Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/55901
Automatic Translation
1,2, 1
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Summary

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

Abstract

בשלבים המוקדמים של הסרטן, תאים מוטנטיים שהשתנו מראים תקלות ציטולוגיות, מתחילים בשגשוג בלתי מבוקר, ומפריעים בהדרגה לארגון הרקמות. תסיסנית melanogaster התפתחה כמערכת מודל ניסיוני פופולרי ביולוגיה של סרטן ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. בפרט, כלים גנטיים עבור דיסוזופיל דימיוני דיסקים (לפתח epithelia בזחלים) לאפשר יצירת תאים Pro- הגידול הופכים ברקמה אפיתל רגיל, מצב דומה לשלבים הראשונים של סרטן האדם. מחקר שנערך לאחרונה על tumorigenesis בדיסקופיית כנפיים תסיסנית , לעומת זאת, הראה כי ייזום הגידול תלוי cytoarchitecture המהותית ואת הסביבה microenviron המקומית, דבר המצביע על כך חשוב לשקול את האזור ספציפי רגישות לגירויים tumorigenic בהערכת פנוטיפים הגידול בדמיון דיסקים. כדי להקל על ניתוח פנוטיפי של הגידול progressiב דיסקים דמיוני, כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסויים גנטיים באמצעות מערכת GAL4-UAS כדי לגרום לגידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיון כנף. בנוסף, אנו מציגים שיטת אבחון כדי לסווג את פנוטיפים של נגעים משובצים המושרה epithelia דמיוני, כמו שיטת סיווג ברור להפלות בשלבים שונים של התקדמות הגידול (כגון היפרפלזיה, דיספלזיה, או neoplasia) לא תוארה קודם לכן. שיטות אלה עשויים להיות חלים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

Introduction

רקמות אפיתל הן מערכות מאורגנות מאוד, כי יש יכולת הומיאוסטית יוצאת דופן לשמור על הארגון שלהם באמצעות פיתוח מחזור התא. מערכת זו עצמית מאורגנת, עם זאת, הוא שיבשו בהדרגה במהלך התפתחות הגידול. בתחילת התפתחות הגידול, תאים מוטציה בודדים הנובעים הפעלה אונקוגן או גידולים סרטניים inactivation להתגלות בתוך שכבת אפיתל. כאשר זה השתנה "Pro-הגידול התא" מתחמק בסביבה מדכאת, משבש ארגון אפיתל, ומתחיל התפשטות בלתי מבוקרת, tumorigenesis מתרחשת 1 . במהלך העשורים האחרונים, התקדמות טכנולוגית יוצאת דופן בגנטיקה וביולוגיה מולקולרית עשו התקדמות מדהימה על מחקר הסרטן. במיוחד, מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות כלי ניתוח פסיפס גנטית ב תסיסנית melanogaster , כגון FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase היעד) recombin מיטוטיAtion 2 ו flip-out-GAL4-UAS (במעלה מפעיל רצף) מערכות 3 , תרמו רבות להבנה טובה יותר של המנגנונים הגנטיים המעורבים היווצרות גרורות של גידולים 4 , 5 , 6 .

מחקרים של קבוצת גני תסיסנית גידול משתיק משומרים, זחלי ענק קטלניים (LGL), דיסקים גדולים (dlg), ולקשקש (scrib), הדגישו את הקשר הקריטי בין הפסד של ארגון אפיתל התפתחות גידולים, כמו גנים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים ב ויסות קוטביות תא אפית, ותאי תאים ברקמות אפיתל 7 . בעוד שדיסקופיית הדיסקופיליה היא בדרך כלל אפיתיל מונוליר, מוטציות הומוזיגיות בכל אחד משלושת הגנים האלה גורמים לתאים לאבד מבנה וקוטביות,לשכור, overproliferate, ובסופו של דבר להרכיב multorayered המוני אמורפיים כי הפתיל עם רקמות סמוכות 7 . כמו כן, הפרעה של גנים אלה יונקים מעורב בפיתוח של גידולים ממאירים 8 , 9 . הפנוטיפים הניאופלסטיים המוצגים על ידי הרקמות המוטנטיות הובילו לסיווגם של שלושה גנים אלה כגנים משמרים, נויפלסטיים, מדכאי גידולים (nTSG) 7 , 8 . עם זאת, כאשר תאים הומוזיגיים nTSG מוטציה הם שנוצר באופן ספורדי בפיתוח wild-type דימויים דמיוניים באמצעות רקומבינציה מיטבית FLP-FRT בתיווך, תאים מוטציה מסולקות מן הרקמה דרך אפקטוזיס C- יוני K- מסוף (JNK), אפופטוזיס תלויים 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , שחול 15 , 16 , או engulfment ו phagocytosis על ידי השכנים 17 . ב אפיתל זה מוזאיקה גנטית, אפופטוזיס הוא זוהה בעיקר בתאי מוטציה nTSG הממוקם בגבול שיבוט, דבר המצביע על כך תאים נורמליים סמוכים מפעילה אפופטוזיס של תאים nTSG מוטציה 10 , 11 , 12 , 18 . מחקרים שנערכו לאחרונה בתאי יונקים אישרו כי חיסונים אלה התומכים בתאי גזע של תאים פרו-סרטניים הם מנגנון הגנה עצמית אפיתלי משומר מבחינה אבולוציונית נגד סרטן 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

