Summary
Анализ мозаичного клона в эпителии дрозофилы имагинального диска представляет собой мощную модельную систему для изучения генетических и клеточных механизмов опухолевого генеза. Здесь мы описываем протокол для индуцирования опухолей на дислоцированных крыльях Drosophila с использованием системы GAL4-UAS и вводим метод диагностики для классификации фенотипов опухолей.
Abstract
На ранних стадиях рака трансформированные мутантные клетки проявляют цитологические аномалии, начинают неконтролируемое разрастание и постепенно нарушают организацию тканей. Drosophila melanogaster стала популярной экспериментальной модельной системой в области биологии рака для изучения генетических и клеточных механизмов опухолевого генеза. В частности, генетические инструменты для дискретных дисков Drosophila (развитие эпителия у личинок) позволяют создавать трансформированные опухолевые клетки в нормальной эпителиальной ткани, что аналогично начальным стадиям рака человека. Однако недавнее исследование опухолеобразования на крысиных имагинальных дисках дрозофилы показало, что инициирование опухоли зависит от внутренней цитоархитектуры ткани и местного микроокружения, что свидетельствует о том, что важно учитывать специфичность региона к опухолегенным стимулам при оценке фенотипов опухолей в имагинальных диски. Чтобы облегчить фенотипический анализ прогрессирования опухолиНа имагинальных дисках, здесь мы описываем протокол для генетических экспериментов с использованием системы GAL4-UAS для индукции неопластических опухолей в крыловых образных дисках. Далее мы вводим метод диагностики для классификации фенотипов клональных поражений, индуцированных в имагинальном эпителии, поскольку четкий метод классификации для различения различных этапов прогрессирования опухоли (таких как гиперплазия, дисплазия или неоплазия) ранее не описывался. Эти методы могут быть широко применимы к клональному анализу фенотипов опухолей в различных органах у Drosophila .
Introduction
Эпителиальные ткани представляют собой высокоорганизованные системы, которые обладают замечательной гомеостатической способностью поддерживать свою организацию посредством развития и клеточного оборота. Однако эта устойчивая система самоорганизации постепенно разрушается при развитии опухоли. В начале развития опухоли в эпителиальном слое появляются отдельные мутантные клетки, связанные с активацией онкогена или инактивацией гена опухолевых супрессоров. Когда это преобразованная «клетка про опухоль» уклоняется подавляющей среда, разрушает эпителиальные организации, и начинается бесконтрольное распространение, канцерогенез происходит 1. В течение последних нескольких десятилетий выдающиеся технологические достижения в области генетики и молекулярной биологии достигли значительных успехов в области исследований рака. В частности, недавние исследования с использованием инструментов генетического мозаичного анализа у Drosophila melanogaster , таких как митотический рекомбинат миотического рекомбината FLP-FRT (филипса рекомбиназа / флупаза рекомбиназа)Ation 2 и flip-out-GAL4-UAS (восходящая активирующая последовательность) 3 значительно способствовали лучшему пониманию генетических механизмов, участвующих в образовании и метастазировании опухолей 4 , 5 , 6 .
Исследования группы консервативных генов опухолевых супрессоров дрозофилы, летальные гигантские личинки (ЖС), диски большой (DLG), и каракуль (Scrib), подчеркнули критическую зависимость между потерей эпителиальной организации и развитием опухолей, так как эти гены играют ключевую роль В регуляции апикально-базальной клеточной полярности и пролиферации клеток в эпителиальных тканях 7 . В то время как Drosophila имагинальные диски обычно представляют собой монолитированный эпителий, гомозиготные мутации в любом из этих трех генов заставляют клетки терять структуру и полярность, не могут различатьсяrentiate, overproliferate, и в конечном счете образуют многослойные аморфные массы , которые сливаются с окружающими тканями 7. Аналогичным образом, разрушение этих генов у млекопитающих связано с развитием злокачественных опухолей 8 , 9 . Неопластические фенотипы, проявляемые мутантными тканями, привели к классификации этих трех генов в качестве консервативных неопластических опухоле-супрессорных генов (nTSG) 7 , 8 . Однако, когда гомозиготные мутантные клетки nTSG спорадически генерируются при развитии имагинальных дисков дикого типа с использованием митотической рекомбинации, опосредованной FLP-FRT, мутантные клетки удаляются из ткани через c-Jun N-концевую киназу (JNK) -зависимый апоптоз 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , экструзия 15 , 16 , или поглощение и фагоцитоз соседей 17 . В этой генетически мозаичной эпителии апоптоз чаще всего обнаруживается в мутантных клетках nTSG, расположенных на границе клона, что указывает на то, что соседние нормальные клетки вызывают апоптоз мутантных клеток nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Недавние исследования в клетках млекопитающих подтвердили, что эта клеточная конкурентная элиминация проопухолевых клеток является эволюционно консервативным механизмом самозащиты эпителия против рака 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Однако недавнее исследование в дислоцированных дисках Drosophila показало, что мозаичные клоны nTSG-нокдауна индуцируют опухолевые опухоли в специфическихIC областей крыла имагинальных дисков 16 . Первоначальная опухолевая формация всегда находилась в периферической области «шарнира» и никогда не наблюдалась в центральной области «мешочка» эпителия диска крыла, что указывает на то, что опухолегенный потенциал nTSG-нокдаун-клеток зависит от местной среды. Центральная область мешочка функционирует как «опухолевая холодность», где проопухолевые клетки не проявляют диспластического роста, тогда как периферическая область шарнира ведет себя как «горячая точка опухоли» 16 . В областях «холодного пятна» клетки nTSG-нокдауна расслаиваются с базальной стороны и подвергаются апоптозу. Напротив, поскольку ячейки шарнира «горячей точки» обладают сетью устойчивых цитоскелетных структур на их базальных сторонах, клетки с нокаутом nTSG расслаиваются с апикальной стороны эпителия и инициируют опухолегенный переросток 16 . Поэтому анализ фенотипов опухолей в имагинальных дисках требует тщательного анализаДеградации специфичной для региона восприимчивости к опухолегенным стимулам.
