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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

में ट्यूमर के प्रेरण और निदान Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/55901
Automatic Translation
1,2, 1
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Summary

ड्रोसोफिला कल्पना का डिस्क एपिथेलिया में मोजाइक क्लोन विश्लेषण ट्यूमोरिजेन्सिज़ के आनुवंशिक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। यहाँ हम GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करते हुए ड्रोसोफिला विंग काल्पनिक डिस्क में ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और ट्यूमर फेनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का परिचय देते हैं।

Abstract

कैंसर के प्रारंभिक दौर में, उत्परिवर्ती कोशिकाओं को बदलकर, कोशिका संबंधी असामान्यताएं दिखाई देती हैं, अनियंत्रित अतिवृद्धि शुरू होती है, और ऊतक संगठन को उत्तरोत्तर बाधित होती है। ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर ट्यूमोरिजिनेसिस के आनुवांशिक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए कैंसर जीव विज्ञान में एक लोकप्रिय प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला कल्पना के लिए आनुवांशिक उपकरण (लार्वा में एपिथेलिया का विकास) एक सामान्य उपकला टिशू के भीतर बदलकर समर्थक ट्यूमर कोशिकाओं के निर्माण को सक्षम करता है, जो मानव कैंसर के प्रारंभिक चरण के समान है। ड्रोसोफिला विंग काल्पनिक डिस्क में ट्यूमोरिजिनेसिस के एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि ट्यूमर की शुरुआत ऊतक-आंतरिक cytoarchitecture और स्थानीय सूक्ष्म ऊर्जा पर निर्भर करती है, यह सुझाव देती है कि ट्यूमरिजेनिक उत्तेजनाओं को ट्यूमरिजेनिक उत्तेजनाओं को कल्पना के लिए ट्यूमर phenotypes में मूल्यांकन करने पर विचार करना महत्वपूर्ण है। डिस्क। ट्यूमर प्रगति के फेनोटाइपिक विश्लेषण की सुविधा के लिएकल्पनाशील डिस्क पर, यहां हम विस्फोट काल्पनिक डिस्क में नवपालक ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करते हुए आनुवंशिक प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम आगे कल्पनात्मक एपिथेलिया में प्रेरित क्लोनल घावों के फेनोटाईप्स को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का परिचय देते हैं, क्योंकि ट्यूमर की प्रगति के विभिन्न चरणों (जैसे हाइपरप्लासिया, डिस्प्लेशिया, या नियोप्लासिया) को भेदभाव करने के लिए एक स्पष्ट वर्गीकरण विधि के रूप में पहले वर्णित नहीं किया गया था। ड्रॉसोफिला में विभिन्न अंगों में ट्यूमर फेनोटाइप के क्लोनल विश्लेषण के लिए ये विधियां मोटे तौर पर लागू हो सकती हैं।

Introduction

उपकला ऊतक अत्यधिक संगठित सिस्टम हैं जिनके विकास और सेल टर्नओवर के माध्यम से अपने संगठन को बनाए रखने की उल्लेखनीय होमोस्टेटिक क्षमता है। हालांकि, यह मजबूत स्व-आयोजन प्रणाली, ट्यूमर के विकास के दौरान उत्तरोत्तर बाधित है। ट्यूमर के विकास की शुरुआत में, ऑन्कोजीन सक्रियण या ट्यूमर-दमनकारी जीन निष्क्रियता से उत्पन्न होने वाली व्यक्तिगत उत्परिवर्ती कोशिकाएं एक उपकला परत के भीतर उभरती हैं। जब यह रूपांतरित "प्रो-ट्यूमर सेल" एक दमनकारी वातावरण से बचा जाता है, उपकला संगठन को बाधित करता है, और अनियंत्रित प्रसार शुरू होता है, ट्यूमोरिजिनेसिस 1 होता है पिछले कुछ दशकों के दौरान आनुवंशिकी और आणविक जीव विज्ञान में बकाया तकनीकी प्रगति ने कैंसर अनुसंधान पर उल्लेखनीय प्रगति की है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में आनुवंशिक रूप से मोज़ेक विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करते हुए हाल ही के अध्ययन, जैसे कि FLP-FRT (फ्लिप्पस रिंकंबेस / फ्लिपबेस रीकंबीनस लक्ष्य) mitotic recombinआयन 2 और फ्लिप-आउट- जीएएल 4-यूएएस (अपस्ट्रीम सक्रिय अनुक्रम) सिस्टम 3 , ट्यूमर 4 , 5 , 6 के गठन और मेटास्टेसिस में शामिल आनुवांशिक तंत्र को बेहतर समझने में काफी योगदान दिया है।

संरक्षित ड्रोसोफिला ट्यूमर शमन करने वाले जीन का एक समूह, घातक विशाल लार्वा (LGL), डिस्क बड़े (dlg), और घसीटना (scrib) के अध्ययन, उपकला संगठन और ट्यूमर के विकास के नुकसान के बीच महत्वपूर्ण संबंध पर प्रकाश डाला, के रूप में इन जीनों महत्वपूर्ण भूमिका निभाते एपिकल-बेसल सेल पोलारिटी के विनियमन और उपकला ऊतकों 7 में सेल प्रसार जबकि ड्रोसोफिला कल्पना डिस्क्स आमतौर पर मोनोलेयर एपिथेलिया हैं, इनमें से किसी भी तीन जीन में होमोजियग्ज म्यूटेशन कोशिकाएं संरचना और ध्रुवीकरण खोने का कारण बनती हैंकिराए पर करना, अतिरंजित और अंततः बहुपरमेय अनाकार वाले लोगों का निर्माण होता है जो आसन्न ऊतकों के साथ फ्यूज 7 इसी प्रकार, स्तनधारियों में इन जीनों का विघटन, घातक ट्यूमर 8 , 9 के विकास में शामिल है। उत्परिवर्ती ऊतकों द्वारा प्रदर्शित नवप्रोपिक phenotypes ने इन तीन जीनों के वर्गीकरण को संरक्षित, नवप्रोपिक ट्यूमर-सप्रेस दांत (एनटीएसजी) 7 , 8 के रूप में वर्गीकृत किया है। हालांकि, जब होमोजीजीस एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं को जंगली-प्रकार की कल्पना डिप्लोक्स के विकास में उत्पन्न किया जाता है, तो FLP-FRT-mediated mitotic recombination का उपयोग कर, उत्परिवर्ती कोशिकाओं को ऊतक से सी-जून एन-टर्मिनल किनेज (जेएनके) -निर्धारित एपोपोसिस 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , एक्सट्रूज़न 15 , 16 , या पड़ोसियों द्वारा घुसपैठ और phagocytosis 17 आनुवंशिक रूप से मोज़ेक एपिथेलिया में, एपोपोसिस को ज्यादातर क्लोन सीरेज़ पर स्थित एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं में पाया जाता है, यह सुझाव देता है कि आसन्न सामान्य कोशिकाओं ने एनटीएसजी उत्परिवर्ती कोशिकाओं 10 , 11 , 12 , 18 के एपोपोसिस को ट्रिगर किया। स्तनधारी कोशिकाओं में हाल के अध्ययन ने पुष्टि की है कि प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं के इस सेल प्रतिस्पर्धा पर निर्भरता उन्मूलन 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 के कैंसर के खिलाफ एक विकासशील संरक्षित उपकला स्वयं रक्षा तंत्र है।

