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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Inducción y diagnóstico de tumores en Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/55901
Automatic Translation
1,2, 1
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Summary

El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.

Abstract

En las primeras etapas del cáncer, las células mutantes transformadas muestran anormalidades citológicas, comienzan un crecimiento excesivo no controlado y alteran progresivamente la organización tisular. Drosophila melanogaster ha surgido como un modelo experimental popular en el sistema de biología del cáncer para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. En particular, las herramientas genéticas para los discos imaginarios de Drosophila (desarrollo de epitelios en larvas) permiten la creación de células pro tumorales transformadas dentro de un tejido epitelial normal, situación similar a las etapas iniciales del cáncer humano. Sin embargo, un estudio reciente de tumorigénesis en discos imaginarios de alas de Drosophila demostró que la iniciación tumoral depende de la citoarquitectura intrínseca del tejido y del microambiente local, lo que sugiere que es importante considerar la susceptibilidad específica de la región a los estímulos tumorigénicos en la evaluación de fenotipos tumorales en imaginal Discos Para facilitar el análisis fenotípico del progreso tumoralEn discos imaginal, aquí se describe un protocolo para experimentos genéticos utilizando el sistema GAL4-UAS para inducir tumores neoplásicos en discos imaginal de ala. Además, hemos introducido un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos de las lesiones clonales inducidas en el epitelio imaginal, como un método de clasificación clara para discriminar las diversas etapas de la progresión tumoral (como la hiperplasia, displasia o neoplasia) no se había descrito anteriormente. Estos métodos podrían aplicarse ampliamente al análisis clonal de fenotipos tumorales en diversos órganos de Drosophila .

Introduction

Los tejidos epiteliales son sistemas altamente organizados que tienen la notable capacidad homeostática de mantener su organización a través del desarrollo y la renovación celular. Este robusto sistema de auto-organización, sin embargo, se interrumpe progresivamente durante el desarrollo del tumor. Al comienzo del desarrollo del tumor, las células mutantes individuales que surgen de la activación del oncogén o la inactivación del gen supresor del tumor emergen dentro de una capa epitelial. Cuando esta transformada "célula pro-tumor" evade un ambiente supresor, interrumpe la organización epitelial, y comienza la proliferación incontrolada, la tumorigénesis se produce 1 . Durante las últimas décadas, avances tecnológicos sobresalientes en genética y biología molecular han hecho progresos notables en la investigación del cáncer. En particular, los estudios recientes que utilizan los instrumentos de análisis genéticamente mosaico en Drosophila melanogaster , tales como la recombinación mitótica FLP-FRT (recombinante flippase / flase recombinase)ación 2 y flip-out-GAL4-UAS sistemas (secuencia de activación aguas arriba) 3, han contribuido enormemente a una mejor comprensión de los mecanismos genéticos implicados en la formación y metástasis de tumores 4, 5, 6.

Los estudios de un grupo de genes supresores de tumores conservados de Drosophila , larvas gigantes letales ( lgl ), discos grandes ( dlg ) y garabatos ( scrib ), resaltaron la relación crítica entre la pérdida de organización epitelial y el desarrollo tumoral, ya que estos genes desempeñan papeles clave En la regulación de la polaridad celular apical-basal y la proliferación celular en los tejidos epiteliales [ 7] . Mientras que los discos imaginarios de Drosophila son normalmente epitelios monocapa, las mutaciones homocigóticas en cualquiera de estos tres genes hacen que las células pierdan estructura y polaridad, no difierenRentizar, sobreproliferar y, finalmente, formar masas amorfas multicapa que se funden con tejidos adyacentes 7 . Del mismo modo, la interrupción de estos genes en los mamíferos está involucrado en el desarrollo de tumores malignos [ 8 , 9] . Los fenotipos neoplásicos exhibidos por los tejidos mutantes han llevado a la clasificación de estos tres genes conservados, genes neoplásicos supresores de tumores (nTSGs) [ 7 , 8] . Sin embargo, cuando homozygous nTSG células mutantes son esporádicos generados en el desarrollo de tipo salvaje discursos imaginales utilizando FLP-FRT mediada por la recombinación mitótica, las células mutantes son eliminados del tejido a través de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) -dependiente apoptosis 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusión 15 , 16 , o el engolfamiento y la fagocitosis por los vecinos [ 17] . En este epitelio genéticamente mosaico, la apoptosis se detecta principalmente en las células mutantes nTSG localizadas en el límite del clon, lo que sugiere que las células normales adyacentes desencadenar la apoptosis de nTSG células mutantes [ 10 , 11 , 12 , 18] . Estudios recientes en células de mamíferos han confirmado que esta eliminación celular dependiente de la competencia de las células pro-tumor es un mecanismo evolutivo conservado epiteliales de autodefensa contra el cáncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Un reciente estudio en Drosophila imaginal discos, sin embargo, mostró que mosaico nTSG-knockdown clones induce tumores neoplásicos en especificaIc de los discos imaginal de ala 16 . La formación inicial de tumores se encontró siempre en la región periférica de la "bisagra" y nunca se observó en la región central de la "bolsa" del epitelio del disco de ala, lo que sugiere que el potencial tumorigénico de las células knockdown nTSG depende del entorno local. La región de la bolsa central funciona como una "mancha fría del tumor" donde las células pro-tumor no muestran sobrecrecimiento displásico, mientras que la región bisagra periférica se comporta como un "hotspot tumoral" 16 . En las regiones de bolsa "coldspot", las células de desmontaje de nTSG se deslaminan desde el lado basal y sufren apoptosis. Por el contrario, como "hotspot" bisagra células poseen una red de estructuras robusto citoesqueleto en sus lados basales, nTSG-knockdown células delaminate desde el lado apical del epitelio e iniciar tumorigenic sobrecrecimiento [ 16] . Por lo tanto, el análisis de los fenotipos tumorales en discos imaginal requiereLa susceptibilidad específica de la región a estímulos tumorigénicos.