Здесь мы описываем протокол, который индуцирует образование неопластических опухолей в римановых дисках крыс Drosophila с использованием системы GAL4-UAS- RNAi , посредством которой клетки с нокаутом nTSG генерируются в нормальном эпителии диска крыла. Хотя эти экспериментальные системы полезны для изучения ранних стадий рака, четкий классификационный метод для оценки этапов прогрессирования опухоли в эпителии эпиданов эпителия не был четко описан ранее. Поэтому мы также предлагаем диагностический метод для классификации пролонгированных клональных фенотипов, индуцированных в эпителиях крыла диска, по трем категориям: гиперплазия (накопление избыточного количества клеток с нормальным появлением с повышенной пролиферацией), дисплазия (предраковая ткань, состоящая из аномально появляющихся Клетки) и неоплазия (доброкачественная или злокачественная опухоль, состоящая из клеток, имеющих аномальный вид и аномальную картину пролиферации).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Летающие кресты и индукция клонов
- Удалите всех мух во флаконе за 12 часов до сбора девственных мух.
- Анестезируйте мух во флаконе, впрыскивая газ CO 2, и поместите мухи на подушку для укладки CO 2 .
- Перенесите 10 - 20 девственных самок и 10 мужчин из подушки для укладки CO 2 в свежий флакон и инкубируйте в течение 1 дня при 25 ° C.
- Перенесите этих мух в свежий флакон и инкубируйте в течение 12 часов при 25 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Отбросьте первый флакон, поскольку девственные самки не кладут достаточное количество яиц в первый день. - Для линий энхансер-GAL4 удалите взрослых мух и инкубируйте флакон при 25 ° C до вскрытия.
- Для индукции мозаичных клонов путем откидывания-GAL4 удалите взрослых мух и инкубируйте флакон в течение 2-4 дней при 25 ° C. Время инкубации до теплового шока зависит от экспериментальной цели. Тепловой шок через 2 дня после осаждения яйца (AED) генерирует мозаичные клоны в незрелом второмВозрастают имагинальные эпителии. Тепловой шок после 3 или 4 дней AED генерирует мозаичные клоны в дифференцированном инагинальном эпителии раннего и среднего возраста.
ПРИМЕЧАНИЕ. Важно проанализировать влияние изменения времени теплового удара на опухолегенерические фенотипы. - Для индукции мозаичных клонов выталкиванием-GAL4 тепловой удар удаляли флаконом путем погружения в водяную баню с температурой 37 ° C в течение 10-45 минут с последующей инкубацией в течение 2 - 3 дней при 25 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Информация о времени теплового удара, времени и времени инкубации в каждом эксперименте показана в легендах фигур.
2. Расчленение личинок
- Собирайте блуждающие личинки третьего возраста с деревянной палочкой или тупыми щипцами, генотипируйте их соответствующими флуоресцентными маркерами ( например , EGFP) под стереоскопическим микроскопом с флуоресценцией и поместите их в планшет для диссекции с PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор).
- Вымойте личинок в PBS путем пипетирования с помощью 2 мл пластиковых переносных пипеток.
- Зажмите центр личинки одним щипцом и раздирайте тело пополам другими щипцами.
- Зажмите крючок для рта передней половины одним щипцом и нажмите рот в направлении тела с помощью других щипцов, чтобы вывернуть тело наизнанку.