ड्रोसोफिला कल्पना डिस्क्स में एक हालिया अध्ययन, हालांकि, दिखाया गया है कि मोज़ेक एनटीएसजी-नॉकडाउन क्लोन ने नवोप्लेस्टिक ट्यूमर को निर्दिष्ट में लाया हैआईसी के पंख कल्पना के डिस्क क्षेत्रों 16 शुरुआती ट्यूमर गठन हमेशा परिधीय "हिंग" क्षेत्र में पाया जाता था और कभी-कभी पंख डिस्क उपकला के केंद्रीय "पाउच" क्षेत्र में नहीं देखा जाता था, यह सुझाव देते हुए कि एनटीएसजी-दस्तक की कोशिकाओं की ट्यूमेरीजेनिक क्षमता स्थानीय पर्यावरण पर निर्भर करती है। सेंट्रल पाउच क्षेत्र "ट्यूमर ठंडस्पोट" के रूप में कार्य करता है जहां प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं को डिसएप्लास्टिक ओवरग्रोथ नहीं दिखाती है, जबकि परिधीय काज क्षेत्र "ट्यूमर हॉटस्पॉट" 16 के रूप में व्यवहार करता है। "थूकपॉट" पाउच क्षेत्रों में, एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिकाओं को बेसल तरफ से विस्फोट किया जाता है और एपोप्टोसिस होता है। इसके विपरीत, "हॉटस्पॉट" कणिका कोशिकाओं के रूप में उनके बेसल पक्षों पर मजबूत साइटोस्केलेलेट संरचनाओं का एक नेटवर्क है, एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिकाओं ने एपिथेलियम के शिखर पक्ष से भिगोया और ट्यूमेरीजेनिक अतिवृद्धि 16 आरंभ किया। इसलिए, कल्पनात्मक डिस्क में ट्यूमर फ़िनोटीप्स के विश्लेषण के लिए सावधानीपूर्वक कॉन्सी की आवश्यकता होती हैट्यूमेरीजेनिक उत्तेजनाओं के लिए क्षेत्र-विशिष्ट संवेदनशीलता की गति।

यहां, हम जीओएल 4-यूएएस- आरएनएआई प्रणाली का उपयोग करते हुए ड्रोसोफिला विंग इम्प्लांटल डिस्क्स में नियोप्लास्टिक ट्यूमर गठन को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके द्वारा सामान्य विंग डिस्क एपिथेलिया में एनटीएसजी-नॉकडाउन कोशिका उत्पन्न होती हैं। यद्यपि इन प्रयोगात्मक प्रणालियां कैंसर के शुरुआती चरणों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, हालांकि, कल्पित डिस्क एपिथेलिया में ट्यूमर प्रगति के चरणों का मूल्यांकन करने के लिए एक स्पष्ट वर्गीकरण विधि स्पष्ट रूप से पहले वर्णित नहीं है। इसलिए, हम तीन श्रेणियों में विंग डिस्क एपिथेलिया में प्रेरित प्रो-ट्यूमर क्लोनल फेनोनिटि को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति का प्रस्ताव भी देते हैं: हाइपरप्लासिया (बढ़ी हुई प्रसार के साथ सामान्य दिखाई देने वाले कोशिकाओं की एक अत्यधिक संख्या में संचय), डिस्प्लासीआ (असामान्य रूप से प्रदर्शित होने से बना प्रीमेंग्लांट टिशू) कोशिकाओं), और नेपलाशिया (सौम्य या घातक ट्यूमर जिसमें असामान्य उपस्थिति और असामान्य प्रसार पैटर्न वाले कोशिकाओं)।

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Protocol

1. पार फ्लाई और क्लोन प्रेरण

  1. कुंवारी मक्खियों को इकट्ठा करने से पहले शीशी 12 घंटे में सभी मक्खियों को निकालें।
  2. सीओ 2 गैस इंजेक्शन लगाने और सीओ 2 मक्खी पैड पर मक्खियों के द्वारा शीशी में मक्खियों को एनेस्थेटिज़ करना।
  3. सीओ 2 मक्खी पैड से 10 - 20 कुंवारी महिलाओं और 10 पुरुषों को ताजा शीशी में स्थानांतरित करें और 1 दिन 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. इन मक्खियों को एक ताजा शीशी में स्थानांतरित करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते रहें
    नोट: पहली शीशी को त्यागें क्योंकि कुंवारी महिला पहले दिन में पर्याप्त अंडे नहीं रखती।
  5. बढ़ाने के लिए- GAL4 लाइनें, वयस्क मक्खियों को हटा दें और विच्छेदन तक 25 डिग्री सेल्सियस पर शीशी को सेते हैं।
  6. मोज़ेक क्लोनों को फ्लिप-आउट-जीएएल 4 द्वारा शामिल करने के लिए, वयस्क मक्खियों को हटा दें और 2 से 4 दिनों के लिए शीशी को 25 डिग्री सेल्सियस से निकाल दें। गर्मी के झटके से पहले ऊष्मायन समय प्रायोगिक उद्देश्य पर निर्भर है। अंडे बयान (एईडी) अपरिपक्व दूसरे में मोज़ेक क्लोन उत्पन्न करने के 2 दिन बाद गर्मी झटकाInstar imaginal epithelia 3 या 4 दिनों के बाद एएडी ने गर्मी का झटका विभेदित शुरुआती समय में मोज़ेक क्लोन उत्पन्न किया।
    नोट: ट्यूमेरीजेनिक फेनोटॉप्स पर परिवर्तित गर्मी-सदमे समय के प्रभाव की जांच करना महत्वपूर्ण है।
  7. फ्लिप आउट GAL4 द्वारा मोज़ेक क्लोनों को शामिल करने के लिए, 10 - 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विसर्जन द्वारा शीशी को झटका, 2 से 3 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद 25 डिग्री सेल्सियस
    नोट: प्रत्येक प्रयोग में गर्मी-झटका समय, समय और ऊष्मायन समय की जानकारी आंकड़ा किंवदंतियों में दिखाई देती है।

2. लार्वा का विच्छेदन

  1. एक लकड़ी की छड़ी या कुंद संदंश के साथ भटकते तीसरे instar लार्वा इकट्ठा, उन्हें प्रतिदीप्ति त्रिविम सूक्ष्मदर्शी के तहत उचित फ्लोरोसेंट मार्करों ( उदाहरण के लिए , ईजीएफपी) द्वारा जीनोटाइप और पीबीएस (फॉस्फेट बुफ़र खारा) के साथ एक विच्छेदन व्यंजन में उन्हें जगह।
  2. पीबीएस में 2 एमएल प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट्स के साथ pipetting में लार्वा धो लें।
  3. एक संदंश के साथ लार्वा का केंद्र चुटकी और दूसरे संदंश के साथ आधे में शरीर को फाड़ दें।
  4. एक संदंश के साथ पूर्वकाल के आधे मुंह को छिड़कते हैं और शरीर की ओर मुंह को दूसरे संदंश के साथ धक्का देते हैं ताकि शरीर को अंदर बाहर कर दिया जा सके।
  5. लापरवाही ग्रंथियों या संदंश के साथ वसा शरीर जैसे अनावश्यक सामग्री निकालें

