Summary
L'analyse de clones de mosaïque dans l'épithélium de disque imaginal de Drosophila est un système modèle puissant pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. Nous décrivons ici un protocole pour induire des tumeurs dans des disques imaginaux d'ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS et introduire une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes tumoraux.
Abstract
Aux premiers stades du cancer, les cellules mutantes transformées présentent des anomalies cytologiques, commencent une prolifération incontrôlée et perturbent progressivement l'organisation du tissu. Drosophila melanogaster est apparue comme un système de modèle expérimental populaire dans la biologie du cancer pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. En particulier, les outils génétiques pour les disques imaginatifs de Drosophila (développement d'épithélium dans les larves) permettent la création de cellules pro-tumorales transformées dans un tissu épithélial normal, une situation similaire aux étapes initiales du cancer humain. Cependant, une étude récente de la tumorigénèse dans les disques imaginaux d'ailes de Drosophila a montré que l'initiation de la tumeur dépend de la cytoarchitecture tissulaire-intrinsèque et du microenvironnement local, ce qui suggère qu'il est important de considérer la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes dans l'évaluation des phénotypes tumoraux dans l'imaginaire Disques. Pour faciliter l'analyse phénotypique des progrès de la tumeurSur les disques imaginaux, nous décrivons ici un protocole pour les expériences génétiques utilisant le système GAL4-UAS pour induire des tumeurs néoplasiques dans des disques imaginaux d'ailes. Nous introduisons en outre une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes des lésions clonales induites dans les épithéliums imaginaux, car une méthode de classification claire pour discriminer les différentes étapes de la progression de la tumeur (comme l'hyperplasie, la dysplasie ou la néoplasie) n'a pas été décrite auparavant. Ces méthodes pourraient être largement applicables à l'analyse clonale des phénotypes tumoraux dans divers organes de Drosophila .
Introduction
Les tissus épithéliaux sont des systèmes hautement organisés qui ont la capacité homéostatique remarquable de maintenir leur organisation par le développement et le renouvellement cellulaire. Ce système auto-organisé robuste, cependant, est progressivement perturbé lors du développement de la tumeur. Au début du développement de la tumeur, des cellules mutantes individuelles issues de l'activation de l'oncogène ou de l'inactivation du gène suppresseur de tumeur apparaissent dans une couche épithéliale. Lorsque cette «cellule pro-tumorale» transformée évite un environnement suppresseur, perturbe l'organisation épithéliale et commence la prolifération incontrôlée, la tumorigenèse survient 1 . Au cours des dernières décennies, les progrès technologiques exceptionnels en génétique et en biologie moléculaire ont fait des progrès remarquables dans la recherche sur le cancer. En particulier, des études récentes utilisant les outils d'analyse de mosaïque génétique dans Drosophila melanogaster , telles que la recombinaison mitotique recombinante FLP-FRT (recombinant flippase / flippase recombinase)2 et les systèmes flip-out-GAL4-UAS (séquence d'activation en amont) 3 ont grandement contribué à mieux comprendre les mécanismes génétiques impliqués dans la formation et la métastase des tumeurs 4 , 5 , 6 .
Les études d'un groupe de gènes suppresseurs de tumeurs Drosophila conservés, de larves géantes létales ( lgl ), de disques grands ( dlg ) et de griffonnages ( scrib ) ont mis en évidence le lien critique entre la perte d'organisation épithéliale et le développement de la tumeur, car ces gènes jouent des rôles clés Dans la régulation de la polarité des cellules apicales-basales et de la prolifération cellulaire dans les tissus épithéliaux 7 . Alors que les disques imaginatifs de Drosophila sont normalement des épithéliums monocouches, des mutations homozygotes dans l'un de ces trois gènes provoquent une perte de structure et de polarité des cellules, ne parviennent pas à diffuserRentier, surprolifier et, finalement, former des masses amorphes multicouches qui fusionnent avec des tissus adjacents 7 . De même, la rupture de ces gènes chez les mammifères est impliquée dans le développement de tumeurs malignes 8 , 9 . Les phénotypes néoplasiques exposés par les tissus mutants ont conduit à la classification de ces trois gènes comme conservateurs, les gènes suppresseurs de tumeurs néoplasiques (nTSG) 7 , 8 . Cependant, lorsque des cellules mutantes nTSG homozygotes sont générées sporadiquement dans le développement de disques imaginaux de type sauvage en utilisant une recombinaison mitotique médiée par FLP-FRT, les cellules mutantes sont éliminées du tissu par l'apoptose dépendante de la kinase N-terminale c-Jun (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusion 15 , 16 , ou engulfment et phagocytose par voisins 17 . Dans cette épithélium génétiquement mosaïque, l'apoptose est surtout détectée dans les cellules mutantes nTSG situées à la limite des clones, ce qui suggère que les cellules normales adjacentes déclenchent l'apoptose des cellules mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Des études récentes dans des cellules de mammifères ont confirmé que cette élimination dépendante de la cellule des cellules pro-tumorales est un mécanisme d'autodéfense épithélial conservé de manière évolutive contre le cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Une étude récente dans les disques imaginatifs de Drosophila , cependant, a montré que les clones de knots de nTSG de mosaïque induisent des tumeurs néoplasiques en spécimensDisques imaginatifs des régions de l'aile 16 . La formation initiale des tumeurs a toujours été observée dans la région périphérique de la «charnière» et n'a jamais été observée dans la région centrale de la poche de l'épithélium du disque d'aile, ce qui suggère que le potentiel tumorigène des cellules knock-nTSG dépend de l'environnement local. La région de la poche centrale fonctionne comme une «tache de tumeur froide» où les cellules pro-tumorales ne présentent pas de prolifération dysplasique, alors que la région charnière périphérique se comporte comme un «hotspot tumoral» 16 . Dans les régions de poche "coldspot", les cellules nTSG-knockdown se délamment du côté basal et subissent une apoptose. En revanche, les cellules de charnière "hotspot" possèdent un réseau de structures cytosquelettiques robustes sur leurs côtés basaux, les cellules knockdowns nTSG se délamment du côté apical de l'épithélium et déclenchent une prolifération tumorigène 16 . Par conséquent, l'analyse des phénotypes tumoraux dans les disques imaginatifs nécessite une attention particulièreDéduction de la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes.
