von Pro-Tumor-Zellen von der Epithelschicht abweicht, größer als der 4-Zellen-Durchmesser ist, können wir feststellen, dass sie überleben und sich als Neoplasie außerhalb der Epithelschicht vermehren.
Obwohl diese Diagnose-Methode einfach ist, ist es entscheidend, einen Zeitverlauf von Phänotypen zu nehmen, da die Tumorentwicklung und die Malignität im Laufe der Zeit fortschreiten. Zum Beispiel ist Dysplasie ein zytologisch abnormales Gewebe und ein Übergangszustand zwischen vollständig gutartigen Wucherungen und denen, die vor sindmaligne. Auch wenn ein beobachteter Klon als Dysplasie nach dem Flußdiagramm definiert ist ( Abbildung 1 ), ist es möglich, dass sich die Dysplasie anschließend zu einer Neoplasie entwickelt. Obwohl das Larvenstadium zeitlich begrenzt ist (5 - 6 Tage bei 25 ° C oder 4 - 5 Tagen bei 29 ° C AED), verlängert das Tumorwachstum bei imaginären Scheiben die Larvenstufe durch eine Insulin-ähnliche Peptid-induzierte Verzögerung der Pupariation 35 , 36 Daher macht die neoplastische Tumorbildung in imaginären Scheiben es möglich, die Phänotypen des Tumorklons für mehrere Tage zu beobachten. Unsere einfache Klassifizierungsmethode kann weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken J. Vaughen für kritisches Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 und The Takeda Science Foundation Research Grant zu YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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