- Удалите ненужные материалы, такие как слюнные железы или жировые тела с помощью щипцов.
3. Фиксация и окрашивание антителом
- Перенесите рассеченную переднюю половину личиночного тела (включая диски воображаемого крыла) в пластиковую трубку объемом 1,5 мл и зафиксируйте в 1 мл раствора Fix (4% формальдегида в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте с нежным вращением.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид является токсичным и обладает канцерогенным потенциалом. Надевайте защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этой части все шаги выполняются на нутаторе при комнатной температуре в темноте, если не указано иное. - Удалите решение Fix и отбросьте его. Промыть ткани 1 мл PBT (0,3% TritНа X-100 в PBS) три раза по 15 минут каждый.
- Удалите PBT и добавьте 1 мл PBTG (0,2% бычьего сывороточного альбумина и 5% нормальной козьей сыворотки в PBT) для блокирования и нутации 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите PBTG и добавьте раствор первичного антитела, соответствующим образом разбавленный PBTG (см. Таблицу материалов ) и нутат в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите раствор первичного антитела и три раза промывайте ткани 1 мл ПБТ три раза в течение 15 мин.
- Удалите PBT и добавьте раствор вторичного антитела, соответствующим образом разбавленный PBTG (1: 400). Нутаат в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Удаляют раствор вторичного антитела и промывают ткани 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
- Для окрашивания F-актина удалите PBT и добавьте раствор Phalloidin, соответствующим образом разбавленный в PBS (1:40). Затем нутат в течение 20 мин. Удалите раствор Phalloidin и промойте ткани 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
- Чтобы противостоять ядерной ДНК, удалите PBT и добавьте раствор DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) (0,5 мкг / мл DAPI в PBS). Затем нутат 10 мин.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: DAPI обладает канцерогенным потенциалом. Надевайте защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей. - Удалите раствор DAPI и промойте ткани 1 мл PBT два раза в течение 15 минут каждый.
- Промойте один раз в 1 мл PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Удалите PBS и добавьте 500 мкл 100% глицерина в качестве среды для предварительной установки.
4. Монтаж на микроскопы
- Поместите окрашенные ткани на слайд микроскопа с помощью 2 мл пластиковой переносной пипетки.
- Перенесите ткани в капли монтажной среды на другой микроскоп с помощью щипцов.
- Удерживайте конец расчлененной ткани одним пинцетом и отрывайте мозговые и глазные антенные диски с другими щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните рассеченные мозги, чтобы разместить их рядом с крылатыми имагинальными дисками, Мозги выступают в качестве платформы, предотвращающей покровное от дробления крылатых имагинальных дисков. - Чтобы изолировать крылатые имагинальные диски, удерживайте конец рассеченной ткани одним щипцом и аккуратно поцарапайте стенку корпуса и оторвите диски другими щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если трудно найти крылатые имагинальные диски, очистите трахею от задней к передней стороне. Крыло имагинальных дисков прилипает к трахее. - Аккуратно закройте имагинальные диски с помощью покровного стекла и заклейте лаком для ногтей; Хранить при температуре 4 ° C.
5. Конфокальная микроскопия
- Для получения конфокальных изображений с использованием набора параметров захвата конфокального микроскопа, включая диапазон длины волны излучения, интенсивность лазера, коэффициент усиления, смещение, скорость сканирования и размер изображения 24 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Подробную процедуру получения изображений см. В руководстве по эксплуатации, прилагаемом каждым изготовителем микроскопа. - Для захвата одного coNfocal разделов целого крыла имагинального диска, используйте объектив 20X объектива.
- Приобретите 3-мерные изображения с помощью сканирования z-стека с шагом 0,5-1,0 мкм с использованием линз 40X или 60X.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализа ячеистых фенотипов с высоким разрешением размер изображения должен быть больше 512 х 512 пикселей.
6. Анализ изображения с использованием ImageJ
- Используйте Фиджи, программное обеспечение ImageJ с открытым исходным кодом, ориентированное на анализ биологического изображения (https://fiji.sc/) 25 , для получения и анализа изображений конфокальных z-стеков.
- Чтобы получить вертикальные сечения, откройте изображения z-стека в ImageJ и выберите пункт меню «Изображение / Стеки / Сглаживание».
ПРИМЕЧАНИЕ. Любая ось XZ или ось YZ могут быть выбраны в меню Reslice. Вертикальная секция может быть получена также в произвольном направлении, рисуя прямую линию или прямоугольник на изображении z-стека.
7. Диагностика неопластических фенотипов
- Открыть вертикальную(Ось XZ или YZ), полученная из одного набора изображений z-стека, и анализирует морфологические фенотипы и окрашивание антителами.