Ici, nous décrivons un protocole pour induire une formation de tumeur néoplasique dans les disques imaginaux d'ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS- RNAi par lequel des cellules knock-nTSG sont générées dans des épithéliums à disque d'aile normale. Bien que ces systèmes expérimentaux soient utiles pour étudier les premiers stades du cancer, une méthode de classification claire pour évaluer les étapes de la progression de la tumeur dans les épithéliums de disque imaginal n'a pas été clairement décrite auparavant. Par conséquent, nous proposons également une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes clonaux pro-tumoraux induits dans l'épithélium du disque d'aile en trois catégories: hyperplasie (accumulation d'un nombre excessif de cellules apparaissant normalement avec une prolifération accrue), dysplasie (tissu prémalignant composé d'apparences anormales Cellules) et néoplasies (tumeur bénigne ou maligne composée de cellules ayant un aspect anormal et un modèle de prolifération anormal).
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Protocol
1. Fly Crosses and Clone Induction
- Retirez toutes les mouches dans le flacon 12 h avant de collecter les mouches vierges.
- Anesthésier les mouches dans le flacon en injectant du CO 2 gaz et placer les mouches sur un coussin de CO 2 .
- Transférer 10 à 20 femelles vierges et 10 mâles dans le flacon de CO 2 dans un flacon frais et incuber pendant 1 jour à 25 ° C.
- Transférer ces mouches dans un flacon frais et incuber pendant 12 h à 25 ° C.
REMARQUE: Jeter le premier flacon en tant que femelles vierges ne déposez pas assez d'oeufs au premier jour. - Pour les lignes d'amplificateur-GAL4, enlever les mouches adultes et incuber le flacon à 25 ° C jusqu'à dissection.
- Pour l'induction de clones de mosaïque par flip-out-GAL4, retirer les mouches adultes et incuber le flacon pendant 2 à 4 jours à 25 ° C. Le temps d'incubation avant choc thermique dépend du but expérimental. Un choc thermique deux jours après le dépôt des œufs (AED) génère des clones de mosaïque en immature secondeInstar imaginal epithelia. Un choc thermique après 3 ou 4 jours L'AED génère des clones de mosaïque dans des épithéliums imaginaux différenciés de début à mi-troisième stade.
NOTE: Il est important d'examiner l'effet de la modification du temps de choc thermique sur les phénotypes tumorigènes. - Pour l'induction de clones de mosaïque par flip-out-GAL4, choc thermique du flacon par immersion dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 à 45 minutes, puis incubation pendant 2 à 3 jours à 25 ° C.
REMARQUE: L'information sur le temps de choc thermique, le temps et le temps d'incubation dans chaque expérience est illustrée dans les légendes des figures.
2. Dissection des larves
- Recueillir des larves de troisième stade errant avec un bâton de bois ou une pince serrée, les génotyper par des marqueurs fluorescents appropriés ( p . Ex. , EGFP) sous un microscope stéréoscopique à fluorescence et les placer dans un plat de dissection avec du PBS (solution salée tamponnée au phosphate).
- Laver les larves dans le PBS en pipettant avec 2 mL de pipettes de transfert en plastique.
- Pincer le centre de la larve avec une pince et déchirer le corps en deux avec l'autre pince.
- Pincer le crochet de la bouche de la moitié antérieure avec une pince et pousser la bouche vers le corps avec l'autre pince pour éteindre le corps.
- Retirez les matériaux inutiles tels que les glandes salivaires ou les corps gras avec des pinces.