En este sentido, se describe un protocolo para inducir la formación de tumores neoplásicos en el disco Drosophila imaginal discos utilizando el GAL4-UAS- RNAi sistema por el cual nTSG-knockdown células se generan en el epitelio del disco de ala normal. Aunque estos sistemas experimentales son útiles para estudiar las primeras etapas del cáncer, no se ha descrito claramente un método claro de clasificación para evaluar las etapas de progresión tumoral en epitelios discales imaginarios. Por lo tanto, también proponemos un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos clonales pro-tumorales inducidos en el epitelio del disco ala en tres categorías: hiperplasia (acumulación de un número excesivo de células de aparición normal con aumento de la proliferación), displasia (tejido premaligno compuesto de anormalmente aparente Células), y neoplasia (tumor benigno o maligno compuesto de células que tienen un aspecto anormal y un patrón de proliferación anormal).

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Protocol

1. Cruces de la mosca y inducción del clon

  1. Eliminar todas las moscas en el vial 12 h antes de recoger virgen moscas.
  2. Anestesiar las moscas en el vial inyectando gas CO 2 y colocar moscas en una almohadilla de mosca de CO 2 .
  3. Transferir de 10 a 20 hembras virgenes y 10 machos de la almohadilla de mosca de CO 2 a un vial nuevo e incubar durante 1 día a 25 ° C.
  4. Transferir estas moscas en un vial nuevo e incubar durante 12 h a 25 ° C.
    NOTA: Deseche el primer vial ya que las hembras virgen no ponen suficientes huevos en el primer día.
  5. Para líneas enhancer-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial a 25 ° C hasta disección.
  6. Para la inducción de los clones del mosaico mediante el flip-out-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial durante 2-4 días a 25 ° C. El tiempo de incubación antes del choque térmico depende del propósito experimental. Un choque térmico 2 días después de la deposición del huevo (AED) genera clones de mosaico en segundos inmadurosInstar epitelios imaginal. Un shock térmico después de 3 ó 4 días de DEA genera clones de mosaico en epitelios imaginarios diferenciados de instar temprano a mediados del tercer instar.
    NOTA: Es importante examinar el efecto del tiempo de choque térmico alterado en los fenotipos tumorigénicos.
  7. Para la inducción de los clones de mosaico mediante flip-out-GAL4, calentar el vial por inmersión en un baño de agua a 37 ° C durante 10 - 45 min seguido de incubación durante 2 - 3 días a 25 ° C.
    NOTA: La información del tiempo de choque térmico, el tiempo y el tiempo de incubación en cada experimento se muestran en las leyendas de la figura.

2. Disección de las larvas

  1. Recoja las larvas de tercer estadio errantes con una pinza de madera o fórceps romos, genotipo por marcadores fluorescentes apropiados ( por ejemplo , EGFP) bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelas en un plato de disección con PBS (solución salina tamponada con fosfato).
  2. Lavar las larvas en PBS pipeteando con pipetas de transferencia de plástico de 2 ml.
  3. Pellizque el centro de la larva con una pinza y rompa el cuerpo por la mitad con la otra pinza.
  4. Pellizque el gancho de la boca de la mitad anterior con una pinza y empuje la boca hacia el cuerpo con la otra pinza para girar el cuerpo de adentro hacia afuera.
  5. Eliminar los materiales innecesarios, como las glándulas salivales o los cuerpos de grasa con fórceps.