- Для диагностики фенотипов опухолей основное внимание уделяется следующим трем пунктам: (1) если клеточная масса, включая кнукерные клоны, отклоняется от основного эпителиального слоя, (2), если субклеточная локализация соединительных белков изменяется в этой клеточной массе , И (3) если диаметр этой клеточной массы больше 4 клеток.
- Классифицировать фенотипы опухолей в соответствии с блок-схемой, описанной на рисунке 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать образование неопластической опухоли, экспериментально индуцированную RNAi- опосредованным nTSG-нокдауном в дислоцированных крыльях Drosophila , три разных драйвера GAL4 использовались для выражения UAS-RNAi для lgl или scrib : (1) sd-GAL4, который управляет сильной экспрессией UAS в Крыла и мягкой экспрессии в шарнирных областях ( рис. 2 и рис. 3А ); (2) upd-GAL4, который двигается в субдоменах шарнира, включая сильное выражение в двух доменах дорзальной медиальной складки, умеренную экспрессию в одной передней латеральной области и слабое выражение в вентрально-заднем домене ( рис. 2 и рис. 3C ); И (3) индуцированный тепловым шоком GAL4, который генерирует случайные мозаичные клоны, экспрессирующие UAS-гены ( рис. 4 и Fi5). Во всех экспериментах UAS-EGFP был совместно выражен с UAS-RNAi, чтобы отметить клоны нокдауна.
Во-первых, sd-GAL4 -driven lgl-RNAi использовался для индукции нокдауна lgl в крышке и шарнирных областях. В контрольных дисках крыла третьего возраста без UAS-lgl-RNAi морфологические изменения не наблюдались ( рис. 3A ). Напротив, в дисках крыла третьего возраста, экспрессирующих lgl-RNAi , в некоторых частях шарнира отчетливо наблюдались эпителиальные деформации и туморогенные переростки ( рис. 3B ). Однако в области колпака крыла не наблюдалось диспластического перероста. Сильная экспрессия MMP1 (матричная металлопротеиназа-1) наблюдалась в опухолевых шарнирных поражениях, но не в области крыла ( рис. 3B ). Поскольку экспрессия MMP1 участвует в деградации мембраны основанияВозможно, эти опухоли шарнира обладают метастатическим потенциалом ( рис. 3B ). Затем upd-GAL4 использовался для индукции lgl knockdown в области шарнира. В контрольных дисках крыла третьего возраста без UAS-lgl-RNAi морфологические изменения не наблюдались ( рис. 3C ). Тем не менее, через 5 дней AED диски крыс третьего возраста с upd-GAL4 и lgl-RNAi проявили заметную эпителиальную дезорганизацию, с накоплением F-актина и смещением клона из эпителиального слоя ( рис. 3D ). В течение 6 дней AED опухолевые опухоли, экспрессирующие MMP1, переросли в шарнирную область ( рис. 3G ), хотя и с изменением размера опухоли между образцами ( рис. 3Е и F ). Вертикальный участок шарнирной области подтвердил, что опухолевая опухоль претерпела отклонения от роста на апикальной стороне эпителиального слоя ( Для мониторинга прогрессирования роста опухоли, вызванного нокдауном lgl , спорадические клоны, экспрессирующие lgl-RNAi, были получены в крыловых дисках с использованием мозаичной системы GAL4, индуцированной тепловым шоком. Через два дня после теплового шока личинкам второго возраста (2 дня AED) некоторые клоны lgl -knockdown, расположенные в области шарнира, показали отклонение от апикальной стороны эпителиального слоя ( рис. 4A ). Через четыре дня после индукции теплового шока диспластические поражения в области шарнира стали ясными, что свидетельствует о том, что клыки lgl -knockdown, смещенные от апикальной стороны, размножаются в просвете ( рис. 4B ). Через семь дней после индукции теплового шока в области шарниров доминировали туморогенные переросты ( рис. 4C ). Чтобы продемонстрироватьКлассификация клональных фенотипов с использованием нашего метода диагностики, спорадические клоны, экспрессирующие scrib-RNAi, были созданы в крыловых дисках с использованием мозаичной системы GAL4, вызванной тепловым шоком. Через пять дней после теплового шока личинкам второго возраста (2 дня AED) некоторые GFP-экспрессирующие клонированные клонированные клоны проявляли опухолегенные фенотипы ( рис. 5A ). Мы