3. फिक्सेशन और एंटीबॉडी स्टीनिंग

  1. लार्वा बॉडी के विच्छेदन पूर्वकाल आधा (कल्पनाशील विंग डिस्क्स सहित) 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरण करें और नरम रोटेशन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फिक्स समाधान के 1 एमएल (पीबीएस में 4% फॉर्मलाडिहाइड) में ठीक करें।
    सावधानी: फार्मलाडेहाइड विषाक्त है और कैंसरजनक क्षमता है। त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें
    नोट: इस भाग में, सभी चरणों को एक नायटर पर अंधेरे में कमरे के तापमान पर ले जाते हैं, जब तक कि अन्यथा नोट नहीं किया गया हो।
  2. फिक्स समाधान निकालें और त्यागें। पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को धो लें (0.3% ट्राटपीबीएस में X-100 पर) 15 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार।
  3. पीबीटी को निकालें और पीबीटीजी (0.2% गोजातीय सीरम एल्बूमिन और 5% पीबीटी में सामान्य बकरी सीरम) को अवरुद्ध करने के लिए और कमरे के तापमान पर 1 घंटा या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात्रि को एनोट करें।
  4. पीबीटीजी निकालें और पीबीटीजी ( सामग्री तालिका देखें) के साथ उचित रूप से पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पाउलेट करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1 एमएल पीबीटी के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार ऊतकों को धो लें।
  6. पीबीटी निकालें और पीबीटीजी (1: 400) के साथ उचित रूप से पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए नटेट या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लें।
  8. एफ-एक्टिन को दागने के लिए, पीबीटी को हटा दें और पीबीएस (1:40) में उचित रूप से पतला फलोइडिन समाधान जोड़ें। फिर 20 मिनट के लिए नट Phalloidin समाधान निकालें और पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लें।
  9. परमाणु डीएनए का मुकाबला करने के लिए, पीबीटी को हटा दें और डीएपीआई (4 ', 6-डायरिडिनो-2-फेनिलंडोल) समाधान (पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएपी डीएपीआई) जोड़ें। फिर 10 मिनट की नायलेट
    सावधानी: डीएपीआई में कैंसरजनक क्षमता है त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें
  10. डीएपीआई समाधान निकालें और पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को 15 मिनट में दो बार धो लें।
  11. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल में एक बार कुल्ला।
  12. पीबीएस निकालें और प्री-माउंटिंग माध्यम के रूप में 500 μL का 100% ग्लिसरॉल जोड़ें।

4. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते हुए

  1. एक 2 एमएल प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर दाग ऊतकों को रखें।
  2. संदंश के साथ एक अन्य सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की बूंदों के ऊतकों को स्थानांतरित करें।
  3. एक संदंश के साथ विच्छेदित ऊतक के अंत को दबाए रखें और अन्य संदंश के साथ मस्तिष्क और आंखों के अन्तर्निहित डिस्क को हटा दें।
    नोट: विच्छेदित दिमाग को उन्हें विंग कल्पना के डिब्बे के पास रखने के लिए रखें। मस्तिष्क एक मंच के रूप में कार्य करते हैं, जिसमें कप्तान को विंग काल्पनिक डिस्क को कुचलने से रोकता है।
  4. पंखों को अलग करने के लिए कल्पित डिस्क डिस्केक्टेड ऊतक के अंत में एक संदंश के साथ पकड़ लेती हैं और धीरे से शरीर की दीवार को खरोंच कर देती है और डिस्क को अन्य संदंश के साथ फाड़ देती है।
    नोट: यदि विंग कल्पना के डिब्बे को ढूंढना मुश्किल है, तो पीछे से पूर्वकाल तक ट्रेकिआ को छील कर दें। विंग काल्पनिक डिस्क ट्रेकिआ से चिपक जाता है
  5. धीरे से एक कवरलिप के साथ काल्पनिक डिस्क को कवर करें और नेल पॉलिश के साथ मुहर; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

5. कन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक confocal खुर्दबीन सेट छवि अधिग्रहण मापदंडों सहित उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, लेजर तीव्रता, लाभ, ऑफसेट, स्कैनिंग की गति और छवि आकार 24 सहित confocal छवियों को प्राप्त करने के लिए।
    नोट: छवि अधिग्रहण सेटिंग्स की विस्तृत प्रक्रिया के लिए, प्रत्येक माइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा दिए गए निर्देश पुस्तिका का संदर्भ लें।
  2. एकल सह कब्जा करने के लिएएक पूरे विंग इम्प्लांटल डिस्क के एनफोकल अनुभाग, 20 एक्स उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
  3. 0.5 -0.0 माइक्रोन के 40x या 60x लेंस का उपयोग करके ज़-स्टैक स्कैनिंग द्वारा 3-आयामी चित्र प्राप्त करें।
    नोट: उच्च रिज़ॉल्यूशन में सेलुलर फिनोटाइप्स का विश्लेषण करने के लिए, एक छवि का आकार 512 x 512 पिक्सल से बड़ा होना चाहिए।

6. ImageJ का प्रयोग करके छवि विश्लेषण

  1. फ़िजी का उपयोग करें, एक ओपन सोर्स इमेजजे सॉफ़्टवेयर जो जैविक-छवि विश्लेषण (https://fiji.sc/) 25 पर केंद्रित है, जो कि कन्फोकल जेड स्टैक छवियों का अधिग्रहण और विश्लेषण करता है।
  2. ऊर्ध्वाधर वर्गों को प्राप्त करने के लिए, छवि-जे में ज़-स्टैक छवियां खोलें और मेनू आइटम "छवि / ढेर / रेजलाइस" चुनें।
    नोट: या तो XZ अक्ष या YZ अक्ष Reslice मेनू में चयन योग्य हैं कार्यक्षेत्र अनुभाग एक सीधा रेखा या रेखा को चित्रित करके z-stack छवि पर एक मनमाना दिशा में भी प्राप्त किया जा सकता है।

7. निओप्लास्टिक फेनोटाइप का निदान

  1. ऊर्ध्वाधर खोलेंज़े-स्टैक छवियों के एक समूह से प्राप्त अनुभाग (एक्सज़ या वाईज़ अक्ष) और रूपात्मक फिनोटाइप्स और एंटीबॉडी स्टैनिंग का विश्लेषण करते हैं।
  2. ट्यूमर phenotypes के निदान के लिए, मुख्य रूप से निम्नलिखित तीन बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करें: (1) यदि दस्तक क्लोन सहित सेल द्रव्यमान, मुख्य उपकला परत से भटक जाता है, (2) यदि इस सेल द्रव्यमान में जंक्शन प्रोटीन के subcellular स्थानीयकरण बदल जाता है , और (3) यदि इस सेल द्रव्यमान का व्यास 4 कोशिकाओं से बड़ा है।
  3. चित्रा 1 में वर्णित फ्लोचार्ट के अनुसार ट्यूमर फेनोटाइप को वर्गीकृत करें।