3. Fijación y tinción de anticuerpos

  1. Transferir la mitad anterior disecada del cuerpo larval (incluyendo los discos imaginarios del ala) a un tubo plástico de 1,5 ml y fijar en 1 mL de solución Fix (formaldehído 4% en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con rotación suave.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y tiene un potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
    NOTA: En esta parte, todas las etapas tienen lugar en un nutator a temperatura ambiente en la oscuridad a menos que se indique lo contrario.
  2. Quite la solución Fix y deséchela. Lave los tejidos con 1 mL de PBT (0.3% TritEn X-100 en PBS) tres veces durante 15 min cada uno.
  3. Eliminar el PBT y añadir 1 ml de PBTG (0,2% de suero de bóvidos bovinos y 5% de suero normal de cabra en PBT) para bloquear y nutate 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC.
  4. Quitar PBTG y añadir la solución de anticuerpo primario diluido apropiadamente con PBTG (véase Tabla de Materiales ) y nutate durante la noche a 4 ° C.
  5. Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavar los tejidos con 1 mL de PBT tres veces durante 15 minutos cada uno.
  6. Eliminar PBT y añadir una solución de anticuerpo secundaria debidamente diluida con PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h a temperatura ambiente o durante una noche a 4 ° C.
  7. Eliminar la solución de anticuerpos secundarios y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
  8. Para teñir F-actina, eliminar PBT y añadir Phalloidin solución diluida adecuadamente en PBS (1:40). A continuación, nutate durante 20 min. Retire la solución de Phalloidin y lave los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 min cada uno.
  9. Para contra-tinción de ADN nuclear, eliminar PBT y añadir DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) solución (0,5 μ g / mL de DAPI en PBS). A continuación, nutate 10 min.
    PRECAUCIÓN: DAPI tiene potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
  10. Eliminar la solución DAPI y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
  11. Enjuagar una vez en 1 mL de PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
  12. Eliminar PBS y añadir 500 μ l de 100% de glicerol como el medio de pre-montaje.

4. Montaje en portaobjetos de microscopio

  1. Coloque los tejidos teñidos en una diapositiva de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico de 2 ml.
  2. Transferir los tejidos a gotas de medio de montaje en otra diapositiva de microscopio con fórceps.
  3. Mantenga presionado el extremo del tejido diseccionado con una pinza y retire los discos antenales del cerebro y los ojos con las otras pinzas.
    NOTA: Mantenga los cerebros disecados para colocarlos cerca de los discos imaginales del ala. Los cerebros actúan como una plataforma que impide que el cubreobjeto aplaste los discos imaginal del ala.
  4. Para aislar el ala los discos imaginales mantienen el extremo del tejido disecado con una pinza y rascan suavemente la pared del cuerpo y arrancan los discos con las otras pinzas.
    NOTA: Si es difícil encontrar discos imaginal del ala, pelar la tráquea desde el lado posterior al lado anterior. Los discos imaginarios del ala se adhieren a la tráquea.
  5. Cubra suavemente los discos imaginales con un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas; Almacenar a 4 ° C.

5. Microscopía confocal

  1. Para adquirir imágenes confocales usando un microscopio confocal, fije los parámetros de adquisición de imágenes, incluyendo el rango de longitud de onda de emisión, intensidad láser, ganancia, offset, velocidad de exploración y tamaño de imagen 24 .
    NOTA: Para el procedimiento detallado de los ajustes de adquisición de imágenes, consulte el manual de instrucciones suministrado por cada fabricante de microscopio.
  2. Para capturar solo coSecciones nfocal de un disco imaginal del ala entera, utilice un objetivo 20X.
  3. Adquiera imágenes tridimensionales mediante escaneo de pilas en z con tamaño de paso de 0,5 a 1,0 μm usando lentes de 40X o 60X.
    NOTA: Para analizar los fenotipos celulares en alta resolución, un tamaño de imagen debe ser mayor de 512 x 512 píxeles.

6. Análisis de imágenes con ImageJ

  1. Utilice Fiji, un software de código abierto ImageJ enfocado en el análisis de imágenes biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir y analizar las imágenes confocal de la z-pila.
  2. Para obtener secciones verticales, abra las imágenes de pila z en ImageJ y seleccione el elemento de menú "Imagen / pilas / Reslice".
    NOTA: Tanto el eje XZ como el eje YZ se pueden seleccionar en el menú Reslice. La sección vertical puede obtenerse también en una dirección arbitraria dibujando una línea recta o rectángulo sobre la imagen de la pila z.

7. Diagnóstico de los fenotipos neoplásicos

  1. Abrir la vertical(Eje XZ o YZ) obtenidos a partir de un conjunto de imágenes de pila z y analizar fenotipos morfológicos y tinción de anticuerpos.
  2. Para el diagnóstico de los fenotipos tumorales, se centran principalmente en los siguientes tres puntos: (1) si una masa celular, incluyendo clones knockdown, se desvía de la capa epitelial principal, (2) si la localización subcelular de las proteínas de unión se altera en esta masa celular , Y (3) si el diámetro de esta masa celular es mayor que 4 células.
  3. Clasificar los fenotipos tumorales de acuerdo con el diagrama de flujo descrito en la Figura 1 .