проанализировали четыре клона (B, C, D и E на рис. 5A ) в вертикальных сечениях конфокальных изображений z-стека с использованием ImageJ, так как трудно получить подробные цитологические и структурные фенотипы в 2D конфокальных изображениях ( рис. 4 и рис. 5А ). Клоны B и C были классифицированы как дисплазия, так как белок септимента-перехода большой (Dlg) был неправильно локализован ( рис. 5B и C ). В клоне В размер клеточной массы, вытесненной из эпителия, не превышал 4-клеток в диаметреR ( рис. 5B ), тогда как клон C не отклоняется от эпителия ( рис. 5C ); Поэтому клоны B и C не считаются неопластическими. Однако клоны D и E, которые также показали неправильную локализацию Dlg, образовывали массы опухолевых клеток вне эпителия ( рис. 5D И 5Е ). Поскольку размер этих смещенных опухолевых клонов составлял более 4 клеток в диаметре, клоны классифицировались как неопластические. Для индуцирования гиперпластических опухолей или образований кисты в крылатных образных дисках были созданы спорадические клоны, экспрессирующие онкогенные Ras ( Ras V12 ) или конститутивно активную форму Yorkie, транскрипционного коактиватора пути Hippo ( Yki 3SA ) с использованием индуцированного тепловым шоком Откидной мозаичной системы GAL4. Через четыре дня после теплового шока к личинкам второго возраста (2 дня AED) RaV12- экспрессирующие клоны, помеченные GFP, стали круглыми клеточными массами в имагинальных дисках ( рис. 6A ). Вертикальная часть экспрессирующего клона Ras V12 (клон В на рис. 6А ) показала, что клеточная масса, диссоциированная из эпителиального слоя, имеет правильную локализацию Dlg, предполагая, что клеточная масса поддерживает нормальные эпителиальные структуры вне эпителиального слоя ( фиг. 6B ) , Экспрессия MMP1 не наблюдалась в этих Ras V12- экспрессирующих клонов ( рис. 6C ). Поэтому клон В классифицировали как образование кисты. Через четыре дня после теплового шока личинкам второго возраста (2 дня AED), Yki 3SA- экспрессирующие клоны, меченные GFP, образовывали большие клеточные массы в имагинальных дисках ( рис. 7A ). Мы сосредоточились на двух клонов (B и C на рисунке 7A ). Clone B показалИнтеграция в эпителиальный слой и правильная локализация Dlg в субапикальных мембранах эпителиальных клеток, что свидетельствует о том, что экспрессирующий клон Yki 3SA B поддерживает эпителиальную структуру. Поэтому клон В классифицировался как гиперплазия ( рис. 7В ). Клон С, расположенный в области шарнира, показал неправильную локализацию Dlg и сформировал многослойную структуру на основной стороне эпителиального слоя. Экспрессия MMP1 не наблюдалась в экспрессирующих клонах Yki 3SA . Взятый вместе, клон C был классифицирован как доброкачественное новообразование ( рис. 7C и D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Рисунок 1: Блок-схема классификации опухолевых фенотипов. Эта блок-схема представляет собой метод диагностики для классификации клональных поражений в имагинальном эпителии. Классический(1) отклонение клонов от эпителиального слоя, (2) субклеточная неправильная локализация белков, (3) клеточная пролиферация, (4) размер клона и (5) экспрессия MMP1. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 
Рисунок 2: ( A ) Имагинальный диск крылатого типа, окрашенный для Dlg (зеленый) и ядер (DAPI, пурпурный). ( B ) Схематическое изображение дислоцированных дислокаций дрозофилы, показывающих крысиные мешочки (синие), шарнирные (оранжевые) и нотные (зеленые) области. ( C ) Обычный имагинальный диск крыла, окрашенный для F-актина (красный) и микротрубочек (зеленый). Мембраны подвалов маркируются коллагеном IV / Vkg-GFP (синий). ( D ) Вертикальный участок сайтаОтмечена белой пунктирной линией в ( C ). ( E ) Линейные рисунки отслеживают апикальные (красные) и базальные (синие) стороны эпителиального слоя в ( D ). Пунктирные линии прослеживают периподиальную мембрану. Указаны дистальные (Df), медиальные (Mf) и проксимальные (Pf) складки дорзального шарнира.
Подробные генотипы: A, w - CD, Vkg-GFP Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка. 