מחקר שנערך לאחרונה תסיסנית דיסקים דמיוניים, לעומת זאת, הראה כי פסיפס nTSG-knockdown שיבוט גורם גידולים ניאופלסטיים specifאיזורים של כנפיים דימויים דימויים 16 . היווצרות ראשונית של הגידול נמצאה תמיד באזור "ציר" הפריפריאלי ולא נצפתה באזור המרכזי של "שקיק" של אפיתל הדיסק של האגף, דבר המצביע על כך שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי NTSG-knockdown תלוי בסביבה המקומית. אזור שקיק מרכזי פונקציות כמו "coldspot הגידול" שבו תאים Pro הגידול אינם מראים overgroastic דיספלסטי, ואילו באזור ציר ההיקפי מתנהג כמו "נקודה חמה" 16 . ב "coldspot" אזורים שקיק, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד הבסיסי ועוברים אפופטוזיס. לעומת זאת, כמו "נקודה חמה" תאים הציר להחזיק רשת של מבנים cytoskeletal חזקים על הצדדים הבסיסיים שלהם, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד האפי של אפיתל וליזום צמיחת יתר של טומוריגנית 16 . לכן, ניתוח של פנוטיפים הגידול בדיסקים דמיוניים דורש consi זהירשל רגישות ספציפית לאזור לגירויים טומוריגניים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לעורר היווצרות הגידול neoplastic בתקליטורים כנף תסיסנית הדיסק באמצעות מערכת GAL4-UAS- RNAi שבו תאים nTSG-knockdown נוצרים epithelia דיסק epaghelia רגיל. למרות אלו מערכות ניסיוניות שימושיים ללמוד את השלבים המוקדמים של סרטן, שיטה סיווג ברור להעריך את השלבים של התקדמות הגידול ב epithelia דיסק דמיוני לא תוארה בבירור לפני. לכן, אנו מציעים גם שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים הגידול המושרה epithelia דיסק האגף לשלוש קטגוריות: hyperplasia (הצטברות של מספר מופרז של תאים מופיעים נורמלי עם התפשטות מוגברת), דיספלסיה (רקמה prealignant מורכב להופיע באופן חריג תאים), ו neoplasia (גידול שפיר או ממאיר המורכב של תאים בעלי מראה חריג דפוס התפשטות לא נורמלי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לטוס צלבים ואינדוקציה משובטים

  1. הסר את כל הזבובים בבקבוקון 12 שעות לפני איסוף זבובים בתולה.
  2. להרדים את הזבובים בבקבוקון על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום עף על גבי כרית זבוב CO 2.
  3. העברת 10 - 20 נשים בתולה ו -10 גברים מן CO 2 לטוס כרית לתוך בקבוקון טרי דגירה ליום 1 ב 25 ° C.
  4. העברת זבובים אלה לתוך בקבוקון טרי דגירה במשך 12 שעות ב 25 ° C.
    הערה: להשליך את הבקבוקון הראשון כמו נקבות בתולה לא להניח מספיק ביצים ביום הראשון.
  5. עבור משפר- GAL4 שורות, להסיר את הזבובים למבוגרים דגירה בקבוקון על 25 מעלות צלזיוס עד לנתיחה.
  6. עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, להסיר את הזבובים המבוגרים דגירה בקבוקון עבור 2 - 4 ימים על 25 מעלות צלזיוס. זמן דגירה לפני הלם חום תלויה המטרה הניסויית. הלם חום 2 ימים לאחר הביצה בתצהיר (א.ד.) מייצר שיבוטי פסיפס בשנייה לא בוגר- אפיתיל דמיוני. הלם חום לאחר 3 או 4 ימים א.ד. מייצר שיבוטים פסיפס ב מובחן מוקדם עד אמצע השלישי epithelia הדמיון.
    הערה: חשוב לבחון את ההשפעה של תזמון חום שהשתנה על פנוטיפים טומוריגניים.
  7. עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, הלם חום הבקבוקון על ידי טבילה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 - 45 דקות ואחריו הדגירה של 2-3 ימים על 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: מידע על זמן הזעזוע החום, העיתוי וזמן הדגירה בכל ניסוי מוצג באיור האגדות.

2. דיסקציה של הזחלים

  1. איסוף נודדים instar השלישי עם מקל עץ או מלקחיים קהה, גנוטיפ אותם על ידי סמנים ניאון המתאים ( למשל , EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי ומניחים אותם צלחת לנתיחה עם PBS (פוספט שנאגרו מלוחים).
  2. לשטוף את הזחלים PBS ידי pipetting עם 2 מ"ל pipettes העברת פלסטיק.
  3. צבוט את מרכז הזחל עם מלקחיים אחת ולקרוע את הגוף לשניים עם מלקחיים אחרים.
  4. קמצוץ את הפה של החצי הקדמי עם מלקחיים אחד לדחוף את הפה לכיוון הגוף עם מלקחיים אחרים כדי להפוך את הגוף פנימה החוצה.
  5. הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות הרוק או גופים שומן עם מלקחיים.