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Representative Results

Para demostrar la formación de tumores neoplásicos inducidos experimentalmente por RNAi mediada nTSG-knockdown en Drosophila ala imaginal discos, tres diferentes GAL4 conductores se utilizaron para expresar UAS-RNAi para lgl o scrib : (1) sd-GAL4, que impulsa fuerte UAS expresión en el Bolsa de ala y expresión suave en las regiones de bisagra ( Figura 2 y Figura 3A ); (2) upd-GAL4, que conduce en subdominios de la bisagra, incluyendo una fuerte expresión en dos dominios del pliegue medial dorsal, una expresión leve en un dominio anterior-lateral y una expresión débil en el dominio ventral-posterior ( Figura 2 y Figura 3C ); Y (3) GAL4 desencadenada por choque térmico, que genera clones de mosaico al azar que expresan genes UAS ( Figura 4 y FiGura 5). En todos los experimentos, UAS-EGFP fue co-expresado con UAS-RNAi para marcar los clones knockdown.

En primer lugar, se usó lgl-RNAi -drivenido con sd-GAL4 para inducir el derribo de lgl en la bolsa de alas y en las regiones de bisagra. En el control de los discos de alas del tercer estadio sin UAS-lgl-RNAi , no se produjo alteración morfológica ( Figura 3A ). En contraste, en los discos de alas de tercer estadio que expresan lgl-RNAi , se observaron claramente deformaciones epiteliales y sobrecrecimiento tumorigénico en ciertas partes de la bisagra ( Figura 3B ). Sin embargo, en la región de la bolsa de alas no se observó sobrecrecimiento displásico. Se observó una expresión fuerte de MMP1 (metaloproteasa de matriz-1) en las lesiones de bisagra tumorales pero no en la región de bolsa de ala ( Figura 3B ). Dado que la expresión de MMP1 está implicada en la degradación de la membrana basalEs, es posible que estos tumores de bisagra tengan una capacidad metastásica ( Figura 3B ). A continuación, se utilizó upd-GAL4 para inducir el desmontaje lgl en la región bisagra. En el control de los discos de alas del tercer estadio sin UAS-lgl-RNAi , no se produjeron alteraciones morfológicas ( Figura 3C ). Sin embargo, después de 5 días de DEA, los discos de alas de tercer estadio con upd-GAL4 y lgl-RNAi mostraron una desorganización epitelial prominente, con acumulación de actina F y desplazamiento de clones desde la capa epitelial ( Figura 3D ). A los 6 días AED, tumores neoplásicos que expresan MMP1 sobregred en la región bisagra ( Figura 3G ), aunque con variación en el tamaño del tumor entre las muestras ( Figura 3E y F ). Una sección vertical de la región bisagra confirmó que el tumor neoplásico sufrió una desviación del crecimiento en el lado apical de la capa epitelial (

Para monitorizar la progresión del crecimiento tumoral inducida por knockdown lgl , se generaron clones esporádicos que expresaban lgl-RNAi en discos de ala utilizando el sistema de mosaico GAL4 de desplazamiento térmico inducido por choque térmico. Dos días después del choque térmico a larvas de segundo instar (AED de 2 días), algunos clones de bloqueo de lgl localizados en la región de bisagra mostraron desviación del lado apical de la capa epitelial ( Figura 4A ). Cuatro días después de la inducción por choque térmico, las lesiones displásicas en la región de bisagra se hicieron claras, lo que sugiere que los clones de bloqueo de lgl desplazados lejos del lado apical proliferan en el lumen ( Figura 4B ). Siete días después de la inducción por choque térmico, los sobrecrecimientos tumorigénicos dominaron las regiones bisagra ( Figura 4C ).

Para demostrar laClasificación de los fenotipos clonales con nuestro método de diagnóstico, clones esporádicos que expresan scrib-RNAi se generaron en discos de ala utilizando el calor-choque inducido por el sistema de mosaico GAL4 flip-out. Cinco días después de un choque térmico a larvas de segundo instar (2 días AED), ciertos clones de clavijas que representaban Grib que mostraban fenotipos tumorigénicos ( Figura 5A ). Se analizaron cuatro clones (B, C, D y E en la Figura 5A ) en secciones verticales de z-pila de imágenes confocales utilizando ImageJ, porque es difícil adquirir los detallados fenotipos citológicos y estructurales en las imágenes 2D confocal ( Figura 4 y Figura 5A ). Los clones B y C se clasificaron como displasia como proteína de unión septentrional. Los discos grandes (Dlg) se localizaron erróneamente ( Figura 5B y C ). En el clon B, el tamaño de la masa celular desplazada desde el epitelio no era mayor que 4-células en diametaR ( Figura 5B ), mientras que el clon C no se desviaba del epitelio ( Figura 5C ); Por lo tanto, los clones B y C no se consideraron neoplásicos. Sin embargo, los clones D y E, que también mostraron mislocalization de Dlg, formaron masas de células tumorales fuera del epitelio ( Figura 5D Y 5E ). Como el tamaño de estos clones tumorales desplazados era más de 4 células de diámetro, los clones se clasificaron como neoplásicos.