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Representative Results

प्रयोगात्मक आरएनएआई द्वारा प्रेरित नियोप्लास्टिक ट्यूमर गठन प्रदर्शित करने के लिए मध्यस्थता nTSG-नॉकडाउन ड्रोसोफिला विंग imaginal डिस्क में, तीन अलग अलग GAL4 ड्राइवरों LGL या scrib के लिए यूएएस-आरएनएआई व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया: (1) एसडी-GAL4, जिसमें मजबूत यूएएस अभिव्यक्ति ड्राइव विंग पाउच और हिंग क्षेत्र में हल्के अभिव्यक्ति ( चित्रा 2 और चित्रा 3 ए ); (2) अपडेट-जीएएल 4, जो हिंग के उपडोमेन में चलती है, जिसमें पृष्ठीय औसत दर्जे का गुना, एक पूर्वकाल-पार्श्व डोमेन में हल्के अभिव्यक्ति, और ऊतक-पश्चवर्ती डोमेन ( 2 चित्रा और चित्रा) में कमजोर अभिव्यक्ति में मजबूत अभिव्यक्ति शामिल है। 3 सी ); और (3) गर्मी-झटका प्रेरित फ्लिप-आउट GAL4, जो यादृच्छिक मोज़ेक क्लोन बनाता है जो यूएएस-जीन को व्यक्त करता है ( चित्रा 4 और फाई5) सभी प्रयोगों में, यूएएस-ईजीएफपी को पछाड़ना क्लोनों को चिह्नित करने के लिए यूएएस-आरएनएआई के साथ सह-व्यक्त किया गया था।

सबसे पहले, एसडी-जीएएल 4 -ड्रिवेन एलजीएल-आरएनएआई का इस्तेमाल विंग पाउच और काज के क्षेत्रों में एलजीएल के दस्तक के लिए किया गया था। यूएएस-एलएलजी-आरएनएआई के बिना तीसरे इंस्टार्स विंग डिस्क को नियंत्रित करने में कोई आकृति परिवर्तन नहीं हुआ ( चित्रा 3 ए )। इसके विपरीत, एलजीएल-आरएनएआई , उपकला विकृति और ट्यूमेरीजेनिक ओवरग्रोव को व्यक्त करने वाले तीसरे इंस्टार्स विंग डिस्क में हिंग के कुछ हिस्सों ( चित्रा 3 बी ) में स्पष्ट रूप से देखा गया था। विंग पाउच क्षेत्र में, हालांकि, डिसप्लेस्टिक ओवरग्रोथ नहीं देखा गया था। मजबूत एमएमपी 1 (मैट्रिक्स मेटालोप्राईटेज़ -1) अभिव्यक्ति ट्यूमरस टिकी हुई घावों में देखी गई, लेकिन विंग पाउच क्षेत्र में नहीं ( चित्रा 3 बी )। चूंकि एमएमपी 1 अभिव्यक्ति तहखाने झिल्ली के क्षरण में शामिल हैEs, यह संभव है कि इन टिकी हुई ट्यूमरों में एक मेटास्टैटिक क्षमता ( चित्रा 3 बी ) है। इसके बाद, अपडेट-जीएएल 4 का उपयोग हिप क्षेत्र में एलजीएल दस्तक के लिए किया गया था। यूएएस-एलजीएल-आरएनएआई के बिना तीसरे इंस्टार्स विंग डिस्क्स पर नियंत्रण में कोई आकृति परिवर्तन नहीं हुआ ( चित्रा 3 सी )। हालांकि, 5 दिनों के बाद एईडी, अपडेट -जीएएल 4 और एलएलएल-आरएनएआई के साथ तीसरा इंस्टार्स विंग डिस्क्स एफ-एक्टिन संचय और उपकला परत ( चित्रा 3 डी ) से क्लोन विस्थापन के साथ प्रमुख उपकला विघटन प्रदर्शित करता है। नमूनों ( चित्रा 3 ई और एफ ) के बीच ट्यूमर आकार में भिन्नता के साथ यद्यपि, 6 दिनों के एईडी में, एचएमपी 1 को अभिव्यक्त करते हुए, न्यूप्लास्टिक ट्यूमर, हिंग क्षेत्र ( चित्रा 3 जी ) में आगे बढ़ता है। काज के क्षेत्र का एक ऊर्ध्वाधर खंड ने पुष्टि की कि नवपैरक्त ट्यूमर उपकला परत के शिखर पक्ष पर विघटित हो जाना (

एलजीएल दस्तकडाउन द्वारा प्रेरित ट्यूमर के विकास की प्रगति पर नजर रखने के लिए, एलजीएल-आरएनएआई को व्यक्त करने वाले छिटपुट क्लोनों को विंग डिस्क में गर्मी-झटका प्रेरित फ्लैप -आउट GAL4 मोज़ेक सिस्टम का उपयोग किया गया था। दो दिनों के बाद, दूसरे इन्स्टार लार्वा (2 दिन एईडी) में गर्मी के झटके के बाद, कुछ हिस्सों में स्थित कुछ एलजीएल -कॉन्कडाउन क्लोन ने उपकला परत ( चित्रा 4 ए ) के शिखर पक्ष से विचलन दूर दिखाया। गर्मी-झटका प्रेरण के चार दिन बाद, काज क्षेत्र में डिसप्लेस्टिक घावों को स्पष्ट हो गया, यह सुझाव दिया गया कि एलजीएल -नकॉकडाउन क्लोन लुमेन ( चित्रा 4 बी ) में अस्थिर तरंगों से विस्थापित हो जाते हैं। गर्मी-झटका प्रेरण के सात दिन बाद, ट्यूमेरीजेनिक ओवरग्रॉथ काज क्षेत्र ( चित्रा 4 सी ) पर हावी था।

प्रदर्शित करने के लिएहमारे निदान पद्धति के साथ क्लोनल फेनोटाईप्स का वर्गीकरण, स्क्रैब- आरएनएआई को व्यक्त करने वाले छिटपुट क्लोन को गर्मी-झटका प्रेरित फ्लैग-आउट GAL4 मोज़ेक सिस्टम का उपयोग करते हुए विंग डिस्क में उत्पन्न किया गया था। पांच दिन दूसरा इनस्टार लार्वा को गर्मी सदमे के बाद (2 दिन एईडी), कुछ GFP-व्यक्त scrib -knockdown क्लोन tumorigenic समलक्षणियों (चित्रा 5 ए) से पता चला। हमने जेड स्टैक confocal छवियों के ऊर्ध्वाधर वर्गों में चार क्लोनों ( चित्रा 5 ए में बी, सी, डी और ई में) का विश्लेषण किया है क्योंकि छवि 2 डी कन्फोकल छवियों ( चित्रा 4 और चित्रा) में विस्तृत कोशिकीय और संरचनात्मक फेनोटाइप प्राप्त करना कठिन है। 5 ए )। क्लोन बी और सी को डिस्प्लाशिया के रूप में वर्गीकृत किया गया था क्योंकि सेप्टेट जंक्शन-प्रोटेक्शन डिस्क्स बड़े (डीएलजी) को मिलोलोक्लाइज़ किया गया था ( चित्रा 5 बी और सी )। क्लोन बी में, एपिथेलियम से विस्थापित सेल द्रव्यमान का आकार 4-कोशिकाओं की तुलना में अधिक नहीं थाआर ( चित्रा 5 बी ), जबकि क्लोन सी एपिथेलियम ( चित्रा 5C ) से विचलित नहीं हुआ; इसलिए, क्लोन बी और सी को नियोप्लास्टिक नहीं माना जाता था हालांकि, क्लोन डी और ई, जो भी डीएलजी के mislocalization दिखाया, उपकला के बाहर ट्यूमरस सेल जनसंपर्क बनाया ( चित्रा 5 डी और 5 ई )। चूंकि इन विस्थापित ट्यूमरस क्लोनों के आकार के व्यास में 4 से अधिक कोशिकाएं थीं, क्लोनों को नियोप्लास्टिक के रूप में वर्गीकृत किया गया था।