3. קיבוע נוגדן מכתים

  1. מעבירים את החלק הקדמי גזור של הגוף הזחל (כולל דיסקים כנפיים דמיוני) כדי צינור פלסטיק 1.5 מ"ל לתקן 1 מ"ל של פתרון תקן (פורמלדהיד 4% ב PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין.
    זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לו פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור.
    הערה: בחלק זה, כל השלבים מתרחשים על נוטאטור בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם צוין אחרת.
  2. הסר את הפתרון תקן וזורקים. לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT (0.3% Tritב X-100 ב PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
  3. הסר את PBT ולהוסיף 1 מ"ל של PBTG (0.2% אלבומין בסרום שור 5% בסרום עירום נורמלי PBT) לחסימת ו nutate 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
  4. הסר PBTG ולהוסיף פתרון נוגדן ראשוני בדילול נאות עם PBTG (ראה טבלה חומרים ) ו nutate לילה ב 4 ° C.
  5. הסר את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
  6. הסר PBT ולהוסיף פתרון נוגדנים משני כראוי בדילול מלא עם PBTG (1: 400). Nutate עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. הסר פתרון נוגדנים משני לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  8. כדי הכתם F- אקטין, להסיר PBT ולהוסיף פתרון Phalloidin בדילול נאותה PBS (1:40). ואז nutate במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  9. כדי להדוף DNA גרעיני, להסיר PBT ולהוסיף DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של DAPI ב PBS). ואז nutate 10 דקות.
    זהירות: DAPI יש פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור.
  10. הסר פתרון DAPI לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  11. יש לשטוף פעם 1 מ"ל של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. הסר PBS ולהוסיף 500 μL של גליצרול 100% כמו המדיום מראש הרכבה.

4. הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ

  1. מניחים את הרקמות המוכתמות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 2 מ"ל.
  2. מעבירים את הרקמות טיפות של המדיום גובר על שקופית מיקרוסקופ אחר עם מלקחיים.
  3. החזק את קצה הרקמה גזור עם מלקחיים אחת ולמשוך משם דיסקים antennal העין עם מלקחיים אחרים.
    הערה: לשמור על המוח גזור למקום אותם ליד הדיסק דימיון כנף. המוח לפעול כפלטפורמה המונעת את coverslip מ מוחצת את האגף דיסקים דמיוניים.
  4. כדי לבודד את הדיסק כנפיים הדימיון להחזיק בקצה של רקמה גזור עם מלקחיים אחד בעדינות לגרד את קיר הגוף ולקרוע את הדיסקים עם מלקחיים אחרים.
    הערה: אם קשה למצוא דיסקיות דימויים כנפיים, לקלף את קנה הנשימה מן האחורי אל הצד הקדמי. כנפיים דיגיטליות כנפיים מקל על קנה הנשימה.
  5. בעדינות לכסות את הדיסקים הדמיוניים עם coverslip וחותמת עם לק. חנות ב 4 ° C.

5. מיקרוסקופיה confocal

  1. כדי לרכוש תמונות confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal להגדיר תמונה פרמטרים הרכישה כולל טווח של גל פליטה, עוצמת לייזר, רווח, היסט, מהירות סריקה גודל התמונה 24 .
    הערה: לקבלת הליך מפורט של הגדרות רכישת תמונות, עיין במדריך ההוראות המצורף על ידי כל יצרן מיקרוסקופ.
  2. כדי ללכוד שיתוף יחידקטעים nfocal של דיסק שלם אגף כולו, להשתמש בעדשה אובייקטיבית 20X.
  3. לרכוש 3-ממדי תמונות על ידי Z- מחסנית סריקה בגודל צעד של 0.5 - 1.0 מיקרומטר באמצעות עדשות 40X או 60X.
    הערה: כדי לנתח פנוטיפים סלולריים ברזולוציה גבוהה, גודל התמונה צריך להיות גדול מ 512 x 512 פיקסלים.

6. ניתוח תמונה באמצעות ImageJ

  1. השתמש פיג 'י, קוד פתוח ImageJ התוכנה התמקדה ביולוגי ניתוח התמונה (https://fiji.sc/) 25 , לרכוש ולנתח confocal z- מחסנית תמונות.
  2. כדי לרכוש חלקים אנכיים, לפתוח את z- ערימת תמונות ImageJ ובחר פריט בתפריט "תמונה / ערימות / Reslice."
    הערה: ניתן לבחור בציר XZ או בציר YZ בתפריט Reslice. סעיף אנכי ניתן להשיג גם בכיוון שרירותי על ידי ציור קו ישר או מלבן על התמונה z- מחסנית.

7. אבחון פנוטיפים ניאופלסטיים

  1. פתח את האנכימקטעים (XZ או ציר YZ) המתקבל קבוצה אחת של z- מחסנית תמונות ולנתח פנוטיפים מורפולוגיים מכתים נוגדן.
  2. עבור אבחון של פנוטיפים הגידול, בעיקר להתמקד בשלוש נקודות הבאות: (1) אם מסה התא, כולל שיבוטים מציאה, סוטה מן השכבה אפיתל הראשי, (2) אם לוקליזציה subcellular של חלבונים jnctional משתנה מסה זו התא , ו (3) אם הקוטר של מסת התא הזה הוא גדול מ 4 תאים.
  3. סיווג פנוטיפים הגידול לפי תרשים זרימה המתואר בתרשים 1 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים היווצרות הגידול נאופלסטיות המושרה בניסוי ידי RNAi בתיווך nTSG-מציאה ב דיסקים דמותי תסיסנית הכנף, שלושה נהגים GAL4 שונים שימשו להביע כטב"מ RNAi עבור LGL או scrib: (1) SD-GAL4, אשר מניע ביטוי כטב"מ חזקה כיס כנף והבעה קלה באזורי הצירים ( איור 2 ו איור 3 א ); (2) מעדכן GAL4, אשר כוננים בתת הצירים של ציר, כולל ביטוי חזק בשני תחומים של לקפל המדיאלי הגבי, ביטוי מתון בתחום אחד קדמי לרוחב, ואת הביטוי החלש בתחום הגחון האחורי ( איור 2 ו איור 3C ); ו 3 () הלם חום- Induced להעיף החוצה GAL4, אשר מייצר שיבוטים פסיפס אקראי לבטא UAS- גנים ( איור 4 ו - FiGure 5). בכל הניסויים, UAS-EGFP היה שיתוף לידי ביטוי עם UAS-RNAi כדי לסמן שיבוטים מציאה.