Para inducir tumores hiperplásicos o formaciones de quistes en los discos imaginal de ala, se generaron clones esporádicos que expresaban Ras oncogénico ( Ras V12 ) o forma constitutivamente activa de Yorkie, un coactivador transcripcional de la vía Hippo ( Yki 3SA ) utilizando el efecto inducido por choque térmico Flip-out GAL4 sistema de mosaico. Cuatro días después del choque térmico a larvas de segundo instar (2 días AED), RaS V12 clones expresados ​​por GFP se convirtieron en masas de células redondas en los discos imaginal ( Figura 6A ). Una sección vertical del clon de expresión de Ras V12 (clon B en la figura 6A ) reveló que la masa de células disociada de la capa epitelial tiene una localización adecuada de Dlg, lo que sugiere que la masa celular mantiene estructuras epiteliales normales fuera de la capa epitelial ( Figura 6B ) . MMP1 expresión no se observó en estos Ras V12- expresando clones ( Figura 6C ]. Por lo tanto, el clon B se clasificó como formación de quistes. Cuatro días después del choque térmico a larvas de segundo instar (AED de 2 días), los clones expresadores de Yki 3SA marcados por GFP formaron masas de células grandes en los discos imaginales ( Figura 7A ). Nos concentramos en dos clones (B y C en la Figura 7A ). El clon B mostróLa integración en la capa epitelial y la adecuada localización de Dlg en las membranas sub-apical de las células epiteliales, lo que sugiere que el clon B de expresión de Yki 3SA mantiene la estructura epitelial. Por lo tanto, el clon B se clasificó como hiperplasia ( Figura 7B ). El clon C situado en la región bisagra mostró una localización errónea de Dlg y formó una estructura multicapa en el lado basal de la capa epitelial. La expresión de MMP1 no se observó en los clones que expresaban Yki 3SA . En conjunto, el clon C se clasificó como neoplasia benigna ( Figura 7C y D ).