3. Fixation et coloration des anticorps
- Transférer la moitié antérieure disséquée du corps larvaire (y compris les disques d'ailes imaginaux) jusqu'à un tube en plastique de 1,5 ml et réparer dans 1 ml de solution Fix (4% de Formaldéhyde dans PBS) pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec une rotation douce.
ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique et présente un potentiel cancérogène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau.
REMARQUE: Dans cette partie, toutes les étapes ont lieu sur un nutator à température ambiante dans l'obscurité, sauf indication contraire. - Retirez la solution Fix et laissez-la. Laver les tissus avec 1 ml de PBT (0,3% de TritSur X-100 dans PBS) trois fois pendant 15 minutes chacun.
- Retirez le PBT et ajoutez 1 mL de PBTG (albumine de sérum bovin à 0,2% et 5% de sérum de chèvre normal dans PBT) pour bloquer et nuer 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
- Retirez PBTG et ajoutez une solution d'anticorps primaire diluée de manière appropriée avec PBTG (voir la Table des matériaux ) et nutatez pendant une nuit à 4 ° C.
- Retirez la solution d'anticorps primaire et lavez les tissus avec 1 mL de PBT trois fois pendant 15 minutes chacun.
- Retirer PBT et ajouter une solution d'anticorps secondaire diluée avec PBTG (1: 400). Nutatez pendant 2 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
- Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
- Pour tacher l'actine F, retirer PBT et ajouter une solution de Phalloidine diluée de manière appropriée dans du PBS (1:40). Ensuite, interceptez pendant 20 min. Retirez la solution de Phalloidine et lavez les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
- Pour contre-durcir l'ADN nucléaire, éliminer le PBT et ajouter la solution DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) (0,5 μg / mL de DAPI dans PBS). Ensuite, nutez 10 min.
ATTENTION: DAPI a un potentiel cancérogène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau. - Retirer la solution DAPI et laver les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
- Rincer une fois dans 1 mL de PBS pendant 10 min à température ambiante.
- Retirer PBS et ajouter 500 μL de glycérol 100% comme support de pré-montage.
4. Montage sur des lames de microscope
- Placez les tissus colorés sur une lame à microscope en utilisant une pipette de transfert de plastique de 2 mL.
- Transférer les tissus à des gouttes de milieu de montage sur une autre glissière de microscope avec une pince.
- Maintenez enfoncée la fin du tissu disséqué avec une pince et retirez les disques cérébraux et antenaux avec les autres pince.
REMARQUE: Gardez le cerveau disséqué pour les placer près des disques imaginaux de l'aile. Les cerveaux agissent comme une plate-forme empêchant la lamelle de couper les disques imaginaux de l'aile. - Pour isoler les disques imaginaux de l'aile, maintenez enfoncée la fin du tissu disséqué avec une pince et grattez délicatement la paroi du corps et déchirez les disques avec les autres pinces.
REMARQUE: s'il est difficile de trouver des disques imaginaux d'ailes, éplucher la trachée du côté postérieur au côté antérieur. Les disques imaginaires de l'aile s'accrochent à la trachée. - Recouvrir doucement les disques imaginaux avec une lamelle et sceller avec un vernis à ongles; Conserver à 4 ° C.
5. Microscopie confocale
- Pour acquérir des images confocales à l'aide d'un microscope confocal, des paramètres d'acquisition d'image comprennent une gamme de longueur d'onde d'émission, l'intensité laser, le gain, le décalage, la vitesse de balayage et la taille d'image 24 .
REMARQUE: pour une procédure détaillée des paramètres d'acquisition d'image, reportez-vous au mode d'emploi fourni par chaque fabricant de microscope. - Pour capturer un seul coSections nfocales d'un disque imaginal d'aile entière, utilisez un objectif objectif 20X.
- Acquérir des images tridimensionnelles par balayage de la pile z à une taille de pas de 0,5 à 1,0 μm en utilisant des lentilles 40X ou 60X.
REMARQUE: pour analyser les phénotypes cellulaires en haute résolution, une taille d'image devrait être supérieure à 512 x 512 pixels.
6. Analyse d'image à l'aide d'ImageJ
- Utilisez Fiji, un logiciel ImageJ open source basé sur l'analyse de l'image biologique (https://fiji.sc/) 25 , pour acquérir et analyser les images confocales de la pile z.
- Pour acquérir des sections verticales, ouvrez les images de la pile z dans ImageJ et sélectionnez l'option de menu "Image / Stacks / Reslice".
REMARQUE: L'axe XZ ou l'axe YZ peuvent être sélectionnés dans le menu Reslice. La section verticale peut être obtenue également dans une direction arbitraire en dessinant une droite ou un rectangle sur l'image de la pile z.
7. Diagnostic des phénotypes néoplasiques
- Ouvrir la verticaleSections (axe XZ ou YZ) obtenues à partir d'un ensemble d'images de pile z et analyser les phénotypes morphologiques et la coloration des anticorps.
- Pour le diagnostic des phénotypes tumoraux, concentrez-vous principalement sur les trois points suivants: (1) si une masse cellulaire, y compris des clones knockdown, s'écarte de la couche épithéliale principale, (2) si la localisation subcellulaire des protéines jonctionnelles est altérée dans cette masse cellulaire , Et (3) si le diamètre de cette masse cellulaire est supérieur à 4 cellules.
- Catégoriser les phénotypes tumoraux selon le diagramme décrit dans la figure 1 .
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Representative Results
Pour démontrer la formation de tumeur néoplasique induite expérimentalement par NTSG-knockdown médié par RNAi dans des disques imaginaux d'ailes de Drosophila , trois pilotes GAL4 différents ont été utilisés pour exprimer UAS-RNAi pour lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, qui conduit une forte expression d'UAS dans le Poche d'aile et expression douce dans les régions de charnière ( figure 2 et figure 3A ); (2) upd-GAL4, qui conduit dans les sous-domaines de la charnière, y compris une forte expression dans deux domaines du pli médian dorsal, une expression douce dans un domaine antérieur-latéral et une faible expression dans le domaine ventral-postérieur ( Figure 2 et Figure 3C ); Et (3) GAL4 induit par choc thermique, qui génère des clones de mosaïque aléatoires exprimant des gènes UAS ( Figure 4 et FiGure 5). Dans toutes les expériences, UAS-EGFP a été co-exprimé avec UAS-RNAi pour marquer les clones knockdown.
Tout d'abord, le lng-RNAi dérivé de sd-GAL4 a été utilisé pour induire le décrochage de lgl dans la poche d'aile et les régions charnières. Dans les disques d'aile de troisième stade de contrôle sans UAS-lgl-RNAi , aucune altération morphologique n'a eu lieu ( Figure 3A ). En revanche, dans les disques d'aile du troisième stade qui expriment lgl-RNAi , des déformations épithéliales et des surcroies tumorigènes ont été clairement observées dans certaines parties de la charnière ( figure 3B ). Dans la région de la poche d'aile, cependant, la prolifération dysplasique n'a pas été observée. Une forte MMP1 (matrice métalloprotéase-1) a été observée dans les lésions de la charnière tumorale mais pas dans la région de la poche d'aile ( figure 3B ). Puisque l'expression de MMP1 est impliquée dans la dégradation de la membrane du sous-solEs, il est possible que ces tumeurs charnières aient une capacité métastatique ( Figure 3B ). Ensuite, upd-GAL4 a été utilisé pour induire lgl knockdown dans la région charnière. Dans les disques d'aile de troisième stade de contrôle sans UAS-lgl-RNAi , aucune altération morphologique n'a eu lieu ( Figure 3C ). Cependant, après 5 jours AED, les disques d'aile du troisième stade avec upd-GAL4 et lgl-RNAi ont montré une désorganisation épithéliale proéminente, avec l'accumulation de l'actine F et le déplacement du clone de la couche épithéliale ( Figure 3D ). À 6 jours AED, les tumeurs néoplasiques exprimant MMP1 dépassent dans la région charnière ( Figure 3G ), bien que avec une variation de la taille de la tumeur entre les échantillons ( Figure 3E et F ). Une section verticale de la région charnière a confirmé que la tumeur néoplasique avait subi une détérioration du côté apical de la couche épithéliale ( Pour surveiller la progression de la croissance de la tumeur induite par lgl knockdown, des clones sporadiques exprimant lgl-RNAi ont été générés dans des disques d'aile en utilisant le système de mosaïque GAL4 flip-out induit par choc thermique. Deux jours après le choc thermique aux larves du deuxième stade (AED 2 jours), certains clones lub- knockdown situés dans la région charnière ont montré une déviation du côté apical de la couche épithéliale ( Figure 4A ). Quatre jours après l'induction du choc thermique, les lésions dysplasiques dans la région charnière sont devenues claires, ce qui suggère que les clones lng- décalage déplacés loin du côté apical prolifèrent dans la lumière ( figure 4B ). Sept jours après l'induction du choc thermique, les surcroies tumorigènes ont dominé les régions charnières ( figure 4C ). Pour démontrer leClassification des phénotypes clonaux avec notre méthode de diagnostic, des clones sporadiques expriment le scrib-RNAi ont été générés dans des disques d'aile en utilisant le système de mosaïque GAL4 flip-out induit par