ראשית, sd-GAL4 -driven lgl-RNAi שימש כדי לגרום מציאה של lgl באגף כנף ואזורי ציר. בשליטה השלישי instar דיסקיות ללא UAS-lgl-RNAi , לא חל שינוי מורפולוגי ( איור 3 א ). לעומת זאת, בחלק השלישי של דיסקיות כנף המבטאות lgl-RNAi , דפורמציות אפיתל וצמחי גידול tumorigenic נצפו בבירור בחלקים מסוימים של הציר ( איור 3 ב ). באזור כנף האגף, לעומת זאת, דיספלסטית יתר לא נצפתה. MMP1 חזקה (מטריקס metalloprotease-1) הביטוי נצפתה נגעים בציר גידולים אך לא באזור כנף האגף ( איור 3 ב ). מאז הביטוי MMP1 מעורב השפלה של ממברנה במרתףEs, זה אפשרי כי אלה גידולים ציר יש יכולת גרורתי ( איור 3 ב ). לאחר מכן, נעשה שימוש ב- GAL4 כדי לעורר מציפה של Lgl באזור הצירים. בשליטה השלישי instar דיסקים כנף ללא UAS-lgl-RNAi , לא בוצעו שינויים מורפולוגיים ( איור 3 ג ). עם זאת, לאחר 5 ימים AED, השלישי דיסקות כנף instar עם עדכון GAL4 ו - lgl-RNAi הראה חוסר תפקוד אפיתל בולט, עם F- אקטין הצטברות עקירה משובטים מן השכבה אפיתל ( איור 3 ). ב 6 ימים א, גידולים neoplastic המבטא MMP1 overgrew באזור ציר ( איור 3G ), אם כי עם וריאציה בגודל הגידול בין דגימות ( איור 3E ו- F ). קטע אנכי של אזור הצירים אישר כי הגידול הניאופלסטי עבר סטייה סוטה בצד האפיקלי של שכבת האפיתל (

כדי לפקח על התקדמות הצמיחה של הגידול הנגרמת על ידי מציאת lgl , שיבוטים ספוראדי להביע lgl-RNAi נוצרו בדיסקים כנף באמצעות הזעז- Induced להעיף החוצה GAL4 פסיפס המערכת. יומיים לאחר הזעזוע לזחלים instar השני (2 ימים), כמה שיבוטים lgl- knockdown הממוקם באזור הציר הראה סטייה מן הצד apical של שכבת אפיתל ( איור 4 א ). ארבעה ימים לאחר הזעזוע החום, נגעים dysplastic באזור הציר התברר, מה שמרמז כי שיבוטים lgl- knockdown נעקרו הרחק בצד apical להתרבות לומן ( איור 4 ב ). שבעה ימים לאחר הזעזוע חום החום, overgrowths tumorigenic נשלט על אזורי ציר ( איור 4 ג ).

כדי להדגים אתסיווג של פנוטיפים המשובטים בשיטת האבחון שלנו, שיבוטים ספוראדיים המבטאים scrib-RNAi נוצרו בדיסקי כנף באמצעות מערכת פסיפס GAL4 המופיעה בחום. חמישה ימים לאחר-הלם חום הזחלים instar השני (2 ימים AED), בטוח-GFP להביע scrib שיבוטים -knockdown הראה פנוטיפים tumorigenic (איור 5 א). ניתחנו ארבעה שיבוטים (B, C, D ו- E בתרשים 5A ) בקטעים אנכיים של z- מחסנית confocal תמונות ניצול ImageJ, כי קשה לרכוש את פנוטיפים cytological מפורט מבני בתמונות confocal 2D ( איור 4 ו איור 5 א ). שיבוטים B ו- C סווגו כמו dysplasia כמו חלבון הצומת מחלת דיסקים גדולים (Dlg) היה mislocalized ( איור 5 ב ו C ). בשכפול B, גודלו של מסת התאים שנשארו מהאפיתל לא היה גדול מ -4 תאים בקוטרR ( איור 5 ב ), בעוד C שיבוט לא לסטות מן האפיתל ( איור 5 ג ); לפיכך, שיבוטים B ו- C לא נחשבו ניאופלסטיים. עם זאת, שיבוטים D ו- E, אשר הראה גם mislocalization של Dlg, נוצר המוני תאים סרטניים מחוץ האפיתל ( איור 5D ו 5E ). ככל שגודלם של שיבוטים גידולים אלה היה בקוטר של יותר מ -4 תאים, המשובטים סווגו כנואופלסטיים.