Figura 1
Figura 1: Diagrama de flujo para la clasificación de los fenotipos del tumor. Este diagrama de flujo representa un método de diagnóstico para clasificar lesiones clonales en epitelios imaginales. El clasificador(1) desviación de los clones de la capa epitelial, (2) desocalización subcelular de proteínas de unión, (3) proliferación celular, (4) tamaño de clon y (5) expresión de MMP1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: ( A ) Disco imaginal de ala de tipo salvaje teñido para Dlg (verde) y núcleos (DAPI, magenta). ( B ) Representación esquemática de discos imaginal de alas de Drosophila que muestran las bolsas de las alas (azul), bisagra (naranja) y no (verde). ( C ) Disco imaginal del ala normal teñido de F-actina (rojo) y microtúbulos (verde). Las membranas basales están marcadas con Colágeno IV / Vkg-GFP (azul). ( D ) Sección vertical del sitioMarcado con la línea punteada blanca en ( C ). ( E ) Los dibujos lineales trazan los lados apical (rojo) y basal (azul) de la capa epitelial en ( D ). Las líneas punteadas trazan la membrana peripodial. Se indican los pliegues distal (Df), medial (Mf) y proximal (Pf) de la bisagra dorsal.
Genotipos detallados: A, w - CD, Vkg-GFP Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3 Tumorigénesis específica del sitio inducida por Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Las imágenes confocales muestran discos imaginales de ala disecados de larvas de tercer estadio de genotipos indicados teñidos para MMP1 (rojo). El sd-GAL4 -expreSsing regiones fueron marcados por GFP expresión (verde). ( CG ) Las imágenes confocales muestran discos imaginal de ala disecados de larvas de tercer estadio de genotipos indicados en el punto de tiempo indicado AED. F-actina se tiñó con Phalloidin (rojo) en ( CF ). La expresión de MMP1 se tiñe con anticuerpos anti-MMP1 (rojo) en ( G ). Las regiones que expresan GAL4-upd fueron marcadas por expresión GFP (verde). Los paneles inferiores de ( CF ) muestran vistas ampliadas de las regiones indicadas en los paneles superiores. Las flechas blancas indican lesiones displásicas inducidas por los clones de lgl - knockdown. ( H ) Sección vertical del sitio marcada con línea punteada blanca en el panel inferior de (E). Las líneas punteadas blancas marcan los límites entre la bolsa de ala y las regiones de bisagra en (A) y (B). Los núcleos se marcaron con DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm en (AG) y 50 μm en (H). Genotipos detallados: A, w - , sd - GAL4, UAS - EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd - GAL4, UAS - EGFP; UAS-dicer2; UAS - lgl - RNAi; C, w - , upd - GAL4, UAS - EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd - GAL4, UAS - EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Fenotipos de tumores inducidos por clones de mosaico aleatorio. ( AC ) Las imágenes confocales muestran discos imaginales de alas de mosaico de larvas de tercer estadio con clones coexpresando lgl-RNAi y GFP (verde) en el punto de tiempo indicado después de la inducción por choque térmico. Los núcleos fueron marcados por DAPI (azul). Los paneles centrales muestran vistas ampliadas de las regiones cuadradas blancas marcadas en los paneles de la izquierda. El panel derecho S muestran dibujos lineales esquemáticos del lado apical de las capas epiteliales (azul) y los clones que expresan GFP (verde). Los clones mosaicos situados dentro del epitelio se representan en verde claro mientras que los tumores neoplásicos que se desvían del epitelio se muestran en magenta. Las líneas de puntos blancas en los paneles de la izquierda marcan los límites entre la bolsa de ala y las regiones de bisagra. Las flechas blancas en los paneles centrales indican lesiones displásicas inducidas por los clones de lgl - knockdown. Barras de escala = 100 μm. Genotipos detallados: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (30 min a los 2 días de AED, incubar 2 días a 25 ° C en A, incubar 4 días a 25 ° C en B, incubar 7 días a 25 ° C en C después del choque térmico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Examen diagnóstico de los fenotipos clonales displásicos. ( A ) En el panel izquierdo se muestra un disco imaginal de alas de mosaico de larva de tercer estadio con clones coexpresando scrib-RNAi y GFP (verde) 5 días después de la inducción por choque térmico, teñido para Dlg (rojo). El panel derecho muestra un dibujo lineal esquemático del lado apical de las capas epiteliales (azul) y de los clones que expresan GFP (verde). Los clones de mosaico en las capas epiteliales se muestran en verde claro mientras que los tumores neoplásicos desplazados desde el epitelio se muestran en magenta. ( BE ) Las imágenes confocales muestran secciones verticales de los clones scrib -knockdown indicados en el panel derecho de (A). Los segundos paneles de la izquierda muestran los patrones de localización Dlg (rojo). Los terceros paneles de la izquierda muestran dibujos lineales esquemáticos de los lados apical (rojo) y basal (azul) de las capas epiteliales y el GFP-exprClaves scrib -knockdown (verde). Los clones displásicos en las capas epiteliales se muestran en verde claro (B y C) mientras que los clones neoplásicos desplazados desde el epitelio se muestran en magenta (D y E). Las flechas blancas indican clones scrib - knockdown que muestran fenotipo tumorigénico. Los núcleos se marcaron con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. El fenotipo tumoral de cada clon se clasificó de acuerdo con el diagrama de flujo mostrado en la Figura 1 . Genotipos detallados: AE, hsFLP; UAS - scrib - RNAi; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (30 minutos de shock térmico a 2 días de AED, incubar 4 días a 25 ˚C después del choque térmico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: DiagnósticoTico de los fenotipos clonales de Ras V12 . ( A ) El panel izquierdo muestra un disco imaginal de alas de mosaico de larva de tercer estadio con clones coexpresando oncogénicos Ras V12 y GFP (verde) 4 días después de la inducción por choque térmico, teñidos para Dlg (rojo). El panel derecho muestra un dibujo lineal esquemático del lado apical de las capas epiteliales (azul) y de los clones que expresan GFP (verde). La barra de escala representa 50 μm. ( B ) Secciones verticales de los clones que expresan Ras V12 indicados en el panel derecho de (A). Los segundos paneles de la izquierda muestran los patrones de localización Dlg (rojo). Los terceros paneles de la izquierda muestran dibujos lineales esquemáticos de los lados apical (rojo) y basal (azul) de las capas epiteliales y los clones que expresan Ras V12 y GFP (verde). Barra de escala = 25 μm. ( C ) Disco imaginario del ala mosaica de larva de tercer estadio con clones coexpresando <Em> Ras V12 y GFP (verde) 4 días después de la inducción por choque térmico, teñido para MMP1 (rojo). Barra de escala = 100 μm. Genotipos detallados: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (shock térmico 45 min a 2 días AED, incubar 4 días a 25 ° C después del choque térmico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7: Examen de diagnóstico de los fenotipos clonales que expresan Yki 3SA . ( A ) El panel izquierdo muestra un disco imaginario de ala de mosaico de larva de tercer estadio con clones que coexpresan Yki 3SA y GFP (verde) constitutivamente activos 4 días después de la inducción por choque térmico, teñidos para Dlg (rojo). El panel derecho muestra como Chematic del lado apical de las capas epiteliales (azul) y los clones que expresan GFP (verde). Barra de escala = 50 μm. ( BC ) Secciones verticales de los clones que expresan Yki 3SA indicados en el panel derecho de (A). Los segundos paneles de la izquierda muestran los patrones de localización Dlg (rojo). Los terceros paneles de la izquierda muestran dibujos lineales esquemáticos de los lados apical (rojo) y basal (azul) de las capas epiteliales y los clones que expresan Yki y GFP (verde). Barra de escala = 25 μm. ( D ) Disco imaginario del ala mosaica de larva de tercer estadio con clones que coexpresan Yki 3SA y GFP (verde) 4 días después de la inducción por choque térmico, teñidos para MMP1 (rojo). Barra de escala = 100 μm. Genotipos detallados: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( sometida a un choque térmico de 30 min a 2 días AED, incubar durante 4 días a 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El sistema GAL4-UAS es una de las herramientas genéticas más potentes para la expresión génica dirigida en Drosophila 26 y facilita en gran medida la inducción y el análisis de células tumorales in vivo 4 . Este sistema permite la generación de clones que tienen knockdown de genes supresores de tumores o sobreexpresión de oncogenes dentro de tejido epitelial de tipo salvaje, una situación muy similar a las etapas iniciales de cáncer humano en donde las células pro tumorales transformadas están rodeadas por células epiteliales normales. Las líneas de conductor GAL4 reguladas por secuencias potenciadoras tales como líneas de trampa potenciador de GAL4 o líneas 27 de Janelia GAL4 tienen patrones de expresión únicos, espacialmente limitados. Por lo tanto, estas líneas GAL4 potenciadoras son útiles para inducir tumores consistentemente en áreas restringidas de discos imaginales. Además de sd-GAL4 y upd-GAL4 se muestra en este estudio, hemos confirmado que lgl -knockdown inducida bY otras lıneas GAL4 enganchadoras-GAL4 ( en-GAL4 ), hedgehog-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-ciego-GAL4 ( omb-GAL4 ), patched-GAL4 ( ptc- GAL4 ) y spalt- GAL4 ( salm-GAL4 ) puede generar tumores neoplásicos en las regiones bisagra de los discos imaginal del ala. Si el patrón de expresión de potenciador-GAL4 necesita ser controlado temporalmente, una combinación de GAL4 y una versión sensible a la temperatura de GAL80 (GAL80 ts ) es una opción. GAL80 ts reprime la función GAL4 a 18 ° C pero no a 29 ° C, lo que permite activar o desactivar la expresión de transgenes UAS 28 .

El sistema de mosaico flip-out-GAL4, que combina el sistema FLP-FRT y el sistema GAL4-UAS 3 , genera clones aleatorios en discos imaginal. Mediante la combinación de flippase inducible por choque térmico (hsFLP) con GAL4 flip-out, la sincronización de clon generatIon es controlable. Debido a que el potencial tumorigénico de las células del disco imaginal puede ser dependiente de la etapa de desarrollo, los eventos de señalización endógena y / o la diferenciación celular 29 , 30 , es muy importante examinar el efecto de la alteración del choque térmico en los fenotipos tumorigénicos.

Se ha demostrado previamente que los clones mutantes de nTSG sufren apoptosis dependiente de la competencia celular cuando están rodeados por células de tipo salvaje 10 , 11 , 12 , 18 , lo que sugiere que se requieren múltiples mutaciones para la transformación celular durante el desarrollo del cáncer. De hecho, la sobreexpresión de Ras oncogénico o Yki en clones mutantes lgl o scrib los transforma en tumores agresivos 10 , 18 , 31 mientras queLa expresión de Ras V12 o Yki 3SA no induce neoplasia maligna por sí mismos sin mutaciones de nTSG. Como se muestra aquí y anteriormente 16 , pro-tumor nTSG-knockdown clones generados en el ala de tipo salvaje discos también sufren apoptosis y no muestran tumorigénesis en la bolsa de ala [ 16] . Al mismo tiempo, los clones knockdown de nTSG localizados en hotspots de bisagra se desarrollan en tumores neoplásticos sin ninguna mutación oncogénica adicional. En regiones de bisagra, nTSG-células deficiente secuestrar endógeno Janus kinasa / transductor de señal y activador de la transcripción (JAK / STAT) de señalización para conducir tumorigénesis [ 16] . Por lo tanto, los GAL4 específicos de bisagra tales como upd-GAL4 son herramientas útiles para inducir de forma consistente la formación de tumores neoplásicos mediante la eliminación de genes supresores de tumores mediada por RNAi . Aunque flotar-GAL4 inducida por nTSG knockdown mosaico clones también inducir tumores neoplásicos en bisagra reLa ocurrencia de la tumorigénesis depende del tamaño del clon inicial: los clones grandes generados por un choque térmico durante 20 min suelen inducir tumorigénesis, mientras que la mayoría de los pequeños clones generados por choque térmico menor de 10 min son eliminados por completo (KM y YT, datos no publicados).

Una serie de estudios recientes sobre el desarrollo de tumores y la progresión del cáncer utilizan Drosophila discos imaginal como un sistema modelo 32 , 33 . Común a estos estudios se incluyen varios marcadores de tumores neoplásicos: masas de células desviadas, formas de disco deformadas, acumulación de F-actina, ciclo celular mejorado (incorporación de BrdU / EDU o expresión de PH3), activación de la señalización JNK y su objetivo aguas abajo MMP1, membrana basal (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 o PAR-6), las uniones septadas(Lgl, Scrib, Dlg o Coracle), o las uniones adherens (E-Cadherin o Armadillo). Estos fenotipos son fácilmente detectables por tinción con anticuerpos convencionales. Aunque es difícil determinar si un fenotipo clonal es hiperplasia, displasia, neoplasia benigna o neoplasia maligna en la etapa temprana de la tumorigénesis, debería ser más sencillo en el epitelio de disco imaginario de Drosophila compuesto por una única monocapa epitelial. En este estudio, se introdujo un método de diagnóstico para clasificar tumoral clon fenotipos inducidos en la monocapa epitelial ( Figura 1 ]. Este método requiere observaciones cuidadosas de cinco criterios usando imágenes confocales de z-pila; Cada criterio de diagnóstico puede examinarse mediante tinción de anticuerpos convencional y formación de imágenes confocal. Uno de los nuevos criterios que hemos introducido en este método es el "criterio de diámetro de 4 células" que discrimina entre displasia y neoplasia en discos imaginal. Las células pro-tumorales tales como los clones mutantes de nTSG son frecuentesExtruido a partir de capas epiteliales a través de la competencia celular o la desorientación del huso 15 , 16 , 34 . En la mayoría de las situaciones, estas células extruidas apoptosa, y por lo tanto no pueden proliferar. Aunque podría ser posible que las células pro-tumor sufren una división celular una vez durante la extrusión y una o dos veces más después de la extrusión, esto hace que una masa celular de 2 a 3 células de diámetro. Por lo tanto, si una masa celular de células pro-tumorales desviadas de la capa epitelial es mayor que el diámetro de 4 células, podemos determinar que están sobreviviendo y proliferando como una neoplasia fuera de la capa epitelial.

Aunque este método de diagnóstico es simple, es crítico tomar un curso de tiempo de fenotipos, como el desarrollo del tumor y la malignidad progresa a través del tiempo. Por ejemplo, la displasia es un tejido citológicamente anormal y un estado de transición entre crecimientos completamente benignos y los que son premaligno. Por lo tanto, incluso si un clon observado se define como una displasia de acuerdo con el diagrama de flujo ( Figura 1 ), es posible que la displasia posteriormente se convierta en una neoplasia. Aunque el estadio larvario es limitado en el tiempo (5 - 6 días a 25 ° C o 4 - 5 días a 29 ° C AED), el crecimiento tumoral en discos imaginal prolonga la fase larvaria a través de un péptido insulínico inducido por el retraso de pupariation 35 , 36 . Por lo tanto, la formación de tumores neoplásicos en discos imaginales hace posible observar la progresión fenotípica del clon tumoral durante varios días más. Nuestro método de clasificación simple podría ser ampliamente aplicable al análisis clonal de fenotipos tumorales en diversos órganos en Drosophila .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a J. Vaughen por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de JSPS KAKENHI Grant Números 26891025, 15H01500 y la Fundación de Ciencias de Takeda Subvención de investigación a YT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Wako 162-19321
TritonX-100 Wako 168-11805
Formaldehyde Wako 064-00406
bovine serum albumin Sigma A7906
normal goat serum Sigma G6767
mounting medium, Vectashield Vector Laboratories H-1000
DAPI Sigma D9542
mouse-anti-Dlg 4F3 Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3A6B4, RRID:AB_579780 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3B8D12, RRID:AB_579781 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 5H7B11, RRID:AB_579779 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin Developmental Studies Hybridoma Bank AA4.3, RRID:AB_579793 dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin Molecular probes A22283 dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 Molecular probes A11030 dilute in PBTG, 1:400
Name Company Catalog Number Comments
Fly strains
sd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #8609 recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #26796 recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #51247
UAS-scrib-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #105412
UAS-RasV12 Bloomington Drosophila Stock Center #64196
UAS-Yki3SA Bloomington Drosophila Stock Center #28817
hsFLP Bloomington Drosophila Stock Center #6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) Bloomington Drosophila Stock Center #4780 recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #5428 X chromosome
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #6658 third chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24650 second chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24651 third chromosome
vkg-GFP Morin et al. 2001 GFP protein trap

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Biología del Cáncer Número 125 Drosophila Disco Imaginal Tumorigénesis Neoplasia Displasia Gen supresor de tumores GAL4-UAS RNAi
Inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epitelio
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Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (125), e55901, doi:10.3791/55901 (2017).

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