Рисунок 3: Site-specific Tumorigenesis, индуцированный Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Конфокальные изображения показывают крылатые имагинальные диски, вырезанные из личинок третьего возраста указанных генотипов, окрашенных для MMP1 (красный). Sd -GAL4 -expreОбласти ssing были помечены выражением GFP (зеленый). ( CG ) Конфокальные изображения показывают крыло имагинальные диски, рассеченные от личинок третьего возраста указанных генотипов в указанный момент времени AED. F-актин окрашивали фаллоидином (красный) в ( CF ). Экспрессия MMP1 окрашивается антителами против MMP1 (красный) в ( G ). Области, обновляющие upd-GAL4, были помечены выражением GFP (зеленый). Нижние панели ( CF ) показывают увеличенные виды областей, указанных в верхних панелях. Белые стрелки указывают на диспластические поражения, вызванные клонами lgl- knockdown. ( H ) Вертикальный участок сайта, отмеченный белой пунктирной линией в нижней панели (E). Белые пунктирные линии обозначают границы между корпусом крыла и шарнирными областями в (A) и (B). Ядра были помечены DAPI (синий). Шкалы шкалы = 100 мкм (AG) и 50 мкм (H). Подробные генотипы: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; БАС-dicer2; БАС-LGL-иРНК; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; БАС-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; БАС-dicer2; UAS-lgl-RNAi Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка. 
Рисунок 4: Фенотипы опухолей, индуцированные случайными мозаичными клонов. ( AC ) Конфокальные изображения показывают мозаичные крылья имагинальных дисков личинок третьего возраста с клон-когенерацией lgl-RNAi и GFP (зеленый) в указанный момент времени после индукции теплового шока. Ядра были помечены DAPI (синий). Средние панели показывают увеличенные виды областей белого квадрата, отмеченных на левых панелях. Правая панель S показывают схематические чертежи апикальной стороны эпителиальных слоев (синий) и GFP-экспрессирующие клоны (зеленый). Мозаичные клоны, расположенные внутри эпителия, изображены светло-зелеными, а неопластические опухоли, отклоняющиеся от эпителия, показаны пурпуром. Белые пунктирные линии на левых панелях обозначают границы между крышкой и шарнирными областями. Белые стрелки на средних панелях указывают на диспластические поражения, вызванные клонами lgl -knockdown. Шкала шкалы = 100 мкм. Подробные генотипы: AC, hsFLP; БАС-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (тепловой шокированный 30 мин через 2 дня AED, инкубировать 2 дня при 25 ° C в А, инкубировать 4 дня при 25 ° C в B, инкубировать 7 дней при 25 ° C в C после теплового шока). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Диагностическое исследование диспластических клональных фенотипов. ( A ) На левой панели изображен мозаичный имагинальный диск личинки третьего возраста с клонами, совместно выражающими scrib-RNAi и GFP (зеленый) через 5 дней после индукции теплового шока, окрашиваемых для Dlg (красный). На правой панели показан схематический рисунок линии апикальной стороны эпителиальных слоев (синий) и GFP-экспрессирующие клоны (зеленый). Мозаичные клоны в эпителиальных слоях показаны светло-зелеными, а неопластические опухоли, вытесненные из эпителия, показаны пурпуром. ( BE ) Конфокальные изображения показывают вертикальные разрезы клонов- кратковременных клонов, указанных на правой панели (A). На вторых панелях слева показаны шаблоны локализации Dlg (красный). Третьи панели слева показывают схематические чертежи апикальных (красных) и базальных (синих) сторон эпителиальных слоев и GFP-exprEssing scrib -knockdown clones (зеленый). Диспластические клоны в эпителиальных слоях показаны светло-зелеными (B и C), в то время как неопластические клоны, вытесненные из эпителия, показаны пурпурной (D и E). Белые стрелки указывают на клонирование- клоун-клоны, показывающие опухолевый фенотип. Ядра были помечены DAPI (синий). Шкала шкалы = 50 мкм. Фенотип опухоли каждого клона классифицировали в соответствии с блок-схемой, показанной на рисунке 1 . Подробные генотипы: AE, hsFLP; БАС-Scrib-иРНК; Действовать> CD2> GAL4, UAS-EGFP (с термическим шоком 30 мин при 2 дня AED, инкубировать 4 дня при 25 ° C после теплового шока). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 