כדי לגרום לגידולים היפרפלסטיים או לתצורות ציסטות בדיסקים הדימויים של האגף, שיבוטים ספורדיים המבטאים ראס אונקוגני ( ראס V12 ) או צורה פעילה של יורקיה, מקדם תמליל של מסלול היפו, ( Yki 3SA ) נוצרו באמצעות הזעזוע- induced פליפ החוצה GAL4 פסיפס המערכת. ארבעה ימים לאחר הלם חום עד הזחלים instar השני (2 ימים), Raשל שיבוטים V12- vexpressing שכותרתו על ידי GFP הפך המוני תאים התא בדיסקים דמיוני ( איור 6 א ). קטע אנכי של שיבוט ראס V12 -expressing (לשכפל B באיור 6A ) גילה כי מסה התא ניתק משכבת ​​אפיתל יש לוקליזציה נאותה של Dlg, מה שמרמז כי מסת התא שומרת על מבנים אפיתל נורמלי מחוץ לשכבת אפיתל ( איור 6 ב ) . ביטוי MMP1 לא נצפתה אלה שיבוטים ראס V12 -expressing ( איור 6 ג ). לכן, שיבוט B סווג היווצרות כיס. ארבעה ימים לאחר ההלם חום הזחלים instar השני (2 ימים), יקי 3SA -expressing שיבוטים שכותרתו על ידי GFP נוצר המוני תא גדול הדיסקים הדמיוניים ( איור 7 א ). התמקדנו בשני שיבוטים (B ו- C באיור 7A ). Clone B הראהאינטגרציה בשכבת אפיתל לוקליזציה נאותה של Dlg ב תת קרום apical של התאים אפיתל, מה שמרמז כי יקי 3SA -express clone B שמרו מבנה אפיתל. לכן, שיבוט B היה מסווג hyperplasia ( איור 7 ב ). Clone C הממוקם באזור הציר הראה mislocalization של Dlg ויצרו מבנה רב שכבתית בצד הבסיס של שכבת אפיתל. ביטוי MMP1 לא נצפתה שיבוטים Yki 3SA -expressing . יחדיו, שיבוט C היה מסווג כמו neoplasm שפיר ( איור 7C ו- D ).