choc thermique. Cinq jours après le choc thermique des larves du deuxième stade (AED 2 jours), certains clones de scrib- knockdown exprimant les GFP présentaient des phénotypes tumorigènes ( figure 5A ). Nous avons analysé quatre clones (B, C, D et E de la figure 5A ) dans des sections verticales d'images confocales à pile z utilisant ImageJ, car il est difficile d'acquérir les phénotypes cytologiques et structurels détaillés dans les images confocales 2D ( Figure 4 et Figure 5A ). Les clones B et C ont été classés comme dysplasie en tant que protéines de jonction-septate Les disques de grande taille (Dlg) ont été mis en localisation ( figure 5B et C ). Dans le clone B, la taille de la masse cellulaire déplacée de l'épithélium n'était pas supérieure à 4 cellules dans la dièteR ( Figure 5B ), alors que le clone C ne s'est pas dévié de l'épithélium ( Figure 5C ); Par conséquent, les clones B et C n'étaient pas considérés comme néoplasiques. Cependant, les clones D et E, qui ont également montré une mauvaise localisation de Dlg, ont formé des masses de cellules tumorales à l'extérieur de l'épithélium ( Figure 5D Et 5E ). Comme la taille de ces clones tumoraux déplacés avait plus de 4 cellules de diamètre, les clones étaient classés comme néoplasiques. Pour induire des tumeurs hyperplasiques ou des formations de kyste dans les disques imaginaux de l'aile, des clones sporadiques exprimant oncogeneic Ras ( Ras V12 ) ou une forme constitutivement active de Yorkie, un coactivateur transcriptionnel de la voie Hippo ( Yki 3SA ) ont été générés à l'aide du choc thermique Système de mosaïque GAL4 flip-out. Quatre jours après le choc thermique des larves du deuxième stade (AED de 2 jours), RaS V12 -expressing clones étiquetés par GFP sont devenus des masses cellulaires rondes dans les disques imaginaux ( figure 6A ). Une section verticale du clone d'expression Ras V12 (clone B de la figure 6A ) a révélé que la masse cellulaire dissociée de la couche épithéliale a une localisation appropriée de Dlg, suggérant que la masse cellulaire maintient des structures épithéliales normales à l'extérieur de la couche épithéliale ( figure 6B ) . L'expression de MMP1 n'a pas été observée dans ces clones d'Expression Ras V12 ( Figure 6C ). Par conséquent, le clone B a été classé comme formation de kyste. Quatre jours après le choc thermique des larves du second stade (2 jours AED), les clones d' expression Yki 3SA marqués par GFP ont formé de grandes masses cellulaires dans les disques imaginaux ( Figure 7A ). Nous nous sommes concentrés sur deux clones (B et C de la figure 7A ). Clone B a montréL'intégration dans la couche épithéliale et la localisation appropriée de Dlg dans les membranes sous-apicales des cellules épithéliales, ce qui suggère que le clone B exprimant Yki 3SA a maintenu une structure épithéliale. Par conséquent, le clone B a été classé comme hyperplasie ( figure 7B ). Le clone C situé dans la région charnière a montré une mauvaise localisation de Dlg et une structure multi-couches formée sur le côté basal de la couche épithéliale. L'expression de MMP1 n'a pas été observée dans les clones d'expression Yki 3SA . Ensemble, le clone C a été classé comme un néoplasme bénin ( Figure 7C et D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Figure 1: organigramme pour la classification des phénotypes tumoraux. Cet organigramme représente une méthode de diagnostic pour classer les lésions clonales dans les épithéliums imaginaux. Le classificSe base sur cinq critères: (1) écart des clones de la couche épithéliale, (2) mise en phase intracellulaire de protéines jonctionnelles, (3) prolifération cellulaire, (4) taille de clone et (5) expression de MMP1. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 
Figure 2: ( A ) Disque imaginal d'aile de type sauvage coloré pour Dlg (vert) et noyaux (DAPI, magenta). ( B ) Représentation schématique des disques imaginatifs d'ailes de Drosophila montrant une poche d'aile (bleu), des charnières (orange) et des régions de notum (vert). ( C ) Disque imaginal d'aile normale coloré pour F-actine (rouge) et microtubules (vert). Les membranes de sous-sol sont étiquetées avec le collagène IV / Vkg-GFP (bleu). ( D ) Section verticale du siteMarqué avec une ligne pointillée blanche en ( C ). ( E ) Les dessins de ligne retracent les côtés apical (rouge) et basal (bleu) de la couche épithéliale dans ( D ). Les lignes pointillées tracent la membrane périipodiale. Les plis distal (Df), médian (Mf) et proximal (Pf) de la charnière dorsale sont indiqués.
Génotypes détaillés: A, w - CD, Vkg-GFP Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 
Figure 3: Tumorigénèse spécifique au site induite par Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Les images confocales montrent des disques imaginaux d'aile disséqués à partir de larves de troisième stade des génotypes indiqués colorés pour MMP1 (rouge). Le sd-GAL4 -expreLes régions ssing ont été marquées par l'expression GFP (vert). ( CG ) Les images confocales montrent des disques imaginaux de l'aile disséqués des larves du troisième stade des génotypes indiqués au point de temps indiqué AED. La F-actine a été colorée avec Phalloidine (rouge) dans ( CF ). L'expression de MMP1 est colorée avec des anticorps anti-MMP1 (rouge) dans ( G ). Les régions d'expression actuelles GAL4 ont été étiquetées par l'expression GFP (vert). Les panneaux inférieurs de ( CF ) affichent des vues agrandies des régions indiquées dans les panneaux supérieurs. Les flèches blanches indiquent des lésions dysplasiques induites par les clones lub- knockdown. ( H ) Section verticale du site marqué avec une ligne pointillée blanche dans le panneau inférieur de (E). Les lignes pointillées en blanc marquent les limites entre la poche d'aile et les régions charnières en (A) et (B). Les noyaux ont été étiquetés avec DAPI (bleu). Barres d'échelle = 100 μm dans (AG) et 50 μm dans (H). Génotypes détaillés: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 4: Phénotypes tumoraux induits par des mélanges de mosaïque aléatoire. ( AC ) Les images confocales montrent des rayons imaginaux d'ailes de mosaïque de larves de troisième stade avec des clones co-exprimant lgl-RNAi et GFP (vert) au point de temps indiqué après l'induction du choc thermique. Les noyaux ont été étiquetés par DAPI (bleu). Les panneaux du milieu montrent des vues agrandies des régions du carré blanc marquées dans les panneaux de gauche. Le panneau de droite S montrent des dessins de lignes schématiques du côté apical des couches épithéliales (bleu) et des clones exprimant GFP (vert). Les clones de mosaïque situés dans l'épithélium sont représentés en vert clair tandis que les tumeurs néoplasiques qui s'écartent de l'épithélium sont représentées en magenta. Les lignes pointillées blanches dans les panneaux de gauche marquent les limites entre la poche d'aile et les régions charnières. Les flèches blanches dans les panneaux du milieu indiquent des lésions dysplasiques induites par les clones lub- knockdown. Barres d'échelle = 100 μm. Génotypes détaillés: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (30 minutes à 2 jours AED, incubé 2 jours à 25 ° C dans A, incuber 4 jours à 25 ° C en B, incuber 7 jours à 25 ° C en C après choc thermique). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Examen diagnostique des phénotypes clonaux dysplasiques. ( A ) Le panneau de gauche montre un disque imaginal d'aile en mosaïque de larve de troisième stade avec des clones coexpérimentant scrib-RNAi et GFP (vert) 5 jours après l'induction par choc thermique, colorés pour Dlg (rouge). Le panneau de droite montre un dessin en ligne schématique du côté apical des couches épithéliales (bleu) et des clones d'expression GFP (vert). Les clones de mosaïque dans les couches épithéliales sont montrés en vert clair tandis que les tumeurs néoplasiques déplacées de l'épithélium sont représentées en magenta. ( BE ) Les images confocales montrent des sections verticales des clones scrib -knockdown indiqués dans le panneau droit de (A). Les deuxièmes panneaux de gauche montrent les motifs de localisation Dlg (rouge). Les troisièmes panneaux de gauche montrent des dessins de lignes schématiques des côtés apicaux (rouges) et basaux (bleus) des couches épithéliales et du GFP-exprEssentielle scrib- cloque des clones (vert). Les clones dysplasiques dans les couches épithéliales sont montrés en vert clair (B et C) alors que les clones néoplasiques déplacés de l'épithélium sont représentés en magenta (D et E). Les flèches blanches indiquent des clones de scrib -knockdown montrant un phénotype tumorigène. Les noyaux ont été étiquetés avec DAPI (bleu). Barre d'échelle = 50 μm. Le phénotype tumoral de chaque clone a été classé selon l'organigramme présent dans la figure 1 . Génotypes détaillés: AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; Acte> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choc thermique 30 min à 2 jours AED, incuber 4 jours à 25 ° C après choc thermique). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 
Figure 6: DiagnosticExamen tic des phénotypes clonaux exprimés par Ras V12 . ( A ) Le panneau de gauche montre un disque imaginal de l'aile en mosaïque de la larve du troisième stade avec des clones coexpansant Ras V12 et GFP oncogènes (vert) 4 jours après l'induction par choc thermique, colorés pour Dlg (rouge). Le panneau de droite montre un dessin en ligne schématique du côté apical des couches épithéliales (bleu) et des clones d'expression GFP (vert). La barre d'échelle représente 50 μm. ( B ) Les sections verticales des clones d'expression Ras V12 indiqués dans le panneau de droite de (A). Les deuxièmes panneaux de gauche montrent les motifs de localisation Dlg (rouge). Les troisièmes panneaux de gauche montrent des dessins de lignes schématiques des côtés apicaux (rouge) et basal (bleu) des couches épithéliales et des clones d'expression Ras V12 et GFP (vert). Barre d'échelle = 25 μm. ( C ) Disque imaginal de l'aile mosaïque de la larve du troisième stade avec des clones co-exprimant <Em> Ras V12 et GFP (vert) 4 jours après l'induction par choc thermique, colorés pour MMP1 (rouge). Barre d'échelle = 100 μm. Génotypes détaillés: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Acte> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choc thermique de 45 min à 2 jours AED, incuber 4 jours à 25 ° C après choc thermique). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 
Figure 7: Examen diagnostique de Yki 3SA -expressing Clonal Phenotypes. ( A ) Le panneau de gauche montre un disque imaginal d'aile en mosaïque de larve de troisième stade avec des clones coexpérimentant activement Yki 3SA et GFP (vert) 4 jours après l'induction par choc thermique, colorés pour Dlg (rouge). Le panneau de droite apparaît comme Dessin à la ligne chimique du côté apical des couches épithéliales (bleu) et des clones exprimant GFP (vert). Barre d'échelle = 50 μm. ( BC ) Sections verticales des clones d'expression Yki 3SA indiqués dans le panneau de droite de (A). Les deuxièmes panneaux de gauche montrent les motifs de localisation Dlg (rouge). Les troisièmes panneaux de gauche montrent des dessins de lignes schématiques des côtés apicaux (rouge) et basal (bleu) des couches épithéliales et des clones d'expression Yki et GFP (vert). Barre d'échelle = 25 μm. ( D ) Disque imaginal de l'aile de mosaïque de la larve du troisième stade avec des clones co-exprimant Yki 3SA et GFP (vert) 4 jours après l'induction au choc thermique, colorés pour MMP1 (rouge). Barre d'échelle = 100 μm. Génotypes détaillés: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (choc thermique 30 min à 2 jours AED, incuber 4 jours à 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le système GAL4-UAS est l'un des outils génétiques les plus puissants pour l'expression des gènes ciblés dans Drosophila 26 et facilite grandement l'induction et l'analyse des cellules tumorales in vivo 4 . Ce système permet de générer des clones portant un knockdown de gènes suppresseurs de tumeurs ou une surexpression d'oncogènes dans un tissu épithélial de type sauvage, une situation très similaire aux stades initiaux du cancer humain où les cellules pro-tumorales transformées sont entourées de cellules épithéliales normales. Les lignes de conduite GAL4 régulées par des séquences d'amplificateurs telles que les lignes de traçage d'amplificateur GAL4 ou les lignes 27 de Janelia GAL4 ont des pattes d'expression uniques et spatiotemportement restreintes. Par conséquent, ces lignes Enhancer-GAL4 sont utiles pour induire régulièrement des tumeurs dans des zones restreintes de disques imaginaux. En plus de sd-GAL4 et upd-GAL4 présentés dans cette étude, nous avons confirmé que lgl- knockdown induit bEt autres lignes GAL4 de remplisseur d'amplificateurs, y compris le GAL4 gravé ( en-GAL4 ), le Héron-GAL4 ( hh-GAL4 ), l' optométriste-aveugle-GAL4 ( omb-GAL4 ), le patch-GAL4 ( ptc-GAL4 ) et le spalt-major- GAL4 ( salm-GAL4 ) peut générer des tumeurs néoplasiques dans les régions charnières des disques imaginaux d'ailes. Si le modèle d'expression de l'amplificateur-GAL4 doit être temporairement contrôlé, une combinaison de GAL4 et d'une version sensible à la température de GAL80 (GAL80 ts ) est une option. GAL80 ts réprime la fonction GAL4 à 18 ° C mais pas à 29 ° C, ce qui permet d'allumer ou éteindre l'expression UAS-transgenes si nécessaire 28 .
Le système de mosaïque flip-out-GAL4, qui combine le système FLP-FRT et le système GAL4-UAS 3 , génère des clones aléatoires dans des disques imaginaux. En combinant le flippase inducible contre les chocs thermiques (hsFLP) avec le flip-out GAL4, le moment du clone generatIon est contrôlable. Étant donné que le potentiel tumorigène des cellules de disque imaginaire peut dépendre du stade de développement, des événements de signalisation endogène et / ou de la différenciation cellulaire 29 , 30 , il est très important d'examiner l'effet de la temporisation de choc thermique sur les phénotypes tumorigènes altérés.
On a déjà montré que les clones mutants de nTSG subissent une apoptose dépendante de la compétition cellulaire lorsqu'ils sont entourés de cellules de type sauvage 10 , 11 , 12 , 18 , ce qui suggère que des mutations multiples sont requises pour la transformation cellulaire pendant le développement du cancer. En fait, la surexpression de Ras ou Yki oncogène dans des clones de lggl ou de scrib mutants les transforme en tumeurs agressives 10 , 18 , 31 alors que malL'expression de Ras V12 ou Yki 3SA n'induit pas le néoplasme malin par eux-mêmes sans mutations nTSG. Comme le montrent ici et auparavant 16 , les clones de nTSG-knockdown pro-tumorales générés dans des disques d'ailes de type sauvage subissent également une apoptose et ne montrent pas la tumorigénéité dans la poche d'aile 16 . Dans le même temps, les clones nTSG-knockdown situés dans les «hotspots» de charnière se développent en tumeurs néoplasiques sans mutations oncogènes supplémentaires. Dans les régions charnières, les cellules déficients en NTSG détournent le transducteur Janus kinase endogène / signal et l'activateur de la transcription (JAK / STAT) pour diriger la tumorigénèse 16 . Par conséquent, les GAL4 spécifiques à la charnière tels que upd-GAL4 sont des outils utiles pour induire systématiquement la formation de tumeur néoplasique par un knockdown médié par l' ARNi des gènes suppresseurs de tumeurs. Bien que les clones de mosaïque nTSG-knockdown induits par GAL4 induisent également des tumeurs néoplasiques en charnièreL'apparition de la tumorigène dépend de la taille initiale du clone: les grands clones générés par un choc thermique pendant 20 minutes induisent généralement la tumorigénèse, alors que la plupart des petits clones générés par un choc thermique de moins de 10 min sont complètement éliminés (KM et YT, données non publiées).
Un certain nombre d'études récentes sur le développement de tumeurs et la progression du cancer utilisent les disques drosophiles imaginaux comme système modèle 32 , 33 . Ces études comprennent plusieurs marqueurs de tumeurs néoplasiques: masses cellulaires déviantes, formes de disque déformées, accumulation de F-actine, cyclisme cellulaire amélioré (incorporation de BrdU / EdU ou expression de PH3), activation de la signalisation JNK et son objectif aval MMP1, membrane basale La perturbation et / ou la désorganisation épithéliale, y compris la perte ou la délocalisation subcellulaire des protéines impliquées dans la polarité de la cellule apicale basale (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 ou PAR-6), les jonctions septate(Lgl, Scrib, Dlg ou Coracle), ou des jonctions adhérentes (E-Cadherin ou Armadillo). Ces phénotypes sont facilement détectables par coloration d'anticorps classique. Bien qu'il soit difficile de déterminer si un phénotype clonal est une hyperplasie, une dysplasie, un néoplasme bénin ou un néoplasme malin au stade précoce de la tumorigénèse, il devrait être plus simple dans l'épithélium du disque imaginal de Drosophila composé d'une seule monocouche épithéliale. Dans cette étude, nous avons introduit une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes de clones tumoraux induits dans la monocouche épithéliale ( figure 1 ). Cette méthode nécessite des observations minutieuses de cinq critères utilisant des images confocales de pile z; Chaque critère de diagnostic peut être examiné par coloration d'anticorps classique et imagerie confocale. L'un des nouveaux critères que nous avons introduits dans cette méthode est le «critère du diamètre de 4 cellules» qui distingue la dysplasie et le néoplasme dans les disques imaginaux. Les cellules pro-tumorales telles que les clones mutants nTSG sont fréquentesExtrudé à partir des couches épithéliales par la compétition cellulaire ou la faiblesse de la broche 15 , 16 , 34 . Dans la plupart des situations, ces cellules extrudées apoptose, et donc elles ne peuvent pas proliférer. Bien qu'il soit possible que les cellules pro-tumorales subissent une division cellulaire une fois lors de l'extrusion et une fois ou deux fois après l'extrusion, cela fait une masse cellulaire de 2 à 3 cellules. Par conséquent, si une masse cellulaire de cellules pro-tumorales déviées de la couche épithéliale est supérieure au diamètre de 4 cellules, nous pouvons déterminer qu'elles survivent et prolifèrent comme un néoplasme à l'extérieur de la couche épithéliale.
Bien que cette méthode de diagnostic soit simple, il est essentiel de prendre un certain temps de phénotypes, car le développement de la tumeur et la malignité progressent au fil du temps. Par exemple, la dysplasie est un tissu cytologiquement anormal et un état de transition entre les croissances complètement bénignes et celles pré prémalin. Par conséquent, même si un clone observé est défini comme une dysplasie selon l'organigramme ( Figure 1 ), il est possible que la dysplasie se développe par la suite dans un néoplasme. Bien que le stade larvaire soit limité dans le temps (5 à 6 jours à 25 ° C ou 4 à 5 jours à 29 ° C AED), la croissance tumorale dans les disques imaginaux prolonge le stade larvaire à travers un peptide induit par l'insuline retardé de laparparation 35 , 36 . Par conséquent, la formation de tumeur néoplasique dans les disques imaginaux permet d'observer une progression phénotypique des clone tumoral pendant plusieurs jours de plus. Notre méthode de classification simple pourrait être largement applicable à l'analyse clonale des phénotypes tumoraux dans divers organes de Drosophila .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions J. Vaughen pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 et The Takeda Science Foundation Research Grant to YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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