विंग imaginal डिस्क में hyperplastic ट्यूमर या पुटी संरचनाओं को प्रेरित करने के छिटपुट क्लोन oncogeneic रास (रास V12) या constitutively Yorkie, हिप्पो मार्ग, (Yki 3SA) के एक ट्रांस्क्रिप्शनल coactivator का सक्रिय रूप को व्यक्त करने का उपयोग कर उत्पन्न किया गया गर्मी सदमे प्रेरित फ्लिप-आउट GAL4 मोज़ेक सिस्टम चार दिन बाद दूसरे झटके के झटके (2 दिन एईडी), राजीएफपी द्वारा लेबल किए गए वी 12- एस्प्रेसिंग क्लोनों को कल्पनाशील डिस्क ( चित्रा 6 ए ) में राउंड सेल जनसंपर्क बन गया। रास वी 12- एस्प्रेसिंग क्लोन (क्लोन बी में चित्रा 6 ए ) का एक ऊर्ध्वाधर खंड ने पाया कि उपकला परत से अलग सेल द्रव्यमान में डीएलजी का उचित स्थानीयकरण है, यह सुझाव देता है कि कोशिका द्रव्यमान उपकला परत ( चित्रा 6 बी ) के बाहर सामान्य उपकला संरचना का रखरखाव करता है । इन रास वी 12- एक्सप्रेसिंग क्लोनों ( चित्रा 6C ) में एमएमपी 1 अभिव्यक्ति नहीं देखी गई थी। इसलिए, क्लोन बी को पुटी गठन के रूप में वर्गीकृत किया गया था। चार दिन दूसरा इनस्टार लार्वा को गर्मी सदमे के बाद (2 दिन एईडी), Yki 3SA -expressing GFP द्वारा लेबल क्लोन imaginal डिस्क (चित्रा 7A) में बड़ा सेल जनता का गठन किया। हमने दो क्लोनों पर ध्यान केंद्रित किया ( चित्रा 7 ए में बी और सी) क्लोन बी ने दिखायाउपकला परत और Dlg के समुचित स्थानीयकरण उपकला कोशिकाओं के उप-शिखर झिल्ली में में एकीकरण, सुझाव है कि Yki 3SA -expressing क्लोन बी उपकला संरचना को बनाए रखा। इसलिए, क्लोन बी को हाइपरप्लासिया ( चित्रा 7 बी ) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। हिंग क्षेत्र में स्थित क्लोन सी में डीएलजी का गलत विवरण दिखाया गया और उपकला परत के बेसल तरफ बहु-स्तरित संरचना का निर्माण किया। MMP1 अभिव्यक्ति Yki 3SA -expressing क्लोन में नहीं देखा गया। एक साथ ले लिया, क्लोन सी को सौम्य नवजात ( चित्रा 7 सी और डी ) के रूप में वर्गीकृत किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: ट्यूमर फीनोटाइप के वर्गीकरण के लिए फ्लोचार्ट। यह फ्लोचार्ट कल्पनीय उपकला में क्लोनल घावों को वर्गीकृत करने के लिए निदान पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है। वर्गीकृतआचरण पांच मानदंडों पर आधारित है: (1) उपकला परत से क्लोनों का विचलन, (2) जोड़ों के प्रोटीन के सबसुलुलर मिस्लोकेलाइजेशन, (3) सेलुलर प्रसार, (4) क्लोन आकार और (5) एमएमपी 1 अभिव्यक्ति। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: ( ए ) जंगली-प्रकार वाली पंखीय डिस्क डीएलजी (हरा) और नाभिक (डीएपीआई, मैजेंटा) के लिए दाग़ी गई। ( बी ) विंग पाउच (नीला), हिंग (नारंगी) और नोटम (हरा) क्षेत्रों को प्रदर्शित करने वाले ड्रोसोफिला विंग काल्पनिक डिस्क के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ( सी ) एफ-एक्टिन (लाल) और माइक्रोट्यूब्यूल्स (हरा) के लिए सामान्य विंग काल्पनिक डिस्क दाग। तहखाने झिल्ली को कोलेजन IV / Vkg-GFP (नीला) के साथ लेबल किया जाता है। ( डी ) साइट के कार्यक्षेत्र अनुभाग( सी ) में सफेद बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित ( ई ) लाइन ड्रॉइंग ( डी ) में उपकला परत के बेसिक (लाल) और बेसल (नीला) पक्षों का पता लगाते हैं। बिंदीदार रेखाएं पेरिओडोरियल झिल्ली का पता लगाती हैं पृष्ठीय काज के दूरस्थ (डीएफ), औसत दर्जे (एमएफ) और समीपस्थ (पीएफ) सिलवटों का संकेत दिया जाता है।
विस्तृत जीनोटाइपः ए, डब्ल्यू - सीडी, वीकेजी-जीएफपी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: साइट-विशिष्ट Tumorigenesis Enhancer-GAL4s द्वारा प्रेरित ( ए , बी ) कन्फोकल छवियां विंग काल्पनिक डिस्क्स दिखाती हैं जो कि एमएमपी 1 (लाल) के लिए दाग वाले संकेतों के तीसरे instar लार्वा से विच्छेदित हैं। SD-GAL4 -expreSsing क्षेत्रों GFP अभिव्यक्ति (हरा) द्वारा लेबल किया गया ( सीजी ) कन्फोकल छवियों ने इंगित समय बिंदु एईडी पर संकेतित जीनोटाइप के तीसरे instar लार्वा से विच्छेदित विंग कल्पना डिस्क्स दिखाते हैं। एफ-एक्टिन (Philloidin (लाल)) ( सीएफ ) के साथ दाग गया था। MMP1 अभिव्यक्ति में विरोधी MMP1 एंटीबॉडी (लाल) (जी) के साथ दाग है। अपडेट-जीएएल 4- एक्सपोजिंग क्षेत्रों को GFP अभिव्यक्ति (हरा) द्वारा लेबल किया गया था नीचे के पैनल ( सीएफ़ ) ऊपरी पैनलों में दर्शाए गए क्षेत्रों के बढ़ते दृश्य दिखाते हैं। सफेद तीर एलजीएल -नकॉकडाउन क्लोन द्वारा प्रेरित विकार वाले घावों का संकेत देते हैं। ( एच ) ऊर्ध्वाधर खंड (ई) के नीचे पैनल में सफेद बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित साइट का सफेद बिंदीदार लाइनों (ए) और (बी) में विंग पाउच और हिंग क्षेत्रों के बीच की सीमाओं को चिह्नित करें। नाभिक डीएपीआई (नीला) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 100 μ मीटर (एजी) और 50 माइक्रोन (एच) में। विस्तृत जीनोटाइप: एक, डब्ल्यू -, एसडी-Gal4, यूएएस EGFP; यूएएस dicer2; बी, डब्ल्यू - , एसडी-जीएएल 4, यूएएस-ईजीएफपी; यूएएस-dicer2; यूएएस-LGL-आरएनएआई; सी, डब्ल्यू -, upd-Gal4, यूएएस EGFP; यूएएस-dicer2; DH, डब्ल्यू -, upd-Gal4, यूएएस EGFP; यूएएस-dicer2; यूएएस-एलजीएल-आरएनएआई इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: रैंडम मोज़ेक क्लोन द्वारा प्रेरित ट्यूमर फीनोटाइप। ( एसी ) कन्फोकल छवियों को मोज़ेक विंग को कंट्रोल के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा के कॉम्प्लेक्स डिस्क्स दिखाते हैं, गर्मी-झटका प्रेरण के बाद इंगित समय बिंदु पर एलजीएल-आरएनएआई और जीएफपी (हरा) सह-अभिव्यक्त होते हैं । नाभिक डीएपीआई (नीला) द्वारा लेबल किया गया था। मध्य पैनल बाएं पैनलों में चिह्नित सफेद चौरस क्षेत्रों के बढ़ते दृश्य दिखाते हैं। सही पैनल एस उपकला परतों (नीला) और जीएफपी-व्यक्त क्लोनों (हरा) के शिखर पक्ष के योजनाबद्ध रेखा चित्र दिखाते हैं। एपिथेलियम के भीतर स्थित मोज़ेक क्लोन को हल्के हरे रंग में दिखाया गया है जबकि उपकला से विचलित नवप्रोपिक ट्यूमर मैजेन्टा में दिखाया गया है। बाएं पैनलों में सफेद बिंदीदार रेखाएं विंग पाउच और हिंगे क्षेत्रों के बीच की सीमाओं को चिह्नित करती हैं। मध्य पैनलों में सफेद तीर एलजीएल -नकॉकडाउन क्लोन द्वारा प्रेरित विकार वाले घावों का संकेत देते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन विस्तृत जीनोटाइप: एसी, एचएसएफएलपी; यूएएस-dicer2; कार्य> सीडी 2> जीएएल 4, यूएएस-ईजीएफपी / यूएएस-एलजीएल-आरएनएआई ( एएडी 2 दिनों में 30 मिनट में गर्मी-चौंकाने वाली), ए में 2 दिन से 25 डिग्री सेल्सियस, बी में 25 डिग्री सेल्सियस से 4 दिन से कम, 7 दिन से कम होता है 25 डिग्री सेल्सियस सी में गर्मी झटका के बाद)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

5 "class =" xfigimg "src =" / फ़ाइलें / एफटीपी_अपलोड / 55901 / 55901fig5.jpg "/>
चित्रा 5: डिस्प्लास्टिक क्लोनल फीनोटाइप के डायग्नोस्टिक परीक्षा। ( ए ) बाएं पैनल, डीएलजी (लाल) के लिए दाग वाले गर्मी-झटका प्रेरण के 5 दिनों के बाद, क्लोन -आरएनएआई और जीएफपी (हरा) के साथ क्लोन के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा की एक मोज़ेक विंग कल्पना का डिस्क दिखाता है। सही पैनल उपकला परतों (नीला) और जीएफपी-व्यक्त क्लोनों (हरा) के शिखर पक्ष के एक योजनाबद्ध रेखा चित्रण दिखाता है। उपकला परतों में मोजेक क्लोन हल्के हरे रंग में दिखाए जाते हैं जबकि उपकला से विस्थापित नवपैलिक ट्यूमर मैजेन्टा में दिखाए जाते हैं। (बीई) कोंफोकल छवियों scrib -knockdown (ए) के अधिकार के पैनल में संकेत क्लोन के ऊर्ध्वाधर वर्गों दिखा। बाईं ओर से दूसरे पैनल डीएलजी स्थानीयकरण पैटर्न (लाल) दिखाते हैं एपिकल (लाल) के बाएं शो के योजनाबद्ध रेखा के चित्र से तीसरे पैनल और उपकला परतों के बेसल (नीले) पक्ष और जीएफपी-एक्सपीआरessing scrib -knockdown क्लोन (हरा)। उपकला परतों में डिसप्लिस्टिक क्लोन प्रकाश हरे रंग (बी और सी) में दिखाए जाते हैं, जबकि एपिथेलियम से विस्थापित नवपैलिक क्लोन मैजेन्टा (डी एंड ई) में दिखाए जाते हैं। सफेद तीर scrib -knockdown tumorigenic फेनोटाइप दिखा क्लोन संकेत मिलता है। नाभिक डीएपीआई (नीला) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन प्रत्येक क्लोन के ट्यूमर फेनोनटाइज को चित्र 1 में दिखाए गए फ्लोचार्ट के अनुसार वर्गीकृत किया गया था। विस्तृत जीनोटाइप: एई, एचएसएफएलपी; यूएएस-scrib-आरएनएआई; अधिनियम> सीडी 2> जीएएल 4, यूएएस-ईजीएफपी (2 दिनों के एईडी में गर्मी से चौंका 30 मिनट, गर्मी झटका के बाद 25 डिग्री सेल्सियस से कम 4 दिन)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्र 6: डायग्नोसरास वी 12 के टिक-टिक परीक्षा क्लोनल फीनोटाइप ( ए ) बाएं पैनल क्लॉन्स के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा की एक मोज़ेक विंग काल्पनिक डिस्क दिखाता है जिसमें डीएनजी (लाल) के लिए दाग वाले गर्मी-झटके प्रेरण के 4 दिनों के बाद, कोकोनिक रास वी 12 और जीएफपी (हरा) सह-व्यक्त किया गया है। सही पैनल उपकला परतों (नीला) और जीएफपी-व्यक्त क्लोनों (हरा) के शिखर पक्ष के एक योजनाबद्ध रेखा चित्रण दिखाता है। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है ( बी ) रास V12 व्यक्त क्लोनों के कार्यक्षेत्र अनुभाग (ए) के दाहिने पैनल में दर्शाए गए थे। बाईं ओर से दूसरे पैनल डीएलजी स्थानीयकरण पैटर्न (लाल) दिखाते हैं एपिकल (लाल) और उपकला परतों के बेसल (नीले) पक्षों और रास वी 12 और जीएफपी क्लोनिंग (हरा) के बाईं शो योजनाबद्ध रेखा के चित्र से तीसरे पैनल। स्केल बार = 25 माइक्रोन ( सी ) मोज़ेक विंग का इम्प्लांटिक डिस्क क्लोन के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा की सह-अभिव्यक्ति <एमएपी 1 (लाल) के लिए दागदार गर्मी-झटका प्रेरण के 4 दिन बाद रास वी 12 और जीएफपी (हरा)। स्केल बार = 100 माइक्रोन विस्तृत जीनोटाइप: एसी, एचएसएफएलपी; यूएएस-रास वी 12 ; कार्य> सीडी 2> जीएएल 4, यूएएस-ईजीएफपी (2 दिनों के एईडी पर गर्मी से चौंकाने वाली 45 मिनट, गर्मी झटका के बाद 25 डिग्री सेल्सियस से 4 दिन लगते हैं)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: Yki 3SA के नैदानिक ​​परीक्षा क्लोनल फीनोटाइप। ( ए ) बाएं पैनल क्लॉन्स के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा की एक मोज़ेक विंग काल्पनिक डिस्क दिखाता है जिसे डीएलजी (लाल) के लिए दाग़ी जाने वाली गर्मी-झटका प्रेरण के बाद 4 दिनों के बाद स्थिर रूप से सक्रिय Yki 3SA और GFP (हरा) व्यक्त करता है। सही पैनल दिखाता है उपकला परतों (नीला) और जीएफपी-व्यक्त क्लोनों (हरा) के शिखर पक्ष की रासायनिक रेखा रेखाचित्र स्केल बार = 50 माइक्रोन ( बीसी ) Yki 3SA व्यक्त क्लोनों के कार्यक्षेत्र वर्गों (ए) के दाहिने पैनल में संकेत दिया। बाईं ओर से दूसरे पैनल डीएलजी स्थानीयकरण पैटर्न (लाल) दिखाते हैं एपिकल (लाल) और बाहुल्य (नीला) उपकला परतों और Yki और GFP व्यक्त क्लोन (हरा) के बाएं शो योजनाबद्ध रेखा चित्र से तीसरे पैनल। स्केल बार = 25 माइक्रोन ( डी ) एमएक्स 1 (लाल) के लिए दाग वाले गर्मी-झटका प्रेरण के बाद 4 दिनों के बाद क्लॉन्स के साथ तीसरे इन्स्टार लार्वा की मोजाइक विंग कॉमालिनल डिस्क, Yki 3SA और जीएफपी (हरा) को सह-अभिव्यक्त करते हैं । स्केल बार = 100 माइक्रोन विस्तृत जीनोटाइप: एडी, एचएसएफएलपी ;; यूएएस-Yki 3SA / अधिनियम> CD2> Gal4, यूएएस EGFP (2 दिनों AED पर गर्मी हैरान 30 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिन सेते हैं)।5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

GAL4-UAS प्रणाली ड्रोसोफिला 26 में लक्षित जीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे शक्तिशाली आनुवंशिक टूल में से एक है और विवो 4 में ट्यूमर सेल प्रेरण और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रणाली में क्लोन की पीढ़ी को ट्यूमर-दमनकारी जीन के दस्तक-डाउन या जंगली प्रकार के उपकला ऊतक के भीतर ओंकोजीन के ओवर एक्सप्रेशन को सक्षम किया जा सकता है, ऐसी स्थिति जो मानव कैंसर के शुरुआती चरण के समान होती है जहां प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं को सामान्य उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ है। जीएल 4 एन्हांसर-जाल लाइन या जनेलिया जीएएल 4 लाइन 27 जैसी एन्हांसर अनुक्रमों द्वारा विनियमित जीएलएलआई चालक की रेखाएं अनूठे, स्पीतिओटेमपॉर्पोरेटेड प्रतिबंधित एक्सपीज़ेशन पैटर हैं। इसलिए, इन enhancer-GAL4 लाइनों imaginal discs के सीमित क्षेत्रों में ट्यूमर को लगातार लागू करने के लिए उपयोगी हैं। इस अध्ययन में दिखाया गया SD-GAL4 और upd-GAL4 के अलावा, हमने पुष्टि की है कि एलजीएल -नकॉकडाउन प्रेरित बीY अन्य एन्हांसर-जाल गैल 4 लाइनें शामिल हैं जिनमें एंजेराइल-जीएएल 4 ( एन-जीएल 4 ), हेजहोग-जीएएल 4 ( एचएच-जीएएल 4 ), ऑप्टोमोटर-अंधा-जीएएल 4 ( ओम्ब-जीएल 4 ), पैच्चे- जीएएल 4 ( पीटीसी- जीएएल 4 ) और स्माल-प्रमुख- GAL4 ( सल्म-जीएएल 4 ) विंग इम्प्लांटल डिस्क्स के बिजी क्षेत्रों में नियोप्लास्टिक ट्यूमर उत्पन्न कर सकती है। यदि एनएएनएनटीएआर-जीएएल 4 अभिव्यक्ति पैटर्न को अस्थायी रूप से नियंत्रित करने की आवश्यकता है, तो GAL4 का संयोजन और GAL80 (GAL80 ts ) का एक तापमान-संवेदनशील संस्करण एक विकल्प है। GAL80 ts 18 डिग्री सेल्सियस पर GAL4 फ़ंक्शन को दमन करता है, लेकिन 29 डिग्री सेल्सियस पर नहीं, जो आवश्यक रूप से यूएएस-ट्रांसजेन्स अभिव्यक्ति को चालू या बंद करने की अनुमति देता है 28 ।

फ्लिप आउट GAL4 मोज़ेक सिस्टम, जो FLP-FRT सिस्टम और GAL4-UAS सिस्टम 3 को जोड़ती है, कल्पनाशील डिस्क में यादृच्छिक क्लोन उत्पन्न करता है। फ्लिप आउट GAL4 के साथ गर्मी-झटका-अनुक्रमिक फ्लिपबेस (एचएसएफएलपी) के संयोजन से, क्लोन जनरेट का समयआयन नियंत्रणीय है क्योंकि कल्पनात्मक डिस्क कोशिकाओं की ट्यूमेरैजिएनिक क्षमता विकास के चरण, अंतर्जात सिग्नलिंग घटनाओं, और / या सेलुलर भेदभाव 29 , 30 पर निर्भर हो सकती है, ट्यूमरिजेनिक फेनोटॉप्स पर बदलते गर्मी-झटका समय के प्रभाव की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण है।

यह पहले से पता चला है कि एनटीएसजी उत्परिवर्ती क्लोन सेल प्रतियोगिता-निर्भर एपोपोसिस से गुजरते हैं, जब वन्य प्रकार के कोशिकाओं 10 , 11 , 12 , 18 से घिरे हुए हैं, जो सुझाव देते हैं कि कैंसर के विकास के दौरान सेल परिवर्तन के लिए कई म्यूटेशन आवश्यक हैं। वास्तव में, ऑन्कोजेनिक रास या Yki LGL में या उत्परिवर्ती क्लोन scrib की overexpression उन्हें आक्रामक ट्यूमर 10, 18 में परिवर्तित हो, 31 गलत जबकिरास वी 12 या Yki 3SA की अभिव्यक्ति nTSG उत्परिवर्तनों के बिना खुद के द्वारा घातक नियोप्लाज़ उत्पन्न नहीं करती है। जैसा कि यहाँ और पहले 16 दिखाया गया है, जंगली प्रकार वाली विंग डिस्क में उत्पन्न प्रो-ट्यूमर एनटीएसजी-पछाड़ना क्लोन भी एपोपोटिकिस से गुज़रते हैं और विंग पाउच 16 में ट्यूमरिजेन्सिस नहीं दिखाते हैं। इसी समय, "हॉटस्पॉट" काजिंग में स्थित एनटीएसजी-नॉकडाउन क्लोन किसी भी अतिरिक्त ऑकोजेनिक म्यूटेशन के बिना नियोप्लास्टिक ट्यूमर में विकसित होता है। दांतेदार क्षेत्रों में, एनटीएसजी-कमी कोशिकाएं अंतर्जात जनस किनासे / सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन के सक्रियक (जेक / स्टेट) को ट्यूमोरिजिनेसिस 16 ड्राइव करने के लिए संकेत देती हैं। इसलिए, टिकाऊ दबाने वाली जीन के आरएनएआई- वांछित पछाड़ना द्वारा नवजात-विशिष्ट जीएएल 4 जैसे अपडेट -जीएएल 4 , लगातार नवप्रवर्तित ट्यूमर के गठन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि फ्लिप-आउट- GAL4- प्रेरित nTSG-knockdown मोज़ेक क्लोन में भी रीजोल में न्यूप्लास्टिक ट्यूमर उत्पन्न होते हैंगायन, ट्यूमोरिजिनेसिस की शुरुआत प्रारंभिक क्लोन आकार पर निर्भर होती है: 20 मिनट से अधिक समय तक गर्मी के झटके से उत्पन्न बड़े क्लोन आमतौर पर ट्यूमोरिजेन्सिज़ उत्पन्न करते हैं, जबकि 10 मिनट से कम गर्मी झटका से उत्पन्न सबसे छोटे क्लोन पूरी तरह से समाप्त हो जाते हैं (केएम और वाईटी, अप्रकाशित डेटा)।

ट्यूमर के विकास और कैंसर की प्रगति पर हालिया अध्ययनों में ड्रोसोफिला काल्पनिक डिस्क का इस्तेमाल मॉडल मॉडल 32 , 33 के रूप में हुआ । इन अध्ययनों में आम तौर पर न्यूप्लास्टिक ट्यूमर के कई मार्कर शामिल हैं: विचित्र सेल जनसंपर्क, विकृत डिस्क आकार, एफ-एक्टिन का संचय, बढ़ाया सेल सायक्लिंग (ब्रॉडयू / ईडीयू निगमन या पीएच 3 अभिव्यक्ति), जेएनके सिग्नलिंग के सक्रियण और इसके डाउनस्ट्रीम लक्ष्य एमएमपी 1, तहखाने झिल्ली बाधा, और / या उपकला संबंधी गड़बड़ी, जिसमें एपिकल-बेसल सेल पोलरिटी (टुकड़ियां, स्टारडस्ट, पैटजे, एपीकेसी, बाज़ुका / पीएआर -3 या पीएआर -6) में शामिल प्रोटीनों के नुकसान या सबसेल्यूलर डिओलोकेलाइजेशन शामिल हैं, सेपेट जंक्शन(एलजीएल, स्क्रब, डीएलजी या कोरैकल), या अनुयायी जंक्शन (ई-कैडरिन या आर्मडिलो)। ये फ़ोनोटाइप्स परंपरागत एंटीबॉडी धुंधला होकर आसानी से खोजा जा सकते हैं। यद्यपि यह निर्धारित करना मुश्किल है कि टोनोरिजिनेसिस के शुरुआती चरण में क्लोनल फेनोटाइप हाइपरप्लासिया, डिस्प्लाशिया, सौम्य नवोप्लाज्म या दुर्दम्य नवोप्लेज्म है, यह एक एकल उपकला मोनोलायरे से मिलकर ड्रोसोफिला कल्पना की नकल डिस्क एपिथेलिया में सरल होना चाहिए। इस अध्ययन में, हमने उपकला मोनोलायर ( चित्रा 1 ) में प्रेरित ट्यूमरस क्लोन फेनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए एक निदान पद्धति की शुरुआत की। इस पद्धति को जस्ट स्टैक इन्फोकल इमेज का उपयोग करके पांच मापदंडों के सावधान टिप्पणियों की आवश्यकता है; प्रत्येक नैदानिक ​​मानदंड को पारंपरिक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना और confocal इमेजिंग द्वारा जांच की जा सकती है। इस पद्धति में हमने जो नई मापदंड पेश किया है, वह है "4-सेल-व्यास मानदंड" जो कल्पनाशील डिस्क में डिस्प्लाशिया और नवोप्लाज्म के बीच भेद करता है। प्रो-ट्यूमर कोशिकाओं जैसे कि एनटीएसजी उत्परिवर्तक क्लोन अक्सर होते हैंली कोशिका प्रतिस्पर्धा या स्पिन्टल दुर्गंध के माध्यम से उपकला परतों से extruded 15 , 16 , 34 ज्यादातर परिस्थितियों में, इन extruded कोशिकाओं apoptose, और इसलिए वे पैदा नहीं कर सकते हैं। यद्यपि संभव हो सकता है कि एक्सयूशन के बाद एक बार ट्यूमर कोशिकाओं को कोशिका विभाजन से गुजरना पड़ता है और एक्सट्रूज़न के बाद एक या दो बार अधिक, यह 2 से 3 सेल व्यास का एक सेल द्रव्यमान बनाता है। इसलिए, अगर उपकला परत से घिरा समर्थक ट्यूमर कोशिकाओं का एक सेल द्रव्यमान 4-सेल व्यास से बड़ा होता है, तो हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि वे जीवित हो रहे हैं और उपकला परत के बाहर नववृद्धि के रूप में फैल रहे हैं।

यद्यपि यह निदान पद्धति सरल है, ट्यूमर के विकास और दुर्दमता पूरे समय में प्रगति के रूप में, फेनोटाइप का समय बिताना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, डिसप्लेसीआ एक कोशिकागत असामान्य ऊतक और एक संक्रमणकालीन राज्य है जो पूरी तरह से सौम्य विकास और उन पूर्वघातक। इसलिए, भले ही एक मनाया क्लोन को फ्लोचार्ट ( चित्रा 1 ) के अनुसार डिस्प्लाशिया के रूप में परिभाषित किया गया हो, यह संभव है कि डिस्प्लासिआ बाद में एक नवपात्रा में विकसित हो। हालांकि लार्वा चरण समय (5-6 दिनों में 25 डिग्री सेल्सियस या 4-5 दिनों में 2 9 डिग्री सेल्सियस एईडी) है, कल्पनात्मक डिस्क में ट्यूमर के विकास में पेरर्तियन 35 की इंसुलिन जैसी पेप्टाइड प्रेरित विलंब के माध्यम से लार्वा चरण का विस्तार होता है , 36 इसलिए, नेप्लास्टिक ट्यूमर के गठन में imaginal डिस्क्स के कारण यह कई और दिनों के लिए ट्यूमर क्लोन फेनोटाइपिक प्रगति का पालन करना संभव बनाता है। ड्रॉसोफिला के विभिन्न अंगों में ट्यूमर फेनोटाइप के क्लोनल विश्लेषण के लिए हमारी सरल वर्गीकरण विधि मोटे तौर पर लागू हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जे। यह काम जेएसपीएस कंकनी ग्रांट नंबर 26891025, 15 एच 01500 से अनुदान और YT को टूकेडा साइंस फाउंडेशन रिसर्च अनुदान द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Wako 162-19321
TritonX-100 Wako 168-11805
Formaldehyde Wako 064-00406
bovine serum albumin Sigma A7906
normal goat serum Sigma G6767
mounting medium, Vectashield Vector Laboratories H-1000
DAPI Sigma D9542
mouse-anti-Dlg 4F3 Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3A6B4, RRID:AB_579780 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3B8D12, RRID:AB_579781 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 5H7B11, RRID:AB_579779 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin Developmental Studies Hybridoma Bank AA4.3, RRID:AB_579793 dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin Molecular probes A22283 dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 Molecular probes A11030 dilute in PBTG, 1:400
Name Company Catalog Number Comments
Fly strains
sd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #8609 recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #26796 recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #51247
UAS-scrib-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #105412
UAS-RasV12 Bloomington Drosophila Stock Center #64196
UAS-Yki3SA Bloomington Drosophila Stock Center #28817
hsFLP Bloomington Drosophila Stock Center #6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) Bloomington Drosophila Stock Center #4780 recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #5428 X chromosome
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #6658 third chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24650 second chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24651 third chromosome
vkg-GFP Morin et al. 2001 GFP protein trap

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References

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Morimoto, K., Tamori, Y. Induction… More

Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (125), e55901, doi:10.3791/55901 (2017).

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