איור 1
איור 1: תרשים זרימה עבור סיווג של פנוטיפים סרטניים. תרשים זרימה זה מייצג שיטת אבחון לסווג נגעים משובטים באפיתל הדמיוני. המסווגAtion מבוסס על חמישה קריטריונים: (1) סטייה של שיבוטים משכבת ​​האפיתל, (2) mislocalization subcellular של חלבונים jonctional, (3) התפשטות הסלולר, (4) גודל שיבוט ו (5) ביטוי MMP1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ( A ) Wild-type האגף דיסק דמיוני מוכתמים עבור Dlg (ירוק) וגרעינים (DAPI, מגנטה). ( ב ) ייצוג סכמטי של כנפיים תסיסנית דיסקים כנפיים מציג כנף כנף (כחול), ציר (כתום) ו נוטום (ירוק) אזורים. ( C ) דיסק רגיל אגף מוכתם עבור F- אקטין (אדום) ו microtubules (ירוק). קרום מרתף מסומנים עם קולגן IV / Vkg-GFP (כחול). ( ד ) קטע אנכי של האתרמסומן בקו מנוקד לבן ( C ). ( E ) שרטוטים קו להתחקות אחר צדדי (אדום) ואת הבסיס (כחול) הצדדים של שכבת אפיתל ב ( D ). קווים מנוקדים להתחקות אחר קרום peripodial. דיפל (DF), המדיאלי (MF) ו הפרוקסימלי (PF) קפלי הציר הגבי מסומנים.
גנוטיפים מפורטים: A, w - CD, Vkg-GFP אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: אתר ספציפי Tumorigenesis המושרה על ידי Enhancer-GAL4s. ( A , B ) תמונות Confocal להראות כנף דיסקים דמיוניים גזור מן הזחלים instar השלישי של גנוטיפים המצוין מוכתם MMP1 (אדום). את sd-GAL4- expreאזורים ssing היו שכותרתו ביטוי GFP (ירוק). ( CG ) תמונות confocal להראות כנף דיסקים דמיוניים גזור מן הזחלים instar השלישי של גנוטיפים שצוין בנקודת הזמן הצפויה AED. F- אקטין היה מוכתם Phalloidin (אדום) ב ( CF ). ביטוי MMP1 מוכתם נוגדן אנטי MMP1 (אדום) ב ( G ). עדכון GAL4 -expressing אזורים היו שכותרתו ביטוי GFP (ירוק). לוחות תחתונים של ( CF ) מראים תצוגות מוגדלות של אזורים המופיעים בפאנלים העליונים. חצים לבנים מצביעים על נגעים דיספלסטיים הנגרמים על ידי שיבוטים lgl- knockdown. ( ח ) קטע אנכי של האתר המסומן בקו מנוקד לבן בחלונית התחתונה של (E). קווים מנוקדים לבנים מסמנים את הגבולות בין נרתיק כנפיים ואזורי ציר (A) ו- (B). גרעינים היו מסומנים עם DAPI (כחול). סולם ברים = 100 מיקרומטר ב (AG) ו 50 מיקרומטר ב (H). גנוטיפים מפורטים: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C, w - , update-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , Update-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: פנוטיפים סרטניים שנגרמו על ידי שיבוטים פסיפס אקראיים. ( AC ) תמונות Confocal להראות אגף פסיפס הדימיון הדימיוני של הזחלים instar השלישי עם שיבוטים שיתוף הבעת lgl-RNAi ו- GFP (ירוק) בנקודת הזמן המצוין לאחר השראה בהלם חום. הגרעינים תוארו על ידי DAPI (כחול). הפאנלים האמצעיים מציגים תצוגות מוגדלות של האזורים המרובעים הלבנים המסומנים בפאנלים שמאליים. הפאנל הימני S להראות שרטוטים קו סכמטי של הצד האפיטי של שכבות אפיתל (כחול) ואת שיבוטים GFP-expressing (ירוק). שיבוטים פסיפס הממוקם אפיתל מתוארים באור ירוק בעוד גידולים ניאופלסטיים החורגים מן האפיתל מוצגים במגנטה. קווים מנוקדים לבנים בפאנלים השמאלים מציינים את הגבולות בין שקיק כנפיים ואזורי ציר. חיצים לבנים בלוח האמצעי מציינים נגעים דיספלסטיים הנגרמים על ידי שיבוטים lgl- knockdown. סולם ברים = 100 מיקרומטר. גנוטיפים מפורטים: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (חום מזועזע 30 דקות ב 2 ימים אאד, דגירה 2 ימים ב 25 ° C ב A, דגירה 4 ימים ב 25 ° C ב B, דגירה 7 ימים ב 25 ° C ב C לאחר ההלם חום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/>
איור 5: בחינה אבחנתית של פנוטיפים משוכפלים דיספלסטיים. ( א ) הפאנל השמאלי מראה דיסק פסיפס דמיוני של הזחל instar השלישי עם שיבוטים שיתוף להביע Scrib-RNAi ו- GFP (ירוק) 5 ימים לאחר השראה בהלם חום, מוכתם Dlg (אדום). הפאנל הימני מציג ציור קו סכמטי של הצד האפיטי של שכבות האפיתל (כחול) ואת שיבוטים GFP- ביטוי (ירוק). שיבוטים פסיפס בשכבות אפיתל מוצגים ירוק בהיר בעוד גידולים ניאופלסטיים העקורים מן האפיתל מוצגים במגנטה. (BE) תמונות confocal להראות חלקים אנכיים של שיבוטי scrib -knockdown המצוין בלוח השמאלי של (A). לוחות השני משמאל להראות את דפוסי לוקליזציה Dlg (אדום). לוחות השלישי מן השמאלית להראות שרטוטים קו סכמטי של apical (אדום) ואת הבסיס (כחול) הצדדים של שכבות אפיתל ו- GFP-exprEssing scrib - שיבוטים knockdown (ירוק). שיבוטים דיספלסטיים בשכבות אפיתל מוצגים ירוק בהיר (B ו- C) בעוד שיבוטים ניאופלסטיים העקורים מן האפיתל מוצגים במגנטה (D ו- E). חיצים לבנים מצביעים שיבוטים scrib -knockdown מראה פנוטיפ tumorigenic. גרעינים היו מסומנים עם DAPI (כחול). סולם בר = 50 מיקרומטר. הפנוטיפ הגידול של כל שיבוט היה מסווג על פי תרשים זרימה שמוצג באיור 1 . גנוטיפים מפורטים: AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (חום מזועזע 30 דקות ב 2 ימים א ', דגירה 4 ימים ב 25 מעלות לאחר ההלם חום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: אבחוןבדיקה של ראס V12 -expressing פנוטיפים משובטים. ( א ) הפאנל השמאלי מראה אגף פסיפס דיסק דמיוני של הזחל instar השלישי עם שיבוטים שיתוף להביע oncogenic ראס V12 ו- GFP (ירוק) 4 ימים לאחר השראה בהלם חום, מוכתמים עבור Dlg (אדום). הפאנל הימני מציג ציור קו סכמטי של הצד האפיטי של שכבות האפיתל (כחול) ואת שיבוטים GFP- ביטוי (ירוק). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. ( ב ) חלקים אנכיים של שיבוטים ראס V12 להביע המצוין בלוח הימני של (א). לוחות השני משמאל להראות את דפוסי לוקליזציה Dlg (אדום). הפאנלים השלישי משמאל מראה שרטוטים קו סכמטי של אפית (אדום) ואת הבסיס (כחול) הצדדים של שכבות אפיתל ואת VS ראס ו- GFP שיבוט שיבוטים (ירוק). סולם בר = 25 מיקרומטר. ( ג ) אגף פסיפס האגדי דיסק של הזחל השלישי instar עם שיבוטים שיתוף הבעתEm> ראס V12 ו- GFP (ירוק) 4 ימים לאחר השראה בהלם חום, מוכתם MMP1 (אדום). סולם בר = 100 מיקרומטר. גנוטיפים מפורטים: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (חום מזועזע 45 דקות ב 2 ימים א.ד., דגירה 4 ימים על 25 מעלות צלזיוס אחרי הלם חום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: בחינה אבחנתית של יוקי 3SA - הבנת פנוטיפים משובטים. ( א ) הפאנל השמאלי מראה דיסק פסיפס הדימיון של הזחל instar השלישי עם שיבוטים שיתוף להביע פעיל Yki 3SA ו GFP (ירוק) 4 ימים לאחר השראה בהלם חום, מוכתמים עבור Dlg (אדום). הפאנל הימני מוצג כ- ציור קו כימי של הצד האפיטי של שכבות אפיתל (כחול) ו- GFP להביע שיבוטים (ירוק). סולם בר = 50 מיקרומטר. ( לפנה"ס ) חלקים אנכיים של שיבוטים Yki 3SA להביע המצוין בלוח הימני של (א). לוחות השני משמאל להראות את דפוסי לוקליזציה Dlg (אדום). הפאנלים השלישי משמאל מראה שרטוטים קו סכמטי של אפית (אדום) ואת הבסיס (כחול) הצדדים של שכבות אפיתל ואת שיבוטים Yki ו- GFP להביע (ירוק). סולם בר = 25 מיקרומטר. ( D ) דיסק פסיפס הדימיון של הזחל instar השלישי עם שיבוטים שיתוף הבעת Yki 3SA ו GFP (ירוק) 4 ימים לאחר השראה בהלם חום, מוכתם MMP1 (אדום). סולם בר = 100 מיקרומטר. גנוטיפים מפורטים: AD, hsFLP ;; UAS- Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (חום הלם 30 דקות ב 2 ימים א ', דגירה 4 ימים ב 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת GAL4-UAS הוא אחד הכלים הגנטיים החזקים ביותר עבור ביטוי גנים ממוקד תסיסנית 26 ומאפשר מאוד אינדוקציה תא הגידול וניתוח ב vivo 4 . מערכת זו מאפשרת את הדור של שיבוטים נושאת מציאה של גנים מדכאי גידול או overexpression של אונקוגנים בתוך רקמת אפיתל wild-type, מצב דומה מאוד בשלבים הראשונים של סרטן האדם שבו תאים פרו תאים סרטניים מוקפים בתאי אפיתל נורמלי. GAL4 קווי הנהג מוסדר על ידי רצפים משפר כגון GAL4 משפר קווי מלכודת או קווי Janelia GAL4 27 יש ייחודי, spatiotemporally מוגבלים הביטוי patters. לכן, אלה משפר- GAL4 שורות שימושיים כדי לגרום לגידולים באופן עקבי באזורים מוגבלים של דיסקים דמיוניים. בנוסף sd-GAL4 ו עדכון GAL4 המוצג במחקר זה, אנו אישר כי lgl- knockdown המושרה בקווי GAL4 y משפר-מלכודת אחרים, כולל engrailed-GAL4 (en-GAL4), קיפוד GAL4 (hh-GAL4), optomotor סמיות-GAL4 (OMB-GAL4), תוקנו-GAL4 (PTC-GAL4) ו spalt-המייג'ור GAL4 ( salm-GAL4 ) יכול לייצר גידולים ניאופלסטיים באזורי הצירים של דיסקים דמיוניים כנפיים. אם דפוס הביטוי GAL4 משפר צריך להיות נשלט זמנית, שילוב של GAL4 וגירסת טמפרטורה רגישה של GAL80 (GAL80 TS ) היא אופציה. GAL80 TS מדחיק GAL4 פונקציה ב 18 מעלות צלזיוס, אבל לא ב 29 ° C, אשר מאפשר ביטוי UAS- טרנסגנים להיות מופעל או כבוי לפי הצורך 28 .