Рисунок 6: ДиагностикаTic Изучение Ras V12 -выражения клональных фенотипов. ( A ) На левой панели изображен мозаичный имагинальный диск личинки третьего возраста с клонами, экспрессирующими онкогенные Ras V12 и GFP (зеленый) через 4 дня после индукции теплового шока, окрашиваемых для Dlg (красный). На правой панели показан схематический рисунок линии апикальной стороны эпителиальных слоев (синий) и GFP-экспрессирующие клоны (зеленый). Шкала шкалы представляет собой 50 мкм. ( B ) Вертикальные секции экспрессирующих клонов Ras V12, указанных на правой панели (A). На вторых панелях слева показаны шаблоны локализации Dlg (красный). На третьей панели слева показаны схематические чертежи апикальных (красных) и базальных (синих) сторон эпителиальных слоев и экспрессирующие клоны Ras V12 и GFP (зеленые). Шкала шкалы = 25 мкм. ( C ) Мозаичный крыло имагинального диска личинки третьего возраста с когенерацией клонов <Em> Ras V12 и GFP (зеленый) через 4 дня после индукции теплового шока, окрашенных для MMP1 (красный). Шкала шкалы = 100 мкм. Подробные генотипы: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Действовать> CD2> GAL4, UAS-EGFP (с термическим шоком 45 мин при 2 дня AED, инкубировать 4 дня при 25 ° C после теплового шока). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 
Рисунок 7: Диагностическое исследование Yki 3SA- экспрессирующих клональных фенотипов . ( A ) Левая панель показывает мозаичный имагинальный диск личинки третьего возраста с клонами, ко-экспрессирующими конститутивно активные Yki 3SA и GFP (зеленый) через 4 дня после индукции теплового шока, окрашиваемых для Dlg (красный). Правая панель показывает как Химический рисунок линии апикальной стороны эпителиальных слоев (синий) и GFP-экспрессирующие клоны (зеленый). Шкала шкалы = 50 мкм. ( BC ) Вертикальные участки экспрессирующих клонов Yki 3SA, указанных на правой панели (A). На вторых панелях слева показаны шаблоны локализации Dlg (красный). На третьих панелях слева показаны схематические чертежи апикальных (красных) и базальных (синих) сторон эпителиальных слоев и Yki и GFP, выражающие клоны (зеленые). Шкала шкалы = 25 мкм. ( D ) мозаичный диск крыла имагинального личинки третьего возраста с клонами, экспрессирующими Yki 3SA и GFP (зеленый) через 4 дня после индукции теплового шока, окрашивали для MMP1 (красный). Шкала шкалы = 100 мкм. Подробные генотипы: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (с термическим шоком 30 мин при 2 дня AED, инкубируют 4 дня при 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система GAL4-UAS является одним из самых мощных генетических инструментов для целевой экспрессии генов у Drosophila 26 и значительно облегчает индукцию и анализ опухолевых клеток in vivo 4 . Эта система позволяет генерировать клоны, несущие нокдаун генов опухолей-супрессоров или избыточную экспрессию онкогенов в эпителиальной ткани дикого типа, что очень похоже на начальные стадии рака человека, где трансформированные опухолевые клетки окружены нормальными эпителиальными клетками. Линии драйвера GAL4, регулируемые энхансерными последовательностями, такими как линии энхансера-лазера GAL4 или линии 27 Gel4 Gan4, имеют уникальные пространственно ограниченные экспрессионные паттерны. Следовательно, эти линии энхансер-GAL4 полезны, чтобы индуцировать опухоли последовательно в ограниченных областях воображаемых дисков. В дополнение к sd-GAL4 и upd-GAL4, показанным в этом исследовании, мы подтвердили, что lgl- knockdown bY другие линии энхансер-ловушки GAL4, включая гравюры-GAL4 ( en-GAL4 ), hedgehog-GAL4 ( hh-GAL4 ), оптомотор-GAL4 ( omb-GAL4 ), patched-GAL4 ( ptc-GAL4 ) и spalt-major- GAL4 ( salm-GAL4 ) может генерировать неопластические опухоли в шарнирных областях крыловых имагинальных дисков. Если шаблон экспрессии энхансер-GAL4 должен быть временно контролирован, комбинация GAL4 и чувствительной к температуре версии GAL80 (GAL80 ts ) является опцией. GAL80 ts подавляет функцию GAL4 при 18 ° C, но не при 29 ° C, что позволяет включать или выключать экспрессию UAS-трансгенов 28 по необходимости 28 .
Мозаичная система Flip-out-GAL4, которая объединяет систему FLP-FRT и систему GAL4-UAS 3 , генерирует случайные клоны в имагинальных дисках. Комбинируя индуцируемую тепловым ударом флиппазу (hsFLP) с откидным GAL4, время генерации клонаИон контролируется. Так как опухолегенный потенциал мнимых дискретных клеток может зависеть от стадии развития, эндогенных сигнальных событий и / или клеточной дифференциации 29 , 30 , очень важно исследовать влияние изменения времени теплового шока на опухолевые генотипы.
Ранее было показано, что мутантные клоны nTSG подвергаются клеточно-зависимому апоптозу, когда они окружены клетками дикого типа 10 , 11 , 12 , 18 , что указывает на необходимость множественных мутаций для трансформации клеток при развитии рака. На самом деле, сверхэкспрессия онкогенных Ras или Yki в клонах мутанта lgl или scrib превращает их в агрессивные опухоли 10 , 18 , 31, тогда как misЭкспрессия Ras V12 или Yki 3SA сама по себе не вызывает злокачественных новообразований без мутаций nTSG. Как показано здесь и ранее 16 , протуберкулезные клоны нокдауна nTSG, сгенерированные в дисках крыла дикого типа, также претерпевают апоптоз и не проявляют туморогенез в крышке 16 . В то же время кДНК-нокдаун-клоны, расположенные в «горячих точках» шарнира, развиваются в неопластические опухоли без каких-либо дополнительных онкогенных мутаций. В шарнирных областях nTSG-дефицитные клетки захватывают эндогенный трансмиттер Janus kinase / signal и активатор транскрипции (JAK / STAT) для передачи опухолевого генеза 16 . Поэтому специфичные для шарнира GAL4, такие как upd-GAL4, являются полезными инструментами для последовательного индуцирования образования неопластических опухолей с помощью RNAi- опосредованного нокдауна генов-супрессоров опухолей. Хотя флип-аут-GAL4-индуцированные мозаичные клоны nTSG-нокдауна также индуцируют неопластические опухоли в шарнирахGions, появление опухолеобразования зависит от начального размера клона: большие клоны, генерируемые тепловым шоком в течение 20 мин, обычно индуцируют опухолегенез, тогда как большинство мелких клонов, генерируемых тепловым шоком менее 10 мин, полностью устраняются (KM и YT, неопубликованные данные).
В ряде недавних исследований развития опухолей и прогрессирования рака используются диски Drosophila imaginal в качестве модели 32 , 33 . Обычно к этим исследованиям относятся несколько маркеров опухолевых опухолей: девиационные клеточные массы, деформированные формы диска, накопление F-актина, усиление клеточного цикла (включение BrdU / EdU или экспрессия PH3), активация передачи сигналов JNK и ее мишеней MMP1, расположенной ниже по течению, базальной мембраны Разрушение и / или эпителиальная дезорганизация, включая потерю или субклеточную делокализацию белков, вовлеченных в полярность апикально-базальной клетки (крошки, звездчатость, патч, aPKC, базака / PAR-3 или PAR-6), септированные соединения(Lgl, Scrib, Dlg или Coracle) или присоединяются к соединениям (E-Cadherin или Armadillo). Эти фенотипы легко обнаруживаются обычным окрашиванием антителом. Хотя трудно определить, является ли клональный фенотип гиперплазией, дисплазией, доброкачественным новообразованием или злокачественным новообразованием на ранней стадии опухолевого генеза, он должен быть проще в эпителии диска Drosophila iminal, состоящего из одного эпителиального монослоя. В этом исследовании мы внедрили диагностический метод для классификации фенотипов опухолевых клонов, индуцированных в эпителиальном монослое ( рис. 1 ). Этот метод требует тщательных наблюдений за пятью критериями с использованием конфокальных изображений z-стека; Каждый диагностический критерий может быть исследован обычным окрашиванием антител и конфокальной визуализацией. Одним из новых критериев, которые мы вводили в этом методе, является «критерий 4-клеточного диаметра», который различает дисплазию и новообразование в имагинальных дисках. Про-опухолевые клетки, такие как мутантные клоны nTSG, являются частымиЭкструдировали из эпителиальных слоев через клеточную конкуренцию или разориентировку шпинделя 15 , 16 , 34 . В большинстве случаев эти экструдированные клетки апоптоза, и поэтому они не могут размножаться. Хотя возможно, что пролекарственные клетки подвергаются делению клеток один раз во время экструзии и один или два раза после экструзии, это делает клеточную массу диаметром от 2 до 3 клеток. Поэтому, если клеточная масса проопухолевых клеток, отклоненных от эпителиального слоя, больше, чем 4-клеточный диаметр, мы можем определить, что они выживают и пролиферируют как новообразование за пределами эпителиального слоя.
Несмотря на то, что этот метод диагностики прост, крайне важно пройти временной курс фенотипов, поскольку развитие опухоли и злокачественность прогрессируют в течение всего времени. Например, дисплазия является цитологически ненормальной тканью и переходным состоянием между полностью доброкачественными ростками и теми, которые предваряютзлокачественные. Поэтому, даже если наблюдаемый клон определяется как дисплазия в соответствии с блок-схемой ( рис. 1 ), возможно, что дисплазия впоследствии превращается в новообразование. Хотя личиночная стадия ограничена во времени (5-6 дней при 25 ° C или 4-5 дней при 29 ° C AED), рост опухоли в имагинальных дисках продлевает стадию личинки через индуцированную инсулиноподобным пептидом задержку разведения 35 , 36 . Поэтому образование неопластических опухолей в имагинальных дисках позволяет наблюдать фенотипическую прогрессию опухолевого клона еще несколько дней. Наш простой метод классификации может быть широко применим к клональному анализу фенотипов опухолей в различных органах у дрозофилы .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Дж. Ваугена за критическое чтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами от JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 и научным грантом Научного фонда Takeda до YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