מערכת הפסיפס של ה- GAL4, המשלבת את מערכת FLP-FRT ומערכת ה- GAL4-UAS 3 , יוצרת שיבוטים אקראיים בדיסקים דמיוניים. על ידי שילוב של פליפז הלם- in-flipase (hsFLP) עם פליפ החוצה GAL4, העיתוי של שיבוט generatיון הוא לשליטה. מכיוון שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי הדיסק הדמיוני עשוי להיות תלוי בשלב ההתפתחותי, באינדוגנציה אנדוגנית, ו / או בידול תאים 29 , 30 , חשוב מאוד לבחון את ההשפעה של תזמון חום מזערי על פנוטיפים טומוריגניים.

הוכח בעבר כי שיבוטים מוטנטים nTSG עוברים אפופטוזיס תלויי תא, כאשר הם מוקפים בתאי wild-type 10 , 11 , 12 , 18 , דבר המצביע על כך שמוטציות מרובות נדרשות לשינוי תאים במהלך התפתחות הסרטן. למעשה, overexpression של ראס oncogenic או יקי ב lgl או שיבוט מוטציה סופר הופך אותם לגידולים אגרסיביים 10 , 18 , 31 בעוד misביטוי של ראס V12 או Yki 3SA אינו גורם neoplasm ממאיר לבד ללא מוטציות nTSG. כפי שמוצג כאן בעבר 16 , Pro- הגידול שיבוטים nTSG-knockdown שנוצר דיסקים כנף wild-type גם עוברים אפופטוזיס לא מראים tumorigenesis בכיס כנף 16 . במקביל, שיבוטים nTSG-knockdown הממוקם בצירים "נקודות חמות" להתפתח לגידולים neoplastic ללא כל מוטציות oncogenic נוספים. באזורים הצירים, תאים nTSG לקוי לחטוף endusous Janus kinase / מתמר אות activator של שעתוק (JAK / STAT) איתות לנהוג tumorigenesis 16 . לכן, צירים ספציפיים GAL4s כגון עדכון GAL4 הם כלים שימושיים לעקב באופן עקבי היווצרות הגידול נויפלסטי על ידי RNAi מוכות המכות של גנים מדכאי הגידול. למרות flip-out-GAL4-Induced nTSG-downdown פסיפס שיבוט גם לגרום לגידולים ניאופלסטיים מחדש צירGions, תופעת tumorigenesis תלויה בגודל שיבוט ראשוני: שיבוטים גדולים שנוצרו על ידי הלם חום מעל 20 דקות בדרך כלל לגרום לגידול, ואילו רוב שיבוטים קטנים שנוצר על ידי הלם חום קצר מ 10 דקות יבוטלו לחלוטין (KM ו- YT, נתונים שלא פורסמו).

מספר מחקרים שנעשו לאחרונה על התפתחות הגידול וסרטן השימוש להשתמש תסיסנית דיסקים דמיוניים כמערכת מודל 32 , 33 . המשותף למחקרים אלה כולל מספר סמנים של גידולים ניאופלסטיים: מסות תאים סמויות, צורות דיסק מעוותות, הצטברות של F-actin, רכיבה על תאים משופרת (שילוב של BrdU / EDU או ביטוי PH3), הפעלת איתות JNK ומטרה MMP1 למיקוד במורד, קרום המרתף הפרעה ו / או חוסר תפקוד אפיתלי, כולל אובדן או חלוקה תת-תאית של חלבונים המעורבים בקוטביות תא אפית-בקאלית (פירורים, סטארדאסט, פאט`, אפ"ק, בזוקה / PAR-3 או PAR-6)(Lgl, Scrib, Dlg או Coracle), או דבקות בצמתים (E-Cadherin או Armadillo). פנוטיפים אלה הם לזיהוי בקלות על ידי מכתים נוגדן קונבנציונאלי. למרות שקשה לקבוע אם פנוטיפ המשובש הוא היפרפלזיה, דיספלסיה, ניופלסמה שפירה או ניאופלזמה ממאירה בשלב מוקדם של הגידול, זה צריך להיות פשוט יותר ב epishelia דיסוזופיל הדימיון המורכב של monolayer אפיתל יחיד. במחקר זה, הצגנו שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים גידולים המושרה monolayer אפיתל ( איור 1 ). שיטה זו מחייבת תצפיות זהירות של חמישה קריטריונים באמצעות z- מחסנית confocal תמונות; כל קריטריון אבחון ניתן לבדוק על ידי מכתים נוגדן קונבנציונלי הדמיה confocal. אחד הקריטריונים החדשים שהצגנו בשיטה זו הוא "קריטריונים בקוטר 4 תאים" אשר מפלה בין דיספלסיה ו neoplasm בדיסקים דמיוניים. תאים Pro-tumor כגון שיבוטים מוטציה nTSG הם תכופיםLy extruded מ שכבות אפיתל באמצעות תחרות תא או איזון ציר , 15 , 16 , 34 . ברוב המקרים, תאים אלה extruded אפופטוז, ולכן הם לא יכולים להתרבות. למרות שזה עשוי להיות אפשרי כי תאים Pro הגידול לעבור חלוקה התא פעם במהלך שחול ופעם או פעמיים יותר לאחר שחול, זה עושה מסת התא של בקוטר 2-3 תאים. לכן, אם המסה התא של תאים Pro הגידול סוטה משכבת ​​אפיתל גדול יותר בקוטר 4 תאים, אנו יכולים לקבוע כי הם שורדים ו מתרבים כמו ניאופלזמה מחוץ לשכבת אפיתל.

למרות ששיטת אבחון זו היא פשוטה, זה קריטי לקחת קורס זמן של פנוטיפים, כמו התפתחות הגידול ממאירות מתקדמת לאורך זמן. לדוגמה, דיספלסיה היא רקמה חריגה מבחינה ציטולוגית ומצב מעבר בין גידולים שפירים לחלוטין לבין אלה שהם מראשמַמְאִיר. לכן, גם אם שיבוט שנצפה מוגדר דיספלסיה על פי תרשים זרימה ( איור 1 ), ייתכן כי דיספלסיה לאחר מכן מתפתח לתוך ניאופלזמה. למרות שלב הזחל מוגבל בזמן (5 - 6 ימים ב 25 ° C או 4 - 5 ימים ב 29 ° C א), גידול הגידול בדיסקים דמיוניים מאריך את שלב הזחל באמצעות עיכוב דמוי אינסולין עיכוב המושרה של pupariation 35 , 36 . לכן, היווצרות גידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיוניים מאפשר לראות את הגידול המשוערת הגידול פנוטיפי במשך כמה ימים נוספים. שיטת סיווג פשוטה שלנו עשוי להיות ישים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לג 'ואוגן על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ JSPS KAKENHI מענק מספרים 26891025, 15H01500 ו Takeda מדע הקרן מענק מחקר YT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Wako 162-19321
TritonX-100 Wako 168-11805
Formaldehyde Wako 064-00406
bovine serum albumin Sigma A7906
normal goat serum Sigma G6767
mounting medium, Vectashield Vector Laboratories H-1000
DAPI Sigma D9542
mouse-anti-Dlg 4F3 Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3A6B4, RRID:AB_579780 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 3B8D12, RRID:AB_579781 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank 5H7B11, RRID:AB_579779 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin Developmental Studies Hybridoma Bank AA4.3, RRID:AB_579793 dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin Molecular probes A22283 dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 Molecular probes A11030 dilute in PBTG, 1:400
Name Company Catalog Number Comments
Fly strains
sd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #8609 recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center #26796 recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #51247
UAS-scrib-RNAi Vienna Drosophila RNAi center #105412
UAS-RasV12 Bloomington Drosophila Stock Center #64196
UAS-Yki3SA Bloomington Drosophila Stock Center #28817
hsFLP Bloomington Drosophila Stock Center #6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) Bloomington Drosophila Stock Center #4780 recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #5428 X chromosome
UAS-EGFP Bloomington Drosophila Stock Center #6658 third chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24650 second chromosome
UAS-Dicer2 Bloomington Drosophila Stock Center #24651 third chromosome
vkg-GFP Morin et al. 2001 GFP protein trap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  3. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  4. Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
  5. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  6. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
  7. Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
  8. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
  9. Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
  12. Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
  13. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  14. Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
  15. Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
  16. Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
  17. Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
  18. Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
  19. Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
  20. Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
  21. Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
  22. Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
  23. Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  27. Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
  28. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
  29. Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
  30. Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
  31. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  32. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  33. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  34. Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
  35. Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
  36. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).

Tags

ביולוגיה של סרטן גיליון 125 תסיסנית דימיון דימנטי Tumorigenesis Neoplasia דיספלסיה גן מדכא גידולים GAL4-UAS RNAi
אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morimoto, K., Tamori, Y. Induction… More

Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (125), e55901, doi:10.3791/55901 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter